JPH07143900A - Polynucleotide for use in amplifying single primer and oligonucleotide containing phospho- thioate as primer in amplifying nucleic acid. - Google Patents
Polynucleotide for use in amplifying single primer and oligonucleotide containing phospho- thioate as primer in amplifying nucleic acid.Info
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- JPH07143900A JPH07143900A JP4313917A JP31391792A JPH07143900A JP H07143900 A JPH07143900 A JP H07143900A JP 4313917 A JP4313917 A JP 4313917A JP 31391792 A JP31391792 A JP 31391792A JP H07143900 A JPH07143900 A JP H07143900A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【0001】[0001]
【発明の技術分野】核酸ハイブリダイゼーションは、そ
の同定およびその存在の証明に使用されてきた。ハイブ
リダイゼーションは相補的な塩基対の結合に基づいてい
る。相補的な単一鎖核酸が一緒にインキュベートされる
時、相補的な塩基配列は対になって2本鎖ハイブリッド
分子を形成する。単一鎖デオキシリボ核酸(ssDN
A)またはリボ核酸(RNA)が相補的な核酸配列と水
素結合構造を形成する能力は、分子生物学の研究での分
析手段として使用されてきた。比活性の高い放射性ヌク
レオシド3リン酸が入手できることおよびT4キナーゼ
によりDNAを32P標識できることが、生物学的に興
味のある種々の核酸配列を同定、単離そして性状解析す
ることを可能にした。核酸ハイブリダイゼーションは、
ユニークな核酸配列に関連する疾患状態の診断において
大きな可能性を有する。これらのユニークな核酸配列
は、挿入、欠失、点突然変異、または細菌、糸状菌、真
菌およびウイルスによる外来DNAまたはRNAの獲得
により、DNAに遺伝的または環境の変化を起こすこと
に起因する。これまで核酸配列は、主に大学や産業界の
分子生物学研究室で使用されてきた。患者の体液中に疾
患に関連するDNAまたはRNAの濃度が非常に低いこ
と、および核酸ハイブリダイゼーション分析のための充
分に感受性のある方法がないことなどにより、臨床医学
における診断手段としての核酸ハイブリダイゼーション
の応用は限定されている。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION Nucleic acid hybridization has been used for its identification and proof of its existence. Hybridization is based on the binding of complementary base pairs. When complementary single-stranded nucleic acids are incubated together, the complementary base sequences pair to form a double-stranded hybrid molecule. Single-stranded deoxyribonucleic acid (ssDN
The ability of A) or ribonucleic acid (RNA) to form hydrogen bonding structures with complementary nucleic acid sequences has been used as an analytical tool in the study of molecular biology. The availability of highly specific radioactive nucleoside triphosphates and the ability of the T4 kinase to label DNA with 32 P allowed the identification, isolation and characterization of various nucleic acid sequences of biological interest. Nucleic acid hybridization
It has great potential in diagnosing disease states associated with unique nucleic acid sequences. These unique nucleic acid sequences result from genetic or environmental changes in the DNA due to insertions, deletions, point mutations, or the acquisition of foreign DNA or RNA by bacteria, filamentous fungi, fungi and viruses. To date, nucleic acid sequences have been used primarily in molecular biology laboratories in universities and industry. Nucleic acid hybridization as a diagnostic tool in clinical medicine due to the very low concentration of disease-related DNA or RNA in the body fluids of patients and the lack of sufficiently sensitive methods for nucleic acid hybridization analysis. Has limited applications.
【0002】特異的核酸配列を検出するための現在の方
法は、ニトロセルロースペーパー、セルロースペーパ
ー、ジアゾ化ペーパー、またはナイロン膜などの固体支
持体への標的核酸の固定を用いる。標的核酸を支持体に
固定化した後、支持体に適当に標識したプローブ核酸を
約2から48時間接触させる。この時間の後、調整され
た温度で固体支持体を数回洗浄してハイブリダイズしな
いプローブを除去する。次に支持体を乾燥させて、オー
トラジオグラフィーまたは分光学的方法によりハイブリ
ダイズした物質を検出する。Current methods for detecting specific nucleic acid sequences use the immobilization of target nucleic acids on solid supports such as nitrocellulose paper, cellulose paper, diazotized paper, or nylon membranes. After the target nucleic acid is immobilized on the support, the support is contacted with the appropriately labeled probe nucleic acid for about 2 to 48 hours. After this time, the solid support is washed several times at a controlled temperature to remove unhybridized probe. The support is then dried and the hybridized material is detected by autoradiography or spectroscopic methods.
【0003】非常に低濃度を検出する必要がある場合、
現在の方法は時間と手間がかかり、放射性標識物と異な
り容易には入手できない非放射能標識物は適当ではない
ことが多い。従って核酸配列を検出するのに簡単で、迅
速な、非放射性の、均一法または比均一法の使用を可能
にするように感度を上昇させる方法が好ましい。If it is necessary to detect very low concentrations,
Current methods are time consuming and laborious, and unlike radiolabels, non-radioactive labels that are not readily available are often not suitable. Therefore, methods that increase sensitivity to allow the use of simple, rapid, non-radioactive, homogeneous or ratio homogenous methods for detecting nucleic acid sequences are preferred.
【0004】最近ポリメラーゼチェイン反応(PCR)
として知られる、DNAの特異的部分の酵素的増幅法が
記載されている。このインビトロ増幅法は、変性、オリ
ゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、および好熱
性ポリメラーゼによるプライマーの延長のサイクルを繰
り返して、プライマーの間の領域のコピー数を指数的に
増加させることに基づく。DNAの反対の鎖にアニーリ
ングするPCRプライマーは、1つのプライマーのポリ
メラーゼで触媒された延長生成物が他のプライマーの鋳
型鎖として作用するように配置され、その長さがオリゴ
ヌクレオチドプライマーの5’末端の間の距離で規定さ
れる不連続な断片が蓄積される。Recently, polymerase chain reaction (PCR)
A method of enzymatic amplification of a specific portion of DNA, known as This in vitro amplification method is based on repeated cycles of denaturation, oligonucleotide primer annealing, and primer extension with a thermophilic polymerase to exponentially increase the copy number of the region between the primers. A PCR primer that anneals to the opposite strand of DNA is positioned such that the polymerase-catalyzed extension product of one primer acts as a template strand for the other primer, the length of which is the 5'end of the oligonucleotide primer. Discontinuous fragments, defined by the distance between them, accumulate.
【0005】核酸配列を増幅するのに最近別の方法が記
載されている。この方法は、PCRが2つのプライマー
を必要とするのとは異なり1つのプライマーしか使用し
ないため、単一プライマー増幅法と言われる。この方法
は、標的核酸には比較的短い相補性配列が隣接するステ
ム−ループまたは逆方向反復塩基配列構造を有する標的
核酸の増幅を提供する。検出すべきポリヌクレオチドの
存在に関連するこのような標的核酸を作成するための種
々の方法もまた記載されている。Another method has recently been described for amplifying nucleic acid sequences. This method is referred to as a single primer amplification method because PCR uses only one primer, unlike PCR which requires two primers. This method provides amplification of target nucleic acids having a stem-loop or inverted repeat base sequence structure flanked by relatively short complementary sequences to the target nucleic acid. Various methods for making such target nucleic acids related to the presence of the polynucleotide to be detected have also been described.
【0006】合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用
する場合の1つの問題点は、このようなプライマーは、
増幅法に使用される多くのDNAポリメラーゼに関連す
るエキソヌクレアーゼ活性による減成を受け易いことで
ある。前記したようにこのような方法の1つはPCRで
あり、これは核酸の指数的増幅を提供する。PCRは一
般に、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠如しミス
マッチの除去が不可能なTaqポリメラーゼを使用して
実施される。この方法には多くの変法が記載されてお
り、あるものは温度のサイクリングを必要とし、あるも
のは単一の温度を使用する。単一の温度を用いる方法
は、増幅するのに4個もの酵素の活性に依存し、温度サ
イクリングを使用するものは、熱安定性ポリメラーゼに
依存している。PCRを用いて、遺伝疾患の検出におい
て遺伝的多型性または点突然変異が普通に報告されてい
る。人工的に生成物を導入したり、標的DNAの単一塩
基ミスマッチを検出するのに、3’末端でミスマッチし
たプライマーが使用される。しかし増幅実験計画で使用
される3’−エキソヌクレアーゼ活性を含む酵素は、ミ
スマッチしたプライマー−鋳型領域を消化するため、こ
の種の分析を大幅に制限している。One problem with using synthetic oligonucleotide primers is that such primers are
It is susceptible to degradation by the exonuclease activity associated with many DNA polymerases used in amplification methods. As mentioned above, one such method is PCR, which provides exponential amplification of nucleic acids. PCR is generally performed using Taq polymerase, which lacks 3'-5 'exonuclease activity and is unable to remove mismatches. Many variations of this method have been described, some require cycling of temperature and some use a single temperature. The single temperature method relies on the activity of as many as four enzymes to amplify, and the one using temperature cycling relies on a thermostable polymerase. Genetic polymorphisms or point mutations are commonly reported in the detection of genetic disorders using PCR. Primers mismatched at the 3'end are used to artificially introduce the product or to detect single base mismatches in the target DNA. However, the enzymes containing the 3'-exonuclease activity used in the amplification experimental design digest the mismatched primer-template region, which greatly limits this type of analysis.
【0007】本発明の一部は、強い3’−エキソヌクレ
アーゼ活性を有する酵素の存在下でも、鋳型に沿ったプ
ライマーの延長とプライマーの増幅を可能にする。[0007] Part of the present invention allows extension of a primer along with a template and amplification of the primer even in the presence of an enzyme having a strong 3'-exonuclease activity.
【0008】[0008]
【先行技術の説明】核酸配列を増幅、検出および/また
はクローニングする方法は、米国特許第4,683,1
95号または4.683,202号に記載されている。
配列の重合はサイキ(Saiki)ら、(1986)S
cience,230:1350−1354に記載され
ている。オリゴヌクレオチドを作成する方法はヨーロッ
パ特許出願第0194545A2号に記載されている。
ベルギー特許出願第BE904402号はDNA検出プ
ローブを作成するための鋳型を開示している。真核細胞
における遺伝子増幅は米国特許第4,656,134号
に記載されている。DESCRIPTION OF THE PRIOR ART Methods for amplifying, detecting and / or cloning nucleic acid sequences are described in US Pat. No. 4,683,1.
95 or 4.683,202.
Sequence polymerisation is described by Saiki et al. (1986) S.
Science, 230: 1350-1354. Methods for making oligonucleotides are described in European Patent Application No. 0194545A2.
Belgian Patent Application No. BE904402 discloses templates for making DNA detection probes. Gene amplification in eukaryotic cells is described in US Pat. No. 4,656,134.
【0009】ランガー(Langer)ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA(1981)7
8:6633−6637は、ビオチン標識ポリヌクレオ
チドの酵素的合成と、新規核酸アフィニティプローブと
してのこの使用を開示している。ビオチンを使用しての
培養細胞やパラフィン固定組織中のウイルスゲノムの検
出は、ブリガチ(Brigati)ら、Virolog
y,(1983)136:32−50により説明されて
いる。米国特許第4,486,539号はワンステップ
サンドイッチハイブリダイゼーション試験による微生物
核酸の検出を開示している。DNA検出に基づく悪性腫
瘍の高感度検出は、米国特許第4,490,472号に
記載されている。米国特許第4,480,040号は、
検出すべきウイロイド(viroid)やウイルスの核
酸に相補的な放射標識DNAを用いる植物ウイロイド疾
患やウイルスの、高感度で迅速な診断法を開示してい
る。ヨーロッパ特許出願第83106112.2号(優
先権米国特許出願第391,440号、1982年6月
23日出願)は、修飾標識ヌクレオチドやポリヌクレオ
チドおよびこれらの調製法、使用法そして検出法を記載
している。細胞性DNAの検出と測定のための方法と組
成物は、米国特許第4,423,153号に開示されて
いる。診断微生物学における特異的DNAプローブは、
米国特許第4,358,535号に説明されている。多
型性制限部位と核酸配列の検出法は、ヨーロッパ特許出
願第0164054A1号に説明されている。米国特許
第4,663,283号は2本鎖DNAを変更する方法
を記載している。Langer et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1981) 7
8: 6633-6637 discloses the enzymatic synthesis of biotin labeled polynucleotides and their use as novel nucleic acid affinity probes. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin-fixed tissues using biotin is described by Brigati et al., Virolog.
y, (1983) 136: 32-50. U.S. Pat. No. 4,486,539 discloses the detection of microbial nucleic acid by a one-step sandwich hybridization test. Sensitive detection of malignant tumors based on DNA detection is described in US Pat. No. 4,490,472. U.S. Pat. No. 4,480,040
Disclosed is a highly sensitive and rapid diagnostic method for a plant viroid disease or virus, which uses a radiolabeled DNA complementary to a nucleic acid of a viroid or virus to be detected. European Patent Application No. 83106112.2 (Priority US Patent Application No. 391,440, filed June 23, 1982) describes modified labeled nucleotides and polynucleotides and their methods of preparation, use and detection. ing. Methods and compositions for detecting and measuring cellular DNA are disclosed in US Pat. No. 4,423,153. Specific DNA probes in diagnostic microbiology are
It is described in U.S. Pat. No. 4,358,535. Methods for detecting polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences are described in European Patent Application No. 0164054A1. US Pat. No. 4,663,283 describes a method of altering double-stranded DNA.
【0010】形質転換体配列決定をともなうゲノム増幅
は、ストフレット(Stoflet)ら、Scienc
e(198)239:491に説明されている。熱安定
性DNAポリメラーゼを用いるDNAのプライマー指令
酵素的増幅は、サイキ(Saiki)ら、Scienc
e(1988),239:487に記載されている。米
国特許第4,724,202号は、核酸ハイブリダイゼ
ーションの検出のためのハイブリダイズしない核酸の使
用を開示している。ブガワン(Bugawann)ら
は、親子鑑別と法医学のHLAタイピングのための酵素
的に増幅されたDNAを分析するための非放射性オリゴ
ヌクレオチドプローブの使用を記載している。Genomic amplification with transformant sequencing is described by Stoflet et al., Science.
e (198) 239: 491. Primer-directed enzymatic amplification of DNA using a thermostable DNA polymerase is described by Saiki et al., Science.
e (1988), 239: 487. US Pat. No. 4,724,202 discloses the use of non-hybridizing nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization. Bugawan et al. Describe the use of non-radioactive oligonucleotide probes to analyze enzymatically amplified DNA for parentage discrimination and forensic HLA typing.
【0011】相同性のある、繰り返しのそして増幅され
た核酸配列の検出と単離は、米国特許第4,675,2
83号に記載されている。米国特許第4,683,19
5号と第4,683,202号は、試薬複合体からの置
換されたRNA単一鎖ポリヌクレオチドの消化による均
一ポリヌクレオチド置換測定法、そして2つのオリゴヌ
クレオチドプライマーによる核酸の別々の相補的な鎖の
処理による核酸配列の増幅を開示している。ヨーロッパ
特許出願第0200362号は、核酸配列を増幅、検出
またはクローニングするための方法であって、疾患の診
断と形質転換ベクターの調製に有用な方法を記載してい
る。細胞質ドットハイブリダイゼーションによる多種の
小試料中の相対的な核酸レベルの簡便な分析法は、米国
特許第4,677,054号に記載されている。チオヌ
クレオチドを含むプローブによる核酸配列のハイブリダ
イゼーション検出法は、米国特許第4,647,529
号に記載されている。Detection and isolation of homologous, repetitive and amplified nucleic acid sequences is described in US Pat. No. 4,675,2.
No. 83. U.S. Pat. No. 4,683,19
Nos. 5 and 4,683,202 describe a homogeneous polynucleotide displacement assay by digestion of displaced RNA single-stranded polynucleotides from a reagent complex, and separate complementary complementation of nucleic acids with two oligonucleotide primers. Disclosed is the amplification of nucleic acid sequences by treatment of the strands. European Patent Application No. 0200362 describes a method for amplifying, detecting or cloning nucleic acid sequences, which is useful for diagnosing diseases and preparing transformation vectors. A convenient assay for relative nucleic acid levels in a variety of small samples by cytoplasmic dot hybridization is described in US Pat. No. 4,677,054. A method for detecting hybridization of a nucleic acid sequence with a probe containing a thionucleotide is disclosed in US Pat. No. 4,647,529.
No.
【0012】DNAのセルロースへの共有結合の簡便で
効率的な酵素的方法とそのハイブリダイゼーション−制
限分析への応用とDNAプローブのインビトロ合成への
応用は、Nucleic Acids Researc
h(1986)14:9171−9191に記載されて
いる。EcoRIによる単一鎖オリゴヌクレオチドの切
断はNucleic Acids Research
(1987)15:709−716に記載されている。A simple and efficient enzymatic method for covalent binding of DNA to cellulose and its application to hybridization-restriction analysis and in vitro synthesis of DNA probes are described in Nucleic Acids Research.
h (1986) 14: 9171-9191. Cleavage of single-stranded oligonucleotides by EcoRI is Nucleic Acids Research
(1987) 15: 709-716.
【0013】組換えRNAハイブリダイゼーションプロ
ーブの指数的増幅は、リザルジ(Lizardi)ら、
(1988)Bio/Technology 6:11
97−1202に記載されている。ファーランダー(F
ahrlander)らはDNAプローブシグナルの増
幅について記載している:A ChristmasTr
ee Approach in Bio/Techno
logy(1988)6:1165−1168。Exponential amplification of recombinant RNA hybridization probes is described by Lizardi et al.
(1988) Bio / Technology 6:11.
97-1202. Farlander (F
ahrlander) et al. describe amplification of DNA probe signals: A ChristmasTr
ee Approach in Bio / Techno
logy (1988) 6: 1165-1168.
【0014】標的配列に架橋することができるプローブ
を用いる核酸ハイブリダイゼーション測定法は、米国特
許第4,599,303号に記載されている。この方法
は、2官能性架橋分子が共有結合的に取り込まれている
特異的リボ核酸またはデオキシリボ核酸分子の調製を含
む。この取り込みは、架橋分子が、共有架橋結合を形成
するようなプローブの標的である、細菌性、ウイルス性
または哺乳動物性染色体の核酸と第2の反応をする能力
を保持するようなものである。架橋の後、非架橋プロー
ブは、単一鎖プローブと2本鎖の共有架橋結合したプロ
ーブ−標的複合体を区別する方法の1つを用いて、共有
架橋結合プローブー標的複合体から分離される。A nucleic acid hybridization assay using a probe capable of cross-linking the target sequence is described in US Pat. No. 4,599,303. This method involves the preparation of specific ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid molecules in which a bifunctional cross-linking molecule has been covalently incorporated. This incorporation is such that the cross-linking molecule retains the ability to undergo a second reaction with nucleic acid of a bacterial, viral or mammalian chromosome that is the target of the probe to form a covalent cross-link. . After cross-linking, the non-cross-linked probe is separated from the covalent cross-linked probe-target complex using one of the methods that distinguishes single-stranded probes from double-stranded covalent cross-linked probe-target complexes.
【0015】ハイブリダイゼーション法と核酸配列を検
出するためのプローブは、米国特許第4,908,30
7号に記載されている。増幅したハイブリダイゼーショ
ン法は米国特第4,882,269号に記載されてお
り、ここでは目的の標的配列にハイブリダイズする第1
のプライマーに、1群のシグナルを産生する第2のプロ
ーブが結合する。Hybridization methods and probes for detecting nucleic acid sequences are described in US Pat. No. 4,908,30.
No. 7. The amplified hybridization method is described in US Pat. No. 4,882,269, in which a first hybridizing target sequence of interest is used.
A second probe that produces a group of signals binds to the primer.
【0016】遺伝的に異常な疾患の診断のための診断用
および隣接プローブを用いるハイブリダイゼーションに
よる核酸の標的配列の検出法(特に自動化法)は、ヨー
ロッパ、特許出願第0185494A2号に記載されて
いる。この方法では、試料を標的配列の診断部分に相補
的なプローブ(診断プローブ)とハイブリダイズし、診
断プローブが標的配列を含有する試料核酸にのみ実質的
に結合している条件下で、診断部分に隣接するヌクレオ
チド配列に相補的なプローブ(隣接プローブ)をハイブ
リダイズさせる。次に診断プローブと隣接プローブを共
有結合させて、標的配列に相補的な標的プローブを作成
し、結合しないプローブを除去する。好適な方法では、
プローブの1つを標識して、試料核酸標的プローブの2
本鎖を溶解して、解離した標的プローブを溶出し、そし
て標識物を試験することにより、標的配列の存在の有無
を調べることができる。A method for the detection of target sequences of nucleic acids by hybridization with diagnostic and flanking probes for the diagnosis of genetically abnormal diseases (in particular an automated method) is described in European patent application 0185494A2. . In this method, the sample is hybridized with a probe (diagnostic probe) complementary to the diagnostic part of the target sequence, and the diagnostic part is substantially bound only to the sample nucleic acid containing the target sequence. A probe (adjacent probe) complementary to the nucleotide sequence adjacent to is hybridized. The diagnostic probe and the adjacent probe are then covalently linked to create a target probe that is complementary to the target sequence and the unbound probe is removed. In the preferred method,
One of the probes is labeled with 2 of the sample nucleic acid target probes.
The presence or absence of the target sequence can be determined by lysing the single strands, eluting the dissociated target probe, and testing the label.
【0017】上記方法は少なくとも隣接配列が必要であ
るという点で欠点が存在する。この方法を実施するため
には、診断配列と隣接配列を同定し、これらの配列に相
補的な診断プローブと隣接プローブを作成しなければな
らない。診断配列と隣接配列が正確に同定されないと、
診断プローブと隣接プローブは充分にハイブリダイズせ
ず、測定の特異性と感度が失われるかまたは実質的に低
下する。The above method has a drawback in that at least flanking sequences are required. To perform this method, diagnostic and flanking sequences must be identified and diagnostic and flanking probes complementary to these sequences must be made. If the diagnostic and flanking sequences are not accurately identified,
The diagnostic probe and the adjacent probe do not hybridize well and the specificity and sensitivity of the assay is lost or substantially reduced.
【0018】DNA増幅と消去法はW089/1269
5号に記載されている。この方法は、2つの断片混合物
の1つにユニークな、ゲノムまたはRNA由来2本鎖断
片の単離を用いる。陽性ソースと陰性ソース混合物中の
断片は別々の末端リンカーが結合しており、各混合物
は、結合したリンカーに相同性の単一鎖プライマーを用
いて、プライム鎖の連続的複製により増幅される。第2
のソースリンカーはビオチン化され、この混合物中の断
片は、陽性ソース混合物中の断片にモル過剰でハイブリ
ダイズされる。ビオチン化した種と反応しない種(すな
わち陽性ソース混合物にユニークな種)は、アフィニテ
ィクロマトグラフィーによりハイブリダイズした種を除
去した後単離される。またリンカー/プライマーの繰り
返し複製によりDNA断片の混合物を増幅する方法も開
示されている。The DNA amplification and elimination method is W089 / 1269
No. 5 is described. This method uses the isolation of genomic or RNA derived double stranded fragments that are unique to one of the two fragment mixtures. Fragments in the positive and negative source mixtures have separate terminal linkers attached, and each mixture is amplified by continuous replication of the prime strand using a single-stranded primer homologous to the attached linkers. Second
Of the source linkers are biotinylated and the fragments in this mixture are hybridized in molar excess to the fragments in the positive source mixture. Species that do not react with biotinylated species (ie, species unique to the positive source mixture) are isolated after removal of hybridized species by affinity chromatography. Also disclosed is a method of amplifying a mixture of DNA fragments by repeated replication of linkers / primers.
【0019】米国特許第07/299,282号および
07/399,795号(それぞれ1989年1月19
日および1989年8月29日に出願)(ヨーロッパ特
許379369号も参照)は、単一のポリヌクレオチド
プライマーを用いる核酸増幅を記載している。米国特許
出願第07/555,323号(1990年7月19日
出願)(ヨーロッパ特許469755号も参照)は、単
一プライマー増幅に使用するポリヌクレオチドを産生す
る方法を開示している。これらの出願の開示は参考のた
め本発明中に引用されている。US Pat. Nos. 07 / 299,282 and 07 / 399,795 (January 19, 1989, respectively)
, And filed Aug. 29, 1989) (see also European Patent 379369) describe nucleic acid amplification using a single polynucleotide primer. US patent application Ser. No. 07 / 555,323 (filed Jul. 19, 1990) (see also EP 469755) discloses a method of producing a polynucleotide for use in single primer amplification. The disclosures of these applications are incorporated herein by reference.
【0020】ホスホロチオエート化学に基づくDNAお
よびRNA配列測定は、ギッシュ(G.Gish)ら、
Science(1988)240:1520−152
2により記載されている。チオヌクレオチドを含有する
プローブを用いて核酸を検出するハイブリダイゼーショ
ン法は、米国特許第4,647,529号に記載されて
いる。ミスマッチのある3’末端を有するプライマーを
用いるPCRに基づく部位指令突然変異誘発は、ナサル
(M.Nassal)ら、Nucleic Acids
Research(1990)18(10):307
7−3078に記載されている。サルカー(G.Sar
kar)ら(Analytical Biochemi
stry(1990)186:64−68)は、特異的
アレレのポリメラーゼチェイン反応による増幅の性状解
析を開示している。鎌状赤血球貧血の診断のためのB−
グロビンゲノムDNAのアレレ特異的酵素的増幅は、ウ
ー(Wu)ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA(1989)86:2757−2760に記
載されている。点突然変異の検出のための酵素的に増幅
されたDNAの修飾は、ハリアソス(Haliasso
s)ら、Nucleic Acids Researc
h(1989)17:3606に記載されている。クウ
ォク(s.kwok)らはポリメラーゼチェイン反応に
対するプライマー−鋳型ミスマッチの効果について記載
している:Nucleic AcidsResearc
h(1990) :999−1005中のヒト免疫不
全症ウイルス1型モデル研究。アレレ特異的DNAイン
ビトロ増幅と配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを
用いるHLA−DPアレレのタイピングと単一塩基ミス
マッチの検出の技術的側面は、、フガー(L.Fugg
er)ら、J.Immunol.Methods(19
90)129:175−185に記載されている。オッ
ト(J.Ott)らはBiochemistry(19
87)26:8237−8241に、DNAポリメラー
ゼIによる減成に対するオリゴヌクレオチドプライマー
の保護を記載している。2つのDNA14量体のホスホ
ロチオエート、メチルホスホネートおよびRNA類似体
の2本鎖安定性は、キブラー−ヘルゾーグ(Kible
r−Herzok)ら、Nubleic Acids
Research(1991)19(No.11):2
979−2981に開示されている。ヘルペスシンプレ
ックス2型誘導DNAポリメラーゼに対するホスホロチ
オエートホモーオリゴデオキシヌクレオチドの効果は、
ガオ(Gao)ら、J.Biuol.Chem.(19
89)262(No.19):11521−11526
に記載されており、かれらはイオウ含有オリゴヌクレオ
チドによる、HSV誘導DNAポリメラーゼとある種の
ヒトDNAポリメラーゼの阻害を観察した。グリープ
(Griep)ら、Biochemistry(199
0)29:9006−9014は、鋳型−プライマー類
似体によるDNAポリメラーゼIIIホロ酵素の3’か
ら5’へのエキソヌクレアーゼ活性の低下を開示してい
る。DNA and RNA sequence determinations based on phosphorothioate chemistry are described by G. Gish et al.
Science (1988) 240: 1520-152.
2. Hybridization methods for detecting nucleic acids using probes containing thionucleotides are described in US Pat. No. 4,647,529. PCR-based site-directed mutagenesis using primers with mismatched 3'ends is described by M. Nassal et al., Nucleic Acids.
Research (1990) 18 (10): 307
7-3078. G. Sar
kar) et al. (Analytical Biochemi
(Stry (1990) 186: 64-68) discloses characterization of amplification of specific alleles by the polymerase chain reaction. B- for the diagnosis of sickle cell anemia
Allele-specific enzymatic amplification of globin genomic DNA is described in Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA (1989) 86: 2757-2760. Modification of enzymatically amplified DNA for the detection of point mutations is described in Haliasso.
s) et al., Nucleic Acids Research
h (1989) 17: 3606. Kwok et al. Describe the effect of primer-template mismatch on the polymerase chain reaction: Nucleic Acids Research.
h (1990) : Human Immunodeficiency Virus Type 1 Model Study in 999-1005. The technical aspects of HLA-DP allele typing and single-base mismatch detection using allele-specific DNA in vitro amplification and sequence-specific oligonucleotide probes are described in Fuger (L. Fugg).
er) et al., J. Immunol. Methods (19
90) 129: 175-185. J. Ott et al., Biochemistry (19
87) 26: 8237-8241 describes the protection of oligonucleotide primers against degradation by DNA polymerase I. The double-stranded stability of the phosphorothioate, methylphosphonate, and RNA analogs of the two DNA 14-mers is due to the Kibler-Herzog (Kible
r-Herzok) et al., Nucleic Acids
Research (1991) 19 (No. 11): 2
979-2981. The effect of phosphorothioate homo-oligodeoxynucleotides on herpes simplex type 2 inducible DNA polymerase was
Gao et al., J. Biol. Chem. (19
89) 262 (No. 19): 11521-11526.
And they observed inhibition of HSV-inducible DNA polymerase and certain human DNA polymerases by sulfur-containing oligonucleotides. Griep et al., Biochemistry (199)
0) 29: 9006-9014 disclose reduction of 3'to 5'exonuclease activity of DNA polymerase III holoenzyme by template-primer analogs.
【0021】ホスホロアミダイト(phosphora
midite)化学を介するホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド合成の試薬としてのテトラエチルチウラム
ジスルフィド(tetraethylthiuram
disulfide)(TETD)の使用は、アプライ
ドバイオシルテムズ(Applied Biosyst
ems)によるいくつかの宣伝文献、すなわち1)研究
ニュース、「DNA合成テトラエチルチウラムジスルフ
ィド:アンチセンスホスホロチオエートDNAの新しい
試薬」(Research News,”DNA Sy
nthesisTetraethylthiuram
Disulfide:A New Reagent f
or Antisense Phosphorothi
oate DNA”)、2)ユーザーブルティン58
号、1991年2月号、モデル380A,380B,3
81A,391,392,394 DNA合成機(Sy
nthesizers)および3)TETD/アセトニ
トリルの宣伝ノート、第401147号”TETD:A
ntisense Phosphorothioate
Synthesis Made Easy”に記載さ
れている。Phosphoramidite
Tetraethyl thiuram disulfide as a reagent for phosphorothioate oligonucleotide synthesis via midite chemistry
The use of disulfide (TETD) is based on Applied Biosystems (Applied Biosystems).
Ems) has published several publications: 1) Research News, "DNA Synthesis Tetraethylthiuram Disulfide: A New Reagent for Antisense Phosphorothioate DNA" (Research News, "DNA Sy").
nthesis Tetraethylthiouram
Disulfide: A New Reagent f
or Antisense Phosphorothi
oate DNA ”), 2) User Bulletin 58
Issue, February 1991, Models 380A, 380B, 3
81A, 391, 392, 394 DNA synthesizer (Sy
nthesizes) and 3) TETD / acetonitrile propaganda note, No. 401147 "TETD: A.
sissense Phosphorothioate
Synthesis Made Easy ".
【0022】核酸配列の増幅、検出および/またはクロ
ーニング法は、米国特許第4,683,195号、4,
683,202号、4,800,159号、4,96
5,188号および5,008,182号に記載されて
いる。ポリメラーゼチェイン反応による配列重合体法は
サイキ(Saiki)ら、(1986)Scienc
e,230:1350−1354に記載されている。熱
安定性DNAポリメラーゼを用いるDNAのプライマー
指令酵素的増幅は、サイキ(Saiki)ら、Scie
nce(1988)239:487に記載されてい
る。。Amplification, detection and / or cloning methods for nucleic acid sequences are described in US Pat. No. 4,683,195, 4,
683,202, 4,800,159, 4,96
5,188 and 5,008,182. The sequence polymer method by the polymerase chain reaction is described by Saiki et al. (1986) Science.
e, 230: 1350-1354. Primer-directed enzymatic amplification of DNA using a thermostable DNA polymerase is described in Saiki et al., Scie.
nce (1988) 239: 487. .
【0023】プライマーとしてランダム配列のオリゴヌ
クレオチドを用いる核酸配列の増幅は、米国特許第5,
043,272号に記載されている。PCR増幅におけ
るホスホロチオエートプライマーの使用は、発行された
ばかりのNuclleicAcid Researc
h,Vol.20,No.14,3551−3554,
1992に記載されている。Amplification of nucleic acid sequences using random sequence oligonucleotides as primers is described in US Pat.
043,272. The use of phosphorothioate primers in PCR amplification has been used in the freshly published Nucleic Acid Research.
h, Vol. 20, No. 14,3551-3554,
1992.
【0024】[0024]
【発明の要約】本発明の1つの実施態様において、延長
プローブと単一鎖標的ポリヌクレオチド配列から、非修
飾延長プローブを含まず、上記標的ポリヌクレオチド配
列と同一の配列がその3’末端において、上記単一鎖標
的ポリヌクレオチド配列の5’末端におけるポリヌクレ
オチド配列と相補性のポリヌクレオチド配列に結合し
た、単一鎖ポリヌクレオチド配列を作成する方法が提供
される。この方法は、(a)単一鎖標的ポリヌクレオチ
ド配列の3’末端に、標的ポリヌクレオチド配列の5’
末端における配列S2と実質的に同一な配列を含有する
延長プローブの3’末端をハイブリダイズさせ、(b)
この延長プローブを単一鎖標的ポリヌクレオチド配列に
沿って延長させ、(c)単一鎖標的ポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズしない延長プローブの3’末端を修
飾し、(d)3’末端に配列S2を有するプライマー
を、延長された延長プローブの3’末端にハイブリダイ
ズさせ、(e)このプライマーを上記延長された延長プ
ローブに沿って延長させることよりなる。SUMMARY OF THE INVENTION In one embodiment of the present invention, an extension probe and a single-stranded target polynucleotide sequence are the same as the above target polynucleotide sequence without an unmodified extension probe at its 3'end, Provided is a method of making a single-stranded polynucleotide sequence linked to a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence at the 5'end of the single-stranded target polynucleotide sequence. This method comprises the steps of (a) adding the 5'of the target polynucleotide sequence to the 3'end of the single-stranded target polynucleotide sequence.
Hybridizing the 3'end of an extender probe containing a sequence substantially identical to sequence S2 at the end, (b)
This extension probe is extended along the single-stranded target polynucleotide sequence, (c) the 3'end of the extension probe that does not hybridize to the single-stranded target polynucleotide sequence is modified, and (d) the sequence S2 is added to the 3'end. Comprising hybridizing a primer having a to the 3'end of the extended extension probe, and (e) extending this primer along the extended extension probe.
【0025】ここに開示した本発明は、延長に関与しな
い延長プローブはその3’末端で修飾される延長プロー
ブを延長して、互いに隣接せず相補的な2つのセグメン
トを有する単一鎖ポリデオキシヌクレオチドを作成する
ための方法と試薬を含む。この方法は、例えば単一プラ
イマー増幅測定法に応用される。The present invention disclosed herein is a single-chain polydeoxy which has two segments which are not adjacent to each other and which are not adjacent to each other and extend the extension probe modified at its 3'end. It includes methods and reagents for making nucleotides. This method is applied to, for example, a single primer amplification measurement method.
【0026】木発明の1つの実施態様において、隣接し
ない互いに相補性の2個のセグメントを有する単一鎖ポ
リデオキシヌクレオチドを作成するために、延長プロー
ブが延長される。この産生方法は、(a)2個の隣接し
ない非相補性ヌクレオチド配列S1およびS2を有し、
S2はS1の5’で少なくとも10ヌクレオチド長であ
るポリヌクレオチド、(b)2個のデオキシヌクレオチ
ド配列からなる延長プローブであり、その延長プローブ
の3’末端における配列(EP1)はS1とハイブリダ
イズ可能で、他方のデオキシヌクレオチド配列(EP
2)はS2と実質的に同一である延長プローブ、および
(c)ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない延長プ
ローブの3’末端を修飾する手段、および(d)延長プ
ローブをポリヌクレオチドに沿って延長する(この場合
ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない延長プローブ
はその3’末端で修飾される)工程を組合せで提供する
工程よりなる。In one embodiment of the tree invention, the extension probe is extended to create a single-stranded polydeoxynucleotide having two non-contiguous two complementary segments. This production method has (a) two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2,
S2 is a polynucleotide 5'of S1 at least 10 nucleotides in length, (b) is an extension probe consisting of two deoxynucleotide sequences, and the sequence (EP1) at the 3'end of the extension probe is hybridizable with S1. And the other deoxynucleotide sequence (EP
2) is an extension probe that is substantially identical to S2, and (c) means for modifying the 3'end of the extension probe that does not hybridize to the polynucleotide, and (d) extending the extension probe along the polynucleotide ( In this case the extension probe which does not hybridize to the polynucleotide is modified at its 3'end and comprises a combination of steps.
【0027】本発明の上記実施態様においては、(a)
延長プローブはポリヌクレオチドに沿って延長されて2
本鎖を形成し、(b)ポリヌクレオチドとハイブリダイ
ズしない延長プローブの3’末端は修飾され、(c)延
長された延長プローブは2本鎖から解離され、(d)ポ
リデオキシヌクレオチドプライマーは延長された延長プ
ローブとハイブリダイズしおよび延長された延長プロー
ブに沿って延長されて、延長プライマーを含む第2の2
本鎖を形成し、(e)延長プライマーは第2の2本鎖か
ら解離され、そして(f)このプライマーは延長プライ
マーとハイブリダイズしおよび延長プライマーに沿って
延長されて延長プライマーを含む2本鎖を形成し、そし
て工程(e)と(f)は繰り返される条件下で、S2と
相補的なヌクレオチド配列と少なくとも3’末端でハイ
ブリダイズ可能なポリデオキシヌクレオチドプライマ
ー、DNAポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオシド
3リン酸が組合せで提供される。In the above embodiment of the present invention, (a)
The extension probe is extended along the polynucleotide
The 3'end of the extension probe that forms a double strand and does not hybridize with the polynucleotide (b) is modified, (c) the extended extension probe is dissociated from the double strand, and (d) the polydeoxynucleotide primer is extended. A second 2 which hybridizes with the extended extender and is extended along the extended extender to include the extended primer.
Forming a double strand, (e) the extension primer is dissociated from the second double strand, and (f) the primer hybridizes with the extension primer and is extended along the extension primer to include the extension primer. A polydeoxynucleotide primer, a DNA polymerase, and a deoxynucleoside 3 which form a chain and are hybridizable at least at the 3'end with a nucleotide sequence complementary to S2 under conditions in which steps (e) and (f) are repeated. Phosphoric acid is provided in combination.
【0028】本発明の別の実施態様は、単一鎖標的ポリ
ヌクレオチド配列に相補的な単一鎖ポリヌクレオチド配
列を作成するための方法である。この方法は、(a)媒
体中で単一鎖標的ポリヌクレオチド配列、3’−エキソ
ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ活性、お
よび単一鎖標的ポリヌクレオチド配列の3’末端の配列
に相補性の配列よりなる延長プローブを組合せ(ここで
相補性延長プローブは少なくとも1つのチオホスフェー
トを含有し延長プローブの3’末端で停止しない)、そ
して(b)上記媒体を処理して、上記延長プローブを上
記単一鎖標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、
上記延長プローブを上記単一鎖標的ポリヌクレオチド配
列に沿って延長し、延長プローブの3’末端を減成する
ことよりなる。Another embodiment of the invention is a method for making a single-stranded polynucleotide sequence complementary to a single-stranded target polynucleotide sequence. This method comprises (a) a single-stranded target polynucleotide sequence in a medium, a DNA polymerase activity having 3'-exonuclease activity, and a sequence complementary to the 3'-terminal sequence of the single-stranded target polynucleotide sequence. And (b) treating said medium to combine said extension probe with said single probe. Hybridize to the strand target polynucleotide,
Extending the extender probe along the single-stranded target polynucleotide sequence and degrading the 3'end of the extender probe.
【0029】別の実施態様において、標的ポリヌクレオ
チド配列を含むと考えられる媒体中の標的ポリヌクレオ
チド配列の存在が検出される。この標的ポリヌクレオチ
ド配列は2個の隣接しないハイブリダイズが不可能なヌ
クレオチド配列、S1とS2(ここでS2はS1の5’
であり少なくとも10ヌクレオチド長である)を有す
る。この方法は、(a)(1)媒体、(2)延長プロー
ブの3’末端の配列(EP1)はS1とハイブリダイズ
可能であり、別のデオキシヌクレオチド配列(EP2)
は実質的にS2と同一である2個のデオキシヌクレオチ
ド配列を有する延長プローブ、(3)標的ポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズしない延長プローブの3’末
端を修飾する手段、(4)プライマーが原位置で産生さ
れるという条件でS2に相補性のヌクレオチド配列とハ
イブリダイズ可能なポリヌクレオチドプライマー、
(5)DNAポリメラーゼおよび(6)デオキシヌクレ
オシド3リン酸を、同時にまたは全部または一部を連続
して組合せで、(A)延長プローブは、標的ポリヌクレ
オチド配列とハイブリダイズしかつ上記標的ポリヌクレ
オチド配列に沿って延長されて(延長されたEP)2本
鎖を形成し、(B)標的ヌクレオチド配列にハイブリダ
イズしない延長プローブはそのさ3’末端で修飾され、
(C)延長されたEPは上記2本鎖から解離され、
(D)プライマーは上記延長された延長プローブとハイ
ブリダイズしかつそれに沿って延長されて延長プライマ
ーよりなる第2の2本鎖を形成し、(E)延長プライマ
ーは2本鎖から解離され、そして(F)プライマーは延
長プライマーとハイブリダイズしかつそれに沿って延長
されて延長プライマーよりなる2本鎖を形成し、工程
(E)と(F)は繰り返される条件下で提供し、そして
(b)延長プライマーの存在を調べる工程よりなる。In another embodiment, the presence of the target polynucleotide sequence in the medium suspected of containing the target polynucleotide sequence is detected. This target polynucleotide sequence consists of two non-adjacent non-hybridizable nucleotide sequences, S1 and S2, where S2 is the 5'of S1.
And is at least 10 nucleotides in length). In this method, (a) (1) medium, (2) the 3′-end sequence (EP1) of the extension probe is hybridizable with S1, and another deoxynucleotide sequence (EP2) is used.
Is an extension probe having two deoxynucleotide sequences that are substantially identical to S2, (3) means for modifying the 3'end of the extension probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence, and (4) the primer in situ. A polynucleotide primer capable of hybridizing to a nucleotide sequence complementary to S2 on condition that it is produced,
(5) DNA polymerase and (6) a combination of deoxynucleoside triphosphates simultaneously or in whole or in part in succession, the (A) extension probe hybridizes to the target polynucleotide sequence and the target polynucleotide sequence. An extension probe that is extended along with (extended EP) to form a duplex and (B) does not hybridize to the target nucleotide sequence is modified at its 3'end,
(C) The extended EP is dissociated from the above double strand,
(D) the primer hybridizes to and extends along the extended probe to form a second double strand consisting of the extended primer, (E) the extended primer is dissociated from the double strand, and (F) the primer hybridizes to and extends along the extension primer to form a duplex consisting of the extension primer, steps (E) and (F) providing under repeated conditions, and (b) It consists of checking for the presence of the extension primer.
【0030】本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチ
ドを含むと考えられる試料中のポリヌクレオチドの存在
を検出するための方法に関する。この方法は、(a)試
料を含む媒体を処理して(もし存在する場合には)その
ポリヌクレオチドから、2つの隣接しない非相補性のヌ
クレオチド配列S1とS2(ここでS2はS1の5’で
あり、少なくとも10ヌクレオチド長である)を有する
単一鎖標的ポリヌクレオチド配列を形成させ、(b)上
記媒体に(1)延長プローブの3’末端の配列(EP
1)はS1とハイブリダイズ可能で、他のデオキシヌク
レオチド配列(EP2)は実質的にS2と同一である、
2つのデオキシヌクレオチド配列を有する延長プロー
ブ、(2)EP1とハイブリダイズ可能な部分を有する
ヌクレオチド配列(NS)であって、上記延長プローブ
の別の分子または部分であるNS、(3)ポリデオキシ
ヌクレオチドプライマーを形成するための延長プローブ
を減成する手段がない場合、S2に相補性のヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズすることができるポリデオキシ
ヌクレオチドプライマー、(4)デオキシヌクレオシド
3リン酸、(5)およびDNA鋳型依存性ポリデオキシ
ヌクレオチドポリメラーゼを、(A)延長プローブは、
標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、および
標的ポリヌクレオチド配列に沿って延長され(延長され
た延長プローブ)て2本鎖を形成し、(B)標的ポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズしない延長プローブは
NSに沿って延長され、(C)延長された延長プローブ
は上記2本鎖から解離され、(D)上記プライマーは延
長された延長プローブとハイブリダイズしかつそれに沿
って延長されて、延長プライマーよりなる2本鎖を形成
し、(E)延長プライマーは2本鎖から解離され、そし
て(F)プライマーは延長プライマーとハイブリダイズ
しかつそれに沿って延長されて延長プライマーよりなる
2本鎖を形成し、工程(E)と(F)は繰り返される条
件下で(ここで工程(a)と(b)は同時にまたは全体
にまたは部分的に速続的に行われる)、組合せて、そし
て(c)延長プライマーの存在を調べる工程よりなる方
法。Another embodiment of the invention relates to a method for detecting the presence of a polynucleotide in a sample suspected of containing the polynucleotide. This method involves (a) treating a medium containing a sample from the polynucleotide (if present) of two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2, where S2 is the 5'of S1. And is at least 10 nucleotides in length), and (b) in the medium (1) at the 3'end of the extension probe (EP).
1) is hybridizable with S1 and the other deoxynucleotide sequence (EP2) is substantially identical to S2,
An extension probe having two deoxynucleotide sequences, (2) a nucleotide sequence (NS) having a portion capable of hybridizing with EP1, which is another molecule or portion of the extension probe, (3) polydeoxynucleotide A polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to a nucleotide sequence complementary to S2, (4) deoxynucleoside triphosphate, (5) and DNA if there is no means to degrade the extended probe to form the primer Template-dependent polydeoxynucleotide polymerase (A) extension probe
An extension probe that hybridizes to the target polynucleotide sequence and is extended along the target polynucleotide sequence (extended extension probe) to form a double strand and (B) does not hybridize to the target polynucleotide sequence is NS. And (C) the extended extension probe is dissociated from the double strand, and (D) the primer hybridizes with and is extended along with the extended extension probe to comprise the extended primer. Forming a double strand, (E) the extension primer is dissociated from the double strand, and (F) the primer hybridizes with and is extended along to form a double strand consisting of the extension primer, the steps of: (E) and (F) under repeated conditions (wherein steps (a) and (b) are carried out simultaneously or in whole or in part) The connection effected), in combination, and (c) a method comprising the step of determining the presence of the extension primer.
【0031】本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチ
ドを含むと考えられる試料中のポリヌクレオチドの存在
を検出するための方法に関する。この方法は、(a)試
料を含む媒体を処理して(もし存在する場合には)その
ポリヌクレオチドから、2つの隣接しない非相補性のヌ
クレオチド配列S1とS2(ここでS2はS1の5’で
あり、少なくとも10ヌクレオチド長である)を有する
単一鎖標的ポリヌクレオチド配列を形成させ、(b)上
記媒体に(1)延長プローブの3’末端の配列(EP
1)はS1とハイブリダイズ可能で、他のデオキシヌク
レオチド配列(EP2)は実質的にS2と同一である、
2つのデオキシヌクレオチド配列を有する延長プロー
ブ、(2)単一鎖ポリヌクレオチドを減成することがで
きる酵素、(3)ポリデオキシヌクレオチドプライマー
を形成するための延長プローブを減成する手段がない場
合、S2に相補性のヌクレオチド配列とハイブリダイズ
することができるポリデオキシヌクレオチドプライマ
ー、(4)デオキシヌクレオシド3リン酸、(5)およ
びDNA鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチドポリメラ
ーゼを、(A)延長プローブは、標的ポリヌクレオチド
配列とハイブリダイズし、および標的ポリヌクレオチド
配列に沿って延長されて2本鎖を形成し、(B)標的ポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイズしない延長プロー
ブは減成され、(C)延長された延長プローブは上記2
本鎖から解離され、(D)上記プライマーは延長された
延長プローブとハイブリダイズしかつそれに沿って延長
され、(E)延長プライマーは2本鎖から解離され、そ
して(F)プライマーは延長プライマーとハイブリダイ
ズしかつそれに沿って延長されて延長プライマーよりな
る2本鎖を形成し、工程(E)と(F)は繰り返される
条件下で(ここで工程(a)と(b)は同時にまたは全
体にまたは部分的に連続的に行われる)、組合せて、そ
して(c)延長プライマーの存在を調べる工程よりなる
方法。Another embodiment of the present invention relates to a method for detecting the presence of a polynucleotide in a sample suspected of containing the polynucleotide. This method involves (a) treating a medium containing a sample from the polynucleotide (if present) of two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2, where S2 is the 5'of S1. And is at least 10 nucleotides in length), and (b) in the medium (1) at the 3'end of the extension probe (EP).
1) is hybridizable with S1 and the other deoxynucleotide sequence (EP2) is substantially identical to S2,
An extension probe having two deoxynucleotide sequences, (2) an enzyme capable of degrading a single-stranded polynucleotide, (3) no means for degrading the extension probe to form a polydeoxynucleotide primer, A polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing with a nucleotide sequence complementary to S2, (4) deoxynucleoside triphosphate, (5) and a DNA template-dependent polydeoxynucleotide polymerase (A) an extension probe targeting An extension probe that hybridizes to the polynucleotide sequence and extends along the target polynucleotide sequence to form a duplex, (B) an extension probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence is degraded and (C) extended. The extension probe is 2 above.
Dissociated from the double strand, (D) the primer hybridizes with and is extended along with the extended extension probe, (E) the extended primer is dissociated from the double strand, and (F) the primer is extended primer. Hybridizes and is extended along it to form a double strand consisting of an extension primer, wherein steps (E) and (F) are repeated under repeated conditions (steps (a) and (b) being performed simultaneously or in whole). Or partially sequentially), in combination, and (c) determining the presence of the extension primer.
【0032】本発明はさらに、(a)標的ポリヌクレオ
チド配列中の最初の配列とハイブリダイズ可能な配列
(EP1)をその3’末端に有し、標的ポリヌクレオチ
ド配列の第2の配列と実質的に同一の配列(EP2)を
有するポリデオキシヌクレオチド延長プローブ(ここで
標的ポリヌクレオチド配列中の第2の配列は最初の配列
の5’であり最初の配列とは隣接していない)、(b)
標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズしない延長
プローブの3’末端を修飾する手段、および(c)第2
の配列に相補性の配列にハイブリダイズ可能なポリデオ
キシヌクレオチドプライマーを、パッケージされた組合
せで含むことよりなるキットを包含する。The present invention further comprises (a) a sequence (EP1) at its 3'end which is hybridizable with the first sequence in the target polynucleotide sequence and is substantially the same as the second sequence of the target polynucleotide sequence. A polydeoxynucleotide extender probe having the sequence (EP2) identical to (wherein the second sequence in the target polynucleotide sequence is 5'of the first sequence and is not adjacent to the first sequence), (b)
Means for modifying the 3'end of the extender probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence, and (c) a second
And a polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to a sequence complementary to the sequence of SEQ.
【0033】図1−8は本発明の異なる実施態様の略図
である。1-8 are schematic diagrams of different embodiments of the present invention.
【0034】[0034]
【具体的な実施態様の説明】本発明は、1本鎖(ss)
標的ポリヌクレオチド配列に沿って延長プローブを延長
して、分子内塩基対合構造を形成する能力を有する1本
鎖ポリヌクレオチドの産生を可能にする(ここで1本鎖
ポリヌクレオチドの産生に関与しない延長プローブの
3’末端は修飾される)。こうして1本鎖ポリヌクレオ
チドは分子内塩基対合構造、すなわち隣接しない互いに
相補性の2つのセグメント(逆方向反復(invert
ed repeat)と呼ばれることもある)を有する
ことができる。この方法は上記の単一鎖プライマーの増
幅の分野で特に応用され、ここでは試料中の標的ポリヌ
クレオチド配列が逆方向反復を有するかまたはこのよう
な構造に変換することができる場合、この標的ポリヌク
レオチド配列は増幅される。本発明は、必要な試薬や工
程の数は最小にして、目的のポリヌクレオチド配列を、
分子内塩基対合構造を有する標的ポリヌクレオチド配列
に変換するための極めて便利な方法を与える。DESCRIPTION OF SPECIFIC EMBODIMENTS The present invention relates to single-stranded (ss)
Extending an extender probe along the target polynucleotide sequence to allow production of a single-stranded polynucleotide with the ability to form an intramolecular base-paired structure (where it is not involved in the production of the single-stranded polynucleotide) The 3'end of the extension probe is modified). Thus, a single-stranded polynucleotide has an intramolecular base-pairing structure, ie two non-adjacent mutually complementary segments (inverted repeats (invert repeats)).
ed repeat). This method has particular application in the field of amplification of single-stranded primers as described above, where the target polynucleotide sequence in the sample has inverted repeats or can be converted to such a structure, if the target polynucleotide sequence is The nucleotide sequence is amplified. The present invention minimizes the number of reagents and steps required,
It provides an extremely convenient method for converting to a target polynucleotide sequence having an intramolecular base pairing structure.
【0035】本発明は広い意味において、延長プローブ
から形成される逆方向反復を有する標的ポリヌクレオチ
ド配列の産生を与える(ここで標的ポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズしないすべての延長プローブは3’
末端で修飾され、従って新たに形成された単一鎖ポリヌ
クレオチドを含有する媒体中で非修飾型で存在しな
い)。標的ポリヌクレオチド配列は媒体中で延長プロー
ブと組合せされ、この延長プローブは(1)標的ポリヌ
クレオチド配列内の標的ポリヌクレオチド配列の3’末
端の第1の配列に相補性の延長プローブの3’末端の配
列、および(2)標的ポリヌクレオチド配列の第2の配
列に実質的に同一の延長プローブの第2の配列よりな
り、ここで上記第2の各配列は第1の配列の5’であ
る。媒体を処理して延長プローブを標的ポリヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズさせ、標的ポリヌクレオチド配
列に沿って延長プローブは延長され、標的ポリヌクレオ
チド配列にハイブリダイズしない延長プローブの3’末
端を減成させる。The present invention, in a broad sense, provides for the production of a target polynucleotide sequence having inverted repeats formed from the extension probe, where all extension probes that do not hybridize to the target polynucleotide sequence are 3 '.
Modified at the ends and thus not present in unmodified form in the medium containing the newly formed single-stranded polynucleotide). The target polynucleotide sequence is combined with an extender probe in the medium, wherein the extender probe is (1) the 3'end of the extender probe complementary to the first sequence at the 3'end of the target polynucleotide sequence within the target polynucleotide sequence. And (2) a second sequence of an extension probe that is substantially identical to the second sequence of the target polynucleotide sequence, wherein each second sequence is 5'of the first sequence. . The medium is treated to hybridize the extender probe to the target polynucleotide sequence, the extender probe is extended along the target polynucleotide sequence, degrading the 3'end of the extender probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence.
【0036】本発明の具体的な実施態様をさらに説明す
る前に、いくつかの用語を定義する。Before further describing the specific embodiments of the present invention, some terms are defined.
【0037】ポリヌクレオチド−−ポリマーヌクレオチ
ドである、測定されるべき化合物または組成物であり、
これはインタクトの天然の状態では約20から500,
000個またはそれ以上のヌクレオチドを有することが
でき、単離された状態では約30から50,000個ま
たはそれ以上のヌクレオチドを有することができ、通常
は約100から20,000個、さらに頻繁には500
から10,000個のヌクレオチドを有する。従って天
然の状態のものから単離すると、断片化が起きることは
明らかである。ポリヌクレオチドは任意のソースからの
精製されたまたは精製されていない型の核酸を含み、D
NA(dsDNAやssDNA)やRNA(t−RN
A、m−RNA、r−RNAを含む)、ミトコンドリア
DNAとRNA、葉緑体DNAとRNA、DNA−RN
Aハイブリッド、またはこれらの混合物、染色体、プラ
スミッド、生体材料(例えば細菌、酵母、ウイルス、ウ
イロイド、糸状菌、心筋、植物、動物、ヒトなどの微生
物)のゲノム、およびこれらの断片などを含む。ポリヌ
クレオチドは生物試料のような複雑な混合物のほんのわ
ずかの部分である。これは当業者に公知の方法により種
々の生物試料から得られる。このような生物試料の例を
表1に示すが、これは例示のためであり決して本発明を
限定するものではない。Polynucleotide--a compound or composition to be measured, which is a polymeric nucleotide,
This is about 20 to 500 in the intact natural state,
Can have 000 or more nucleotides, can have about 30 to 50,000 or more nucleotides in the isolated state, usually about 100 to 20,000, and more often Is 500
To 10,000 nucleotides. It is therefore clear that fragmentation occurs when isolated from its native state. A polynucleotide comprises a purified or unpurified form of nucleic acid from any source,
NA (dsDNA and ssDNA) and RNA (t-RN
A, m-RNA and r-RNA), mitochondrial DNA and RNA, chloroplast DNA and RNA, DNA-RN
A hybrid, or a mixture thereof, a chromosome, a plasmid, a genome of a biomaterial (for example, a bacterium such as a bacterium, a yeast, a virus, a viroid, a filamentous fungus, a heart muscle, a plant, an animal, or a human), a fragment thereof, or the like. Polynucleotides are only a small part of a complex mixture such as a biological sample. It is obtained from various biological samples by methods known to those skilled in the art. An example of such a biological sample is shown in Table 1 and is for illustration only and in no way limits the invention.
【0038】[0038]
【表1】 [Table 1]
【表2】 [Table 2]
【表3】 [Table 3]
【表4】 [Table 4]
【表5】 [Table 5]
【0039】ポリヌクレオチドは例えば剪断力、または
エンドヌクレアーゼまたは他の部位特異的化学的切断法
により処理され切断され、標的ポリヌクレオチド配列を
含有する断片が得られる。しかしポリヌクレオチドはさ
らに切断されることなく単離された状態で使用されるこ
とができることは本発明の利点である。The polynucleotides are treated and cleaved, eg, by shearing, or endonucleases or other site-specific chemical cleavage methods to yield fragments containing the target polynucleotide sequence. However, it is an advantage of the present invention that the polynucleotide can be used in isolated form without further cleavage.
【0040】本発明の目的において、ポリヌクレオチド
またはポリヌクレオチドから得られた切断された断片
は、少なくとも部分的に変性した鎖または単一鎖、また
は変性した鎖または単一鎖にするために処理される。こ
のような処理は当業者には公知であり、例えば熱処理ま
たはアルカリ処理を含む。例えば2本鎖DNAは90−
100℃で約1から10分間加熱されると変性された物
質を産生する。For the purposes of the present invention, a polynucleotide or a cleaved fragment obtained from a polynucleotide is treated to be at least partially denatured or single-stranded, or denatured or single-stranded. It Such treatments are known to those skilled in the art and include, for example, heat treatment or alkali treatment. For example, double-stranded DNA is 90-
It produces a denatured material when heated at 100 ° C. for about 1 to 10 minutes.
【0041】標的ポリヌクレオチド配列−−同定すべき
ヌクレオチドの配列であり、通常ポリヌクレオチド内に
存在し、その本体は、少なくともこのような標的配列の
一部とハイブリダイズする延長プローブポリデオキシヌ
クレオチドの調製を可能にする程度まで公知であり、こ
れは普通その3’末端の少なくとも10ヌクレオチドセ
グメント、および好ましくは15、しばしば20から5
0ヌクレオチドセグメントであり、これはその5’末端
に実質的に同一である少なくとも10ヌクレオチドセグ
メントを含む。標的ポリヌクレオチド配列は2つの隣接
しない非相補性のヌクレオチド配列(S1とS2)(こ
のうちの1つ(S1)は延長プローブポリデオキシヌク
レオチドとハイブリダイズすることができる部分であ
り、S2はS1の5’である)を有する。標的ポリヌク
レオチド配列は普通約30から5,000またはそれ以
上のヌクレオチドを含み、好ましくは50から1,00
0ヌクレオチド含む。2つの隣接しない非相補性のヌク
レオチド配列(S1とS2)は、好ましくはそれぞれ1
0から100ヌクレオチドを有し、少なくとも10塩
基、好ましくは100、通常200から10,000塩
基により分離される。1つの標的ポリヌクレオチド配列
はしばしばポリヌクレオチドの一部である。標的ポリヌ
クレオチド配列は一般により大きな物質の1画分である
か、または実質的に全分子である。標的ポリヌクレオチ
ド配列中のヌクレオチドの最小の数は、試料中の標的ポ
リヌクレオチド配列の存在が試料中のポリヌクレオチド
の存在の特異的な指標であることが確認されるように選
択される。非常におおまかに言えば、配列の長さは通常
約1.61ogLヌクレオチドより長い(ここでLは試
料の生物ソースのゲノム中の塩基対の数である)。標的
配列中のヌクレオチドの最大数は、普通ポリヌクレオチ
ドの長さとその剪断力による切れ易さ、または単離中の
他の操作および測定のための試料の調製に必要な任意の
方法による切れ易さ、および検出の効率および/または
配列の増幅効率により支配される。Target Polynucleotide Sequence--A sequence of nucleotides to be identified, usually present within a polynucleotide, the body of which is a preparation of an extended probe polydeoxynucleotide which hybridizes to at least a portion of such target sequence. Is known to the extent that it allows at least 10 nucleotide segments at its 3'end, and preferably 15, often 20 to 5
It is a 0 nucleotide segment, which comprises at least a 10 nucleotide segment that is substantially identical at its 5'end. The target polynucleotide sequence comprises two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences (S1 and S2), one of which (S1) is a moiety capable of hybridizing to the extended probe polydeoxynucleotide and S2 is a 5 '). The target polynucleotide sequence usually contains about 30 to 5,000 or more nucleotides, preferably 50 to 1,000.
Contains 0 nucleotides. The two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences (S1 and S2) are preferably each 1
It has 0 to 100 nucleotides and is separated by at least 10 bases, preferably 100, usually 200 to 10,000 bases. One target polynucleotide sequence is often part of a polynucleotide. The target polynucleotide sequence is generally a fraction of a larger substance, or is substantially the entire molecule. The minimum number of nucleotides in the target polynucleotide sequence is selected to ensure that the presence of the target polynucleotide sequence in the sample is a specific indicator of the presence of the polynucleotide in the sample. Very roughly speaking, the length of the sequence is usually greater than about 1.61 og L nucleotides, where L is the number of base pairs in the genome of the biological source of the sample. The maximum number of nucleotides in a target sequence is usually determined by the length of the polynucleotide and its shearability, or by any method required to prepare the sample for other manipulations and measurements during isolation. , And the efficiency of detection and / or the efficiency of amplification of the sequence.
【0042】1本鎖ポリデオキシヌクレオチド配列−−
本発明の結果として形成されるデオキシヌクレオチドの
配列。これは普通、隣接しない互いに相補性の少なくと
も2つのセグメントまたは側面にある配列よりなる。こ
れはまた、1つまたはそれ以上の配列を含有し、その相
補的な鎖に結合している時、リプレッサー、制限酵素な
どのリセプターの特異的結合部位である。第1または第
2のセグメントまたは側面にある配列は、それぞれ単一
鎖ポリヌクレオチド配列の3’末端および5’末端にあ
り、それぞれ少なくとも10、好ましくは少なくとも1
5個のデオキシヌクレオチド、および/またはその誘導
体よりなる。Single-stranded polydeoxynucleotide sequence--
A sequence of deoxynucleotides formed as a result of the present invention. It usually consists of at least two non-adjacent complementary segments or flanking sequences. It is also a specific binding site for a receptor, such as a repressor, restriction enzyme, which when bound to its complementary strand, contains one or more sequences. The first or second segment or flanking sequences are respectively at the 3'and 5'ends of the single stranded polynucleotide sequence and each is at least 10, preferably at least 1
It consists of 5 deoxynucleotides and / or its derivatives.
【0043】単一鎖ポリデオキシヌクレオチド配列は普
通30から10,000デオキシヌクレオチド、好まし
くは100から2,000デオキシヌクレオチド、さら
に好ましくは500から5,000ヌクレオチドを含有
する。単一鎖ポリデオキシヌクレオチド配列が相補的な
鎖とハイブリダイズされる時、各末端は一対の逆方向反
復の一員である。Single-stranded polydeoxynucleotide sequences usually contain 30 to 10,000 deoxynucleotides, preferably 100 to 2,000 deoxynucleotides, more preferably 500 to 5,000 nucleotides. When a single-stranded polydeoxynucleotide sequence is hybridized with complementary strands, each end is a member of a pair of inverted repeats.
【0044】ポリデオキシヌクレオチドプライマー−−
普通は単一鎖である合成デオキシヌクレオチドであり、
配列S2と同一の配列、または標的ポリヌクレオチド配
列の配列S2に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダ
イズ可能である配列をその3’末端に有する、ポリデオ
キシヌクレオチド。普通ポリデオキシヌクレオチドプラ
イマーは、少なくとも90%好ましくは100%の、延
長プローブの第2のヌクレオチド配列EP2と同じ塩基
配列を有する。ポリデオキシヌクレオチドプライマーの
ハイブリダイズ可能な配列中のデオキシヌクレオチドの
数は、ポリデオキシヌクレオチドプライマーをハイブリ
ダイズさせるのに使用される緊縮性(stringen
cy)条件が、過剰の非特異的ハイブリダイゼーション
を防止するようなものでなければならない。通常ポリデ
オキシヌクレオチドプライマー中のデオキシヌクレオチ
ドの数は、少なくとも標的ポリヌクレオチド配列のS2
配列中と同じように大きく、すなわち少なくとも10デ
オキシヌクレオチド、好ましくは少なくとも15デオキ
シヌクレオチドであり、一般に約10から200、好ま
しくは20から50デンキシヌクレオチドである。Polydeoxynucleotide primer--
A synthetic deoxynucleotide, usually a single strand,
A polydeoxynucleotide having a sequence identical to the sequence S2, or a sequence capable of hybridizing with a nucleotide sequence complementary to the sequence S2 of the target polynucleotide sequence, at its 3 ′ end. Usually the polydeoxynucleotide primer has at least 90%, preferably 100%, the same base sequence as the second nucleotide sequence EP2 of the extension probe. The number of deoxynucleotides in the hybridizable sequence of the polydeoxynucleotide primer depends on the stringency used to hybridize the polydeoxynucleotide primer.
The cy) conditions must be such as to prevent excess non-specific hybridization. Usually, the number of deoxynucleotides in the polydeoxynucleotide primer will be at least S2 of the target polynucleotide sequence.
As large as in the sequence, ie at least 10 deoxynucleotides, preferably at least 15 deoxynucleotides, generally about 10 to 200, preferably 20 to 50 deoxynucleotides.
【0045】デオキシヌクレオシド3リン酸−−5’3
リン酸置換体を有するデオキシヌクレオシド。デオキシ
ヌクレオシドは、窒素含有塩基のプリンまたはピリミジ
ン誘導体が五炭糖の1’−炭素に共有結合した五炭糖誘
導体である。プリン塩基にはアデニン(A)、グアニン
(G)、イノシン、およびそれらの誘導体や類似体があ
る。ピリミジン塩基にはシトシン(C)、チミン
(T)、ウラシル(U)、およびそれらの誘導体や類似
体がある。Deoxynucleoside triphosphate-5'3
A deoxynucleoside having a phosphoric acid substituent. Deoxynucleosides are pentose derivatives in which a purine or pyrimidine derivative of the nitrogen-containing base is covalently attached to the 1'-carbon of the pentose. Purine bases include adenine (A), guanine (G), inosine, and their derivatives and analogs. Pyrimidine bases include cytosine (C), thymine (T), uracil (U), and their derivatives and analogs.
【0046】誘導体や類似体は、非誘導体化ヌクレオシ
ド3リン酸と類似の方法で認識および重合されるものに
より例示される。このような誘導体または類似体の例に
は、レポーター群で修飾されるもの、ビオチン化される
もの、アミン修飾されるもの、放射標識されるもの、ア
ルキル化されるものなどがあり、またホスホロチオエー
トホスファイト(phosphite)、環原子修飾誘
導体などが含まれるが、これらは例示のためであり、決
して本発明を限定するものではない。レポーター群は、
フルオレセインのような蛍光性の群、ルミノールのよう
な化学発光性の群、遅延蛍光により検出可能なN−(ヒ
ドロキシエチル)エチレンジアミントリ酢酸のようなテ
ルビウム(terbium)キレート性物質でもよい。Derivatives and analogs are exemplified by those that are recognized and polymerized in a manner similar to underivatized nucleoside triphosphates. Examples of such derivatives or analogs include those modified with reporter groups, those that are biotinylated, those that are amine modified, those that are radiolabeled, those that are alkylated, etc. Phosphites, ring atom modified derivatives and the like are included, but these are for illustrative purposes only and are not meant to limit the invention in any way. The reporter group is
It may be a fluorescent group such as fluorescein, a chemiluminescent group such as luminol, and a terbium chelating substance such as N- (hydroxyethyl) ethylenediaminetriacetic acid that can be detected by delayed fluorescence.
【0047】ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼ−
−延長鎖がこれに相補的な単一鎖ポリデオキシヌクレオ
チドを含むDNA鋳型に沿ってポリデオキシヌクレオチ
ドプライマーの延長鎖を作成するための触媒、普通酵
素。ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼ鋳型依存性
ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼであり、ポリデ
オキシヌクレオチドプライマーの3’末端を延長するた
めの構成単位(buildingblock)としてデ
オキシヌクレオシド3リン酸を使用する。普通触媒は酵
素であり、例えば原核性DNAポリメラーゼ(I、II
またはIII)、T4DNAポリメラーゼ、T7DNA
ポリメラーゼ、クレノウ断片、逆転写酵素などのDNA
ポリメラーゼがあり、細胞、細菌(例えば大腸菌)、植
物、動物、ウイルス、好熱性細菌などに由来する。ポリ
ヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列がRNA
である場合、ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオ
チド配列に沿って延長プローブの延長を促進するのに逆
転写酵素が含まれるであろう。Polydeoxynucleotide polymerase-
A catalyst, usually an enzyme, for making an extended strand of a polydeoxynucleotide primer along a DNA template in which the extended strand contains a complementary single-stranded polydeoxynucleotide. Polydeoxynucleotide Polymerase A template-dependent polydeoxynucleotide polymerase that uses deoxynucleoside triphosphates as a building block to extend the 3'end of polydeoxynucleotide primers. Usually the catalyst is an enzyme, for example a prokaryotic DNA polymerase (I, II
Or III), T4 DNA polymerase, T7 DNA
DNA for polymerase, Klenow fragment, reverse transcriptase, etc.
There are polymerases, which are derived from cells, bacteria (eg E. coli), plants, animals, viruses, thermophilic bacteria and the like. The polynucleotide or target polynucleotide sequence is RNA
, A reverse transcriptase will be included to facilitate extension of the extension probe along the polynucleotide or target polynucleotide sequence.
【0048】全体にまたは部分的に連続的に−−本発明
で使用される試料や種々の薬剤が同時ではなく組合わさ
れる時、1つまたはそれ以上の薬剤が残りの1つまたは
それ以上の薬剤と組合わされて1つの組合せができる。
次に各組合せが本発明の1つまたはそれ以上の工程にさ
らされる。すなわち各組合せは1つまたはそれ以上の目
的の結果を達成する条件下でインキュベートされる。In whole or in part continuously--when the sample or various agents used in the present invention are combined, not simultaneously, one or more agents may be combined with the remaining one or more agents. Combined with the drug to make one combination.
Each combination is then exposed to one or more steps of the present invention. That is, each combination is incubated under conditions that achieve one or more desired results.
【0049】ハイブリダイゼーション(ハイブリダイズ
すること)および結合−−ヌクレオチド配列の意味にお
いて、これらの用語は互換性がある。互いにハイブリダ
イズする2つのヌクレオチド配列の能力は、2つのヌク
レオチド配列の相補性の程度に基づいており、これはま
た相補的なヌクレオチド対の一致の割合に基づく。ある
配列で別の配列に相補的なヌクレオチドが多い程、ハイ
ブリダイゼーションの条件はより緊縮性があり、2つの
配列の結合はより特異的である。温度を上げたり、共溶
媒(cosolvents)の比率を上げたり、塩濃度
を下げたりすることにより、緊縮性は上がる。Hybridization and binding--the terms are interchangeable in the sense of nucleotide sequences. The ability of two nucleotide sequences to hybridize to each other is based on the degree of complementarity of the two nucleotide sequences, which is also based on the percent match of complementary nucleotide pairs. The more nucleotides that are complementary to one sequence in another, the more stringent the conditions of hybridization and the more specific the binding of the two sequences. The stringency is increased by increasing the temperature, increasing the ratio of cosolvents and decreasing the salt concentration.
【0050】相同または実質的に同一−−一般に同一で
あるか、または同じポリヌクレオチド配列にハイブリダ
イズする2つのポリヌクレオチド配列は相同である。2
つの配列が少なくとも90%、好ましくは100%の同
一または類似の塩基配列を有する場合、これらは相同で
あるかまたは実質的に同一である(ただしここではチミ
ン(T)とウラシル(U)は同一と考える)。すなわち
リボヌクレオチドA、U、CおよびGは、それぞれデオ
キシヌクレオチドdA、dT、dCおよびdGと類似で
あると考える。相同配列は両方ともDNAでもよいし、
1つがDNAで他方がRNAでもよい。Homologous or Substantially Identical--Two polynucleotide sequences that are generally identical or that hybridize to the same polynucleotide sequence are homologous. Two
Two sequences are homologous or substantially identical if at least 90%, preferably 100%, have identical or similar base sequences (wherein thymine (T) and uracil (U) are identical). I think). Thus ribonucleotides A, U, C and G are considered similar to deoxynucleotides dA, dT, dC and dG, respectively. Both homologous sequences may be DNA,
One may be DNA and the other RNA.
【0051】相補的−−2つの配列の1つが他の配列に
逆平行(各配列の3’末端が他の配列の5’末端に結合
し、1つの配列の各A、T(U)、GおよびCがそれぞ
れ他の配列のT(U)、A、CおよびGに結合する)で
結合する場合、これらの2つの配列が相補的である。Complementary--One of the two sequences is anti-parallel to the other (the 3'end of each sequence binds to the 5'end of the other sequence and each A, T (U) of one sequence, Two sequences are complementary when G and C bind at T (U), A, C and G of the other sequence, respectively.
【0052】延長プロ−ブ−−これは2つのヌクレオチ
ド配列よりなる、普通合成オリゴヌクレオチドである単
一鎖ポリヌクレオチド鎖であり、鎖の3’末端に位置す
るこのような配列の1つ(EP1)は好ましくは少なく
とも10個の連続的デオキシヌクレオチドを有し、標的
ポリヌクレオチド配列の最初のポリヌクレオチド配列
(S1)にハイブリダイズすることができる。Extended probe--This is a single-stranded polynucleotide chain, usually a synthetic oligonucleotide, consisting of two nucleotide sequences, one of such sequences located at the 3'end of the chain (EP1). ) Preferably has at least 10 consecutive deoxynucleotides and is capable of hybridizing to the first polynucleotide sequence (S1) of the target polynucleotide sequence.
【0053】EP1を選ぶ大きな基準は、(1)配列は
信頼できるものでなければならない、すなわちそれはS
1とほとんどまたは完全に相補的で、安定で特異的な結
合を提供するのに充分な長さでなければならない。
(2)N−末端は遊離の3’−ヒドロキシ基を有する
か、またはこれを形成することができなければならな
い。EP1の最小の長さは普通少なくとも10、通常は
少なくとも15、好ましくは20−50デオキシヌクレ
オチドである。一般にEP1は約20から100デオキ
シヌクレオチドである。延長プローブの第1と第2のポ
リヌクレオチド配列の組合せた長さは、少なくとも約2
0ヌクレオチドであり、好ましくは約40から200ヌ
クレオチドの長さである。The major criterion for choosing EP1 is (1) the array must be reliable, that is, S
It should be almost or completely complementary to 1 and of sufficient length to provide stable and specific binding.
(2) The N-terminus must have or be capable of forming a free 3'-hydroxy group. The minimum length of EP1 is usually at least 10, usually at least 15, preferably 20-50 deoxynucleotides. Generally EP1 is about 20 to 100 deoxynucleotides. The combined length of the first and second polynucleotide sequences of the extender probe is at least about 2
It is 0 nucleotides, preferably about 40 to 200 nucleotides in length.
【0054】延長プローブの第2のポリヌクレオチド配
列(EP2)は、標的ポリヌクレオチド配列の第2のポ
リヌクレオチド配列(S2)に実質的に同一かまたは相
同であるヌクレオチド配列である。EP2は少なくとも
10ヌクレオチド、通常少なくとも15、好ましくは2
0−50デオキシヌクレオチドの長さである。一般にE
P2は約20から100デオキシヌクレオチドである。The second polynucleotide sequence (EP2) of the extender probe is a nucleotide sequence which is substantially identical or homologous to the second polynucleotide sequence (S2) of the target polynucleotide sequence. EP2 is at least 10 nucleotides, usually at least 15, preferably 2
The length is 0-50 deoxynucleotides. Generally E
P2 is about 20 to 100 deoxynucleotides.
【0055】延長プローブは、EP1とEP2の間また
はEP2の末端に位置する追加のリセプター結合配列ま
たはスペーサー配列または他の配列を含む。The extender probe contains additional receptor binding or spacer sequences or other sequences located between EP1 and EP2 or at the end of EP2.
【0056】非隣接−−配列が非隣接であるとは、ポリ
ヌクレオチドの2つのセグメント間、または2つの配列
S1とS2の間に、通常少なくとも10ヌクレオチドが
標的ポリヌクレオチド配列内に存在することを意味す
る。Non-contiguous--The sequences are non-contiguous means that there is usually at least 10 nucleotides present in the target polynucleotide sequence between the two segments of the polynucleotide or between the two sequences S1 and S2. means.
【0057】隣接−−ポリヌクレオチドの2つのセグメ
ント間、または2つの配列間にヌクレオチドが存在しな
い時、配列は隣接であると見なされる。Adjacent--A sequence is considered contiguous if no nucleotides are present between the two segments of the polynucleotide or between the two sequences.
【0058】コピー−−単一鎖ポリヌクレオチドの配列
に相補性である配列からは区別される、このような単一
鎖ポリヌクレオチドの直接の同一または相同なコピーを
意味する。本発明で実施される単一プライマー増幅で
は、単一鎖ポリデオキシヌクレオチド配列の相補的な配
列は、まずポリデオキシヌクレオチドプライマーの延長
の結果として産生され、次に単一鎖ポリデオキシヌクレ
オチド配列の直接のコピーである配列が前記の相補的な
配列より得られる。Copy--refers to a direct, identical or homologous copy of such a single-stranded polynucleotide, distinguished from sequences which are complementary to the sequence of the single-stranded polynucleotide. In the single primer amplification carried out in the present invention, the complementary sequence of the single-stranded polydeoxynucleotide sequence is first produced as a result of the extension of the polydeoxynucleotide primer and then the direct sequence of the single-stranded polydeoxynucleotide sequence. A sequence that is a copy of the above is obtained from the complementary sequence.
【0059】延長プローブを延長する手段−−延長可能
な3’末端を有する延長プローブは、延長プローブを延
長する条件下で、標的ポリヌクレオチド配列のようなポ
リヌクレオチドにハイブリダイズした延長プローブを、
ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼとデオキシヌク
レオシド3リン酸に組合せて延長することができる。こ
うして延長プローブがポリヌクレオチドに沿って延長さ
れて2本鎖が形成される。標的ポリヌクレオチド配列に
沿って延長される場合、2本鎖は延長された延長プロー
ブよりなる。この方法による延長は、2つの配列間に必
要な正確性が供給され、延長された延長プローブは目的
の標的の正確な検出を提供する。Means for Extending the Extender Probe--The extender probe having an extendable 3'end is an extender probe hybridized to a polynucleotide such as a target polynucleotide sequence under conditions for extending the extender probe,
It can be extended in combination with polydeoxynucleotide polymerase and deoxynucleoside triphosphate. Thus, the extension probe is extended along the polynucleotide to form a double strand. When extended along the target polynucleotide sequence, the duplex consists of an extended probe. Extension by this method provides the required accuracy between the two sequences and the extended extension probe provides accurate detection of the target of interest.
【0060】延長プローブの3’末端を修飾する手段−
−前記した単一プライマー増幅のためには、基部ループ
構造または逆方向反復を形成することができる単一ポリ
ヌクレオチド鎖が使用される。このようなポリヌクレオ
チドは試料中に存在するか、またはポリヌクレオチドの
存在に対応して作成される。標的ポリヌクレオチドへの
結合を用いてこのようなポリヌクレオチドを作成するの
に延長プローブが使用され、これに沿って延長プローブ
が延長される。ポリヌクレオチドの濃度は一般に低くか
つ未知であるため、標的ポリヌクレオチド配列とハイブ
リダイズしない延長プローブの分子がある。これらの延
長プローブの分子は、単一プライマー増幅の効率を低下
させる競合工程が発生するため、好ましくない。適当な
手段を用いて、標的ポリヌクレオチド配列に結合しない
延長プローブの3’末端は修飾され、デオキシヌクレオ
シド3リン酸やDNAポリメラーゼの存在下で、これは
標的ポリヌクレオチド配列に沿ってもう延長されないよ
うになる。Means for modifying the 3'end of the extender probe-
-For the single primer amplification described above, a single polynucleotide chain capable of forming a base loop structure or inverted repeats is used. Such a polynucleotide is present in the sample or is made in response to the presence of the polynucleotide. An extension probe is used to make such a polynucleotide using binding to a target polynucleotide along which the extension probe is extended. Since the concentration of polynucleotides is generally low and unknown, some extender probe molecules do not hybridize to the target polynucleotide sequence. Molecules of these extension probes are not preferred because of the competing process that reduces the efficiency of single primer amplification. Using suitable means, the 3'end of the extension probe that does not bind to the target polynucleotide sequence is modified so that it will no longer extend along the target polynucleotide sequence in the presence of deoxynucleoside triphosphate or DNA polymerase. become.
【0061】延長プローブの3’末端が修飾される1つ
の方法は減成による。例えば3’−エキソヌクレアーゼ
のような酵素が反応媒体に加えられる。ある条件下でこ
のような酵素は単一鎖ポリヌクレオチドの3’末端を減
成する。このようなエキソヌクレアーゼ酵素の例は、ク
レノウ断片、T4ポリメラーゼ、およびT7ポリメラー
ゼがあるが、これらは例示のためでありこれらに限定さ
れるものではない。ある方法では、延長プローブの延長
に使用されるDNAポリメラーゼのようなポリデオキシ
ヌクレオチドポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を
有する。このようなDNAポリメラーゼの例はクレノ
ウ、T4およびT7DNAポリメラーゼがある。One way in which the 3'end of the extension probe is modified is by degradation. An enzyme such as 3'-exonuclease is added to the reaction medium. Under certain conditions such enzymes degrade the 3'end of single-stranded polynucleotides. Examples of such exonuclease enzymes include, but are not limited to, Klenow fragment, T4 polymerase, and T7 polymerase. In one method, the polydeoxynucleotide polymerase, such as the DNA polymerase used to extend the extender probe, has exonuclease activity. Examples of such DNA polymerases are Klenow, T4 and T7 DNA polymerases.
【0062】別の実施態様において、延長プローブの
3’末端は、その5’末端以外で配列NSを有するスカ
ベンジャー(scavenger)ポリヌクレオチドに
沿って延長され、この配列は延長プローブの3’末端と
ハイブリダイズ可能である。延長プローブの3’末端と
スカベンジャーポリヌクレオチド配列がハイブリダイズ
されると、ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼとデ
オキシヌクレオシド3リン酸の存在下で延長プローブの
3’末端はスカベンジャーポリヌクレオチド配列に沿っ
て延長される。この方法により延長プローブの3’末端
が修飾され、延長プローブの標的ポリヌクレオチド配列
に沿った延長や単一プライマー増幅中の相補性がなくな
る。スカベンジャーポリヌクレオチド配列は一般に8か
ら1,000またはそれ以上のヌクレオチド、好ましく
は10から50ヌクレオチドの長さであり、これは延長
プローブの一部であるかまたは延長プローブとは異なる
分子である。スカベンジャーポリヌクレオチド配列が延
長プローブの一部である時、これは延長プローブの配列
EP2の3’または5’でもよい。この鎖の延長で使用
される酵素は、市販されている好熱性ヌクレオチドポリ
メラーゼ(例えばTaq、Vent、Hot Tubな
どがあるがこれらに限定されるものではない)である。In another embodiment, the 3'end of the extender probe is extended along a scavenger polynucleotide having the sequence NS except at its 5'end, which sequence hybridizes to the 3'end of the extender probe. Soybean is possible. When the 3'end of the extender probe is hybridized to the scavenger polynucleotide sequence, the 3'end of the extender probe is extended along the scavenger polynucleotide sequence in the presence of polydeoxynucleotide polymerase and deoxynucleoside triphosphate. This method modifies the 3'end of the extender probe, eliminating the extension of the extender probe along the target polynucleotide sequence or complementarity during single primer amplification. The scavenger polynucleotide sequence is generally 8 to 1,000 or more nucleotides, preferably 10 to 50 nucleotides in length, which is either a part of the extender probe or a different molecule from the extender probe. When the scavenger polynucleotide sequence is part of an extender probe, it may be 3'or 5'of the extender probe sequence EP2. The enzyme used in this chain extension is a commercially available thermophilic nucleotide polymerase such as, but not limited to, Taq, Vent, Hot Tub and the like.
【0063】特異的結合対のメンバー(”sbpメンバ
ー”)−−その表面または空洞内に他の分子の特定の空
間構造や極性構造と特異的に結合する、従って相補的で
あると規定される領域を有する2つの異なる分子のうち
の1つ。特異的結合対のメンバーはリガンドとリセプタ
ー(抗リセプター)と呼ばれる。これらは抗原−抗体の
ような免疫学的対のメンバー、またはオペレーター−リ
プレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−
アビジン、ホルモン−ホルモンリセプター、核酸2本
鎖、IgG−蛋白A、DNA−DNA、DNA−RNA
などである。A member of a specific binding pair ("sbp member")-specifically binds to its surface or cavity within a particular spatial or polar structure of another molecule and is therefore defined as complementary. One of two different molecules with regions. The members of the specific binding pair are called ligand and receptor (anti-receptor). These are members of immunological pairs such as antigen-antibody, or operator-repressor, nuclease-nucleotide, biotin-
Avidin, hormone-hormone receptor, nucleic acid double chain, IgG-protein A, DNA-DNA, DNA-RNA
And so on.
【0064】リガンド−−天然にリセプターが存在する
かまたは調製される任意の化合物。Ligand--any compound for which a receptor naturally exists or is prepared.
【0065】リセプター(”抗リガンド”)−−分子の
特定の空間的および極性構造(例えばエピトープすなわ
ち抗原性決定部位)を認識することができる任意の化合
物。リセプターの例としては、天然に存在するリセプタ
ー、例えばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、防
御性酵素、蛋白A、補体成分Clq、DNA結合蛋白ま
たはリガンドなどがある。Receptor (“antiligand”)-any compound capable of recognizing a particular spatial and polar structure of a molecule (eg, an epitope or antigenic determinant site). Examples of receptors include naturally occurring receptors such as thyroxine binding globulin, antibodies, enzymes, protective enzymes, protein A, complement component Clq, DNA binding proteins or ligands.
【0066】小有機分子−−分子量1500未満、好ま
しくは100から1000、さらに好ましくは300か
ら600(例えばビオチン、フルオレセイン、ローダミ
ンおよび他の色素、テトラサイクリンおよび他の蛋白結
合分子、そしてハプテンなど)の化合物。小有機分子
は、ヌクレオチド配列の標識物または支持体への結合の
手段を与える。Small organic molecules--compounds of molecular weight less than 1500, preferably 100 to 1000, more preferably 300 to 600 (eg biotin, fluorescein, rhodamine and other dyes, tetracycline and other protein binding molecules, and haptens). . Small organic molecules provide a means for attachment of the nucleotide sequence to a label or support.
【0067】支持体または表面−−多孔性または非多孔
性の水不溶性物質。支持体は親水性であるかまたは親水
性にされることが可能であり、シリカ、硫酸マグネシウ
ムおよびアルミナなどの無機粉末;天然のポリマー物
質、特にセルロース物質およびセルロース由来の物質
(例えば濾紙、クロマトグラフィー紙などの紙を含む繊
維);合成または修飾された天然存在するポリマー(例
えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ(ビニル
クロリド)、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、
アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリ(4−メチルブタン)、ポリスチレン、
ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレー
ト)、ナイロン、ポリ(ビニルブチラエート)など);
それ自身でまたは他の物質とともに使用される;バイオ
ガラス(Bioglass)として入手できるガラス、
セラミックス、金属などがある。Support or Surface--A porous or non-porous water-insoluble material. The support may be hydrophilic or made hydrophilic, inorganic powders such as silica, magnesium sulphate and alumina; natural polymeric materials, especially cellulosic and cellulosic derived materials (eg filter paper, chromatography). Fibers containing paper such as paper); synthetic or modified naturally occurring polymers (eg nitrocellulose, cellulose acetate, poly (vinyl chloride), polyacrylamide, cross-linked dextran,
Agarose, polyacrylate, polyethylene, polypropylene, poly (4-methylbutane), polystyrene,
Polymethacrylate, poly (ethylene terephthalate), nylon, poly (vinyl butyrate), etc.);
Used by itself or with other substances; Glass available as Bioglass,
There are ceramics and metals.
【0068】sbpメンバーの支持体または表面への結
合は、普通文献中の公知の方法により実施される。例え
ば、”Immobilized Enzymes,”イ
チロウチバタ(Ichiro Chibatra)、ハ
ルステッド出版(Halsted Press)ニュー
ヨーク(1978)およびクアトレカサス(Cuatr
ecasas)、J.Biol.Chem.,245:
3059(1970)を参照。表面の形は以下のどれで
もよい(例えばストリップ、棒、ビーズのような粒子な
ど)。The attachment of the sbp member to the support or surface is usually carried out by methods known in the literature. For example, "Immobilized Enzymes," Ichiro Chibatra, Halted Press New York (1978), and Cuatrcass.
ecasas), J. Biol. Chem. , 245:
3059 (1970). The shape of the surface may be any of the following (eg strips, rods, particles such as beads, etc.).
【0069】標識物またはレポーター基またはレポータ
ー分子−−シグナル産生系のメンバー。普通標識物また
はレポーター基または分子は、ポリヌクレオチドプロー
ブまたはポリデオキシヌクレオチドプライマーに結合さ
れるか結合されるようになり、直接または特異的反応を
介して検出することが可能であり、検出可能なシグナル
を産生する。標識物には、増幅または結合(ligat
ion)の鋳型を提供するか、またはリプレッサー蛋白
のようなリガンドとして作用するポリヌクレオチドプラ
イマーまたは特異的ポリヌクレオチド配列がある。好ま
しくはポリデオキシヌクレオチドプライマーは標識物を
有するようになるかまたは有することができる。一般に
検出可能な任意の標識物が使用される。標識物は放射性
または非放射性(通常は非放射性)で、触媒(例えば酵
素)、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモータ
ー、色素、蛍光性分子、発光性分子、補酵素、酵素基
質、放射性の基、小有機分子、増幅可能なポリヌクレオ
チド配列、ラテックスまたは炭素のような粒子、金属ゾ
ル、クリスタライト、リポソーム、細胞などがあり、こ
れらは触媒または他の検出可能な基でさらに標識されて
もよい。標識物はシグナル産生系のメンバーであり、単
独でまたは他のシグナル産生系のメンバーとともに検出
可能なシグナルを産生する。標識物は直接ヌクレオチド
配列に結合されるか、またはヌクレオチド配列に結合し
たsbpメンバーに相補的なsbpメンバーによりそこ
に結合される。Label or reporter group or reporter molecule--a member of the signal producing system. A common label or reporter group or molecule is attached to or becomes attached to the polynucleotide probe or polydeoxynucleotide primer, which can be detected directly or through a specific reaction and is a detectable signal. To produce. Labels include amplification or ligat
ion) or a polynucleotide primer or specific polynucleotide sequence that acts as a ligand such as a repressor protein. Preferably the polydeoxynucleotide primer becomes or can carry a label. Generally any detectable label is used. Labels are radioactive or non-radioactive (usually non-radioactive) and include catalysts (eg enzymes), polynucleotides encoding the catalysts, promoters, dyes, fluorescent molecules, luminescent molecules, coenzymes, enzyme substrates, radioactive groups, There are small organic molecules, amplifiable polynucleotide sequences, particles such as latex or carbon, metal sols, crystallites, liposomes, cells, etc., which may be further labeled with catalysts or other detectable groups. The label is a member of the signal producing system and produces a detectable signal alone or together with other members of the signal producing system. The label is attached directly to the nucleotide sequence or is bound thereto by an sbp member complementary to the sbp member attached to the nucleotide sequence.
【0070】シグナル産生系−−ソグナル産生系は1つ
またはそれ以上の成分を含有し、少なくとも1つの成分
は標識物またはレポーター基である。シグナル産生系
は、試料中の標的ポリヌクレオチド配列またはポリヌク
レオチドの存在または量に関連するシグナルを産生す
る。シグナル産生系は、測定可能なシグナルを産生する
のに必要なすべての試薬を含む。標識物がヌクレオチド
配列に結合していない時、標識物は普通ヌクレオチド配
列またはその一部に結合しているsbpメンバーに相補
的なsbpメンバーに結合する。シグナル産生系の他の
成分は展開溶液に含まれ、基質、エンハンサー、補因
子、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、シグ
ナル産生系の結合に必要な特異的結合物質などがある。
シグナル産生系の他の成分は、補酵素、酵素生成物と反
応する物質、他の酵素や触媒などがある。シグナル産生
系は、外部の手段、電磁気放射、好ましくは肉眼判定に
より検出可能なシグナルを産生する。このシグナル産生
系はさらに詳しくは、ヨーロッパ特許469755号
(米国特許出願第07/555,323号、1990年
7月19日出願)に記載されており、その関連する開示
内容は参考のため本明細書中に引用されている。Signal Production System--The signal production system contains one or more components, at least one component being a label or reporter group. The signal producing system produces a signal related to the presence or amount of the target polynucleotide sequence or polynucleotide in the sample. The signal producing system contains all the reagents necessary to produce a measurable signal. When the label is not bound to the nucleotide sequence, the label normally binds to an sbp member that is complementary to the sbp member bound to the nucleotide sequence or a portion thereof. Other components of the signal producing system are contained in the developing solution and include substrates, enhancers, cofactors, inhibitors, scavengers, metal ions, and specific binding substances required for binding the signal producing system.
Other components of the signal producing system include coenzymes, substances that react with enzyme products, and other enzymes and catalysts. The signal producing system produces a signal that is detectable by external means, electromagnetic radiation, preferably by visual inspection. This signal producing system is described in more detail in European Patent No. 469755 (US patent application Ser. No. 07 / 555,323, filed Jul. 19, 1990), the related disclosure content of which is hereby incorporated by reference. It is quoted in the book.
【0071】付属物質−−本発明に関連して種々の付属
物質が測定に使用される。例えば測定媒体中には普通緩
衝液があり、また測定媒体の安定剤および測定成分があ
る。しばしばこれらの付属物質に加えて、アルブミンの
ような蛋白、ホルムアミドのような有機溶媒、4級アン
モニウム塩、デキストラン硫酸のようなポリカチオン、
界面活性剤(特に非イオン界面活性剤)、結合エンハン
サー(例えばポリアルキルグリコール)などが含まれ
る。Adjuncts--A variety of adjuncts are used in the measurements in connection with the present invention. For example, there is usually a buffer in the measuring medium, and there are stabilizers and measuring components of the measuring medium. Often in addition to these adjuncts, proteins such as albumin, organic solvents such as formamide, quaternary ammonium salts, polycations such as dextran sulfate,
Included are surfactants (especially non-ionic surfactants), binding enhancers (eg polyalkyl glycols) and the like.
【0072】本発明の1つの面において、延長プローブ
は標的ポリヌクレオチド配列に沿って延長され、標的ポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイズしない延長プロー
ブはその3’末端で修飾されている、単一鎖標的ポリヌ
クレオチド配列に相補性の単一鎖ポリヌクレオチド配列
を作成する方法が提供される。In one aspect of the invention, the extender probe is extended along the target polynucleotide sequence and the extender probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence is modified at its 3'end. Methods for making a single-stranded polynucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence are provided.
【0073】この方法の1つの実施態様は、図1に略図
で示されている。延長プローブの3’末端に位置するE
P1は、標的ポリヌクレオチド配列のS1とハイブリダ
イズし、配列NSを含むスカベンジャーポリヌクレオチ
ドの一部分とハイブリダイズする。EP2はS2と相同
である。この延長プローブはAに沿って延長されてS2
に相補性の、配列S’2を含有する延長された延長プロ
ーブを産生する。BはEP2とS’2を含み、これらは
互いにハイブリダイズ可能である。標的ポリヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズしない延長プローブはNSとハ
イブリダイズし、スカベンジャーポリヌクレオチドに沿
って延長されて修飾延長プローブCを産生し、ここでは
もうEP1は3’末端に存在しない。好ましくはNSは
約8から100、さらに好ましくは8から30ヌクレオ
チドの長さである。One embodiment of this method is shown schematically in FIG. E located at the 3'end of the extension probe
P1 hybridizes to S1 of the target polynucleotide sequence and to a portion of the scavenger polynucleotide containing the sequence NS. EP2 is homologous to S2. This extension probe is extended along A and S2
Produces an extended extender probe containing the sequence S'2 complementary to. B includes EP2 and S'2, which are hybridizable to each other. The extension probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence hybridizes to the NS and is extended along the scavenger polynucleotide to produce modified extension probe C, where EP1 is no longer present at the 3'end. Preferably the NS is about 8 to 100, more preferably 8 to 30 nucleotides in length.
【0074】本発明の別の実施態様は図2に示されてい
る。この実施態様において延長プローブはEP1とEP
2のみでなく、配列EP2の3’末端である配列NSを
含む。NSはS1と相同である。延長プローブの3’末
端に位置するEP1は、標的ポリヌクレオチド配列のS
1とハイブリダイズし、延長プローブのNSとハイブリ
ダイズする。EP2はS2と相同である。この延長プロ
ーブはAに沿って延長され、S2に相補性の、配列S’
2を含有する延長された延長プローブDを産生する。D
はEP2とS’2を含有し、これらは互いにハイブリダ
イズ可能である。標的ポリヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズしない延長プローブはくるっと回って自分自身と
ハイブリダイズし、EP1はNSとハイブリダイズす
る。延長プロープの3’末端はそれ自身に沿って延長さ
れて修飾された延長プローブEを産生し、ここではEP
1はもう3’末端に存在しない。Another embodiment of the present invention is shown in FIG. In this embodiment, the extension probes are EP1 and EP.
Not only 2 but also the sequence NS, which is the 3'end of the sequence EP2. NS is homologous to S1. EP1 located at the 3'end of the extender probe is the S of the target polynucleotide sequence.
1 and hybridizes with NS of the extension probe. EP2 is homologous to S2. This extension probe extends along A and is complementary to S2 and has the sequence S '.
Produces an extended probe D containing 2. D
Contains EP2 and S'2, which are hybridizable to each other. The extension probe, which does not hybridize to the target polynucleotide sequence, spins and hybridizes to itself, and EP1 hybridizes to NS. The 3'end of the extension probe is extended along itself to produce a modified extension probe E, here EP
1 is no longer present at the 3'end.
【0075】別の実施態様は図3に示されており、配列
NSはEP2の延長プローブ5’に含まれている。延長
プローブの標的ポリヌクレオチド配列およびそれ自身と
のハイブリダイゼーションと延長は、前記図2で記載し
たように起きる。Another embodiment is shown in FIG. 3 in which the sequence NS is contained in the extension probe 5'of EP2. Hybridization and extension of the extension probe with the target polynucleotide sequence and itself occurs as described in Figure 2 above.
【0076】図4に記載した本発明のさらに別の実施態
様においては、延長プローブのEP1は標的ポリヌクレ
オチド配列のS1とハイブリダイズする。延長プローブ
はAに沿って延長されて、図1の実施態様で記載したよ
うに延長された延長プローブBを産生する。3’活性を
有するエキソヌクレアーゼが反応混合物中に存在し、こ
れは延長プローブがその3’末端でS1とハイブリダイ
ズする能力を破壊するのに充分な程度に、Aとハイブリ
ダイズしない延長プローブを減成する。In yet another embodiment of the invention described in FIG. 4, the extender probe EP1 hybridizes to S1 of the target polynucleotide sequence. The extender probe is extended along A to produce extender probe B extended as described in the embodiment of FIG. An exonuclease with 3'activity was present in the reaction mixture that reduced the extension probe that did not hybridize to A to a sufficient extent to destroy the ability of the extension probe to hybridize with S1 at its 3'end. To achieve.
【0077】図4の実施態様の変法は図5に示されてい
る。この延長プローブはEP1とEP2のみでなく、E
P2にハイブリダイズ可能な配列であり好ましくは少な
くともEP2の3’末端と相補性のあるEP3も含む。
この延長プローブのEP1は標的ポリヌクレオチド配列
のS1とハイブリダイズする。延長された延長プローブ
Bは前記の図4の実施態様で記載したように形成され
る。エキソヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド配列
に結合しない延長プローブを、EP3とEP2のハイブ
リダイズにより形成される2本鎖まで減成する。この実
施態様の延長プローブは、その減成により少なくともE
P1が除去されるようにデザインされる。好ましくはE
P2は約5から50、さらに好ましくは8から30ヌク
レオチドの長さである。この変法は以下のステップで減
成された延長プローブをプライマーとして使用するオプ
ションを提供し、ここで減成された延長プローブのEP
2は延長された延長プローブのS2に結合し、延長され
た延長プローブに沿って延長される。A variation of the embodiment of FIG. 4 is shown in FIG. This extension probe is not only for EP1 and EP2, but for E
It also includes EP3, which is a sequence hybridizable to P2 and preferably complementary to at least the 3'end of EP2.
EP1 of this extension probe hybridizes to S1 of the target polynucleotide sequence. The extended extension probe B is formed as described in the embodiment of FIG. 4 above. Exonuclease degrades the extended probe, which does not bind to the target polynucleotide sequence, to the double strand formed by hybridizing EP3 and EP2. The extension probe of this embodiment is at least E due to its degradation.
Designed to have P1 removed. Preferably E
P2 is about 5 to 50, more preferably 8 to 30 nucleotides in length. This variant provides the option of using the extended probe degraded in the following steps as a primer, where the EP of the degraded extended probe is
2 binds to S2 of the extended extension probe and is extended along the extended extension probe.
【0078】この方法は、延長プローブを含まない1つ
またはそれ以上の標的ポリヌクレオチド配列(すなわち
標的ポリヌクレオチド配列と同一の配列)が形成され
る、単一プライマー増幅に使用される。延長プローブは
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされ、上記
した用に延長される。標的に結合しない延長プローブ
は、前記の任意の実施態様においてその3’末端で修飾
される。次にポリデオキシヌクレオチドプライマーは、
(1)延長された延長プローブは単一鎖にされ、(2)
ポリデオキシヌクレオチドプライマーは延長された延長
プローブとハイブリダイズし延長された延長プローブに
沿って延長されて、延長プライマーよりなる2本鎖(こ
れは標的ポリヌクレオチド配列と同一の配列を含有す
る)を形成する条件下で、S2に相補性のヌクレオチド
配列と少なくともその3’末端でハイブリダイズされ
る。好ましくは延長プローブの濃度はポリデオキシヌク
レオチドプライマーの濃度より実質的に低い。「実質的
に低い」ということは、プライマーに対する延長プロー
ブの濃度は少なくとも1対10、通常1対100または
それ以上であることを意味する。好ましくは延長プロー
ブの濃度は、ポリデオキシヌクレオチドプライマーの濃
度の1%より低い。This method is used for single primer amplification in which one or more target polynucleotide sequences (ie, sequences identical to the target polynucleotide sequence) without extension probes are formed. The extender probe is hybridized to the target polynucleotide sequence and extended as described above. The extension probe that does not bind the target is modified at its 3'end in any of the above embodiments. Then the polydeoxynucleotide primer
(1) The extended extension probe is made into a single strand, (2)
The polydeoxynucleotide primer hybridizes with the extended extension probe and is extended along the extended extension probe to form a duplex consisting of the extension primer, which contains the same sequence as the target polynucleotide sequence. Under conditions that hybridize to a nucleotide sequence complementary to S2 at least at its 3'end. Preferably the concentration of extender probe is substantially lower than the concentration of polydeoxynucleotide primer. By "substantially low" is meant that the concentration of extender probe to primer is at least 1: 10, usually 1: 100 or more. Preferably the concentration of extender probe is less than 1% of the concentration of polydeoxynucleotide primer.
【0079】単一プライマー増幅での本発明の方法の使
用は図6に記載されている。The use of the method of the invention for single primer amplification is described in FIG.
【0080】ポリデオキシヌクレオチドプライマーPは
その3’末端にS’2とハイブリダイズする配列(SM
2)を有し、S’2は標的ポリヌクレオチド配列のS2
に相補性である。好ましくはSM2はS2と同一の配列
である。Pはまた標識物Wを含有していてもよい。Pは
延長された延長プローブB(図1)、D(図2)または
F(図3)とハイブリダイズしかつこれに沿って延長さ
れ、SM2とSM’2よりなる延長プライマーHを形成
し、SM’2はEP2と相補性であり好ましくはS’2
と同一である。B、DまたはFおよびHは解離され、P
はHのSM’2およびB、DまたはFのS’2とハイブ
リダイズし、PはB、DまたはFおよびHに沿って延長
されそれぞれHおよびH1を産生する。H1はS’2お
よびSM2と相補性の配列を有する。この2本鎖は解離
され、H1およびHとハイブリダイズしかつこれらに沿
って延長されH1とH2を産生する。これをさらに繰り
返すとH1H2の複数のコピーが得られ、これらは標識
物Wが存在するため検出される。[0080] polydeoxynucleotide primer P has its 3 'end S'2 sequences hybridizing to (S M
2 ) and S′2 is S2 of the target polynucleotide sequence.
Is complementary to. Preferably S M 2 has the same sequence as S2. P may also contain a label W. P hybridizes with and is extended along with the extended extension probe B (FIG. 1), D (FIG. 2) or F (FIG. 3) to provide an extension primer H consisting of S M 2 and S M ′ 2. formed, S M '2 is complementary to EP2 preferably S'2
Is the same as B, D or F and H are dissociated and P
Is S M '2 and B, D or S'2 hybridize F of H, P is producing B, and each H and H 1 is extended along a D or F and H. H 1 has a sequence complementary to S′2 and S M 2. The duplex is dissociated, hybridized with H 1 and H and extended along them to produce H 1 and H 2 . Repeating this further yields multiple copies of H 1 H 2 , which are detected due to the presence of label W.
【0081】本発明の1つの実施態様において、本方法
は延長プローブの3’末端を修飾し原位置でポリデオキ
シヌクレオチドプライマーを形成するのに使用される。
この実施態様は図7に記載されている。延長プローブは
EP1とEP2を含有し、EP2はプライマー配列SM
2と同等であり随時標識物Wを含有する。延長プローブ
のEP1は標的ポリヌクレオチド配列のS1およびスカ
ベンジャーポリヌクレオチド内の配列(NS3)(これ
は少なくともEP2の一部と相補性である)とハイブリ
ダイズする。S2はEP2と相同である。延長プローブ
はAに沿って延長され、S2に相補性である配列S’2
を含有する延長された延長プローブBを産生する。これ
でBは、互いにハイブリダイズ可能であるEP2とS’
2を含有する。NS3にハイブリダイズした延長プロー
ブは、3’活性を有するエキソヌクレアーゼにより減成
され、これは反応媒体に加えられる。延長プローブはそ
の減成によりポリデオキシヌクレオチドプライマーPが
産生されるように作成され、これは単一プライマー増幅
で使用される。従ってNS3は少なくともその3’末端
でEP2とハイブリダイズし、EP1はエキソヌクレア
ーゼにより減成されて、残りのポリヌクレオチドの3’
末端にEP2が残る。EP2にハイブリダイズしたNS
3により形成される2本鎖の存在により、これ以上の減
成が起きないように反応条件が選ばれる。In one embodiment of the invention, the method is used to modify the 3'end of an extension probe to form a polydeoxynucleotide primer in situ.
This embodiment is described in FIG. The extension probe contains EP1 and EP2, and EP2 is the primer sequence S M
It is equivalent to 2 and contains the labeled substance W at any time. The extender probe EP1 hybridizes to S1 of the target polynucleotide sequence and a sequence (NS3) in the scavenger polynucleotide, which is complementary to at least a portion of EP2. S2 is homologous to EP2. The extender probe extends along A and is of the sequence S'2 which is complementary to S2.
To produce an extended probe B containing B is now EP2 and S'which are hybridizable to each other.
Contains 2. The extension probe hybridized to NS3 is degraded by an exonuclease with 3'activity, which is added to the reaction medium. The extension probe is made so that its degradation produces the polydeoxynucleotide primer P, which is used in a single primer amplification. Therefore, NS3 hybridizes to EP2 at least at its 3'end, and EP1 is degraded by exonuclease to yield 3'of the remaining polynucleotide.
EP2 remains at the end. NS hybridized to EP2
Due to the presence of the double strand formed by 3, the reaction conditions are chosen such that no further degradation occurs.
【0082】延長プローブの減成を調節してポリデオキ
シヌクレオチドプライマーを原位置で産生させる別の便
利な方法は図8に記載されている。これは、3’−エキ
ソヌクレアーゼと、EP2の最後と最後から2番目のヌ
クレオチドの間のホスフェートジエステルの代わりに1
つまたはそれ以上のホスホロチオエートジエステル(−
Sにより図8に示されている)を使用する。標的ポリヌ
クレオチド配列に結合しない延長プローブの減成は、ホ
スホロチオエートジエステルまたは上記ホスホロチオエ
ートの1つまたはそれ以上のヌクレオチド3’で停止す
る。減成された延長プローブは3’末端の近くのホスホ
ロチオエートとともに3’末端に配列EP2を有し、単
一プライマー増幅でプライマーPとして作用して鎖を延
長する。この実施態様においてEP2とSM2は同一で
ある。Another convenient way to control the degradation of the extension probe to generate polydeoxynucleotide primers in situ is set forth in FIG. This replaces the 3'-exonuclease and 1 instead of the phosphate diester between the last and penultimate nucleotides of EP2.
One or more phosphorothioate diesters (-
S) (shown in FIG. 8 by S). Degradation of the extended probe that does not bind to the target polynucleotide sequence stops at the phosphorothioate diester or at one or more nucleotides 3'of the phosphorothioate. The degraded extension probe has the sequence EP2 at the 3'end with phosphorothioates near the 3'end and acts as primer P to extend the chain in a single primer amplification. In this embodiment EP2 and S M2 are the same.
【0083】本発明が標的ポリヌクレオチド配列の複製
に応用される時、上記の実施態様の1つが実施され、以
下のステップが少なくとも1回繰り返される:(a)ポ
リデオキシヌクレオチドプライマーを延長された延長プ
ローブとハイブリダイズしかつこれに沿って延長され
て、延長プローブよりなる第2の2本鎖を形成させ、
(b)延長プライマーを第2の2本鎖から解離させる。
普通この方法は少なくとも3回繰り返され、ここでプラ
イマーはまた延長プライマーとハイブリダイズしこれに
沿って延長されて、延長プライマーよりなる2本鎖が形
成され、延長プライマーは解離される。好ましくは少な
くとも延長プローブの15ヌクレオチド配列EP1がS
1とハイブリダイズする。好ましくはまた、ポリデオキ
シヌクレオチドプライマーは、S2に相補性の配列とハ
イブリダイズ可能な少なくとも15のデオキシヌクレオ
チド配列SM2を含有る。When the present invention is applied to the replication of a target polynucleotide sequence, one of the above embodiments is carried out and the following steps are repeated at least once: (a) an extended extension of the polydeoxynucleotide primer. Hybridizing with and extending along the probe to form a second duplex of extended probes,
(B) The extension primer is dissociated from the second double strand.
Usually, this method is repeated at least three times, where the primer also hybridizes with and extends along with the extension primer to form a duplex consisting of the extension primer and the extension primer is dissociated. Preferably at least the 15 nucleotide sequence EP1 of the extension probe is S
Hybridizes with 1. Preferably also, the polydeoxynucleotide primer contains at least 15 deoxynucleotide sequences S M 2 capable of hybridizing with a sequence complementary to S2.
【0084】好ましくはS1とS2はそれぞれ10から
100ヌクレオチドを含有する。本方法は標的ポリヌク
レオチド配列がDNAまたはRNAでも応用できる。1
つの面においてポリデオキシヌクレオチドプライマーは
レポーター分子で標識される。レポーター分子は例えば
検出可能な基または結合基(例えばビオチンまたはS2
に相補性の配列とハイブリダイズする配列以外のヌクレ
オチド配列)である。延長プライマーはプローブの共有
結合したレポーター分子を用いて検出される。このプロ
ーブは普通、S1またはS2以外の標的ヌクレオチド配
列の一部に相同または相補性のヌクレオチド配列を有す
る。Preferably S1 and S2 each contain 10 to 100 nucleotides. The method can also be applied when the target polynucleotide sequence is DNA or RNA. 1
In one aspect the polydeoxynucleotide primer is labeled with a reporter molecule. Reporter molecules may be, for example, detectable or binding groups (eg biotin or S2
Is a nucleotide sequence other than the sequence that hybridizes with the sequence complementary to. The extension primer is detected using the reporter molecule covalently attached to the probe. The probe typically has a nucleotide sequence that is homologous or complementary to a portion of the target nucleotide sequence other than S1 or S2.
【0085】本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチ
ドを含むと考えられる試料中のポリヌクレオチドの存在
を検出する方法に関する。試料を含む媒体を上記のよう
に処理して、ポリヌクレオチドから存在するかも知れな
い単一鎖標的ポリヌクレオチド配列を形成させる。標的
ポリヌクレオチド配列は2つの隣接しない非相補性のヌ
クレオチド配列S1とS2を有し、ここでS2はS1の
5’であり、少なくとも10ヌクレオチドの長さであ
る。媒体を2つのデオキツヌクレオチド配列を有する延
長プローブと組合せる。延長プローブの3’末端の配列
(EP1)はS1とハイブリダイズする。他方のデオキ
シヌクレオチド配列(EP2)はS2に相同である。標
的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない延長プロー
ブの3’末端を修飾する方法が含まれる。延長プローブ
を修飾してもプライマーが提供されない場合、S2に相
補性のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能なポリデ
オキシヌクレオチドプライマーが含まれる。デオキシヌ
クレオシド3リン酸および1つまたはそれ以上のポリデ
オキシヌクレオチドポリメラーゼも組合わされる。以下
の条件が選ばれる:(1)延長プローブは標的ポリヌク
レオチド配列とハイブリダイズし、これに沿って延長さ
れて2本鎖が形成され、(2)標的ポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズしない延長プローブは修飾され、
(3)延長された延長プローブは2本鎖から解離され、
(4)プライマーは延長配列とハイブリダイズし、これ
に沿って延長されて延長プライマーよりなる第2の2本
鎖が形成され、(5)延長プライマーは2本鎖から解離
され、(6)プライマーは延長プライマーとハイブリダ
イズし、これに沿って延長されて延長プライマーよりな
る2本鎖が形成される。ステップ(5)と(6)は繰り
返され、ステップ(a)と(b)は同時または全体にま
たは部分的に連続的に実施される。次に延長プライマー
の存在を調べる。延長プライマーの存在はポリヌクレオ
チドが存在することを示す。ステップ(5)と(6)は
少なくとも3回、好ましくは少なくとも10回繰り返さ
れる;普通繰り返しの回数は30回未満である。一般に
ステップ(5)と(6)はポリヌクレオチドを正確に検
出するのに充分な回数だけ繰り返される。ポリヌクレオ
チドがRNAの場合ポリデオキシヌクレオチドポリメラ
ーゼは逆転写酵素を含む。Another embodiment of the invention relates to a method of detecting the presence of a polynucleotide in a sample suspected of containing the polynucleotide. The medium containing the sample is treated as described above to form the single-stranded target polynucleotide sequence that may be present from the polynucleotide. The target polynucleotide sequence has two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2, where S2 is 5'of S1 and is at least 10 nucleotides in length. The vehicle is combined with an extender probe having two deoxynucleotide sequences. The sequence at the 3'end of the extension probe (EP1) hybridizes with S1. The other deoxynucleotide sequence (EP2) is homologous to S2. Included is a method of modifying the 3'end of an extender probe that does not hybridize to the target nucleotide sequence. If modification of the extension probe does not provide a primer, a polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to the nucleotide sequence complementary to S2 is included. Deoxynucleoside triphosphates and one or more polydeoxynucleotide polymerases are also combined. The following conditions are selected: (1) The extension probe hybridizes with the target polynucleotide sequence and is extended along the same to form a double strand, and (2) the extension probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence is Qualified,
(3) The extended extension probe is dissociated from the double strand,
(4) The primer hybridizes with the extension sequence and is extended along the extension sequence to form a second double strand consisting of the extension primer, (5) the extension primer is dissociated from the double strand, and (6) the primer Hybridizes with the extension primer and is extended along it to form a duplex consisting of the extension primer. Steps (5) and (6) are repeated and steps (a) and (b) are performed simultaneously or wholly or partially sequentially. Next, the presence of the extension primer is examined. The presence of the extension primer indicates the presence of the polynucleotide. Steps (5) and (6) are repeated at least 3 times, preferably at least 10 times; usually less than 30 times. Generally, steps (5) and (6) are repeated a sufficient number of times to accurately detect the polynucleotide. When the polynucleotide is RNA, the polydeoxynucleotide polymerase comprises reverse transcriptase.
【0086】延長プローブを用いて単一鎖ポリデオキシ
ヌクレオチドを形成し、標的ポリヌクレオチド配列にハ
イブリダイズしない延長プローブを修飾し、増幅する方
法の実施においては、水性媒体が使用される。他の極性
共溶媒も使用され、通常1−6個、さらに一般的には1
−4個の炭素原子の酸素添加有機溶媒(例えばアルコー
ル、エーテルなど)が使用される。普通これらの共溶媒
は約70重量%未満、またはさらに一般的には約30重
量%未満で存在する。In carrying out the method of forming single-stranded polydeoxynucleotides with the extender probe and modifying and amplifying the extender probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence, an aqueous medium is used. Other polar cosolvents are also used, usually 1-6, more commonly 1
-Oxygenated organic solvents of 4 carbon atoms (eg alcohols, ethers etc.) are used. Usually, these cosolvents are present in less than about 70% by weight, or more usually less than about 30% by weight.
【0087】媒体のpHは普通約4.5から9.5の範
囲であり、さらに一般的には約5.5−8.5の範囲、
そして好ましくは6−8の範囲である。内部でハイブリ
ダイズした配列の同時または連続的解離、延長プローブ
と標的ポリヌクレオチド配列および延長プローブの3’
末端を修飾する手段の一部を構成する任意の他の配列と
のハイブリダイゼーション、ポリデオキシヌクレオチド
プライマーと延長された延長プローブおよび延長プライ
マーとのハイブリダイゼーション、エキソヌクレアーゼ
による延長プローブの3’末端の減成、延長された延長
プローブと延長プライマーの解離などが起きるように、
場合によりpHと温度は選択され変更される。ある例で
は、上記ステップを連続的または同時に実施することが
好ましいか否かにより、これらのステップのスピード、
効率および特異性を最適化するために妥協が行なわれ
る。目的のpHを達成し測定中pHを維持するために種
々の緩衝液が使用される。緩衝液の例としては、ホウ酸
緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、バ
ルビタール緩衝液などがある。使用される特定の緩衝液
が本発明において決定的に重要であることはないが、各
方法においては好ましい緩衝液が存在する。The pH of the medium is usually in the range of about 4.5 to 9.5, more usually in the range of about 5.5-8.5,
And it is preferably in the range of 6-8. Simultaneous or sequential dissociation of internally hybridized sequences, extender probe and target polynucleotide sequence and 3 ′ of extender probe
Hybridization with any other sequence that forms part of the means for modifying the ends, hybridization of a polydeoxynucleotide primer with an extended probe and an extended primer, reduction of the 3'end of the extended probe with an exonuclease. So that dissociation of the extended probe and extended primer
Depending on the case, pH and temperature are selected and changed. In one example, the speed of these steps depends on whether it is preferable to perform the steps sequentially or simultaneously.
A compromise is made to optimize efficiency and specificity. Various buffers are used to achieve the desired pH and maintain the pH during the measurement. Examples of buffers include borate buffer, phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, barbital buffer and the like. Although the particular buffer used is not critical to the invention, there are preferred buffers for each method.
【0088】本方法の実施には中程度の温度が使用され
る。本方法の実施には普通媒体は2つから3つの温度で
サイクルされる。本方法の温度は一般に約10から10
5℃、さらに一般的には約40から99℃、好ましくは
50から98℃である。正確な温度は、塩濃度、pH、
使用する溶媒、標的およびS1やS2配列の長さおよび
標的ポリヌクレオチド配列やプライマーの組成により変
化する。延長工程には約30から65℃の比較的低い温
度が使用され、変性やハイブリダイゼーションは約50
から105℃の温度で行われる。エキソヌクレアーゼに
よる延長プローブの3’末端の減成は、普通約15から
105℃、好ましくは20から50℃の温度で行われ
る。Moderate temperatures are used in carrying out the method. In practicing the method, the medium is usually cycled at two to three temperatures. The temperature of the process is generally about 10 to 10
5 ° C, more usually about 40 to 99 ° C, preferably 50 to 98 ° C. The exact temperature depends on salt concentration, pH,
It will vary depending on the solvent used, the target and the length of the S1 or S2 sequence and the composition of the target polynucleotide sequence or primer. Relatively low temperatures of about 30 to 65 ° C are used for the extension step, and denaturation and hybridization is about 50%.
To 105 ° C. Degradation of the 3'end of the extension probe with exonuclease is usually performed at a temperature of about 15 to 105 ° C, preferably 20 to 50 ° C.
【0089】標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズしない延長プローブの3’末端の修飾を行う時間は、
一般的に約0.5から30分、好ましくは1から20分
である。本発明の方法が単一プライマー増幅で使用され
る場合、延長プローブまたはこれに相補性の配列の必要
なコピー数を達成するのに充分な時間行われる。これは
また、増幅を実施する目的(例えばポリヌクレオチドの
測定)に依存する。一般に本方法を実施する時間は、1
サイクル当り約1から10分であり、1から200回ま
たはそれ以上、通常5から80回、しばしば10−60
回のサイクルが使用される。便利さからは、一般にサイ
クルの時間と回数を小さくすることが好ましい。一般に
ある程度の増幅の時間は、例えばポリヌクレオチドポリ
メラーゼを飽和するのに充分なヌクレオシド3リン酸の
濃度を選択し、およびポリヌクレオチドポリメラーゼや
ポリデオキシヌクレオチドプライマーの濃度を増加させ
ることにより、短縮することができる。本方法を実施す
る時間は一般に約5から200分である。便利さの点か
らは普通時間を短くすることが好ましい。The time to modify the 3'end of the extension probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence is
Generally about 0.5 to 30 minutes, preferably 1 to 20 minutes. When the method of the invention is used in single primer amplification, it is carried out for a time sufficient to achieve the required copy number of the extended probe or its complementary sequence. It also depends on the purpose for which the amplification is carried out (eg the measurement of polynucleotides). Generally, the time to perform the method is 1
Approximately 1 to 10 minutes per cycle, 1 to 200 times or more, usually 5 to 80 times, often 10-60
One cycle is used. For convenience, it is generally desirable to reduce the time and number of cycles. Generally, some amplification time can be shortened, for example, by choosing a concentration of nucleoside triphosphate sufficient to saturate the polynucleotide polymerase and increasing the concentration of the polynucleotide polymerase or polydeoxynucleotide primer. it can. The time for carrying out the method is generally about 5 to 200 minutes. In terms of convenience, it is usually preferable to shorten the time.
【0090】上記条件はまた、ポリヌクレオチドから標
的ポリヌクレオチド配列を形成するために選択される。The above conditions are also selected to form the target polynucleotide sequence from the polynucleotide.
【0091】延長プローブの3’末端を修飾する試薬の
量は、修飾を達成するための特定の手段により変化す
る。修飾が延長プローブの3’末端の延長を含む場合、
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼやデオキシヌ
クレオシド3リン酸の濃度は一般に、以下の増幅で記載
される濃度と同等かまたはそれより高く、異なる酵素を
必要とする。標的ポリヌクレオチド配列に沿った延長プ
ローブの延長や増幅に使用される試薬の濃度は、標的ポ
リヌクレオチド配列に結合しない延長プローブを延長す
るのに充分である。任意のスカベンジャーポリヌクレオ
チド配列の濃度は、一般に少なくとも延長プローブの濃
度と同じかまたは通常それより少なくとも10倍高い。The amount of reagent that modifies the 3'end of the extender probe will vary depending on the particular means to accomplish the modification. Where the modification involves extension of the 3'end of the extension probe,
The concentration of template-dependent polynucleotide polymerase and deoxynucleoside triphosphates are generally equal to or higher than the concentrations described in the amplifications below, and require different enzymes. The concentration of reagents used to extend or amplify the extension probe along the target polynucleotide sequence is sufficient to extend the extension probe that does not bind to the target polynucleotide sequence. The concentration of any scavenger polynucleotide sequence is generally at least the same as, or usually at least 10 times higher than, the concentration of the extension probe.
【0092】3’−エキソヌクレアーゼにより延長プロ
ーブの修飾を行う場合、エキソヌクレアーゼの濃度は実
用的な時間(例えば0.5−20分)で必要な程度まで
延長プローブを減成するように選択される。好ましくは
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼはまた3’−
エキソヌクレアーゼ活性を有し、従って鎖の延長と減成
を達成するのに充分であるようにポリメラーゼの濃度が
選ばれる。普通延長プローブの3’末端が完全に減成さ
れる場合、最初の酵素反応中のマグネシウムイオン濃度
は低く(例えば4mM未満)維持され、pHは高く(例
えば8.0以上)維持される。When modifying the extension probe with a 3'-exonuclease, the concentration of the exonuclease is selected to degrade the extension probe to the required extent in a practical amount of time (eg 0.5-20 minutes). It Preferably the template dependent polynucleotide polymerase is also 3'-
The concentration of the polymerase is chosen to have exonuclease activity and thus sufficient to achieve chain extension and degradation. Normally, if the 3'end of the extension probe is completely degraded, the magnesium ion concentration during the initial enzymatic reaction is kept low (eg less than 4 mM) and the pH is kept high (eg 8.0 or higher).
【0093】上記のように延長プローブの濃度は、実質
的にプライマーの濃度より低い。好ましくは延長プロー
ブの濃度はプライマーの濃度の1%より小さく、さらに
好ましくはライマーの濃度の0.1%未満であり、通常
延長プローブの濃度は1ナノモル未満であり、しばしば
0.1ナノモル(nM)未満であり、プライマーの濃度
は通常10ナノモル以上であり、通常少なくとも100
ナノモルである。好ましくはプライマーの濃度は100
nMより大きく、延長プローブの濃度は1nM未満であ
る。As mentioned above, the concentration of the extension probe is substantially lower than the concentration of the primer. Preferably the concentration of the extension probe is less than 1% of the concentration of the primer, more preferably less than 0.1% of the concentration of the lymer, usually the concentration of the extension probe is less than 1 nanomolar, often 0.1 nanomolar (nM ), The concentration of the primer is usually 10 nanomolar or more, and usually at least 100
It is nanomolar. Preferably the primer concentration is 100
Greater than nM and the concentration of extension probe is less than 1 nM.
【0094】コピーされるべき標的ポリヌクレオチド配
列の量は、試料中1または2分子と少ないが、一般に約
102から1010、さらに一般的には試料中約103
から108分子であり、好ましくは試料中少なくとも1
0−21Mであり、10−10から10−19M、さら
に一般的には10−14から10−19Mである。ポリ
デオキシヌクレオチドプライマーの量は少なくとも必要
なコピー数と同じであり、普通試料当り10−13から
10−8モルであり、試料は1−1,000μlであ
る。普通プライマーは少なくとも10−9M、好ましく
は10−7M、さらに好ましくは少なくとも約10−6
Mである。好ましくはポリデオキシヌクレオチドプライ
マーの濃度は実質的に単一鎖ポリヌクレオチドの濃度よ
り過剰であり、好ましくは少なくとも100倍過剰であ
る。The amount of target polynucleotide sequence to be copied is as low as 1 or 2 molecules in the sample, but is generally about 10 2 to 10 10 , more usually about 10 3 in the sample.
To 10 8 molecules, preferably at least 1 in the sample
0-21 M, 10-10 to 10-19 M, and more typically 10-14 to 10-19 M. The amount of polydeoxynucleotide primer is at least as high as the required copy number, usually 10 −13 to 10 −8 mol per sample, and the sample is 1-1000 μl. Ordinarily primers are at least 10 -9 M, preferably 10 -7 M, more preferably at least about 10 -6 M.
It is M. Preferably, the concentration of polydeoxynucleotide primer is substantially in excess of that of the single-stranded polynucleotide, preferably at least a 100-fold excess.
【0095】媒体中のデオキシヌクレオシド3リン酸の
濃度は大きく変動する:好ましくはこれらの試薬は過剰
量存在する。普通デオキシヌクレオシド3リン酸は10
−6から10−2M、好ましくは10−5から10−3
Mである。The concentration of deoxynucleoside triphosphates in the medium varies widely: preferably these reagents are present in excess. Ordinary deoxynucleoside triphosphate is 10
-6 to 10-2M, preferably 10-5 to 10-3
It is M.
【0096】鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ
の濃度は普通経験的に決められる。好ましくは充分な濃
度が使用され、濃度が増加しても増幅に必要な時間が5
倍、好ましくは2倍以上増加しない。主要な制限因子は
一般的に試薬のコストである。The concentration of template-dependent polynucleotide polymerase is usually empirically determined. A sufficient concentration is preferably used, and even if the concentration is increased, the time required for amplification is 5
It does not increase more than twice, preferably more than twice. The major limiting factor is generally the cost of reagents.
【0097】組合せを作成するために種々の試薬を組合
せる順序は変化する。一般的に標的ポリヌクレオチド配
列は、このような配列またはポリヌクレオチドを含みこ
のような配列が得られるように処理された試料から得ら
れる。一般に標的ポリヌクレオチド配列と延長プローブ
は、標的ポリヌクレオチド配列に結合しない延長プロー
ブの3’末端の修飾に必要な任意のポリヌクレオチド配
列、デオキシヌクレオシド3リン酸、鋳型依存性ポリヌ
クレオチドポリメラーゼおよび適宜3’−エキソヌクレ
アーゼのあらかじめ調製された組合せと組合わされる。
必要な場合には、調製された組合せ中に含有されるか、
または後で添加される。しかし上記のすべての同時添
加、および段階的添加または連続的添加が用いられる。The order in which the various reagents are combined to create the combination varies. In general, the target polynucleotide sequence will be obtained from a sample containing such a sequence or polynucleotide and treated to obtain such a sequence. Generally, the target polynucleotide sequence and the extension probe are any polynucleotide sequence required for modification of the 3'end of the extension probe that does not bind to the target polynucleotide sequence, deoxynucleoside triphosphates, template-dependent polynucleotide polymerase and optionally 3 '. -Combined with a pre-made combination of exonucleases.
Included in the prepared combination, if necessary,
Or added later. However, all of the above simultaneous additions and stepwise or continuous additions are used.
【0098】試薬の濃度と添加順序および方法の条件
は、一般に延長プローブのコピー数、このようなコピー
が作成される速度および複製の忠実度を上昇させる必要
性に支配される。一般に延長プローブのコピー数を少な
くとも102倍、好ましくは104倍、さらに好ましく
は106倍増加させることが好ましい。Reagent concentrations, order of addition and method conditions are generally governed by the copy number of the extended probe, the rate at which such copies are made and the need to increase the fidelity of replication. Generally it is preferred to increase the copy number of the extender probe by at least 10 2 fold, preferably 10 4 fold, more preferably 10 6 fold.
【0099】ポリヌクレオチドの検出に応用される本発
明の方法の実施において、媒体、pH、温度、および時
間は上記のように考慮される。In practicing the method of the present invention as applied to the detection of polynucleotides, media, pH, temperature, and time are considered above.
【0100】種々の試薬の濃度は一般に目的のポリヌク
レオチドの濃度範囲により決定されるが、各試薬の最終
濃度は普通目的の範囲で測定の感度を最適化するために
経験的に決められる。測定における他の試薬の濃度は、
上記増幅法で記載したのと同じ原理に従い決定される。
主に考慮すべきことは、ポリヌクレオチド配列に比較し
て延長プローブの存在しない延長プライマーの充分なコ
ピー数が産生され、従ってこのようなコピーが容易に検
出され、ポリヌクレオチドの正確な測定が可能になるよ
うにすることである。The concentrations of the various reagents are generally determined by the concentration range of the polynucleotide of interest, but the final concentration of each reagent is usually empirically determined to optimize the sensitivity of the assay in the range of interest. The concentration of other reagents in the measurement is
It is determined according to the same principle as described in the amplification method above.
The main consideration is that a sufficient copy number of the extension primer is produced in the absence of the extension probe as compared to the polynucleotide sequence, and thus such a copy is easily detected, allowing accurate measurement of the polynucleotide. Is to be.
【0101】延長プライマーのコピーは種々の方法で検
出される。例えば本方法では、ポリデオキシヌクレオチ
ドプライマーの分子はレポーター分子(例えばリガン
ド、小有機分子、ポリヌクレオチド配列、蛋白、支持
体、オペレーター−リプレッサー対、挿入色素など)で
標識される。The copy of the extension primer can be detected in various ways. For example, in the method, a molecule of polydeoxynucleotide primer is labeled with a reporter molecule (eg, ligand, small organic molecule, polynucleotide sequence, protein, support, operator-repressor pair, intercalating dye, etc.).
【0102】特定の標識物またはレポーター分子および
その検出の例は、米国特許出願第07/555,323
号(1990年7月19日出願)(またヨーロッパ特許
469755号も参照)に見いだされ、その関連する開
示内容は参考のためここに引用されている。Examples of specific labels or reporter molecules and their detection are given in US patent application Ser. No. 07 / 555,323.
No. (filed Jul. 19, 1990) (see also EP 469755), the relevant disclosure content of which is incorporated herein by reference.
【0103】他の測定法および検出法は、米国特許出願
第07/299,282号(1989年1月19日出
願)および07/399,795号(1989年8月2
9日出願)(またヨーロッパ特許379369号も参
照)に開示されており、これらは参考のためここに引用
されている。Other methods of measurement and detection are described in US patent application Ser. Nos. 07 / 299,282 (filed Jan. 19, 1989) and 07 / 399,795 (Aug. 2, 1989).
Filed 9th) (see also EP 379369), which are hereby incorporated by reference.
【0104】特異的に核酸配列を検出する標準的方法を
使用することができる。Standard methods of specifically detecting nucleic acid sequences can be used.
【0105】核酸を検出する1つの方法は核酸プローブ
を使用する。One method of detecting nucleic acids uses nucleic acid probes.
【0106】プローブを使用する1つの方法は、米国特
許出願第773,386号(1985年9月6日出願)
うUS4868104)に記載されており、その開示内
容は参考のためここに引用されている。One method of using a probe is US Patent Application No. 773,386 (filed Sep. 6, 1985).
U.S. Pat. No. 4,868,104), the disclosure content of which is incorporated herein by reference.
【0107】シグナルの検出法は用いるシグナル産生系
の性質に依存する。レポーター基の標識物が酵素である
なら、シグナル産生系の追加のメンバーとしては酵素基
質などがある。酵素反応の生成物は好ましくは発光性生
成物、または蛍光性または非蛍光性色素(いずれも分光
学的方法により検出される)、または他の分光学的また
は電気磁気学的に検出される生成物である。標識物が蛍
光性分子の場合は、媒体に光を照射し蛍光を測定する。
標識物が放射性基の場合は、媒体は計測されて放射カウ
ントを測定する。The method of detecting a signal depends on the nature of the signal producing system used. If the reporter group label is an enzyme, additional members of the signal producing system include an enzyme substrate. The product of the enzymatic reaction is preferably a luminescent product, or a fluorescent or non-fluorescent dye (both detected by spectroscopic methods), or other spectroscopically or electromagnetically detected product. It is a thing. When the labeling substance is a fluorescent molecule, the medium is irradiated with light and the fluorescence is measured.
If the label is a radioactive group, the medium is counted to measure the radiation count.
【0108】本発明で使用される延長プローブ、ポリデ
オキシヌクレオチドプライマー、または他のポリヌクレ
オチド配列を調製するには、種々の方法を用いることが
できる。これらは生物学的合成または化学合成により得
られる。短い配列(約100ヌクレオチドまで)には、
生物学的合成よりも化学合成の方がしばしば経済的であ
る。経済的な問題の外に、化学合成法は低分子量化合物
の取り込みおよび/または合成工程中の修飾塩基の取り
込みには便利な方法である。さらに化学合成法は、標的
ポリヌクレオチド結合配列の長さや領域の選択に非常に
柔軟性がある。延長プローブ、ポリデオキシヌクレオチ
ドプライマーおよび他のポリヌクレオチドは標準的方法
(例えば市販の自動核酸合成機)を使用して合成でき
る。適当に修飾したガラスまたは樹脂の上でのDNAの
化学合成では、表面に結合したDNAが得られる。これ
は洗浄や試料の取扱に有利である。より長い配列には分
子生物学で使用される標準的複製法が使用される(例え
ばメシング(J.Messing)、(1983)Me
thods Enzymol.101、20−78に記
載の単一鎖DNAへのM13の使用)。A variety of methods can be used to prepare the extension probes, polydeoxynucleotide primers, or other polynucleotide sequences used in the present invention. These are obtained by biological or chemical synthesis. For short sequences (up to about 100 nucleotides):
Chemical synthesis is often more economical than biological synthesis. In addition to economic concerns, chemical synthetic methods are convenient methods for incorporating low molecular weight compounds and / or incorporating modified bases during the synthetic process. In addition, chemical synthesis methods are very flexible in choosing the length and region of the target polynucleotide binding sequence. Extension probes, polydeoxynucleotide primers and other polynucleotides can be synthesized using standard methods (eg, commercially available automated nucleic acid synthesizers). Chemical synthesis of DNA on appropriately modified glass or resin yields surface bound DNA. This is advantageous for cleaning and sample handling. Standard replication methods used in molecular biology are used for longer sequences (eg J. Messaging, (1983) Me.
methods Enzymol. 101, 20-78 for the use of M13 on single-stranded DNA).
【0109】オリゴヌクレオチド合成の他の方法には、
ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法(ナラン
グ(Narang)ら、(1979)Meth.enz
ymol 68:90)、および支持体上での合成(ボ
カージ(Beaucage)ら、(1981)Tetr
ahedron Letters 22:1859−1
862)、およびホスホルアミデート法、カルサーズ
(Caruthers,M)ら、”Methods i
n Enzymology,”Vol.154,287
−314(1988)、および”Synthesis
and Applications of DNA a
nd RNA,”ナラング(S.A.Narang)
編、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク、1987年、およびに本明細書中
に含まれている文献に記載の方法がある。Other methods of oligonucleotide synthesis include:
The phosphotriester and phosphodiester method (Narang et al., (1979) Meth. Ez.
ymol 68:90) and synthesis on a support (Beaucage et al., (1981) Tetr.
ahedron Letters 22: 1859-1
862), and the phosphoramidate method, Caruthers, M., et al., "Methods i.
n Enzymology, "Vol. 154, 287.
-314 (1988), and "Synthesis."
and Applications of DNA a
nd RNA, "Narang.
Hen, Academic Press (Academic Press)
s), New York, 1987, and in the literature included herein.
【0110】少なくとも1つのホスホロチオエートジエ
ステルを含有する延長プローブは公知の方法で調製され
る。オリゴヌクレオチド合成は、ホスホロチオエートジ
エステルの導入が好ましい点までは上記の方法で実施さ
れる。ホスホロチオエートジエステルは種々の方法で導
入される(例えば市販されているジシクロスルフィドま
たはテトラエチルチウラムジスルフィドなどのチオール
化試薬を用いる酸化)。次に残りのヌクレオチドが導入
される。ポリヌクレオチドを含有するホスホロチオエー
トを調製する他の方法は、W09008838)W08
911486、米国特許第4,910,300号、ヨー
ロッパ特許第318245号に記載されており、その関
連する開示内容は参考のため本明細書中に引用されてい
る。ポリヌクレオチドを含有するホスホロチオエート調
製の他の方法は、(a)ヤウ(Yau)ら、Tetra
hedron Lett.(1990)31(14):
1953−1956;(b)ブリル(Brill)ら、
同上(1989)30(48):6621−6624;
(c)カルサーズ(Caruthers)ら、Nucl
eic Acids Symp.Ser.(1989)
21:119−120;(d)カルサーズ(carut
hers)ら、Nucleosides Nucleo
tides(1988)8(5−6):1011−10
14;(e)ブリル(Brill)ら、J.Am.Ch
em.Soc.(1989)111(6):2321−
2322に記載されている。Extender probes containing at least one phosphorothioate diester are prepared by known methods. Oligonucleotide synthesis is carried out as described above up to the point where the introduction of phosphorothioate diesters is preferred. The phosphorothioate diesters are introduced in a variety of ways (eg, oxidation with commercially available dicyclosulfide or thiolation reagents such as tetraethylthiuram disulfide). The remaining nucleotides are then introduced. Other methods for preparing phosphorothioates containing polynucleotides are described in W09908838) W08.
911486, U.S. Pat. No. 4,910,300, European Patent 318245, the relevant disclosures of which are incorporated herein by reference. Other methods of preparing phosphorothioate containing polynucleotides are described in (a) Yau et al., Tetra.
hedron Lett. (1990) 31 (14):
1953-1956; (b) Brill et al.,
Ibid. (1989) 30 (48): 6621-6624;
(C) Caruthers et al., Nucl
eic Acids Symp. Ser. (1989)
21: 119-120; (d) caruturs (carut)
hers) et al., Nucleosides Nucleo
tides (1988) 8 (5-6): 1011-10.
14; (e) Brill et al., J. Am. Am. Ch
em. Soc. (1989) 111 (6): 2321-
2322.
【0111】ある例では、鋳型依存性DNAポリメラー
ゼとの反応を防止するためまたは結合配列を加えるため
にポリヌクレオチドの3’末端が修飾される。例えばジ
デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの結合の
後過ヨー素酸でリボースを酸化し、次に得られたジアル
デヒドを水素化ホウ素およびアミノデキストランのよう
な大きなアミンで還元的アミノ化をすることにより修飾
される。In one example, the 3'end of the polynucleotide is modified to prevent reaction with a template-dependent DNA polymerase or to add a binding sequence. For example, by conjugating a dideoxynucleotide or ribonucleotide to oxidize ribose with periodate and then modifying the resulting dialdehyde by reductive amination with a large amine such as borohydride and aminodextran. R.
【0112】本発明のあらかじめ決められた量の試薬
は、便利さの点からパッケージされた組合せのキット中
で提供することができる。試料中のポリヌクレオチドの
測定において本発明で有用なキットは、他の試薬ととも
にパッケージされた状態で、ポリヌクレオチドから標的
ポリヌクレオチド配列を形成するための試薬、その3’
末端に標的ポリヌクレオチド配列中の最初の配列とハイ
ブリダイズ可能な配列および標的ポリヌクレオチド配列
の第2の配列に相同の配列を有する延長プローブ(ここ
で第2の配列は最初の配列の5’であり隣接していな
い)、およびポリデオキシヌクレオチドプライマー(こ
れは標識されているか基が結合しており、配列が標識物
または支持体に結合されるようにする)を含有する。こ
のキットはさらに、標的ポリヌクレオチド配列に結合す
ることができる標識されたポリヌクレオチドプローブ、
延長プローブの3’末端を修飾するのに必要であり標的
ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしていない任意
のポリヌクレオチド配列、および適宜3’−エキソヌク
レアーゼを含有する。このキットはさらにパッケージさ
れた組合せで、デオキシヌクレオシド3リン酸、例えば
デオキシアデノシン3リン酸(dATP)、デオキシグ
アノシン3リン酸(dGTP)、デオキシシチジン3リ
ン酸(dCTP)、およびデオキシチミジン3リン酸
(dTTP)を含有する。複数のコピーの産生方法に使
用するには、プライマーが延長プローブの減成により産
生されない場合キットはポリデオキシヌクレオチドプラ
イマーを含有してもよい。このキットはさらにポリデオ
キシヌクレオチドポリメラーゼおよびシグナル産生系の
メンバー、および種々の緩衝化媒体(このあるものは上
記の1つまたはそれ以上の試薬を含む)を含有すること
もできる。The predetermined amounts of reagents of the present invention can be provided in a packaged combination kit for convenience. A kit useful in the present invention for the determination of polynucleotides in a sample is a reagent for forming a target polynucleotide sequence from a polynucleotide, packaged with other reagents, 3 ′ thereof.
An extension probe having a sequence at the end which is hybridizable with the first sequence in the target polynucleotide sequence and a sequence homologous to the second sequence of the target polynucleotide sequence, wherein the second sequence is 5'of the first sequence. And non-adjacent), and a polydeoxynucleotide primer, which is labeled or has a group attached, allowing the sequence to be attached to a label or support. The kit further comprises a labeled polynucleotide probe capable of binding to the target polynucleotide sequence,
It contains any polynucleotide sequence required to modify the 3'end of the extender probe and not hybridized to the target polynucleotide sequence, and optionally a 3'-exonuclease. The kit is further packaged in combination with deoxynucleoside triphosphates such as deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxycytidine triphosphate (dCTP), and deoxythymidine triphosphate. (DTTP) is contained. For use in multiple copy production methods, the kit may contain polydeoxynucleotide primers if the primers are not produced by degradation of the extension probe. The kit can also include polydeoxynucleotide polymerase and members of the signal producing system, and various buffering media, some of which include one or more of the reagents described above.
【0113】本方法中で起きる反応を実質的に最適化
し、さらに測定の感度を実質的に最適化する試薬の濃度
を提供するために、キット中の種々の試薬の相対量は大
きく変動する。状況に応じキット中の1つまたはそれ以
上の試薬は、乾燥粉末(通常凍結乾燥されており、賦形
剤を含む)として提供され、これは溶解することにより
本発明の測定法を実施するのに適した濃度を有する試薬
溶液を提供する。各試薬は別の容器に包装されている
か、またはいくつかの試薬は交差反応性と試薬の寿命が
許す限り1つの容器に入っていてもよい。The relative amounts of the various reagents in the kit vary widely in order to provide a concentration of reagents that substantially optimize the reactions that occur in the method, and which also substantially optimize the sensitivity of the assay. Optionally, one or more reagents in the kit are provided as a dry powder (usually lyophilized and containing excipients) that dissolves to perform the assay of the invention. A reagent solution having a concentration suitable for is provided. Each reagent may be packaged in a separate container, or some reagents may be contained in one container as cross-reactivity and reagent life permit.
【0114】例 発明はさらに次の具体例により示される。別に示さない
限り温度は摂氏(°C)であり、部分およびパーセンテ
ージは重量によるものである。EXAMPLES The invention is further illustrated by the following specific examples. Temperatures are in degrees Celsius (° C) and parts and percentages are by weight unless otherwise indicated.
【0115】例1 エキソヌクレアーゼ消化による伸長プローブの修飾 オリゴデオキシリボヌクレオチド配列1および2: ポリヌクレオチド伸長プローブ; オリゴマー1 5′TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT TTG TCG AAA TCC
GCG ACC TGC TCC ATG TTA C
T3′(配列番号1)および 増幅用ポリデオキシヌクレオチドプライマー; オリゴマー2 5′TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT T3′(配列番号2) が、(「オリゴヌクレオチド合成:実践的アプロー
チ」、M.J.Gait編、IRL Press(Ox
ford、英国)、1984年のT.Atkinson
およびM.Smithによる)ホスフォアミダイト法に
より合成、標準法による変性ポリアクリルアミドゲルを
用いて精製された。伸長プローブであるオリゴマー1の
5’端の25塩基はポリデオキシヌクレオチドプライマ
ーであるオリゴマー2と同一であり、分子内の塩基対構
造をもつ増幅可能なポリヌクレオチド配列を精製するた
めに使用された。Example 1 Modification of extension probe by exonuclease digestion Oligodeoxyribonucleotide sequences 1 and 2: Polynucleotide extension probe; Oligomer 1 5'TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT TTG TCG AAA TCC
GCG ACC TGC TCC ATG TTA C
T3 '(SEQ ID NO: 1) and polydeoxynucleotide primer for amplification; Oligomer 2 5'TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT T3 ′ (SEQ ID NO: 2) is (“Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach”, edited by M. J. Gait, IRL Press (Ox
Ford, UK), 1984 T.S. Atkinson
And M.M. Synthetic by the phosphoramidite method (by Smith) and purified using denaturing polyacrylamide gel by standard method. Twenty-five bases at the 5'end of the extension probe, oligomer 1, was identical to the polydeoxynucleotide primer, oligomer 2, and was used to purify an amplifiable polynucleotide sequence having an intramolecular base pair structure.
【0116】最初の増幅可能な構造を形成するためのオ
リゴマー1および増幅を行うためのオリゴマー2を用い
て、標的ポリヌクレオチドバクテリオファージM13m
p19(二重鎖複製型、7250塩基対、Bethes
da Research Laboratories)
のDNA増幅のプロトコールが使用された。10ピコモ
ル(pmol)のオリゴマー1および600分子のM1
3mp19が10mMKCl、10mM(NH4)2
SO4、20mM Tris−HCl(25℃でpH
8.8)、2mM MgSO4、0.1%Triton
X−100および20ナノモル(nmoles)のd
NTPの緩衝液中で混合された。伸長プローブのオリゴ
マー1を鋳型にアニールさせるために反応液を95°C
で5分間変性させ、室温まで冷却した後、5単位のT7
DNAポリメラーゼ(New England Bio
labs)、5単位のT4DNAポリメラーゼ(Bet
hesda Research Laboratori
es)または4単位のKlenow断片(US Bio
chemical)が反応液に添加され、37°Cで5
から10分間インキュベートされた。このインキュベー
トの間に、標的ポリヌクレオチドにアニールしなかった
伸長プローブオリゴマー1は上記酵素の3’から5’エ
キソヌクレアーゼ活性により分割された。標的ポリヌク
レオチドにアニールした伸長プローブは、分子内の塩基
対構造をもつ増幅可能なポリヌクレオチドを形成するた
めに酵素のポリメラーゼ活性により伸長された。T7、
T4またはKlenowポリメラーゼはその後95°C
で2分間インキュベートすることにより熱不活性化さ
れ、反応液は再び室温まで冷却された。100pmol
eのオリゴマー2および1から2単位のVent DN
Aポリメラーゼ(NewEngland Biolab
s)が再び最終容量100マイクロリットル(μl)に
対して添加された。90°C(30秒)、55°C(1
分)及び72°C(最初の10サイクルは5分、その後
は1.5分)の温度循環が、上記の3種の温度による多
くのサイクルのためにプログラム可能なサーマルサイク
ラー(Ericomp,Inc.)を用いて行われた。
これらの反応の液体が温度循環の最後に回収され、1x
TAE緩衝液(40mM Tris−酢酸(23°Cで
pH10.3)、10mM EDTA)中の1.2%ア
ガロース(Seakem GTG、FMC BioPr
oducts)ゲルによる電気泳動により解析され、D
NA産物は臭化エチジウムでのゲルの染色により可視化
された。Using the oligomer 1 to form the initial amplifiable structure and the oligomer 2 to carry out the amplification, the target polynucleotide bacteriophage M13m
p19 (duplex replication type, 7250 base pairs, Bethes
da Research Laboratories)
The DNA amplification protocol was used. 10 picomoles (pmol) of oligomer 1 and 600 molecules of M1
3mp19 is 10 mM KCl, 10 mM (NH4) 2
SO4, 20 mM Tris-HCl (pH at 25 ° C
8.8) 2 mM MgSO4, 0.1% Triton
X-100 and 20 nmoles of d
Mixed in NTP buffer. The reaction solution was heated at 95 ° C. to anneal the oligomer 1 of the extension probe to the template.
After denaturing for 5 minutes and cooling to room temperature, 5 units of T7
DNA polymerase (New England Bio)
labs), 5 units of T4 DNA polymerase (Bet
hesda Research Laboratori
es) or 4 units of Klenow fragment (US Bio
chemical) is added to the reaction mixture and the mixture is added at 37 ° C for 5
Was incubated for 10 minutes. During this incubation, the extended probe oligomer 1 that did not anneal to the target polynucleotide was cleaved by the 3'to 5'exonuclease activity of the enzyme. The extended probe annealed to the target polynucleotide was extended by the polymerase activity of the enzyme to form an amplifiable polynucleotide with an intramolecular base pair structure. T7,
T4 or Klenow polymerase then 95 ° C
The mixture was heat-inactivated by incubating at room temperature for 2 minutes, and the reaction solution was cooled to room temperature again. 100 pmol
e oligomer 2 and 1 to 2 units of Vent DN
A polymerase (NewEngland Biolab
s) was added again to a final volume of 100 microliters (μl). 90 ° C (30 seconds), 55 ° C (1
Min) and 72 ° C (5 min for the first 10 cycles and then 1.5 min) then a thermal cycler (Ericomp, Inc.) programmable for many cycles with the above three temperatures. ) Was used.
The liquid of these reactions is recovered at the end of the temperature cycle, 1x
1.2% agarose (Seakem GTG, FMC BioPr) in TAE buffer (40 mM Tris-acetic acid (pH 10.3 at 23 ° C), 10 mM EDTA).
analyzed by gel electrophoresis,
The NA product was visualized by staining the gel with ethidium bromide.
【0117】3’から5’エキソヌクレアーゼを用いた
処理により完全に標的ポリヌクレオチドにアニールしな
い伸長プローブオリゴマー1を反応液から除去したこと
を確認するために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(U
SB)を用いて32Pで5’端を標識した微量の伸長オ
リゴマー1が反応に含まれた。エキソヌクレアーゼのイ
ンキュベーション後液体は回収され、変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによ
り解析された。この実験から得られた結果は表1に要約
される。To confirm that the extension probe oligomer 1 which did not completely anneal to the target polynucleotide was removed from the reaction solution by treatment with 3'to 5'exonuclease, T4 polynucleotide kinase (U
A small amount of extended oligomer 1 labeled at 32P with SB) was included in the reaction. The liquid was collected after exonuclease incubation and analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography. The results obtained from this experiment are summarized in Table 1.
【0118】[0118]
【表6】 [Table 6]
【0119】表1の結果は、標的ポリヌクレオチドへの
伸長プローブオリゴマー1のアニールの後、しかし増幅
ポリヌクレオチドプライマーおよび熱安定性DNAポリ
メラーゼの添加前に、3’から5’エキソヌクレアーゼ
活性を有するDNAポリメラーゼを用いて反応液を処理
することにより、完全に反応液から全ての伸長プローブ
オリゴマー1が除去され、600の二重鎖DNA標的か
ら増幅させるための分子内の塩基対構造をもつ充分なポ
リヌクレオチドの形成を可能となったことを示してい
る。The results in Table 1 show that DNA with 3'to 5'exonuclease activity was obtained after annealing of the extension probe oligomer 1 to the target polynucleotide, but before addition of the amplification polynucleotide primer and thermostable DNA polymerase. By treating the reaction solution with a polymerase, all the extension probe oligomer 1 was completely removed from the reaction solution, and sufficient poly- mer with an intramolecular base pair structure for amplification from 600 double-stranded DNA targets was obtained. This shows that it is possible to form nucleotides.
【0120】例2 鎖伸長による伸長プローブの修飾 オリゴデオキシリボヌクレオチド配列1および2: ポリヌクレオチド伸長プローブ; オリゴマー1 5’TAG CTA GCA GTA ACA TGG
AGC AGT GTT GTT CCG TTA
GTT CGT TTT ATT TGT CGA A
AT CCG CGA CCT GCT CCA TG
T TAC T3’(配列番号3)および ポリデオキシヌクレオチドプラマー; オリゴマー2 5’TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT T3’(配列番号4) は、ホスフォアミダイト法により合成され、変性ポリア
クリルアミドゲルで精製された。分子内の塩基対構造を
もつ増幅可能なポリヌクレオチドを生成するために用い
られるオリゴマー2(24から48塩基)の全配列がオ
リゴマー1の中に含まれる。オリゴマー1の9から23
および65から79の塩基は15塩基対の幹および41
塩基のループからなる分子内の塩基対構造を形成できる
逆向き繰返し配列を含む。オリゴマー1の5’端の8塩
基は標的ポリヌクレオチド、即ちバクテリオファージM
13mp19とは相補的ではない。Example 2 Modification of extension probe by chain extension Oligodeoxyribonucleotide sequences 1 and 2: Polynucleotide extension probe; Oligomer 1 5'TAG CTA GCA GTA ACA TGG.
AGC AGT GTT GTT CCG TTA
GTT CGT TTT ATT TGT CGA A
AT CCG CGA CCT GCT CCA TG
T TAC T3 ′ (SEQ ID NO: 3) and polydeoxynucleotide plumer; Oligomer 2 5 ′ TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT T3 '(SEQ ID NO: 4) was synthesized by the phosphoramidite method and purified on a denaturing polyacrylamide gel. Included in oligomer 1 is the entire sequence of oligomer 2 (24 to 48 bases) used to generate amplifiable polynucleotides with an intramolecular base pair structure. Oligomer 1 from 9 to 23
And 65 to 79 bases are a 15 base pair stem and 41 bases.
It contains an inverted repeat sequence that can form an intramolecular base-pair structure consisting of a loop of bases. The 5'end 8 bases of oligomer 1 are the target polynucleotide, namely bacteriophage M.
It is not complementary to 13mp19.
【0121】分子内の塩基対構造をもつ最初の増幅可能
な構造を形成するための伸長プローブオリゴマー1およ
び増幅を行うためのオリゴマー2を用いて、バクテリオ
ファージM13mp19(二重鎖複製型、7250塩基
対)のDNA増幅のプロトコールが使用された。10ピ
コモル(pmol)のオリゴマー1、200ピコモルの
オリゴマー2および600分子のM13mp19が10
mM KCl、10mM(NH4)2 SO4、20m
M Tris−HCl(25°CでpH8.8)、2m
M MgSO4、0.1%Triton X−100お
よび20ナノモル(nmoles)のdNTPの緩衝液
中で混合された。伸長プローブオリゴマー1を標的DN
Aにアニールさせるために、反応液は95°Cで5分間
変性され、室温まで冷却された。1から2単位のVen
t DNAポリメラーゼ(NewEngland Bi
olabs)がその後最終容量100マイクロリットル
(μl)に対して添加された。反応液は72°Cで10
分間インキュベートされた。この段階の間に標的ポリヌ
クレオチドにアニールした伸長プローブオリゴマー1は
分子内の塩基対(pb)構造を形成するためにVent
ポリメラーゼにより伸長され、オリゴマー2により増幅
された。標的ポリヌクレオチドにアニールしなかった伸
長プローブオリゴマー1は15bpの幹および8塩基の
5’一本鎖突出を含む分子内幹−ループを形成した。こ
の5’突出は相補ヌクレオチドを用いて、Ventポリ
メラーゼによりうめられた。Ventポリメラーゼによ
りうめられた8塩基は標的ポリヌクレオチドに相補的で
はなかったので、修飾された伸長プローブオリゴマー1
はプライマーとしては不活性となる。標的にアニールし
ているこの伸長プローブは3’端に8塩基のミスマッチ
をもち、それ故Ventポリメラーゼにより伸長されな
い。Bacteriophage M13mp19 (double-stranded replicative, 7250 bases) was prepared using the extended probe oligomer 1 to form the first amplifiable structure with an intramolecular base pair structure and the oligomer 2 to carry out amplification. (Pair) DNA amplification protocol was used. 10 picomoles (pmol) of oligomer 1, 200 picomoles of oligomer 2 and 600 molecules of M13mp19
mM KCl, 10 mM (NH4) 2 SO4, 20 m
M Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 2 m
Mixed in a buffer of M MgSO4, 0.1% Triton X-100 and 20 nmoles of dNTPs. Targeting the extension probe oligomer 1 DN
To anneal to A, the reaction was denatured at 95 ° C for 5 minutes and cooled to room temperature. 1 to 2 units of Ven
t DNA polymerase (NewEngland Bi
olabs) was then added to a final volume of 100 microliters (μl). The reaction solution is 10 at 72 ° C.
Incubated for minutes. During this step, the extension probe oligomer 1 which annealed to the target polynucleotide was subjected to Vent to form an intramolecular base pair (pb) structure.
It was extended by polymerase and amplified by oligomer 2. The extended probe oligomer 1 that did not anneal to the target polynucleotide formed an intramolecular stem-loop containing a 15 bp stem and an 8 base 5'single-stranded overhang. This 5'overhang was filled in by Vent polymerase with complementary nucleotides. The modified extension probe oligomer 1 because the 8 bases filled in by Vent polymerase were not complementary to the target polynucleotide.
Becomes inactive as a primer. This extension probe, which anneals to the target, has an 8 base mismatch at the 3'end and is therefore not extended by Vent polymerase.
【0122】90゜C(30秒)、55゜C(1分)お
よび72゜C(最初の10サイクルは5分、その後は
1.5分)の温度循環が、上記の3種の温度による多く
のサイクルのためにプログラム可能なサーマルサイクラ
ー(Ericomp,Inc.)を用いて行われた。こ
れらの反応の液体が温度循環の最後に回収され、1xT
AE緩衝液(40mM Tris酢酸(23°CでpH
10.3)、10mMEDTA)中の1.2%アガロー
ス(Seakem GTG、FMC BioProdu
cts)ゲルによる電気泳動により解析され、DNA産
物は臭化エチジウムでのゲルの染色により可視化され
た。90 ° C. (30 seconds), 55 ° C. (1 minute) and 72 ° C. (5 minutes for the first 10 cycles, then 1.5 minutes) temperature cycling depends on the above three temperatures. It was performed using a programmable thermal cycler (Ericomp, Inc.) for many cycles. The liquid of these reactions is recovered at the end of the temperature cycle,
AE buffer (40 mM Tris acetic acid (pH at 23 ° C
10.3), 1.2% agarose (Seakem GTG, FMC BioProdu) in 10 mM EDTA).
cts) gel was analyzed by electrophoresis and the DNA product was visualized by staining the gel with ethidium bromide.
【0123】全てのアニールしていない伸長プローブオ
リゴマー1が72゜Cでの最初のインキュベーションの
間にデオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いてVen
tポリメラーゼの作用によりうめられたことを確認する
ために、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(USB)を用
いて32Pで5’端を標識した微量の伸長プローブオリ
ゴマー1が反応に含まれた。72℃での最初のインキュ
ベーション後液体は回収され、変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより解析
された。この実験から得られた結果は表2に要約され
る。All unannealed extension probe Oligomer 1 was venated with deoxyribonucleotide triphosphates during the first incubation at 72 ° C.
To confirm that it was filled in by the action of t polymerase, a small amount of extension probe oligomer 1 labeled at the 5P end with 32P using T4 polynucleotide kinase (USB) was included in the reaction. After the first incubation at 72 ° C, the liquid was collected and analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and autoradiography. The results obtained from this experiment are summarized in Table 2.
【0124】[0124]
【表7】 [Table 7]
【0125】表2の結果は、600分子の二重鎖DNA
標的存在下で、増幅の最初のサイクルの終りにVent
ポリメラーゼにより効果的にうめられ、それにより次の
増幅の循環でプライマーとして作用しなくなる5’一本
鎖突出を用いて、伸長プローブオリゴマーは内部塩基対
構造または幹−ループを形成したことを示す。増幅プラ
イマーは効率的に最初のサイクルで形成された増幅可能
な分子内の塩基対構造の増幅を行った。The results in Table 2 show that 600 molecules of double-stranded DNA
Vent at the end of the first cycle of amplification in the presence of target
It is shown that the extended probe oligomer formed an internal base pair structure or a stem-loop with a 5'single-stranded overhang that was effectively filled by the polymerase, thereby rendering it unusable as a primer in the next round of amplification. The amplification primer efficiently amplified the base pair structure within the amplifiable molecule formed in the first cycle.
【0126】例3 チオリン酸を含むオリゴヌクレオチドを用いた伸長プロ
ーブの修飾 単一のプライマー増幅を用いた約600の二重鎖標的分
子の検出は分解できるチオリン酸を含むオリゴヌクレオ
チドを用いて繰返し示された。オリゴヌクレオチド(5
6塩基)は増幅可能な幹−ループを作る場合に伸長プロ
ーブとして作用し、ヌクレアーゼ処理に続いて、増幅を
行うためにプライマーとして作用する。Example 3 Modification of Extension Probes with Oligonucleotides Containing Thiophosphate Detection of about 600 double stranded target molecules using single primer amplification was repeatedly shown using oligonucleotides containing degradable thiophosphates. Was done. Oligonucleotide (5
6 bases) acts as an extension probe when making an amplifiable stem-loop, and as a primer to perform amplification following nuclease treatment.
【0127】伸長プローブオリゴヌクレオチドの合成は
チオ修飾された結合の位置まで自動的に(4カラムBi
osearch 8750DNA合成機)行われた。手
動による酸化がその後アセトニトリル中の0.1Mテト
ラエチルチウラムジスルフィド(TETD)(Appl
ied Biosystems,Inc.,Foste
r City、CA)を用いて行われた。Applie
d Biosystemsの1991年2月のユーザー
への小冊子第58号のプロトコールにしたがって、通常
のカップリング条件下で残りの塩基が添加された。本例
では、同一の配列で、以下に見られるようにチオリン酸
のヌクレオチド間の結合の数および位置だけが異なる二
つの異なる伸長プローブが別の実験にそれぞれ用いられ
た。The synthesis of extension probe oligonucleotides was automated (4 column Bi
(Osearch 8750 DNA synthesizer). Manual oxidation followed by 0.1M tetraethylthiuram disulfide (TETD) (Appl in acetonitrile).
ied Biosystems, Inc. , Foste
r City, CA). Applie
The remaining base was added under normal coupling conditions according to the protocol of d Biosystems, February 1991, Booklet No. 58 to Users. In this example, two different extension probes with identical sequences, each differing only in the number and position of the internucleotide linkages of thiophosphate, were used in separate experiments.
【0128】幹−ループ分子の形成および増幅は、適当
な緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.8、
10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2m
MMgSO4および0.1%Triton X−10
0)、dNTP(200から300マイクロモーラ
ー)、二重鎖標的ポリヌクレオチド分子(600分子の
M13mp19)および伸長プローブ(初濃度0.5か
ら4マイクロモーラー)を含む100マイクロリットル
の反応系で行われた。反応物は95℃で5分間熱変性さ
れ、25℃(室温)で15から20分間アニールされ
た。強力な3’エキソヌクレアーゼ活性をもつDNAポ
リメラーゼが添加された(100μlあたり10単位の
T7DNAポリメラーゼ、New England B
iolabs(NEB)、Beverly Mas
s)。標的にアニールした伸長プローブが鎖を伸長さ
れ、一方全てのアニールしなかった伸長プローブはチオ
結合の位置まで分解されるように反応系は37゜Cでイ
ンキュベートされた。分解をモニターするために伸長プ
ローブは5’端を放射線標識された。チオ結合までのア
ニールしなかった伸長プローブの完全分解は1分程で得
られたが、残りの配列は15分までさらに分解に耐性で
あった。伸長/分解が完了した後、反応物は再び95゜
Cで1から2分間熱処理され、それによりT7ポリメラ
ーゼは不活化され、元の標的分子から新たに形成された
幹−ループ分子は変性された。熱安定性ポリメラーゼが
添加され(Stratagene、San Dieg
o、CAのPfu、100μlあたり5単位)反応は前
例に記述されたような方法で循環される。これらの反応
液は1xTBE緩衝液(89mM Tris−ホウ酸、
89mM ホウ酸、0.2mM EDTA)中の1.2
%アガロース(Seakem、EMCBioProdu
cts)ゲルによる電気泳動により解析され、増幅産物
は臭化エチジウム染色により可視化された。The formation and amplification of the stem-loop molecule is carried out in an appropriate buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.8,
10 mM KCl, 10 mM (NH4) 2SO4, 2 m
MMgSO4 and 0.1% Triton X-10
0), dNTPs (200 to 300 micromolar), double-stranded target polynucleotide molecules (600 molecules of M13mp19) and extension probe (initial concentration 0.5 to 4 micromolar) in a 100 microliter reaction system. It was The reaction was heat denatured at 95 ° C for 5 minutes and annealed at 25 ° C (room temperature) for 15 to 20 minutes. DNA polymerase with strong 3'exonuclease activity was added (10 units of T7 DNA polymerase per 100 μl, New England B.
iolabs (NEB), Beverly Mas
s). The reaction was incubated at 37 ° C. so that the extension probes that annealed to the target had their strands extended, while all unannealed extension probes were cleaved to the position of the thio bond. The extension probe was radiolabeled at the 5'end to monitor degradation. Complete degradation of the unannealed extension probe up to the thio bond was obtained in about 1 minute, while the remaining sequences were more resistant to degradation by 15 minutes. After extension / degradation was complete, the reaction was again heat-treated at 95 ° C for 1-2 minutes, which inactivated the T7 polymerase and denatured the newly formed stem-loop molecule from the original target molecule. . A thermostable polymerase was added (Stratagene, San Diego.
o, 5 units per 100 μl of Pfu of CA) reaction is cycled as described in the previous example. These reaction solutions were 1 × TBE buffer (89 mM Tris-borate,
1.2 in 89 mM boric acid, 0.2 mM EDTA)
% Agarose (Seakem, EMCBioProdu
cts) gel analysis and amplification products were visualized by ethidium bromide staining.
【0129】チオ結合を含む伸長プローブ: 1.A34およびT35の間の一つのチオリン酸結合
(↓): a)分解後に残った23塩基のプライマー(下線) 3’ TC ATT GTA CCT CGT CCA
GCG CCTAAA GCT G T T T A
↓T T T T G C T T GA T TG
CCTTGTTGT 5’(配列番号5) 2.T33およびT36の間の三個のチオリン酸結合
(↓): a)分解後に残った三種のプライマー(24、23、2
2塩基)の混合物(下線) Extension probe containing a thio bond: One thiophosphate bond between A34 and T35 (↓): a) 23 base primer remaining after degradation (underlined) 3'TC ATT GTA CCT CGT CCA
GCG CCTAAA GCT G T T T A
↓ T T T T G C T T G A T T G
CCTTGTTTGT 5 '(SEQ ID NO: 5) 1. Three thiophosphate bonds (↓) between T33 and T36: a) Three primers (24, 23, 2) remaining after degradation
2 bases) mixture (underlined)
【0130】本発明はまた第二の解釈として、核酸増幅
のプライマーとしてのチオリン酸を含むオリゴヌクレオ
チドの一般的使用に関するものである。The invention also relates in a second aspect to the general use of thiophosphate-containing oligonucleotides as primers for nucleic acid amplification.
【0131】本発明の解釈の要約 本発明の具体例として、一本鎖標的ポリヌクレオチド配
列(「標的配列」)に相補的なポリヌクレオチド配列を
形成する方法が記述される。方法は(a)標的配列の
3’端へ少なくとも一つのリン酸の酸素が硫黄に置換さ
れているヌクレオチド一リン酸を含む3’端をもつポリ
ヌクレオチドプライマーをハイブリダイズすること、
(b)標的配列に沿ってポリヌクレオチドプライマーを
伸長すること、および(c)標的配列から伸長したポリ
ヌクレオチドプライマーを解離する段階からなる。Summary of Interpretation of the Invention As an embodiment of the present invention, a method of forming a polynucleotide sequence complementary to a single-stranded target polynucleotide sequence ("target sequence") is described. The method comprises: (a) hybridizing to a 3'end of a target sequence a polynucleotide primer having a 3'end containing a nucleotide monophosphate in which at least one phosphate oxygen has been replaced by sulfur.
(B) extending the polynucleotide primer along the target sequence, and (c) dissociating the extended polynucleotide primer from the target sequence.
【0132】本発明の別の具体例は、酸素の代わりにリ
ンへの硫黄結合が存在することを除いて、一本鎖標的ポ
リヌクレオチド配列(「標的配列」)と同一の配列をも
つポリヌクレオチド配列を形成する方法である。方法は
(a)標的配列の3’端へ少なくとも一つのリンの結合
を含む第一のポリヌクレオチドプライマー(「第一プラ
イマー」)をハイブリダイズし、(b)第一プライマー
を標的配列に沿って伸長し、(c)標的配列から伸長し
た第一プライマーを解離し、(d)伸長した第一プライ
マーの3’端へ第一プライマーと同一または異なる第二
のポリヌクレオチドプライマー(「第二プライマー」)
をハイブリダイズすること、および(e)第一および第
二プライマーが同一の場合、伸長した第一プライマーが
第一プライマーの鋳型であり、第一および第二プライマ
ーが異なる場合、伸長した第一プライマーが第二プライ
マーの鋳型で、伸長した第二プライマーが第一プライマ
ーの鋳型であるような伸長した第二プライマーを形成す
るために伸長した第一プライマーに沿って第二プライマ
ーを伸長する段階からなる。Another embodiment of the invention is a polynucleotide having a sequence identical to the single stranded target polynucleotide sequence ("target sequence"), except that a sulfur bond to phosphorus is present instead of oxygen. It is a method of forming an array. The method comprises: (a) hybridizing a first polynucleotide primer ("first primer") containing at least one phosphorus bond to the 3'end of the target sequence, and (b) the first primer along the target sequence. A second polynucleotide primer that is the same or different from the first primer (“the second primer”) that is extended and (c) dissociates the extended first primer from the target sequence, and (d) to the 3 ′ end of the extended first primer. )
And (e) when the first and second primers are the same, the extended first primer is the template for the first primer, and when the first and second primers are different, the extended first primer Is a template for the second primer and the extended second primer comprises extending the second primer along the extended first primer to form an extended second primer such that the extended second primer is the template for the first primer. .
【0133】本発明の方法は複数の標的ポリヌクレオチ
ド配列のコピーを形成する方法に適用される。一般に、
これらの方法は標的配列または伸長したポリヌクレオチ
ドプライマーに沿って伸長産物が標的配列のコピーであ
るようなポリヌクレオチドプライマーの伸長産物を形成
する段階を含む。本発明により提供される改良は少なく
とも一つのリン−硫黄結合を含むヌクレオチド一リン酸
からなる3’端をもつプライマーを含む。The methods of the invention apply to methods of making multiple copies of a target polynucleotide sequence. In general,
These methods include forming along the target sequence or an extended polynucleotide primer an extension product of the polynucleotide primer such that the extension product is a copy of the target sequence. The improvements provided by the present invention include primers with a 3'end consisting of a nucleotide monophosphate containing at least one phosphorus-sulfur bond.
【0134】したがって、本発明のこの解釈における具
体例はポリヌクレオチド配列の複数のコピーを生産する
方法である。方法は(a)(1)そのようなポリヌクレ
オチド配列をもち、それぞれの端で少なくとも部分的に
相補的な第一および第二の隣接配列により隣接する一本
鎖ポリヌクレオチド、(2)一本鎖ポリヌクレオチドの
3’端で少なくとも一つのチオリン酸結合を含むポリヌ
クレオチドプライマーである第一および第二の隣接配列
の塩基にその3’端でハイブリダイズできる少なくとも
10塩基の部分をもつポリヌクレオチドプライマー、
(3)ヌクレオチド三リン酸、(4)鋳型依存製ポリヌ
クレオチドポリメラーゼを組合わせて準備すること、お
よび(b)全体的に、または部分的に連続的、または共
存的に(1)相補的な配列から一本鎖ポリヌクレオチド
を解離すること、(2)ポリヌクレオチドプライマーを
一本鎖ポリヌクレオチドの3’端に隣接する配列とハイ
ブリダイズすること、(3)第一の伸長ポリヌクレオチ
ドプライマーを提供するために、一本鎖ポリヌクレオチ
ドに沿ってポリヌクレオチドプライマーを伸長するこ
と、(4)第一伸長プライマーおよび一本鎖ポリヌクレ
オチドを解離すること、(5)第一伸長ポリヌクレオチ
ドプライマーとポリヌクレオチドプライマーをハイブリ
ダイズさせること、(6)第二伸長ポリヌクレオチドプ
ライマーを提供するために第一伸長プライマーに沿っ
て、ポリヌクレオチドプライマーを伸長すること、
(7)第一伸長ポリヌクレオチドプライマーから第二伸
長ポリヌクレオチドプライマーを解離すること、および
(8)上記の(5)から(7)の段階を繰り返すという
条件でこの組合わせをインキュベートすることからな
る。Accordingly, an embodiment of this aspect of the invention is a method of producing multiple copies of a polynucleotide sequence. The method comprises: (a) (1) a single-stranded polynucleotide having such a polynucleotide sequence and flanked by at least partially complementary first and second flanking sequences at each end, (2) a single strand A polynucleotide primer comprising at least one thiophosphate bond at the 3'end of a chain polynucleotide, the polynucleotide primer having a portion of at least 10 bases hybridizable at its 3'end to the bases of the first and second flanking sequences. ,
(3) nucleotide triphosphate, (4) preparing in combination with a template-dependent polynucleotide polymerase, and (b) wholly or partially continuously or coexistently (1) complementary Dissociating the single-stranded polynucleotide from the sequence, (2) hybridizing the polynucleotide primer with a sequence adjacent to the 3'end of the single-stranded polynucleotide, (3) providing a first extended polynucleotide primer To extend the polynucleotide primer along the single-stranded polynucleotide, (4) dissociate the first extended primer and the single-stranded polynucleotide, (5) the first extended polynucleotide primer and the polynucleotide Hybridizing the primer, (6) providing a second extension polynucleotide primer Extending the polynucleotide primer along the first extension primer for
(7) Dissociating the second extension polynucleotide primer from the first extension polynucleotide primer, and (8) incubating this combination under the condition that steps (5) to (7) above are repeated. .
【0135】本発明のこの解釈にしたがって、少なくと
も一つのリン−硫黄結合を含む一本鎖標的ポリヌクレオ
チド配列(「標的配列」)の複数コピーを形成する方法
が得られる。方法は(a)標的配列の3’端へ少なくと
も一つのリン−硫黄結合を含む第一のポリヌクレオチド
プライマー(「第一プライマー」)をハイブリダイズさ
せること、(b)標的配列に沿って第一プライマーを伸
長すること(この第一プライマーは(1)伸長した第一
プライマー、または(2)伸長した第二ポリヌクレオチ
ドプライマー(「第二プライマー」)にハイブリダイズ
でき、およびそれに沿って伸長し、伸長した第二プライ
マーは標的配列に相補的な配列(相補配列)にハイブリ
ダイズし、それに沿って伸長できる第二プライマーの伸
長によりできる)、(c)標的配列から伸長した第一プ
ライマーを解離すること、(d)伸長した第一プライマ
ーの3’端へ第一または第二プライマーをハイブリダイ
ズすること、(e)伸長した第一プライマーに沿って第
一または第二プライマーを伸長すること、(f)伸長し
た第一プライマーから伸長した第一プライマーまたは伸
長した第二プライマーを解離すること、(g)伸長した
第一または第二プライマーの3’端へ第一プライマーを
ハイブリダイズすること、および(h)(e)から
(g)の段階を繰り返すことの段階からなる。In accordance with this aspect of the invention, there is provided a method of forming multiple copies of a single stranded target polynucleotide sequence containing at least one phosphorus-sulfur bond ("target sequence"). The method comprises: (a) hybridizing a first polynucleotide primer containing at least one phosphorus-sulfur bond to the 3'end of the target sequence ("first primer"), and (b) first along the target sequence. Extending a primer (wherein the first primer can hybridize to (1) an extended first primer, or (2) an extended second polynucleotide primer ("second primer"), and extend along it; The extended second primer hybridizes to a sequence complementary to the target sequence (complementary sequence) and can be extended by extension of the second primer), (c) dissociates the extended first primer from the target sequence (D) hybridizing the first or second primer to the 3'end of the extended first primer, (e) the extended first primer Extending the first or second primer along the lymer, (f) dissociating the extended first primer or the extended second primer from the extended first primer, (g) the extended first or second It consists of hybridizing the first primer to the 3'end of the primer and repeating steps (h) (e) to (g).
【0136】本発明のこの解釈による別の具体例は、少
なくとも一つの二重鎖ポリヌクレオチド配列(「ポリヌ
クレオチド配列」)の複数コピーを形成する方法であ
る。配列は一本鎖標的ポリヌクレオチド配列(「標的配
列」)およびその相補配列を含む。方法は(a)標的お
よび相補配列へプライマーをハイブリダイズし、これら
に沿ってプライマーを伸長する条件で、一つまたはそれ
以上の二重鎖ポリヌクレオチド配列を含むことが予想さ
れる試料を試料中に存在すると予想されるそれぞれの標
的およびそれぞれの相補配列にハイブリダイズできるポ
リヌクレオチドプライマーで処理すること、ここで一つ
のプライマーから形成される伸長産物がその相補鎖から
解離される場合、もう一方のプライマーの伸長産物の形
成のための鋳型として作用できるようなプライマーが選
択され、二重鎖ポリヌクレオチド配列のそれぞれに対す
る少なくとも一つのプライマーは少なくとも一つのリン
−硫黄結合を含む、(b)一本鎖分子をつくるために配
列が存在するならば、その鋳型からプライマー伸長産物
を解離すること、および(c)プライマー伸長産物が
(b)の段階でつくられた一本鎖を鋳型として用いて形
成され、標的配列および存在するならば相補配列の増幅
をもたらすような条件下で、(b)の段階でつくられた
一本鎖分子を(a)の段階のプライマーで処理すること
の段階からなる。Another embodiment according to this aspect of the invention is a method of forming multiple copies of at least one double-stranded polynucleotide sequence (“polynucleotide sequence”). The sequence comprises a single-stranded target polynucleotide sequence (“target sequence”) and its complement. The method comprises: (a) a sample expected to contain one or more double-stranded polynucleotide sequences in a sample, provided that the primer hybridizes to the target and complementary sequences and extends along the primer. Is treated with a polynucleotide primer capable of hybridizing to each target and complementary sequence expected to be present in, where the extension product formed from one primer is dissociated from its complementary strand to the other. A primer is selected that can act as a template for the formation of extension products of the primer, wherein at least one primer for each of the double-stranded polynucleotide sequences comprises at least one phosphorus-sulfur bond, (b) single-stranded If the sequence is present to create the molecule, then primer extension products are generated from the template. And (c) under conditions such that a primer extension product is formed using the single strand created in step (b) as a template, resulting in amplification of the target sequence and, if present, the complementary sequence. Then, the single-stranded molecule prepared in the step (b) is treated with the primer in the step (a).
【0137】本発明の別の解釈は、ポリヌクレオチド配
列を含むことが予想される試料中の少なくとも一つの特
異的ポリヌクレオチド配列(「ポリヌクレオチド配
列」)の存在の有無を検出する方法である。方法は
(a)プライマーがハイブリダイズされるそれぞれの異
なるポリヌクレオチド鎖に対して、それぞれの鎖に相補
的なそれぞれのプライマーの伸長産物が形成される条件
で、一つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む
ことが予想される試料を試料中に存在すると予想される
それぞれのポリヌクレオチド配列に対する一つのポリヌ
クレオチドプライマー(「プライマー」)で処理するこ
と、ここで一つのプライマーから形成される伸長産物が
その相補鎖から解離される場合、もう一方のプライマー
の伸長産物の形成のための鋳型として作用できるような
プライマーが選択され、二重鎖ポリヌクレオチド配列の
それぞれに対する少なくとも一つのプライマーは少なく
とも一つのリン−硫黄結合を含む、(b)配列が存在す
るならば、一本鎖分子を作るためにその鋳型からプライ
マー伸長産物を解離すること、(c)プライマー伸長産
物が(b)の段階でつくられたそれぞれの一本鎖を鋳型
として用いて形成され、標的配列および存在するならば
相補配列の増幅をもたらすような条件で、(b)の段階
でつくられた一本鎖分子を(a)の段階のプライマーで
処理すること、(d)段階(c)の産物に、検出される
それぞれの配列に対する配列またはその変異配列にハイ
ブリダイズできる標識したオリゴヌクレオチドプローブ
を添加すること、および(e)そのようなハイブリダイ
ゼーションが起きるかを決定する段階からなる。Another interpretation of the invention is a method of detecting the presence or absence of at least one specific polynucleotide sequence (“polynucleotide sequence”) in a sample that is expected to contain the polynucleotide sequence. The method comprises (a) one or more polynucleotide sequences for each different polynucleotide strand to which the primer is hybridized, provided that an extension product of each primer is formed that is complementary to that strand. Treatment of the sample expected to contain with one polynucleotide primer (“primer”) for each polynucleotide sequence expected to be present in the sample, wherein the extension product formed from one primer is A primer is selected that, when dissociated from its complementary strand, can serve as a template for the formation of extension products of the other primer, and at least one primer for each double-stranded polynucleotide sequence is at least one phosphorous. -If a (b) sequence containing a sulfur bond is present, Dissociating the primer extension product from its template to create a double-stranded molecule, (c) the primer extension product is formed using each single strand made in step (b) as a template, and the target sequence and Treating the single-stranded molecule made in step (b) with the primer of step (a) under conditions that result in the amplification of complementary sequences, if any, (d) the product of step (c) To adding a labeled oligonucleotide probe capable of hybridizing to the sequence for each sequence detected or a variant thereof, and (e) determining if such hybridization occurs.
【0138】本発明の別の解釈は、前記分析物を含むこ
とが予想される試料中のポリヌクレオチド分析物の存在
を決定する方法である。方法は(a)分析物の存在の結
果として、それぞれ少なくとも15ヌクレオチドからな
る少なくとも80%相補的な第一および第二の隣接配列
に隣接する一本鎖ポリヌクレオチドを形成すること、
(b)ヌクレオチド三リン酸および鋳型依存性ポリメラ
ーゼ存在下で、一本鎖ポリヌクレオチド配列の3’端で
隣接配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチドプラ
イマーの少なくとも3’端でポリヌクレオチドプライマ
ーの伸長産物を形成すること、ここで(a)および
(b)の段階は全体的に、または部分的に連続して、ま
たは付随して行われる、および(c)ポリヌクレオチド
配列と同一および/または相補的な配列を含む伸長した
ポリヌクレオチドプライマーを検出することを含む。上
記の方法は、(a)の段階において、S2がS1の5’
側であり、少なくとも10ヌクレオチドの長さである隣
接しない非相補的なヌクレオチド配列S1およびS2を
もつ分析物と伸長プローブが組合わされる変法を含むこ
とができる。伸長プローブはS1にハイブリダイズでき
る配列S3およびS3の5’側でS2に相同な、および
さらに前記分析物に沿って伸長できる配列S4をもつ。Another interpretation of the invention is a method of determining the presence of a polynucleotide analyte in a sample suspected of containing said analyte. The method comprises: (a) forming a single-stranded polynucleotide flanking at least 80% complementary first and second flanking sequences, each consisting of at least 15 nucleotides, as a result of the presence of the analyte;
(B) forming an extension product of a polynucleotide primer at least at the 3'end of a polynucleotide primer capable of hybridizing to a flanking sequence at the 3'end of a single-stranded polynucleotide sequence in the presence of nucleotide triphosphate and a template-dependent polymerase Wherein the steps (a) and (b) are performed wholly or partly in succession or concomitantly, and (c) a sequence identical and / or complementary to the polynucleotide sequence. Detecting an extended polynucleotide primer comprising According to the above method, in the step (a), S2 is 5'of S1.
Variants may be included in which the extension probe is combined with an analyte having non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2 that are flanking and that are at least 10 nucleotides in length. The extension probe has a sequence S3 capable of hybridizing to S1 and a sequence S4 homologous to S2 on the 5'side of S3 and further capable of extending along said analyte.
【0139】発明はまた(a)少なくとも一つのリン−
硫黄結合を含むヌクレオチド一リン酸からなる3’端を
もつポリヌクレオチドプライマー、(b)ヌクレオシド
三リン酸および(c)鋳型依存性ポリヌクレオチドポリ
メラーゼの一括の組合わせからなるキットを含む。標的
ポリヌクレオチド配列の増幅のためのキットはまた第二
のポリヌクレオチドプライマーを含むことができる。標
的配列に沿った一方の伸長産物がもう一方の伸長の鋳型
として作用するプライマーが関係する。上記キットにお
いて、第二プライマーは少なくとも一つのリン−硫黄結
合を含むヌクレオチド一リン酸を含む3’端をもつ。The invention also includes (a) at least one phosphorus-
It includes a kit comprising a polynucleotide primer having a 3 ′ end consisting of a nucleotide monophosphate containing a sulfur bond, (b) a nucleoside triphosphate and (c) a template-dependent polynucleotide polymerase all together. The kit for amplification of the target polynucleotide sequence can also include a second polynucleotide primer. Involved is a primer in which one extension product along the target sequence acts as a template for the other extension. In the above kit, the second primer has a 3 ′ end containing a nucleotide monophosphate containing at least one phosphorus-sulfur bond.
【0140】図の簡単な説明 図9から11は本発明にしたがった異なる具体例の概要
である。Brief Description of the Figures Figures 9 to 11 are overviews of different embodiments according to the invention.
【0141】図12から14はこれ以下の例のセクショ
ンで得られる反応産物のアガロースゲルの写真である。FIGS. 12-14 are photographs of agarose gels of the reaction products obtained in the Examples section below.
【0142】付随する図において、これらは発明の第二
の解釈の図として引用される。In the accompanying drawings, these are referred to as a second interpretation of the invention.
【0143】特定の具体例の説明 広義の解釈では、本発明は一本鎖標的ポリヌクレオチド
配列に相補的なポリヌクレオチド配列の形成を提供す
る。方法では、少なくとも一つのリン酸の酸素が硫黄に
置換されているヌクレオチド一リン酸を含む3’端をも
つポリヌクレオチドプライマーは標的ポリヌクレオチド
配列の3’端にハイブリダイズされる。ポリヌクレオチ
ドプライマーは標的ポリヌクレオチド配列に沿って伸長
され、伸長されたポリヌクレオチドプライマーは標的ポ
リヌクレオチド配列から解離される。DESCRIPTION OF SPECIFIC EMBODIMENTS In its broadest sense, the present invention provides for the formation of polynucleotide sequences complementary to single-stranded target polynucleotide sequences. In the method, a polynucleotide primer having a 3'end containing a nucleotide monophosphate in which at least one phosphate oxygen has been replaced by sulfur is hybridized to the 3'end of the target polynucleotide sequence. The polynucleotide primer is extended along the target polynucleotide sequence and the extended polynucleotide primer is dissociated from the target polynucleotide sequence.
【0144】これまでは、チオリン酸基を含むオリゴヌ
クレオチドはポリメラーゼの劣った基質であると考えら
れていた。例えば、上述のGaoらの文献を参照せよ。
本発明の結果として、多くのDNAポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ活性による分解に耐性の合成オリゴヌク
レオチドプライマーが増幅処理で使用される。したがっ
て、3’から5’のエキソヌクレアーゼ活性をもつポリ
メラーゼが各種の伸長および増幅処理で使用される。こ
のエキソヌクレアーゼ活性により提供される編集機能は
増幅処理における複製のより高い忠実度を与える。Up until now, oligonucleotides containing thiophosphate groups were considered to be poor substrates for polymerases. See, for example, Gao et al., Supra.
As a result of the present invention, synthetic oligonucleotide primers resistant to degradation by the exonuclease activity of many DNA polymerases are used in the amplification process. Therefore, polymerases with 3'to 5'exonuclease activity are used in various extension and amplification processes. The editing function provided by this exonuclease activity confers higher fidelity of replication in the amplification process.
【0145】方法は、試料に由来するポリヌクレオチド
配列が増幅される、上で引用されたポリメラーゼ連鎖反
応、単一のプライマー増幅およびプライマーとしてラン
ダム配列のオリゴヌクレオチドを用いた増幅によるよう
なポリヌクレオチドの増幅の分野における特定の応用で
ある。本方法は核酸配列の増幅処理の非常に簡便な方法
を提供する。The method involves the amplification of a polynucleotide sequence such as by the polymerase chain reaction cited above, single primer amplification and amplification using a random sequence oligonucleotide as a primer, in which the polynucleotide sequence derived from the sample is amplified. It has particular application in the field of amplification. This method provides a very convenient method for amplifying nucleic acid sequences.
【0146】本発明の結果として、合成オリゴヌクレオ
チドプライマーは核酸の伸長および増幅処理で用いられ
る多くのDNAポリメラーゼに付随するエキソヌクレア
ーゼ活性による分解に関係なく核酸の増幅を含む伸長処
理において用いられる。例えば、核酸の指数的増幅をも
たらすPCRは3’−5’エキソヌクレアーゼ活性をも
たないTaqポリメラーゼとは別の酵素を用いて行わ
れ、それ故、ミスマッチを除去することができない。あ
るものは温度循環を必要とし、他は単一温度で増幅する
ような、この方法による多くの増幅が記述されている。
本発明は単一酵素を用いて行われるPCRのような増幅
処理を提供する。本発明の別の利点は日常的に記述され
る遺伝病をPCRを用いて診断する際の遺伝的多型また
は点突然変異の検出の範囲である。3’端にミスマッチ
をもつプライマーが人工的な制限酵素部位を導入するた
めに、または標的DNA中の一塩基のミスマッチを検出
するために、無関係に酵素がミスマッチのプライマー−
鋳型領域を消化する3’エキソヌクレアーゼ活性をもつ
酵素と共に使用される。As a result of the present invention, synthetic oligonucleotide primers are used in extension procedures involving amplification of nucleic acids regardless of degradation by the exonuclease activity associated with many DNA polymerases used in nucleic acid extension and amplification procedures. For example, PCR leading to exponential amplification of nucleic acids is performed using an enzyme other than Taq polymerase, which does not have 3'-5 'exonuclease activity, and therefore cannot remove the mismatch. Many amplifications by this method have been described, some requiring temperature cycling and others amplifying at a single temperature.
The present invention provides an amplification process such as PCR performed using a single enzyme. Another advantage of the present invention is the scope of detection of genetic polymorphisms or point mutations in diagnosing routinely described genetic diseases using PCR. In order to introduce an artificial restriction enzyme site by a primer having a mismatch at the 3'end or to detect a single base mismatch in the target DNA, a primer having an enzyme mismatch regardless of-
Used with enzymes that have 3'exonuclease activity to digest the template region.
【0147】本発明の特定の具体例の記述をさらに進め
る前に、多くの用語が定義される。(他の全ての用語は
上に定義されている通りである。)Before proceeding further with the description of particular embodiments of the invention, a number of terms are defined. (All other terms are as defined above.)
【0148】標的ポリヌクレオチド配列−−同定される
ヌクレオチドの配列で、通常ポリヌクレオチド分析物中
に存在し、その同一性は中に含まれる標的配列の増幅を
行うのに必要な各種のプライマーおよび他の分子の調製
にある程度充分であることが知られている。一般に、プ
ライマーは標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ
し、それに沿って伸長され、それ故標的ポリヌクレオチ
ド配列は鋳型として作用する。標的ポリヌクレオチド配
列は通常必要ではないが、二つの決った配列の間に存在
する。一般に、プライマーおよび他のプローブポリデオ
キシヌクレオチドは決った配列、または少なくともその
ような標的配列の部分で、その3’端で少なくとも10
ヌクレオチドの断片、好ましくは15、頻繁にはその2
0から50ヌクレオチドの断片にハイブリダイズする。
上述のように、標的ポリヌクレオチド配列は一般的に二
つの決った、即ち隣接しない、相補的な、または非相補
的なヌクレオチド配列である、そのようなプライマーま
たはプローブにハイブリダイズできるS1およびS2を
もつ。標的ポリヌクレオチド配列は通常約30から50
00またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは50か
ら1000ヌクレオチドを含む。二つの隣接しない、非
相補的なヌクレオチド配列であるS1およびS2は好ま
しくはそれぞれ10から100ヌクレオチドを含み、少
なくとも10塩基、好ましくは少なくとも100、通常
は200から10000塩基離される。標的ポリヌクレ
オチド配列は多くのポリヌクレオチド分析物の一部であ
る。標的ポリヌクレオチド配列は一般により大きな分子
の断片、あるいは本質的には分子全体である。標的ポリ
ヌクレオチド配列のヌクレオチドの最少数は、試料中の
標的ポリヌクレオチド配列の存在が試料のポリヌクレオ
チド分析物の存在の特定の標識であることを確実にする
ように選択される。非常に大雑把には、配列の長さは通
常約1.6log Lヌクレオチドで、Lは生物学的試
料のゲノム中の塩基対の数である。標的配列のヌクレオ
チドの最大数は一般にポリヌクレオチド分析物および切
られることにより、または分離および、アッセイおよび
配列の検出および/または増幅の効率のために試料を調
製するために必要な手順の間の他の過程により分解され
た部分の長さに支配される。Target Polynucleotide Sequence--A sequence of nucleotides to be identified, usually found in a polynucleotide analyte, the identity of which is the variety of primers and other primers necessary to effect amplification of the target sequence contained therein. It is known to be somewhat sufficient for the preparation of the molecule. Generally, the primer hybridizes to and extends along the target polynucleotide sequence, thus the target polynucleotide sequence acts as a template. The target polynucleotide sequence is usually not required, but will lie between two defined sequences. Generally, primers and other probe polydeoxynucleotides are defined sequences, or at least a portion of such target sequence, at least 10 at their 3'ends.
A fragment of nucleotides, preferably 15, often 2
It hybridizes to a fragment of 0 to 50 nucleotides.
As mentioned above, the target polynucleotide sequence is generally two fixed, non-contiguous, complementary or non-complementary nucleotide sequences, S1 and S2, which are capable of hybridizing to such a primer or probe. Hold. The target polynucleotide sequence is usually about 30 to 50
It contains 00 or more nucleotides, preferably 50 to 1000 nucleotides. The two non-contiguous, non-complementary nucleotide sequences S1 and S2 preferably each contain 10 to 100 nucleotides and are separated by at least 10 bases, preferably at least 100, usually 200 to 10000 bases. The target polynucleotide sequence is part of many polynucleotide analytes. The target polynucleotide sequence is generally a fragment of a larger molecule, or essentially the entire molecule. The minimum number of nucleotides in the target polynucleotide sequence is selected to ensure that the presence of the target polynucleotide sequence in the sample is a specific indicator of the presence of the sample polynucleotide analyte. Very roughly, the length of a sequence is usually about 1.6 log L nucleotides, where L is the number of base pairs in the genome of the biological sample. The maximum number of nucleotides in the target sequence is generally due to polynucleotide analytes and truncation, or during separation and other procedures necessary to prepare samples for efficiency of assay and sequence detection and / or amplification. It is governed by the length of the decomposed part.
【0149】ポリデオキシヌクレオチドプライマー−−
その3’端で標的ポリヌクレオチド配列の決った配列と
ハイブリダイズできる配列を含む一本鎖の通常合成デオ
キシヌクレオチドであるポリデオキシヌクレオチド。通
常ポリデオキシヌクレオチドプライマーは決った配列と
して、少なくとも50%、好ましくは70%、さらに好
ましくは90%、最も好ましくは100%の相補性をも
つ。ポリデオキシヌクレオチドプラマーのハイブリダイ
ズできる配列中のデオキシヌクレオチドの数は、ポリデ
オキシヌクレオチドプライマーをハイブリダイズするた
めに用いられる緊縮条件が極端にランダムな非特異的ハ
イブリダイゼーションを妨げるように決定される。通
常、ポリデオキシヌクレオチドプライマー中のデオキシ
ヌクレオチドの数は標的ポリヌクレオチド配列の決った
配列と少なくとも同じ、即ち、少なくとも10デオキシ
ヌクレオチド、好ましくは少なくとも15デオキシヌク
レオチドおよび一般的には約10から200、好ましく
は20から50デオキシヌクレオチドである。Polydeoxynucleotide primer--
A polydeoxynucleotide, which is a single-stranded normally synthesized deoxynucleotide containing a sequence capable of hybridizing at its 3'end to a sequence having a determined target polynucleotide sequence. Usually, polydeoxynucleotide primers have at least 50%, preferably 70%, more preferably 90%, and most preferably 100% complementarity as a determined sequence. The number of deoxynucleotides in the hybridizable sequence of the polydeoxynucleotide plumer is determined so that the stringent conditions used to hybridize the polydeoxynucleotide primers prevent extremely random non-specific hybridization. Usually, the number of deoxynucleotides in the polydeoxynucleotide primer is at least the same as the determined sequence of the target polynucleotide sequence, ie at least 10 deoxynucleotides, preferably at least 15 deoxynucleotides and generally about 10 to 200, preferably 20 to 50 deoxynucleotides.
【0150】プライマーを伸長する方法−−ポリヌクレ
オチドポリメラーゼまたは少なくともプライマーの3’
端または両方にハイブリダイズできるその3’端とは別
の配列をもつ一本鎖鋳型ポリヌクレオチド。プライマー
を伸長する方法はまた酵素および他の物質の基質として
作用できるヌクレオチド三リン酸またはその類似体およ
び二価金属イオン(通常はマグネシウム)、pH、イオ
ン強度、(ホルムアミドのような)有機溶媒などのよう
な酵素活性に必要な条件を含む。Methods for Extending a Primer--Polynucleotide Polymerase or at least 3 ′ of the primer
A single-stranded template polynucleotide having a sequence distinct from its 3'end that is hybridizable to either or both ends. Methods for extending the primer also include nucleotide triphosphates or analogs thereof that can act as substrates for enzymes and other substances and divalent metal ions (usually magnesium), pH, ionic strength, organic solvents (such as formamide), etc. Conditions necessary for enzyme activity such as
【0151】本発明にしたがって、鋳型または標的ポリ
ヌクレオチドに沿った伸長に用いられる少なくとも一つ
のポリデオキシヌクレオチドプライマーは少なくとも一
つのリン酸の酸素が硫黄に置換されているヌクレオチド
一リン酸を含む3’端をもつ。好ましくは1から5個の
リン酸の酸素が硫黄に置換され、さらに好ましくは1か
ら2個のリン酸の酸素が置換される。硫黄は多くは単独
でリンに結合されるが(チオリン酸基)、リボースの炭
素原子または標識の炭素原子にもまた結合できる。それ
故、本発明の方法に使用できるポリデオキシヌクレオチ
ドプライマーは、少なくとも一つ、好ましくは1から5
個の、さらに好ましくは1から2個のリン−硫黄結合を
含む。リン−硫黄結合の数について考慮することは、プ
ライマーおよび鋳型ポリヌクレオチドの間の相補性の程
度である。一般に、相補性が大きくなるほど、リン−硫
黄結合の許容される数は大きくなる。リン−硫黄結合は
一般にポリデオキシヌクレオチドプライマーの3’端、
通常は3’端の最後の10ヌクレオチドの中に、好まし
くは3’端の最後の5ヌクレオチドの中に、さらに好ま
しくはプライマーの最後のヌクレオチドに存在する。こ
れらの硫黄を含むポリデオキシヌクレオチドプライマー
は以下に記述されるように、既知の技術にしたがって調
製される。According to the present invention, at least one polydeoxynucleotide primer used for extension along a template or target polynucleotide comprises a nucleotide monophosphate in which at least one phosphate oxygen is replaced by sulfur. It has an edge. Preferably 1 to 5 phosphoric acid oxygens are replaced by sulfur, more preferably 1 to 2 phosphoric acid oxygens. Sulfur is mostly attached to phosphorus alone (thiophosphate group), but it can also be attached to the carbon atom of ribose or the carbon atom of the label. Therefore, at least one polydeoxynucleotide primer that can be used in the method of the present invention, preferably 1 to 5
, More preferably 1 to 2 phosphorus-sulfur bonds. A consideration for the number of phosphorus-sulfur bonds is the degree of complementarity between the primer and template polynucleotide. In general, the greater the complementarity, the greater the allowable number of phosphorus-sulfur bonds. Phosphorus-sulfur bonds are commonly found at the 3'end of polydeoxynucleotide primers,
Usually present in the last 10 nucleotides of the 3'end, preferably in the last 5 nucleotides of the 3'end, more preferably in the last nucleotide of the primer. These sulfur-containing polydeoxynucleotide primers are prepared according to known techniques, as described below.
【0152】本発明の具体例では、一本鎖の標的ポリヌ
クレオチド配列(「標的配列」)に相補的なポリヌクレ
オチド配列を形成するための方法が記述される。方法
は、(a)少なくとも一つのリン酸の酸素が硫黄に置換
されているヌクレオチド一リン酸からなる3’端をもつ
ポリヌクレオチドプライマーを標的配列の3’端へハイ
ブリダイズさせること、(b)標的配列に沿って、ポリ
ヌクレオチドプライマーを伸長すること、および(c)
伸長したポリヌクレオチドプライマーを標的配列から解
離する段階からなる。In an embodiment of the invention, methods for forming a polynucleotide sequence complementary to a single stranded target polynucleotide sequence (“target sequence”) are described. The method comprises: (a) hybridizing to a 3'end of a target sequence a polynucleotide primer having a 3'end consisting of a nucleotide monophosphate in which at least one phosphate oxygen has been replaced by sulfur. Extending a polynucleotide primer along a target sequence, and (c)
It consists of dissociating the extended polynucleotide primer from the target sequence.
【0153】そのような方法の具体例は図9に模式的に
示される。プライマーP1は(図で−Sと示されてい
る)3’端に存在するリン−硫黄結合をもつ。プライマ
ーは標的ポリヌクレオチド配列(T)のT1とハイブリ
ダイズする。プライマーはTに相補的な伸長プライマー
Hを生産するためにTに沿って伸長される。例えば、T
2のような特定の配列が知られているTが選択される。
伸長プライマーは、T2に相補的な配列P2を含む。さ
らに、伸長プライマーはその複合体から解離される。A specific example of such a method is schematically shown in FIG. Primer P1 has a phosphorus-sulfur bond present at the 3'end (indicated as -S in the figure). The primer hybridizes with T1 of the target polynucleotide sequence (T). The primer is extended along T to produce extension primer H, which is complementary to T. For example, T
A T for which a particular sequence such as 2 is known is selected.
The extension primer contains the sequence P2 complementary to T2. In addition, the extension primer is dissociated from the complex.
【0154】本発明の別の具体例は、リン−酸素結合の
代わりにリン−硫黄結合が存在することを除いて、一本
鎖の標的ポリヌクレオチド配列と同一の配列をもつポリ
ヌクレオチド配列を形成する方法である。方法は、
(a)少なくとも一つのリン−硫黄結合を含む第一のポ
リヌクレオチドプライマー(「第一プライマー」)を前
記標的ポリヌクレオチド配列の3’端にハイブリダイズ
すること、(b)標的ポリヌクレオチド配列に沿って第
一プライマーを伸長すること、(c)標的ポリヌクレオ
チドから伸長した第一プライマーを解離すること、
(d)第一プライマーと同一、または異なる第二のポリ
ヌクレオチドプライマー(「第二プライマー」)を伸長
した第一プライマーの3’端にハイブリダイズするこ
と、および(e)第一および第二プライマーが同一であ
る場合、伸長した第一プライマーが第一プライマーの鋳
型となり、第一および第二プライマーが異なる場合、伸
長した第一プライマーが第二プライマーの鋳型となり、
伸長した第二プライマーが第一プライマーの鋳型となる
ような伸長した第二プライマーを形成するために、伸長
した第一プライマーに沿って第二プライマーを伸長する
段階からなる。上記方法は伸長した第一プライマーから
伸長した第二プライマーを解離する段階を含む。伸長し
たプライマーがその鋳型から解離され、プライマーがそ
の伸長プライマーにハイブリダイズし、それに沿って伸
長されるような繰り返しの循環を得るために、条件が選
択される。循環は少なくとも三回繰り返される。伸長は
ヌクレオチド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチ
ドポリメラーゼ存在下で行われる。Another embodiment of the invention forms a polynucleotide sequence having a sequence identical to the single stranded target polynucleotide sequence except that a phosphorus-sulfur bond is present instead of a phosphorus-oxygen bond. Is the way to do it. The method is
(A) hybridizing a first polynucleotide primer containing at least one phosphorus-sulfur bond ("first primer") to the 3'end of the target polynucleotide sequence, and (b) along the target polynucleotide sequence. Extending the first primer, (c) dissociating the extended first primer from the target polynucleotide,
(D) hybridizing to the 3'end of the extended first primer with a second polynucleotide primer ("second primer"), which is the same as or different from the first primer, and (e) the first and second primers Are the same, the extended first primer is the template of the first primer, when the first and second primer are different, the extended first primer is the template of the second primer,
The step of extending a second primer along an extended first primer to form an extended second primer such that the extended second primer serves as a template for the first primer. The method comprises dissociating the extended second primer from the extended first primer. Conditions are chosen in order to obtain a repetitive cycle in which the extended primer is dissociated from its template and the primer hybridizes to and extends along the extension primer. The circulation is repeated at least three times. Extension is carried out in the presence of nucleotide triphosphate and template-dependent polynucleotide polymerase.
【0155】発明の方法は例えば、一つまたはそれ以上
の標的ポリヌクレオチド配列のコピー、即ち標的ポリヌ
クレオチド配列と同一の配列が形成されるPCRおよび
単一プライマー増幅のようなポリヌクレオチド増幅に有
効であることが明らかである。The methods of the invention are useful, for example, in polynucleotide amplification, such as PCR and single primer amplification in which one or more copies of the target polynucleotide sequence, ie, a sequence identical to the target polynucleotide sequence, is formed. It is clear that there is.
【0156】単一プライマー増幅への本方法の利用は図
10に示される。以下の記述では、ハイブリダイズ、伸
長および解離の段階の適当な条件が以下に討論されてい
るように選択される。ポリデオキシヌクレオチドプライ
マーP1はT1とハイブリダイズし、T1は標的ポリヌ
クレオチド配列のT2にハイブリダイズでき、好ましく
はT2と相補的である。P1はまた標識W(示されてい
ない)を含むことができる。P1は配列P1およびT2
およびP1に相補的であるP2を含む伸長プライマーH
を形成するために標的Tにハイブリダイズし、これに沿
って伸長される。HはTおよびP1から解離され、Hの
P2およびTのT1部分にハイブリダイズし、それぞれ
HおよびTに沿って伸長される。それぞれH’およびH
を得るために、二重鎖は解離され、P1はHおよびTに
ハイブリダイズし、これらに沿って伸長される。さらに
繰り返すことにより、標識Wが存在するために検出され
る標的ポリヌクレオチド配列の複数コピーが得られる。The use of this method for single primer amplification is shown in FIG. In the description below, the appropriate conditions for the steps of hybridisation, extension and dissociation are chosen as discussed below. The polydeoxynucleotide primer P1 hybridizes to T1, which is capable of hybridizing to T2 of the target polynucleotide sequence and is preferably complementary to T2. P1 can also include a label W (not shown). P1 is the sequence P1 and T2
And an extension primer H containing P2 which is complementary to P1
Hybridizes to the target T to form and is extended along. H is dissociated from T and P1, hybridized to P2 of H and the T1 portion of T, and extended along H and T, respectively. H'and H respectively
To obtain, the duplex is dissociated and P1 hybridizes to H and T and is extended along them. Further iterations will result in multiple copies of the target polynucleotide sequence being detected due to the presence of label W.
【0157】本発明のこの解釈による別の具体例は図1
1に示され、少なくとも一つのリン−硫黄結合を含むヌ
クレオチド一リン酸をもつそれぞれのプライマーがPC
R増幅に使用される。もちろん、一方は少なくとも一つ
のリン−硫黄結合を含むヌクレオチド一リン酸をもつ
が、二つのプライマーを用いたPCRを行うことは本発
明の範囲内である。上述のように、PCR法は少なくと
も一つの二重鎖ポリヌクレオチド配列の複数のコピーを
形成するために使用される。配列は一本鎖標的ポリヌク
レオチド配列およびその相補鎖を含む。一つまたはそれ
以上の二重鎖ポリヌクレオチド配列を含むことが予想さ
れる試料は、それぞれ試料中に存在すると予想される標
的およびその相補鎖にハイブリダイズできるポリヌクレ
オチドプライマーP’1およびP’2で処理される。標
的および相補鎖にプライマーがハイブリダイズし、それ
に沿ってプライマーが伸長する条件が選択される。その
相補鎖から解離される場合、一つのプライマーから形成
される伸長産物は他方のプライマーの伸長産物の形成の
ための鋳型として作用することができる。図11に見ら
れるように、相補配列はT’およびT’’である。T’
は配列T’1およびT’2をもち、T’’は配列T’’
1およびT’’2をもつ。P’1はT’のT’1とハイ
ブリダイズし、P’2はT’’のT’’2とハイブリダ
イズする。適当な条件下で、P’1はVを得るために
T’に沿って伸長され、P’2はV’を得るために
T’’に沿って伸長される。P’1およびT’1が相補
的であり、P’2およびT’’2が相補的で、P’1お
よびT’’1は相同で、P’2およびT’2が相同であ
ることは図3から明らかである。伸長プライマーはこれ
らのそれぞれの鋳型から解離される。それぞれV、
W’、WおよびV’を得るためにプライマーP’1分子
はそれぞれT’およびV’にハイブリダイズし、それに
沿って伸長され、プライマーP’2分子はそれぞれ
T’’およびVにハイブリダイズし、それに沿って伸長
される。図11に見られるように、サイクルの繰返しに
より標的配列を含むWおよびW’の複数のコピーが得ら
れる。サイクルは、プライマー伸長産物が鋳型として生
産された一本鎖を用いて形成され、存在するならば、標
的配列およびその相補配列を増幅させるような条件下で
行われる。Another embodiment of this interpretation of the invention is shown in FIG.
1, each primer having a nucleotide monophosphate containing at least one phosphorus-sulfur bond is PC
Used for R amplification. Of course, one has a nucleotide monophosphate containing at least one phosphorus-sulfur bond, but it is within the scope of the invention to perform PCR with two primers. As mentioned above, the PCR method is used to form multiple copies of at least one double-stranded polynucleotide sequence. The sequence comprises a single stranded target polynucleotide sequence and its complement. Samples expected to contain one or more double-stranded polynucleotide sequences are polynucleotide primers P'1 and P'2 capable of hybridizing to the target expected to be present in the sample and its complementary strand, respectively. Is processed in. Conditions are selected in which the primer hybridizes to the target and complementary strand along which the primer extends. When dissociated from its complementary strand, the extension product formed from one primer can act as a template for the formation of the extension product of the other primer. As seen in FIG. 11, the complementary sequences are T ′ and T ″. T '
Has the sequences T'1 and T'2 and T "is the sequence T"
1 and T ″ 2. P'1 hybridizes with T'1 of T'and P'2 hybridizes with T "2 of T". Under appropriate conditions, P'1 is extended along T'to obtain V and P'2 is extended along T "to obtain V '. P'1 and T'1 are complementary, P'2 and T "2 are complementary, P'1 and T" 1 are homologous, and P'2 and T'2 are homologous. Is clear from FIG. The extension primer is dissociated from each of these templates. V, respectively
The primer P'1 molecule hybridizes to and is extended along T'and V'respectively to obtain W ', W and V', and the primer P'2 molecule hybridizes to T "and V respectively. , Stretched along it. As seen in FIG. 11, repeating the cycle results in multiple copies of W and W ′ containing the target sequence. Cycles are conducted under conditions such that the primer extension product is formed using the single strand produced as template and, if present, amplifies the target sequence and its complementary sequence.
【0158】標的ポリヌクレオチド配列がDNAまたは
RNAである場合、方法が応用される。一つの解釈で
は、ポリデオキシヌクレオチドプライマーは標識(レポ
ーター分子)で標識される。レポーター分子は例えば、
ビオチンまたは標的配列にハイブリダイズする配列とは
別のヌクレオチド配列のような検出可能な基または結合
剤である。レポーター分子は直接的にプライマーのチオ
リン酸基に接着するか、または別の場所へ接着する。伸
長プライマーはプローブに共有結合で結合したレポータ
ー分子により検出される。プローブは通常プライマーが
結合する配列とは別の標的ヌクレオチド配列の部分と相
同または相補的なヌクレオチド配列をもつ。The method is applied when the target polynucleotide sequence is DNA or RNA. In one interpretation, the polydeoxynucleotide primer is labeled with a label (reporter molecule). Reporter molecules are eg
A detectable group or binding agent such as biotin or a nucleotide sequence separate from the sequence that hybridizes to the target sequence. The reporter molecule attaches directly to the thiophosphate group of the primer, or elsewhere. The extension primer is detected by the reporter molecule covalently attached to the probe. A probe usually has a nucleotide sequence that is homologous or complementary to a portion of the target nucleotide sequence that differs from the sequence to which the primer binds.
【0159】発明の別の具体例は、ポリヌクレオチド分
析物を含むと予想される試料中のポリヌクレオチド分析
物の存在を検出する方法に関するものである。試料を含
む媒体は存在するならば、ポリヌクレオチド分析物から
一本鎖の標的ポリヌクレオチド配列を形成するために、
上述のように処理される。標的ポリヌクレオチド配列は
二つの隣接しない、非相補的な配列S1およびS2をも
ち、ここでS2はS1の5’で、少なくとも10ヌクレ
オチドの長さである。媒体は二つのデオキシヌクレオチ
ド配列をもつ伸長プローブと合わされる。単一プライマ
ー増幅のためのそのようなアプローチが上に記述され
る。伸長プローブ(EP1)の3’端の配列はS1にハ
イブリダイズされる。デオキシヌクレオチド配列(EP
2)の他方はS2に相同である。S2に相補的なヌクレ
オチド配列にハイブリダイズできるポリデオキシヌクレ
オチド配列が、伸長プローブの修飾がプライマーを提供
しない場合に含まれる。伸長プローブはプライマーの濃
度以下の、通常1%以下の濃度で存在する。本発明にし
たがって、プライマーは少なくとも一つのリン酸の酸素
が硫黄に置換されているヌクレオチド一リン酸からなる
3’端をもつ。デオキシヌクレオチド三リン酸および一
つまたはそれ以上のポリデオキシヌクレオチドポリメラ
ーゼもまた組合わされる。(1)二重鎖を形成するため
に、伸長プローブが標的ポリヌクレオチド配列にハイブ
リダイズし、それに沿って伸長され、(2)標的ポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズしない伸長プローブが
修飾され、(3)伸長プローブが二重鎖から解離され、
(4)伸長プライマーを含む第二の二重鎖を形成するた
めに、プライマーが伸長された配列にハイブリダイズさ
れ、それに沿って伸長され、(5)伸長プライマーが二
重鎖から解離され、および(6)伸長プライマーを含む
二重鎖を形成するために、プライマーが前記伸長プライ
マーにハイブリダイズし、それに沿って伸長されるよう
な条件が選択される。段階(5)および(6)は繰り返
され、段階(a)および(b)が付随的に、または全体
的にあるいは部分的に連続して行われる。その後、伸長
プライマーの存在についての試験が行われ、その存在は
ポリヌクレオチド分析物の存在を示す。段階(5)およ
び(6)は少なくとも三回、好ましくは少なくとも10
回繰り返される;通常繰返し回数は30回以下であるこ
とが望ましい。一般に、段階(5)および(6)はポリ
ヌクレオチド分析物の正確な検出を行うために充分な回
数繰り返される。ポリヌクレオチド分析物がRNAであ
る場合、ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼは逆転
写酵素を含む。Another embodiment of the invention relates to a method of detecting the presence of a polynucleotide analyte in a sample suspected of containing the polynucleotide analyte. The medium containing the sample, if present, forms a single-stranded target polynucleotide sequence from the polynucleotide analyte,
It is processed as described above. The target polynucleotide sequence has two non-contiguous, non-complementary sequences S1 and S2, where S2 is 5'of S1 and is at least 10 nucleotides in length. The medium is combined with an extension probe having two deoxynucleotide sequences. Such an approach for single primer amplification is described above. The sequence at the 3'end of the extension probe (EP1) is hybridized to S1. Deoxynucleotide sequence (EP
The other of 2) is homologous to S2. A polydeoxynucleotide sequence capable of hybridizing to a nucleotide sequence complementary to S2 is included where modification of the extension probe does not provide a primer. The extension probe is present at a concentration below the concentration of the primer, usually below 1%. According to the present invention, the primer has a 3'end consisting of a nucleotide monophosphate in which at least one phosphate oxygen is replaced by sulfur. Deoxynucleotide triphosphates and one or more polydeoxynucleotide polymerases are also combined. (1) an extension probe hybridizes to and extends along the target polynucleotide sequence to form a duplex, (2) an extension probe that does not hybridize to the target polynucleotide sequence is modified, (3) The extension probe is dissociated from the duplex,
(4) the primer is hybridized to and extended along the extended sequence to form a second duplex containing the extended primer, (5) the extended primer is dissociated from the duplex, and (6) Conditions are selected such that the primer hybridizes to and extends along the extension primer to form a duplex containing the extension primer. Steps (5) and (6) are repeated, steps (a) and (b) being performed concomitantly or wholly or partially in succession. A test is then made for the presence of the extension primer, the presence of which is indicative of the presence of the polynucleotide analyte. Steps (5) and (6) are performed at least three times, preferably at least 10
Repeated repeatedly; usually, the number of repetitions is preferably 30 times or less. Generally, steps (5) and (6) are repeated a sufficient number of times to provide accurate detection of the polynucleotide analyte. When the polynucleotide analyte is RNA, the polydeoxynucleotide polymerase comprises reverse transcriptase.
【0160】これらの方法を実施するための条件、濃度
等は以下に記述しない限り、上述のものに類似する。Conditions, concentrations, etc. for carrying out these methods are similar to those described above unless otherwise stated.
【0161】本発明が単一プライマー増幅またはPCR
に用いられる場合、方法は伸長プライマーまたはその相
補鎖の望みのコピー数を得るために充分な時間行われ
る。これは即ち、例えばポリヌクレオチド分析物のアッ
セイのような増幅が行われる目的に依存する。一般に、
方法が行われる時間はサイクルあたり約1から10分
で、サイクル数は1から200回程度またはそれ以上、
通常は5から80回、頻繁には10から60回である。
便宜上、通常は時間およびサイクル数を最少化すること
が望ましい。一般に、与えられた程度の増幅のための時
間は、例えばポリヌクレオチドポリメラーゼを飽和する
のに充分なヌクレオチド三リン酸の濃度を選択し、ポリ
ヌクレオチドポリメラーゼおよびポリヌクレオチドプラ
イマーの濃度を増加することにより短縮される。一般
に、方法を行う時間は約5から200分である。便宜
上、通常は時間を最少化することが望ましい。Single Primer Amplification or PCR
, The method is carried out for a time sufficient to obtain the desired copy number of the extension primer or its complement. This depends, for example, on the purpose for which the amplification is to be carried out, eg in the assay of polynucleotide analytes. In general,
The method is performed for about 1 to 10 minutes per cycle, and the number of cycles is about 1 to 200 times or more,
Usually 5 to 80 times, often 10 to 60 times.
For convenience, it is usually desirable to minimize the time and number of cycles. In general, the time for a given degree of amplification is shortened, for example, by choosing a concentration of nucleotide triphosphate sufficient to saturate the polynucleotide polymerase and increasing the concentration of the polynucleotide polymerase and polynucleotide primer. To be done. Generally, the time for carrying out the method is about 5 to 200 minutes. For convenience, it is usually desirable to minimize time.
【0162】上述のように、本発明の主たる利点は3’
エギソヌクレアーゼ活性をもつ鋳型依存性ポリヌクレオ
チドポリメラーゼがポリヌクレオチドの増幅に使用され
ることである。このポリメラーゼの濃度は鎖の伸長が完
了するのに充分となるように選択される。鋳型依存性ポ
リヌクレオチドポリメラーゼの濃度は通常、経験的に決
定される。好ましくは、濃度の増加が5倍以上、好まし
くは2倍増幅の時間を減少させない程充分な濃度が使用
される。主たる限定要因は一般には試薬の価格である。As stated above, the main advantage of the present invention is 3 '.
A template-dependent polynucleotide polymerase with exonuclease activity is used for amplification of the polynucleotide. The concentration of this polymerase is chosen to be sufficient to complete chain extension. The concentration of template-dependent polynucleotide polymerase is usually determined empirically. Preferably, a sufficient concentration is used so that the increase in concentration is not less than 5-fold, and preferably the time for 2-fold amplification is not reduced. The main limiting factor is generally the price of the reagent.
【0163】伸長プライマーのコピーは多くの方法で検
出される。例えば、本方法ではポリデオキシヌクレオチ
ドプライマー分子はリガンド、小有機分子、ポリヌクレ
オチド配列、タンパク質、支持体、オペレーター−プロ
モーターの対、挿入染料などのようなレポーター分子で
標識される。核酸配列を特異的に検出する標準的な方法
が使用される。硫黄原子は本発明にしたがって、増幅産
物に取り込まれるので、これらの硫黄原子が標的ポリヌ
クレオチドの存在に関連する存在である、レポーター分
子を構成できる。このアプローチでは、増幅産物は硫黄
原子の存在を検出するために多くの方法で、化学的に処
理される。例えば、本発明にしたがった反応物は、二重
鎖産物のチオリン酸結合の反対側の結合を切断する酵素
で処理される。そのような酵素は例えば、Hinc I
Iである。別のアプローチでは、反応産物はチオリン酸
結合を切断するために既知の方法により化学的に処理さ
れる。反応産物中の硫黄原子の存在の検出の他の方法は
技術的に提案されている。Copies of extension primers are detected in many ways. For example, in the method, the polydeoxynucleotide primer molecule is labeled with a reporter molecule such as a ligand, a small organic molecule, a polynucleotide sequence, a protein, a support, an operator-promoter pair, an intercalating dye and the like. Standard methods of specifically detecting nucleic acid sequences are used. According to the present invention, sulfur atoms are incorporated into the amplification product, so that a reporter molecule can be constituted, which is an entity related to the presence of the target polynucleotide. In this approach, the amplified product is chemically treated in many ways to detect the presence of sulfur atoms. For example, the reactants according to the invention are treated with an enzyme that cleaves the double stranded product on the opposite side of the thiophosphate bond. Such enzymes are, for example, Hinc I
I. In another approach, the reaction product is chemically treated by known methods to cleave the thiophosphate bond. Other methods of detecting the presence of sulfur atoms in reaction products have been proposed in the art.
【0164】核酸を検出する一つの方法は核酸プローブ
を用いることである。プローブを用いた方法は、参考と
してこの中に取れ入れられている1985年9月6日の
米国特許出願第773,386号、US486810
4、に記述されている。One method of detecting nucleic acids is to use nucleic acid probes. The method using the probe is described in US Patent Application No. 773,386, US Pat. No. 4,868,810 of September 6, 1985, which is incorporated herein by reference.
4 are described.
【0165】他のアッセイ法および検出法は、それぞれ
1989年1月19日および1989年8月29日の米
国特許出願第07/299,292号および第07/3
99,795号に明らかにされている。また、EP37
9369および1990年7月19日の米国特許出願第
07/555,323号およびEP469755を参照
せよ。これらの出願は参考としてこの中に取り入れられ
ている。Other assay and detection methods are described in US patent application Ser. Nos. 07 / 299,292 and 07/3 of January 19, 1989 and August 29, 1989, respectively.
99,795. Also, EP37
See 9369 and U.S. patent application Ser. No. 07 / 555,323 of July 19, 1990 and EP 469755. These applications are incorporated herein by reference.
【0166】特定の標識またはレポーター分子の例およ
びその検出は上に記述されている。シグナルの検出は上
に記述されている。各種技術が上述のように、ポリデオ
キシヌクレオチドプライマーまたは他のポリヌクレオチ
ド配列を調製するために用いられる。Examples of specific labels or reporter molecules and their detection have been described above. Signal detection is described above. Various techniques are used to prepare polydeoxynucleotide primers or other polynucleotide sequences, as described above.
【0167】少なくとも一つのリン酸の酸素が硫黄に置
換されているヌクレオチド一リン酸からなる3’端をも
つ少なくとも一つの一リン酸を含むポリデオキシヌクレ
オチドプライマーは、既知の技術にしたがって調製され
る。そのような基を含む伸長プローブに関しては、上述
のように具体例を参照せよ。Polydeoxynucleotide primers containing at least one monophosphate with a 3 ′ end consisting of a nucleotide monophosphate in which the oxygen of at least one phosphate is replaced by sulfur are prepared according to known techniques. . For extension probes containing such groups, see specific examples as described above.
【0168】便宜上、本発明で使用される予め決められ
た量の試薬が包装組合せのキットで提供される。キット
は、(a)少なくとも一つのリン−硫黄結合を含むヌク
レオチド一リン酸からなる3’端をもつポリヌクレオチ
ドプライマー、(b)ヌクレオチド三リン酸および
(c)エキソヌクレアーゼ活性をもつ、またはもたない
鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼを包装の組合
せとして含む。標的ポリヌクレオチド配列の増幅のため
のキットは上記の品目を含み、PCRを行うためにさら
に、前記標的配列に沿ったプライマーの伸長産物がもう
一方のプライマーの伸長の鋳型として作用することにプ
ライマーが関連するような第二のポリヌクレオチドプラ
イマーを含む。第二プライマーはまた、少なくとも一つ
のリン−硫黄結合を含むヌクレオチド一リン酸からなる
3’端をもつ。For convenience, the predetermined amount of reagents used in the present invention are provided in a packaged combination kit. The kit comprises (a) a polynucleotide primer having a 3 ′ end consisting of a nucleotide monophosphate containing at least one phosphorus-sulfur bond, (b) a nucleotide triphosphate and (c) having exonuclease activity, or having No template-dependent polynucleotide polymerase is included as a packaging combination. A kit for the amplification of a target polynucleotide sequence comprises the above items, and in order to carry out PCR, the primer extension product of the primer along said target sequence acts as a template for the extension of the other primer It includes a second polynucleotide primer as related. The second primer also has a 3'end consisting of a nucleotide monophosphate containing at least one phosphorus-sulfur bond.
【0169】試料中のポリヌクレオチド分析物のアッセ
イのために、本方法に有効なキットは上述の他の試薬と
共に包装中に、ポリヌクレオチド分析物から標的ポリヌ
クレオチド配列を形成するための試薬を含む。さらに、
ポリデオキシヌクレオチドプライマーは標識されるか、
または標識した、あるいは支持体に結合した配列を与え
るための基を提供される。キットはさらに増幅した標的
ポリヌクレオチド配列に結合できる標識されたポリヌク
レオチドプローブを含む。上記キットはさらに包装中
に、例えばデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、
デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシ
チジン三リン酸(dCTP)およびデオキシチミジン三
リン酸(dTTP)のデオキシヌクレオチド三リン酸の
ようなデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。キットは
さらにシグナル生産システムおよび上記試薬の一つまた
はそれ以上を含む各種の緩衝液を含む。For assaying a polynucleotide analyte in a sample, a kit useful in the present method includes, in a package with the other reagents described above, a reagent for forming a target polynucleotide sequence from the polynucleotide analyte. . further,
Is the polydeoxynucleotide primer labeled,
Alternatively, groups are provided to provide labeled or support-bound sequences. The kit further comprises a labeled polynucleotide probe capable of binding to the amplified target polynucleotide sequence. The kit is further packaged in a package such as deoxyadenosine triphosphate (dATP),
Includes deoxynucleotide triphosphates such as deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxycytidine triphosphate (dCTP) and deoxythymidine triphosphate (dTTP) deoxynucleotide triphosphates. The kit further comprises a signal production system and various buffers containing one or more of the above reagents.
【0170】キットの各種の試薬の相対的な量は、本方
法を起こし、さらに本質的にアッセイの感度を最適化す
るために必要な反応を本質的に最適化する試薬濃度を提
供するために広く変えられる。適当な環境下で、キット
の一つまたはそれ以上の試薬が本発明にしたがって方法
またはアッセイを行うために適当な濃度をもつ試薬溶液
を溶解することにより提供する、賦形剤を含む乾燥粉
末、通常は凍結乾燥品として提供される。それぞれの試
薬は別々の容器に包装され、あるいは交差反応性および
貯蔵寿命が許されるいくつかの試薬は一つの容器に合わ
される。The relative amounts of the various reagents in the kit are such that they provide the reagent concentrations that essentially optimize the reaction needed to bring about the method and essentially optimize the sensitivity of the assay. Can be widely changed. A dry powder containing excipients, provided by dissolving, in a suitable environment, one or more reagents of the kit in a reagent solution having a suitable concentration for performing the method or assay according to the present invention, Usually, it is provided as a lyophilized product. Each reagent is packaged in a separate container, or several reagents that allow cross-reactivity and shelf life are combined in one container.
【0171】例 本発明の第二の解釈はさらに次の具体例により示され
る。他に示さない限り、温度は摂氏(°C)であり、パ
ーツおよびパーセンテージは重量によるものである。Examples The second interpretation of the present invention is further illustrated by the following specific examples. Unless otherwise noted, temperatures are in degrees Celsius (° C) and parts and percentages are by weight.
【0172】例1 逆向き繰返しをもつ415merの調製 逆向き繰返し(幹−ループ分子)をもつ415merの
調製は、1990年7月19日に提出された米国特許出
願第07/555,323号に記述された方法にしたが
って行われた。この中で参考として取り込まれている関
連の発表であるEP469755もまた参照せよ。調製
では、10mM Tris−Cl、pH8.3、50m
M KCl、1.5mM MgCl2、0.01%ゼラ
チンおよび200マイクロモーラーのデオキシヌクレオ
チド三リン酸(dNTPs)を含む100マイクロリッ
トルの反応系で10アットモルの一本鎖M13mp19
(標的DNA、Bethesda Research
Laboratories(BRL)が用いられた。1
マイクロモーラーの単一プライマー増幅プライマーON
1(ポリデオキシヌクレオチドプライマー)および0.
1マイクロモーラーの伸長プローブON2存在下で、上
記反応液は95°Cで5分間熱処理され、15分間室温
に冷却された。これにより伸長プローブが標的DNAに
アニールされる。Taqポリメラーゼ(Stratag
ene、Inc.、San Diego、CA)が(5
単位)添加され、温度が次のように循環された:90°
C30秒、55°C60秒、72°C90秒。この温度
循環は30回繰り返された。415merの産物はアガ
ロースゲル電気泳動により可視化された。アガロースゲ
ルはSeaKem LEアガロース(FMC BioP
roducts、Rockland、ME)を用いて
1.2%重量/容量(w/v)で調製された。反応液
(10マイクロリットル)が6xdye(0.25%プ
ロモフェノールブルー、0.25%キシレンシアノール
および15%フィコール、タイプ400(Maniat
isらの「分子クローニング、実験室マニュアル」45
5ページ(1982年)))に添加され、1xTBE緩
衝液(0.1M Tris、89mMホウ酸、2mMエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム)での電気泳動にかけ
られた。415merの産物を構成するバンドは臭化エ
チジウム(1mg/ml)染色により同定され、UV光
下での試験により検出された。ゲルはFotodyne
、Inc.(NewBerlin、WI)のUVトラ
ンスイルミネーターに備え付けられたポラロイドMP−
4ランドカメラを用いて写真撮影された。415mer
に相当する単一バンドを与えた反応液は集められ、標準
的な方法(「分子生物学の現在のプロトコール」第15
章、ページ15.2.2)にしたがってエタノール沈殿
され、光度計を用いて定量された。Example 1 Preparation of a 415mer with inverted repeats A preparation of a 415mer with inverted repeats (stem-loop molecules) was prepared in US patent application Ser. No. 07 / 555,323 filed Jul. 19, 1990. It was done according to the method described. See also related publication EP 469755, which is incorporated herein by reference. For preparation, 10 mM Tris-Cl, pH 8.3, 50 m
10 atmole of single chain M13mp19 in 100 microliter reaction system containing M KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.01% gelatin and 200 micromolar deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
(Target DNA, Bethesda Research
Laboratories (BRL) were used. 1
Micromolar single primer amplification primer ON
1 (polydeoxynucleotide primer) and 0.
In the presence of 1 micromolar extension probe ON2, the reaction solution was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes and cooled to room temperature for 15 minutes. This causes the extension probe to anneal to the target DNA. Taq polymerase (Stratag
ene, Inc. , San Diego, CA) (5
Unit) was added and the temperature was cycled as follows: 90 °
C30 seconds, 55 ° C 60 seconds, 72 ° C 90 seconds. This temperature cycle was repeated 30 times. The 415-mer product was visualized by agarose gel electrophoresis. Agarose gel is SeaKem LE agarose (FMC BioP
products, Rocklands, ME) at 1.2% weight / volume (w / v). The reaction mixture (10 microliters) was 6xdye (0.25% promophenol blue, 0.25% xylene cyanol and 15% ficoll, type 400 (Maniat).
"Molecular Cloning, Laboratory Manual" by is et al. 45
5 (1982))) and subjected to electrophoresis in 1 × TBE buffer (0.1 M Tris, 89 mM boric acid, 2 mM sodium ethylenediaminetetraacetate). The band constituting the 415mer product was identified by ethidium bromide (1 mg / ml) staining and detected by testing under UV light. The gel is Fotodyne
, Inc. (New Berlin, WI) Polaroid MP- equipped with UV transilluminator
Photographed using a 4-land camera. 415mer
Reactions that gave a single band corresponding to were collected by standard methods ("Current Protocols in Molecular Biology", Section 15).
Ethanol precipitation according to Chapter, page 15.2.2) and quantification using a photometer.
【0173】オリゴヌクレオチドON1およびON2は
次の通りであった: ON1:5’TGT TGT TCC GTT AGT
TCG TTT TAT T3’(配列番号2) ON2:5’TGT TGT TCC GTT AGT
TCG TTT TAT TCA TAG TTA
GCG TAA CGA TCT AAA GTT T
TG TC3’(配列番号7)Oligonucleotides ON1 and ON2 were as follows: ON1: 5′TGT TGT TCC GTT AGT.
TCG TTT TAT T3 '(SEQ ID NO: 2) ON2: 5'TGT TGT TCC GTT AGT
TCG TTT TAT TCA TAG TTA
GCG TAA CGA TCT AAA GTT T
TG TC3 '(SEQ ID NO: 7)
【0174】例2 3’の終りから二つ目の位置にチオリン酸をもつプライ
マーを用いた増幅 例1に記述されたように生産された415merは、よ
り充分に以下に記述されるように、リン−酸素結合の代
わりに一つまたはそれ以上のリン−硫黄結合を含むいく
つかの異なるプライマーを用いた単一プライマー増幅反
応の標的配列として使用された。プライマー1は以下の
太字で示されたように、3’端の最後および最後から二
番目の間にリン−硫黄結合をもつON1であった:5’
TGTTGT TCC GTT AGT TCG TT
T TAT T3’(配列番号8)。プライマー1は以
下に記述されるようにプライマー2のために調製され
た。Example 2 Amplification with a primer having a thiophosphate in the second position from the end of the 3 ′ The 415mer produced as described in Example 1 was more fully described as follows: It was used as the target sequence in a single primer amplification reaction with several different primers containing one or more phosphorus-sulfur bonds instead of phosphorus-oxygen bonds. Primer 1 was ON1 with a phosphorus-sulfur bond between the end of the 3'end and the penultimate end as shown in bold below: 5 '
TGTTGT TCC GTT AGT TCG TT
T TAT T3 '(SEQ ID NO: 8). Primer 1 was prepared for Primer 2 as described below.
【0175】太字で示されたチオ修飾結合の位置まで自
動的に(Millipore Corp.、Bedfo
rd、MAの4カラムBiosearch 8750D
NA合成機)合成された次のオリゴヌクレオチド(ON
3):5’TGT TGTTCC GTT AGT T
CG TTT TAT TCA TAG TTAGCG
TAA CGA TCT AAA GTT TTG
TC3’(配列番号9)のエキソヌクレアーゼ消化によ
りプライマー2は調製された。手動酸化がその後アセト
ニトリル中0.1Mテトラエチルチウラムジスルフィド
(TETD)(Applied Biosystem
s、Inc.、Foster City、CA)を用い
て行われた。残りの塩基が1991年2月のAppli
edBiosystems、Inc.のユーザーブルチ
ン第58号のプロトコールにしたがった通常のカップリ
ング条件下で添加された。上記オリゴヌクレオチド(2
μM)の消化は1xVent緩衝液中で行われた。反応
液は5分間95°Cで熱変性され、その後室温に冷却さ
れた。T7DNAポリメラーゼ、未修飾II型(New
England Biolabs、Beverly、
MA)が添加され、反応液は5分間37°Cでインキュ
ーベートされた。T7はその後2分間95°Cで熱処理
することにより不活化された。プライマー2を含む得ら
れた反応液は以下の実験に用いられた。プライマー2:
5’TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT T3’(配列番号10)。Automatically up to the position of the thio-modified bond shown in bold type (Millipore Corp., Bedfo
rd, MA 4 column Biosearch 8750D
NA synthesizer) Synthesized next oligonucleotide (ON
3): 5'TGT TGTTCC GTT AGT T
CG TTT TAT TCA TAG TTAGCG
TAA CGA TCT AAA GTT TTG
Primer 2 was prepared by exonuclease digestion of TC3 '(SEQ ID NO: 9). Manual oxidation was followed by 0.1M tetraethylthiuram disulfide (TETD) in acetonitrile (Applied Biosystem).
s, Inc. , Foster City, CA). The remaining bases are February 1991 Appli
edBiosystems, Inc. User Bulletin No. 58 was added under normal coupling conditions. The above oligonucleotide (2
μM) digestion was performed in 1 × Vent buffer. The reaction was heat denatured at 95 ° C for 5 minutes and then cooled to room temperature. T7 DNA polymerase, unmodified type II (New
England Biolabs, Beverly,
MA) was added and the reaction was incubated for 5 minutes at 37 ° C. T7 was then inactivated by heat treating for 2 minutes at 95 ° C. The resulting reaction solution containing Primer 2 was used in the following experiments. Primer 2:
5'TGT TGT TCC GTT AGT TCG
TTT TAT T3 '(SEQ ID NO: 10).
【0176】増幅反応は以下のプロトコールにしたがっ
て行われた:415merは約500分子の415me
rを含む媒体を得るために水で連続的に希釈された。V
entポリメラーゼ緩衝液(1x)(100mM KC
l、200mM Tris−HCl、25°CでpH
8.8、100mM(NH4)2SO4、20mM M
gSO4、1%Triton X−100)、300
μM dNTPsおよび1μMのプライマー1が合わさ
れた。混合液は95°Cで5分間熱処理され、その後室
温で15分間冷却された。Taq DNAポリメラーゼ
(Stratagene、San Diego、CA)
(5単位)が反応系に添加され、次のような50サイク
ルの温度循環にかけられた:72℃5分(1回)、90
℃30秒、55°C60秒および72°C90秒(50
回)。コントロールとして、リン−酸素結合の代わりに
リン−硫黄結合をもたないON1、即ち、5’TGT
TGT TCC GTT AGT TCG TTT T
AT T3’(配列番号2)のコントロールプライマー
を用いて、上記の増幅が繰り返された。上記の実験の結
果は上述のようにアガロースゲル電気泳動により決定さ
れ、図12に示された。ここで、コントロールの反応は
レーン1に示され、プライマー1を用いた反応はレーン
2および3に示されている。The amplification reaction was performed according to the following protocol: 415mer was about 500 molecules of 415me.
It was serially diluted with water to obtain a medium containing r. V
ent polymerase buffer (1x) (100 mM KC
1, 200 mM Tris-HCl, pH at 25 ° C
8.8, 100 mM (NH4) 2SO4, 20 mM M
gSO4, 1% Triton X-100), 300
μM dNTPs and 1 μM Primer 1 were combined. The mixture was heat treated at 95 ° C for 5 minutes and then cooled at room temperature for 15 minutes. Taq DNA Polymerase (Stratagene, San Diego, CA)
(5 units) was added to the reaction system and subjected to 50 cycles of temperature cycling as follows: 72 ° C. 5 min (1 time), 90
30 seconds at 55 ° C, 60 seconds at 55 ° C and 90 seconds at 72 ° C (50
Times). As a control, ON1 which does not have a phosphorus-sulfur bond instead of a phosphorus-oxygen bond, that is, 5'TGT
TGT TCC GTT AGT TCG TTT T
The above amplification was repeated using the control primer for AT T3 '(SEQ ID NO: 2). The results of the above experiments were determined by agarose gel electrophoresis as described above and are shown in Figure 12. Here, the control reaction is shown in lane 1 and the reaction with primer 1 is shown in lanes 2 and 3.
【0177】415merの増幅はまたプライマー2お
よび上述の方法に類似したプロトコールを用いて行われ
た。プライマー2の濃度は1μMで、2.5単位のPf
uDNAポリメラーゼ(Stratagene、San
Diego、CA)がTaq DNAポリメラーゼの
代わりに使用された。結果は図13に示されている。レ
ーン1は標的分子が存在しない負のコントロールを表
す。レーン2、3および4は、本発明にしたがった41
5merのそれぞれ約300、30および3分子の増幅
を表し、この連続希釈は増幅前の415merの濃度を
得るために用いられた。Amplification of the 415mer was also performed using primer 2 and a protocol similar to the method described above. The concentration of primer 2 is 1 μM and 2.5 units of Pf
uDNA polymerase (Stratagene, San
Diego, CA) was used instead of Taq DNA polymerase. Results are shown in FIG. Lane 1 represents a negative control with no target molecule present. Lanes 2, 3 and 4 are according to the invention 41
Representing amplification of about 300, 30 and 3 molecules of 5 mer, respectively, this serial dilution was used to obtain a concentration of 415 mer before amplification.
【0178】例3 in situでのプライマーを生成する分解可能なチ
オリン酸を含む伸長プローブを用いた単一プライマー増
幅 単一プライマー増幅を用いた約600分子の二重鎖標的
の検出が分解可能なチオリン酸を含むオリゴヌクレオチ
ドを用いて繰返し示された。オリゴヌクレオチド(56
塩基)は増幅可能な幹−ループを生成する伸長プローブ
として作用し、ヌクレアーゼ処理後、増幅を行うために
プライマーとして働く。Example 3 Single Primer Amplification with an Extended Probe Containing a Degradable Thiophosphate to Generate a Primer In Situ Detection of approximately 600 molecules of double stranded target using single primer amplification is degradable Repeatedly shown with an oligonucleotide containing thiophosphate. Oligonucleotide (56
The base) acts as an extension probe that produces an amplifiable stem-loop and, after nuclease treatment, acts as a primer for amplification.
【0179】伸長プローブオリゴヌクレオチドの合成は
チオ修飾結合の位置まで自動的に行われた(4カラムB
iosearch 8750 DNA合成機)。手動で
の酸化がその後アセトニトリル中0.1Mテトラエチル
チウラムジスルフィド(TETD)(Applied
Biosystems、Inc.、Foster Ci
ty、CA)を用いて行われた。残りの塩基がAppl
ied Biosystemsの1991年2月のユー
ザーブルチン第58号のプロトコールにしたがった通常
のカップリング条件下で添加された。The synthesis of the extension probe oligonucleotide was carried out automatically up to the position of the thio-modified bond (4 column B
iosearch 8750 DNA synthesizer). Manual oxidation followed by 0.1M tetraethylthiuram disulfide in acetonitrile (TETD) (Applied)
Biosystems, Inc. , Foster Ci
ty, CA). The remaining base is Appl
ied Biosystems was added under conventional coupling conditions according to the protocol of User Burtin No. 58, February 1991.
【0180】チオ結合を含む伸長プローブ: T33およびT36の間の三個のチオリン酸結合
(↓): 分解後に残った三種類のプライマー(24、23、22
塩基)(下線)の混合物 Extension probe containing a thio bond: Three thiophosphate bonds between T33 and T36 (↓): Three types of primers remaining after degradation (24, 23, 22)
Base) (underlined) mixture
【0181】幹−ループ分子の形成および増幅は適当な
緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.8、1
0mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM
MgSO4および0.1%Triton X−10
0)、dNTPs(200から300マイクロモーラ
ー)、二重鎖標的ポリヌクレオチド分子(M13mp1
9を600分子)および伸長プローブ(初濃度0.5お
よび1マイクロモーラー)を含む100マイクロリット
ルの反応系で行われた。反応物は5分間95°Cで熱変
性され、15から20分間25°C(室温)でアニール
された。強力な3’エキソヌクレアーゼ活性をもつ三種
類のDNAポリメラーゼのそれぞれが別々に添加された
(100μlあたり6単位のKlenow DNAポリ
メラーゼ、100μlあたり5単位のT4DNAポリメ
ラーゼ(New England Biolabs(N
EB)、Beverly Mass)または100μl
あたり5単位のT7DNAポリメラーゼ(New En
gland Biolabs(NEB)、Beverl
y Mass))。標的にアニールした伸長プローブは
鎖を伸長され、一方全てのアニールしなかった伸長プロ
ーブはチオ結合の位置まで分解されるように、反応液は
37°Cでインキュベートされた。伸長プローブは分解
をモニターするために5’端が放射線標識された。硫黄
結合までのアニールしなかった伸長プローブの完全分解
は1分程度で得られたが、残りの配列は60分まで分解
に耐性であった。伸長/分解が完全に終了した後、反応
液は再び95℃で2分間熱処理され、それにより特定の
DNAポリメラーゼが不活化され、元の標的分子から新
たに形成された幹−ループが変性される。熱安定ポリメ
ラーゼが添加され(Stratagene、San D
iego、CAのPfu、100μlあたり10単
位)、次のように反応液は温度循環される:72°C5
分(1回)、90℃30秒、55°C60秒、72°C
5分(10回)、90°C30秒、55°C60秒およ
び72°C90秒(50回)。これらの反応の溶液は1
xTBE緩衝液(89mM Tris−ホウ酸、89m
Mホウ酸、0.2mM EDTA)中1.2%アガロー
ス(Seakem、FMC BioProducts)
ゲルによる電気泳動により解析され、増幅産物は臭化エ
チジウム染色により可視化された。結果は図14に示さ
れており、レーン1は0.5マイクロモーラー濃度の伸
長プローブを示し、レーン2は1マイクロモーラー濃度
の伸長プローブを示す。The formation and amplification of the stem-loop molecule is carried out in an appropriate buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 1,
0 mM KCl, 10 mM (NH4) 2SO4, 2 mM
MgSO4 and 0.1% Triton X-10
0), dNTPs (200 to 300 micromolar), double-stranded target polynucleotide molecule (M13mp1
9 in 600 molecules) and an extension probe (initial concentrations 0.5 and 1 micromolar) in a 100 microliter reaction system. The reaction was heat denatured at 95 ° C for 5 minutes and annealed at 25 ° C (room temperature) for 15 to 20 minutes. Each of the three DNA polymerases with strong 3 ′ exonuclease activity was added separately (6 units of Klenow DNA polymerase per 100 μl, 5 units of T4 DNA polymerase per 100 μl (New England Biolabs (N
EB), Beverly Mass) or 100 μl
5 units of T7 DNA Polymerase (New En
ground Biolabs (NEB), Beverl
y Mass)). The reaction was incubated at 37 ° C. so that the extension probes that annealed to the target were chain extended, while all non-annealed extension probes were cleaved to the position of the thio bond. The extension probe was radiolabeled at the 5'end to monitor degradation. Complete degradation of the unannealed extension probe up to the sulfur bond was obtained in about 1 minute, while the remaining sequences were resistant to degradation up to 60 minutes. After the completion of extension / degradation, the reaction solution is again heat-treated at 95 ° C. for 2 minutes, which inactivates a specific DNA polymerase and denatures the newly formed stem-loop from the original target molecule. . Thermostable polymerase was added (Stratagene, San D
iego, CA Pfu, 10 units per 100 μl), the reaction is temperature cycled as follows: 72 ° C.
Minute (1 time), 90 ° C 30 seconds, 55 ° C 60 seconds, 72 ° C
5 minutes (10 times), 90 ° C 30 seconds, 55 ° C 60 seconds and 72 ° C 90 seconds (50 times). The solution for these reactions is 1
xTBE buffer (89 mM Tris-boric acid, 89 m
1.2% agarose (Seakem, FMC BioProducts) in M boric acid, 0.2 mM EDTA).
The amplification products were analyzed by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. The results are shown in Figure 14, lane 1 showing the extension probe at 0.5 micromolar concentration and lane 2 showing the extension probe at 1 micromolar concentration.
【0182】例4 チオリン酸プライマーを用いたPCR増幅 PCR増幅が10mM Tris−Cl、pH8.3、
50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01
%ゼラチンおよび200マイクロモーラーのデオキシヌ
クレオチド三リン酸(dNTPs)を含む100マイク
ロリットルの反応系で10アットモルの一本鎖M13m
p19(標的DNA、BethesdaReserch
Laboratories(BRL))を用いて行わ
れる。1.0マイクロモーラーのプライマー3(5’−
GTT GAA ATT AAA CCA TCT C
AA GCC C−3’(配列番号11)およびプライ
マー4(5’−CAT AGT TAG CGT AA
C GAT CTA AAG TTT TGT C−
3’(配列番号12))の存在下で、上記の反応系は9
5°Cで5分間熱処理され、15分間室温まで冷却され
る。Taq DNAポリメラーゼ(Stratagen
e)が(5単位)添加され、次のように温度が循環され
る:90°C30秒、55°C60秒、72°C90
秒。この温度循環は30回繰り返される。増幅産物の予
想される大きさは880塩基対である。PCR反応液か
ら0、10、20および30サイクルの後とられた溶液
(5マイクロリットル)が1%アガロースゲルで電気泳
動され、臭化エチジウムで染色される。分子量標準の移
動度に基づき、約880塩基対の単一バンドがPCRの
10、20および30サイクルで出現する。Example 4 PCR Amplification Using Thiophosphate Primer PCR amplification was 10 mM Tris-Cl, pH 8.3,
50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01
% Gelatin and 200 micromolar deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) in a 100 microliter reaction system at 10 atmol single chain M13m
p19 (target DNA, Bethesda Research
Laboratories (BRL)). 1.0 micromolar primer 3 (5'-
GTT GAA ATT AAA CCA TCT C
AA GCC C-3 '(SEQ ID NO: 11) and primer 4 (5'-CAT AGT TAG CGT AA
C GAT CTA AAG TTT TGT C-
3 '(SEQ ID NO: 12)), the reaction system
Heat treated at 5 ° C for 5 minutes and cooled to room temperature for 15 minutes. Taq DNA Polymerase (Stratagen)
e) is added (5 units) and the temperature is cycled as follows: 90 ° C 30 seconds, 55 ° C 60 seconds, 72 ° C 90.
Seconds. This temperature circulation is repeated 30 times. The expected size of the amplification product is 880 base pairs. The solution (5 microliters) taken after 0, 10, 20 and 30 cycles from the PCR reaction is electrophoresed on a 1% agarose gel and stained with ethidium bromide. Based on the mobility of molecular weight standards, a single band of approximately 880 base pairs appears at 10, 20 and 30 cycles of PCR.
【0183】標的濃度は100マイクロリットルの反応
あたり10アットモルまで減少され、PCRを用いて増
幅される。個々の反応成分は、時間および温度循環のパ
ラメーター同様前に記述されたものにしたがった。反応
液は95°Cで5分間熱処理され、30分間室温まで冷
却される。0、15および30サイクルの後とられた溶
液(5マイクロリットル)が0.8%アガロースゲルで
電気泳動され、記述されているように染色される。約8
80塩基対の単一バンドがPCRの30サイクルの後出
現する。The target concentration is reduced to 10 attomoles per 100 microliter reaction and amplified using PCR. The individual reaction components followed the previously described parameters as well as the time and temperature cycling parameters. The reaction is heat treated at 95 ° C for 5 minutes and cooled to room temperature for 30 minutes. The solution (5 microliters) taken after 0, 15 and 30 cycles is electrophoresed on a 0.8% agarose gel and stained as described. About 8
A single band of 80 base pairs appears after 30 cycles of PCR.
【0184】上記の例はリン−酸素結合の代わりに、少
なくとも一つのリン酸−硫黄結合をもつヌクレオチド一
リン酸からなる3’端を含むプライマーが効果的に核酸
の増幅に使用されることを示している。The above example shows that a primer containing a 3'-terminal consisting of a nucleotide monophosphate having at least one phosphate-sulfur bond in place of the phosphorus-oxygen bond is effectively used for nucleic acid amplification. Shows.
【0185】上記討論は本発明に含まれる機構に関する
ある理論を含む。本発明が記述さる結果を達成すること
が示されているので、これらの理論は本発明を限定する
ことはない。The above discussion contains some theory of the mechanisms involved in the invention. These theories do not limit the invention, as it has been shown that the invention achieves the results described.
【0186】上記の記述および例は充分にその好ましい
具体例を含む発明を明かにしている。分子生物学および
関連科学のような技術に慣れた者に明かな記述された方
法の修飾は次の特許請求の範囲の解釈に含まれる。The above description and examples fully disclose the invention, including its preferred embodiments. Modifications of the methods described which are obvious to those skilled in the art such as molecular biology and related sciences are included in the interpretation of the following claims.
【図1】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図2】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図3】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 3 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図4】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 4 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図5】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 5 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図6】単一プライマー増幅での本発明の方法の使用を
示す図である。FIG. 6 shows the use of the method of the invention in single primer amplification.
【図7】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 7 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図8】本発明の方法の実施態様を示す模式図である。FIG. 8 is a schematic view showing an embodiment of the method of the present invention.
【図9】本発明の第二の面の具体例を示す模式図であ
る。FIG. 9 is a schematic view showing a specific example of the second aspect of the present invention.
【図10】本発明の第二の面の具体例を示す模式図であ
る。FIG. 10 is a schematic view showing a specific example of the second aspect of the present invention.
【図11】本発明の第二の面の具体例を示す模式図であ
る。FIG. 11 is a schematic view showing a specific example of the second aspect of the present invention.
【図12】得られた反応生成物のアガロースゲル(クロ
マトグラフィー)の写真である。FIG. 12 is a photograph of an agarose gel (chromatography) of the obtained reaction product.
【図13】得られた反応生成物のアガロースゲル(クロ
マトグラフィー)の写真である。FIG. 13 is a photograph of an agarose gel (chromatography) of the obtained reaction product.
【図14】得られた反応生成物のアガロースゲル(クロ
マトグラフィー)の写真である。FIG. 14 is a photograph of an agarose gel (chromatography) of the obtained reaction product.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カレン エム.ハーネンバーガー アメリカ合衆国カリフォルニア州クパーチ ノ,ポータル プラザ 19940 (72)発明者 サミュエル ローズ アメリカ合衆国カルフォルニア州マウンテ イン ビュー,アシュベリィ ウエイ 1008 (72)発明者 マーチン ベッカー アメリカ合衆国カリフォルニア州パロ ア ルト,グリアー ロード 3481 (72)発明者 エドウィン エフ.ウルマン アメリカ合衆国カルフォルニア州アサート ン,セルビィ レーン 135 (72)発明者 グレン エィチ.マックゴール アメリカ合衆国カリフォルニア州マウンテ イン ビュー,カリフォルニア ストリー ト 2065 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Karen M. Hahnenberger Portal Plaza, Cupertino, Calif., USA 19940 (72) Inventor Samuel Rose Inventor, Mountbury, California, USA 1008 (72) Inventor, Martin Becker, Palo Alt, Calif., USA 3481 (72) Invention Person Edwin F. Ullman Selby Lane, Atherton, California 135 (72) Inventor Glenn Eich. McGol, Mountain View, California, United States, California Street 2065
Claims (22)
チド配列から、非修飾延長プローブを含まず、上記標的
ポリヌクレオチド配列と同一の配列がその3’末端にお
いて、上記標的配列の5’末端におけるポリヌクレオチ
ド配列と相補性のポリヌクレオチド配列に結合したポリ
ヌクレオチドを形成させる方法であって、 (a)上記単一鎖標的ポリヌクレオチド配列の3’末端
に、上記単一鎖標的ポリヌクレオチド配列の5’末端に
おける配列S2と実質的に同一な配列を含有する上記延
長プローブの3’末端をハイブリダイズさせ、 (b)上記延長プローブを上記単一鎖標的ポリヌクレオ
チド配列に沿って延長させ、 (c)上記単一鎖標的ポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズしない上記延長プローブの3’末端を修飾し、 (d)その3’末端に上記配列S2を有するプライマー
を延長された延長プローブの3’末端にハイブリダイズ
させ、ついで (e)上記プライマーを上記延長された延長プローブに
沿って延長させる方法1. From the extender probe and the single-stranded target polynucleotide sequence, a sequence identical to the target polynucleotide sequence without an unmodified extender probe is present at its 3'end at the 5'end of the target sequence. A method for forming a polynucleotide bound to a polynucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence, comprising: (a) 5'of the single-stranded target polynucleotide sequence at the 3'end of the single-stranded target polynucleotide sequence. Hybridizing the 3'end of the extender probe containing a sequence substantially identical to sequence S2 at the end, (b) extending the extender probe along the single-stranded target polynucleotide sequence, (c) Modifying the 3'end of the extension probe that does not hybridize to the single-stranded target polynucleotide; Hybridized primers having sequence S2 at the 3 'end of the extended extender probe, and then (e) a method of the above primers to extend along the extended extender probe
列にハイブリダイズしない延長プローブの3’末端を延
長または減成する手段からなる「請求項1」記載の方法2. The method of claim 1 wherein the modification comprises means for extending or degrading the 3'end of the extender probe that does not hybridize to the single stranded target polynucleotide sequence.
性の2個のセグメントを有するポリヌクレオチド(PN
D)であり、上記延長プローブを実質的に含まないPN
Dを製造する方法であって、 (a)2個の隣接しない非相補性ヌクレオチド配列S1
およびS2を有し、S2はS1の5’で少なくとも10
ヌクレオチド長であるポリヌクレオチド、(b)2個の
デオキシヌクレオチド配列からなる延長プローブであ
り、その延長プローブの3’末端における配列、EP1
はS1とハイブリダイズ可能で、他方のデオキシヌクレ
オチド配列、EP2はS2と相同性である延長プロー
ブ、および(c)上記ポリヌクレオチドとハイブリダイ
ズしない上記延長プローブの3’末端を化学的に修飾す
る手段の組合わせを提供し、 上記延長プローブを上記ポリヌクレオチドに沿って延長
させ、この場合、上記ポリヌクレオチドとハイブリダイ
ズしない上記延長プローブの3’末端は修飾される、各
工程からなる方法3. A polynucleotide (PN) having two non-adjacent and mutually complementary segments from an extended probe.
D), which is substantially free of the extension probe
A method for producing D, comprising: (a) two non-adjacent non-complementary nucleotide sequences S1
And S2, S2 is 5'of S1 and is at least 10
A polynucleotide having a nucleotide length, (b) an extension probe consisting of two deoxynucleotide sequences, the sequence at the 3'end of the extension probe, EP1
Is an extender probe hybridizable to S1 and the other deoxynucleotide sequence, EP2 is homologous to S2, and (c) means for chemically modifying the 3'end of the extender probe that does not hybridize to the polynucleotide. And the extension probe is extended along the polynucleotide, wherein the 3 ′ end of the extension probe that does not hybridize to the polynucleotide is modified.
クレオチド配列EP3からなる「請求項3」記載の方法4. The method according to claim 3, wherein the means comprises the nucleotide sequence EP3 capable of hybridizing with EP1.
列EP3からなり、このEP3はEP1とハイブリダイ
ズ可能である「請求項3」記載の方法5. The method of claim 3 wherein the means comprises the nucleotide sequence EP3 in the extension probe, which EP3 is hybridizable with EP1.
せる手段である「請求項3」記載の方法6. The method according to claim 3, wherein the means is a means for degrading the 3'end of the extension probe.
有する酵素からなる「請求項6」記載の方法7. The method according to claim 6, wherein the means comprises an enzyme having 3'-endonuclease activity.
その3’末端において、S2と相補性のヌクレオチド配
列とハイブリダイズ可能なポリデオキシヌクレオチドプ
ライマーを与える「請求項6」記載の方法8. The method of claim 6 wherein the extension probe is degraded to provide a polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to a nucleotide sequence complementary to S2 at least at its 3'end.
において、S2と相補性のヌクレオチド配列と以下の条
件下にハイブリダイズ可能なポリデオキシヌクレオチド
プライマーを提供し、その条件は、(1)延長された延
長プローブが一本鎖になり、(2)上記ポリデオキシヌ
クレオチドプライマーが上記延長された延長プローブと
ハイブリダイズし、それに沿って延長し、延長されたプ
ライマーからなる二本鎖を形成し、(3)上記延長され
たプライマーは上記二本鎖から解離し、そして(4)上
記プライマーは上記延長されたプライマーとハイブリダ
イズし、それに沿って延長し、延長されたプライマーか
らなる二本鎖を形成するものである「請求項3」に記載
の方法9. A polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to a nucleotide sequence complementary to S2 at least at its 3 ′ end during the combination under the following conditions, which condition is (1) extension. The extended probe becomes a single strand, and (2) the polydeoxynucleotide primer hybridizes with the extended probe and extends along it to form a double strand consisting of the extended primer, (3) the extended primer dissociates from the duplex, and (4) the primer hybridizes with the extended primer and extends along it to form a duplex of the extended primer. The method according to claim 3, which is to be formed.
「請求項9」記載の方法10. The method according to claim 9, wherein steps (3) and (4) are repeated.
なくとも10ヌクレオチド長の、隣接しない非相補性の
ヌクレオチド配列S1とS2を有する標的ポリヌクレオ
チド配列を複製するための「請求項3」記載の方法であ
って、(A)延長プローブのいくつかは、上記標的ポリ
ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、および上記標的
ポリヌクレオチド配列に沿って延長され(延長されたE
P)て2本鎖を形成し、(B)標的ヌクレオチド配列に
ハイブリダイズしない延長プローブはその3’末端で延
長または減成され、(C)上記延長されたEPは上記2
本鎖から解離され、(D)上記プライマーは延長された
EPとハイブリダイズしかつそれに沿って延長されて、
延長プライマーよりなる2本鎖を形成し、(E)上記延
長プライマーは上記2本鎖から解離され、そして(F)
上記プライマーは上記延長プライマーとハイブリダイズ
しかつそれに沿って延長されて延長プライマーよりなる
2本鎖を形成し、工程(E)と(F)は繰り返される条
件下で、(1)上記標的ポリヌクレオチド配列、(2)
延長プローブの3’末端の配列EP1はS1とハイブリ
ダイズ可能で、他方のデオキシヌクレオチド配列EP2
はS2に相同性のある、2つのデオキシヌクレオチド配
列を有する延長プローブ、(3)上記標的ポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズしない延長プローブの3’末
端を延長または減成する手段、(4)プライマーが直接
提供されるかまたはその場で(in situ)産生さ
れる3’末端の配列S2よりなるポリデオキシヌクレオ
チドプライマー、(5)DNAポリメラーゼ、および
(6)デオキシヌクレオシド3リン酸を、同時にまたは
全部または一部を連続して、組合せで提供する工程より
なる方法。11. S2 is 5'of S1 and is defined in "claim 3" for replicating a target polynucleotide sequence having noncontiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2, each of at least 10 nucleotides in length. The method comprises: (A) some of the extender probes hybridize to the target polynucleotide sequence and extend along the target polynucleotide sequence (extended E
P) forms a double strand, and (B) an extension probe that does not hybridize to the target nucleotide sequence is extended or degraded at its 3'end, and (C) the extended EP is the same as in 2 above.
Dissociated from the strand, (D) the primer hybridizes to and extends along with the extended EP,
Forming a double strand consisting of the extension primer, (E) the extension primer is dissociated from the double strand, and (F)
The primer hybridizes with the extension primer and is extended along the extension primer to form a double strand consisting of the extension primer, and under the condition that steps (E) and (F) are repeated, (1) the target polynucleotide Array, (2)
The sequence EP1 at the 3'end of the extender probe is hybridizable with S1 and the other deoxynucleotide sequence EP2.
Is an extension probe having two deoxynucleotide sequences homologous to S2, (3) means for extending or degrading the 3'end of the extension probe that does not hybridize with the target polynucleotide sequence, (4) direct primer The polydeoxynucleotide primer provided, or produced in situ, with a 3'terminal sequence S2, (5) a DNA polymerase, and (6) a deoxynucleoside triphosphate, either simultaneously or in whole or in part. A method comprising the steps of sequentially providing the parts in combination.
は延長プローブの減成により与えられ、プライマーの
3’末端に最も近いホスフェートはホスホロチオエート
で置換される、「請求項11」記載の方法。12. The method of claim 11, wherein the polydeoxynucleotide primer is provided by the degradation of an extension probe and the phosphate closest to the 3'end of the primer is replaced with phosphorothioate.
めの「請求項3」記載の方法であって、(a)ポリヌク
レオチドを含むと考えられる媒体を処理して(もし存在
する場合には)そのポリヌクレオチドから、2つの隣接
しない非相補性のヌクレオチド配列S1とS2(ここで
S2はS1の5’であり、少なくとも10ヌクレオチド
長である)を有する単一鎖標的ポリヌクレオチド配列を
形成させ、(b)上記媒体に(1)延長プローブの3’
末端の配列(EP1)はS1とハイブリダイズ可能で、
他のデオキシヌクレオチド配列(EP2)は実質的にS
2と同一である、2つのデオキシヌクレオチド配列を有
する延長プローブ、(2)EP1とハイブリダイズする
ことができる部分を有するヌクレオチド配列(NS)で
あって、上記延長プローブの別の分子または部分である
NS、(3)S2に相補性のヌクレオチド配列とハイブ
リダイズすることができるポリデオキシヌクレオチドプ
ライマー、(4)デオキシヌクレオシド3リン酸、
(5)およびDNA鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチ
ドポリメラーゼを、(A)延長プローブは、上記標的ポ
リヌクレオチド配列とハイブリダイズし、および上記標
的ポリヌクレオチド配列に沿って延長され(延長された
延長プローブ)て2本鎖を形成し、(B)標的ポリヌク
レオチド配列にハイブリダイズしない延長プローブはN
Sに沿って延長され、(C)上記延長された延長プロー
ブは上記2本鎖から解離され、(D)上記プライマーは
上記延長された延長プローブとハイブリダイズしかつそ
れに沿って延長されて、延長プライマーよりなる2本鎖
を形成し、(E)上記延長プライマーは上記2本鎖から
解離され、そして(F)上記プライマーは上記延長プラ
イマーとハイブリダイズしかつそれに沿って延長されて
延長プライマーよりなる2本鎖を形成し、工程(E)と
(F)は繰り返される条件下で(ここで工程(a)と
(b)は同時にまたは全体にまたは部分的に連続的に行
われる)、組合せて、そして(c)上記延長プライマー
の存在を調べる工程よりなる方法。13. A method according to claim 3 for detecting the presence of a polynucleotide, comprising: (a) treating a medium suspected of containing the polynucleotide (if present); Forming from the polynucleotide a single-stranded target polynucleotide sequence having two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2, where S2 is 5'of S1 and is at least 10 nucleotides in length; b) In the above medium, (1) 3'of the extension probe
The terminal sequence (EP1) is hybridizable with S1,
The other deoxynucleotide sequence (EP2) is essentially S
An extension probe having two deoxynucleotide sequences identical to 2, (2) a nucleotide sequence (NS) having a portion capable of hybridizing with EP1, which is another molecule or portion of the extension probe. NS, (3) a polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing with a nucleotide sequence complementary to S2, (4) deoxynucleoside triphosphate,
(5) and the DNA template-dependent polydeoxynucleotide polymerase, (A) the extension probe hybridizes with the target polynucleotide sequence, and is extended along the target polynucleotide sequence (extended extension probe). An extension probe that forms a double strand and does not hybridize to (B) the target polynucleotide sequence is N
Extended along S, (C) the extended extension probe is dissociated from the double strand, and (D) the primer hybridizes with and is extended along with the extended extension probe. Forming a double strand consisting of a primer, (E) the extension primer is dissociated from the double strand, and (F) the primer hybridizes with and extends along the extension primer to the extension primer. Forming a double strand and combining steps (E) and (F) under repeated conditions (where steps (a) and (b) are carried out simultaneously or wholly or partially sequentially) And (c) a step of examining the presence of the extension primer.
一のポリヌクレオチド配列を形成する方法であって、
(a)媒体中で単一鎖標的ポリヌクレオチド配列、DN
Aポリメラーゼ活性および3’−エキソヌクレアーゼ活
性を有する1つまたはそれ以上の酵素、および延長プロ
ーブを組合せ(ここで延長プローブは3’末端で、単一
鎖標的ポリヌクレオチド配列の3’末端の配列S1に相
補性の配列EP1と、上記標的配列の5’末端の配列S
2と実質的に同一の配列EP2よりなり、上記延長プロ
ーブはEP2配列内に少なくとも1つのホスホロチオエ
ートを含有する)、そして(b)上記媒体を処理して、
上記延長プローブを上記単一鎖標的ポリヌクレオチドに
ハイブリダイズさせ、上記延長プローブを上記単一鎖標
的ポリヌクレオチド配列に沿って延長し、単一鎖標的ポ
リヌクレオチド配列にハイブリダイズしない上記延長プ
ローブの3’末端を減成してその3’末端に上記EP2
配列を有するプライマーを形成し、このプライマーを延
長した延長プローブにハイブリダイズさせて、プライマ
ーをこの延長した延長プローブに沿って延長させること
よりなる方法。14. A method of forming a polynucleotide sequence identical to a single-stranded target polynucleotide sequence, the method comprising:
(A) Single-stranded target polynucleotide sequence in a medium, DN
A combination of one or more enzymes having A polymerase activity and 3'-exonuclease activity, and an extension probe, wherein the extension probe is at the 3'end and the sequence S1 at the 3'end of the single-stranded target polynucleotide sequence. EP1 which is complementary to and the sequence S at the 5'end of the above target sequence
2), wherein the extension probe contains at least one phosphorothioate within the EP2 sequence), and (b) treating the medium,
The extension probe is hybridized to the single-stranded target polynucleotide, the extension probe is extended along the single-stranded target polynucleotide sequence, and 3 of the extension probes that do not hybridize to the single-stranded target polynucleotide sequence. EP2 is added to the 3'end by degrading the'end.
A method comprising forming a primer having a sequence, hybridizing the primer to an extended extension probe, and extending the primer along the extended extension probe.
配列とハイブリダイズ可能な配列(EP1)をその3’
末端に有し、標的ポリヌクレオチド配列の第2の配列と
実質的に同一の配列(EP2)を有する延長プローブ
(ここで標的ポリヌクレオチド配列中の第2の配列は最
初の配列の5’であり最初の配列とは隣接していな
い)、EP1とハイブリダイズ可能な部分を有するヌク
レオチド配列(NS)(ここでNSは上記延長プローブ
とは別の分子またはその一部である)、そしてポリデオ
キシヌクレオチドプライマーを形成する手段が別に存在
しない場合、上記第2の配列に相補性の配列にハイブリ
ダイズ可能なポリデオキシヌクレオチドプライマーを、
パッケージされた組合せで含むことよりなるキット。15. A sequence (EP1) which is hybridizable with the first sequence in the target polynucleotide sequence is designated as 3 '.
An extension probe having a sequence (EP2) at the end that is substantially identical to the second sequence of the target polynucleotide sequence (wherein the second sequence in the target polynucleotide sequence is 5'of the first sequence). Non-contiguous with the first sequence), a nucleotide sequence (NS) having a portion capable of hybridizing with EP1 (where NS is a molecule or part thereof different from the extension probe), and a polydeoxynucleotide When there is no other means for forming a primer, a polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to a sequence complementary to the second sequence is added,
A kit comprising comprising in a packaged combination.
ジエステルを有する延長プローブと、この延長プローブ
を加水分解することができる3’−エキソヌクレアーゼ
よりなるキット。16. A kit comprising an extension probe having at least one phosphorothioate diester and a 3′-exonuclease capable of hydrolyzing the extension probe.
めの「請求項3」記載の方法であって、(a)ポリヌク
レオチドを含むと考えられる媒体を処理して(もし存在
する場合には)そのポリヌクレオチドから、2つの隣接
しない非相補性のヌクレオチド配列S1とS2(ここで
S2はS1の5’であり、少なくとも10ヌクレオチド
長である)を有する単一鎖標的ポリヌクレオチド配列を
形成させ、(b)上記媒体に(1)延長プローブの3’
末端の配列(EP1)はS1とハイブリダイズ可能で、
他のデオキシヌクレオチド配列(EP2)は実質的にS
2と同一である、2つのデオキシヌクレオチド配列より
なる延長プローブ(ここで延長プローブは少なくとも1
つのホスホロチオエートジエステルを含有し、減成して
S2に相補性のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能
なポリデオキシヌクレオチドプライマーを形成すること
ができる)、(3)デオキシヌクレオシド3リン酸、
(4)およびDNA鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチ
ドポリメラーゼを、(A)延長プローブは、上記標的ポ
リヌクレオチド配列とハイブリダイズしかつ上記標的ポ
リヌクレオチド配列に沿って延長されて2本鎖を形成
し、(B)標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズしな
い延長プローブは減成して上記ポリデオキシヌクレオチ
ドプライマーを形成し、(C)上記延長された延長プロ
ーブは上記2本鎖から解離され、(D)上記プライマー
は上記延長された延長プローブとハイブリダイズしかつ
それに沿って延長され、(E)上記延長プライマーは上
記2本鎖から解離され、そして(F)上記プライマーは
上記延長プライマーとハイブリダイズしかつそれに沿っ
て延長されて延長プライマーよりなる2本鎖を形成し、
工程(E)と(F)は繰り返される条件下で(ここで工
程(a)と(b)は同時に、または全体にまたは部分的
に連続的に行われる)組合せて、そして(c)上記延長
プライマーの存在を調べる工程よりなる方法。17. A method according to claim 3 for detecting the presence of a polynucleotide, comprising: (a) treating a medium suspected of containing the polynucleotide (if present); Forming from the polynucleotide a single-stranded target polynucleotide sequence having two non-contiguous non-complementary nucleotide sequences S1 and S2, where S2 is 5'of S1 and is at least 10 nucleotides in length; b) In the above medium, (1) 3'of the extension probe
The terminal sequence (EP1) is hybridizable with S1,
The other deoxynucleotide sequence (EP2) is essentially S
An extender probe consisting of two deoxynucleotide sequences identical to 2 (wherein the extender probe is at least 1
Three phosphorothioate diesters, which can be degraded to form a polydeoxynucleotide primer capable of hybridizing to a nucleotide sequence complementary to S2), (3) deoxynucleoside triphosphates,
(4) and the DNA template-dependent polydeoxynucleotide polymerase, (A) the extension probe hybridizes with the target polynucleotide sequence and is extended along the target polynucleotide sequence to form a double strand, ( B) an extension probe that does not hybridize to the target nucleotide sequence is degraded to form the polydeoxynucleotide primer, (C) the extended extension probe is dissociated from the double strand, and (D) the primer is Hybridized with and extended along the extended extension probe, (E) the extension primer is dissociated from the double strand, and (F) the primer hybridizes with and extends along the extension primer. To form a double strand consisting of the extended primer,
Steps (E) and (F) in combination under repeated conditions (where steps (a) and (b) are carried out simultaneously or wholly or partly sequentially), and (c) the above extension. A method comprising the step of examining the presence of a primer.
(「標的配列」)に相補性のポリヌクレオチド配列を形
成する方法であって、(a)上記標的配列の3’末端
に、ヌクレオチドモノホスフェート(ここで少なくとも
1つのホスフェート酸素の代わりにイオウがある)より
なる3’末端を有するポリヌクレオチドプライマーをハ
イブリダイズさせ、(b)このポリヌクレオチドプライ
マーを標的配列に沿って延長し、そして(c)上記標的
配列から上記延長したポリヌクレオチドプライマーを解
離することよりなる方法。18. A method of forming a polynucleotide sequence complementary to a single-stranded target polynucleotide sequence ("target sequence"), comprising: (a) a nucleotide monophosphate (herein) at the 3'end of the target sequence. At least one of which is sulfur in place of phosphate oxygen) and has a 3'end having a 3'end, and (b) the polynucleotide primer is extended along a target sequence, and (c) the target. A method comprising dissociating the extended polynucleotide primer from a sequence.
りにイオウがある、「請求項18」記載の方法。19. The method of claim 18, wherein there is sulfur in place of 1 to 5 phosphate oxygens.
ウ結合を有する以外は、単一鎖標的ポリヌクレオチド配
列(「標的配列」)と同一の配列を有するポリヌクレオ
チド配列を形成するための「請求項18」記載の方法で
あって、(a)上記標的配列の3’末端に、少なくとも
1つのリン−イオウ結合を含有する最初のポリヌクレオ
チドプライマー(”第1のプライマー”)をハイブリダ
イズさせ、(b)上記標的配列に沿って上記第1のプラ
イマーを延長し、(c)上記標的配列から上記延長した
第1のプライマーを解離して、(d)上記延長した第1
のプライマーの3’末端に、第1のプライマーと同一で
あるかまたは異なる第2のポリヌクレオチドプライマー
(”第2のプライマー”)をハイブリダイズさせ、そし
て(e)第2のプライマーを第1のプライマーに沿って
延長し、延長した第2のプライマーを形成する(ここで
第1のプライマーと第2のプライマーが同じ場合上記延
長した第1のプライマーは上記第1のプライマーの鋳型
であり、第1のプライマーと第2のプライマーが異なる
場合上記延長した第1のプライマーは上記第2のプライ
マーの鋳型であり、上記延長した第2のプライマーは上
記第1のプライマーの鋳型である)の工程よりなる方
法。20. A “claim” for forming a polynucleotide sequence having a sequence identical to a single-stranded target polynucleotide sequence (“target sequence”) except that it has a phosphorus-sulfur bond instead of a phosphorus-oxygen bond. Item 18 ”, wherein (a) the 3 ′ end of the target sequence is hybridized with a first polynucleotide primer containing at least one phosphorus-sulfur bond (“ first primer ”), (B) extending the first primer along the target sequence, (c) dissociating the extended first primer from the target sequence, and (d) the extended first primer.
To the 3'end of the first primer, a second polynucleotide primer that is the same as or different from the first primer ("second primer"), and (e) the second primer Extending along the primer to form an extended second primer (where the first primer and the second primer are the same, the extended first primer is the template of the first primer, If the first primer and the second primer are different, the extended first primer is the template of the second primer, and the extended second primer is the template of the first primer) How to become.
ライマーが同一である、「請求項20」記載の方法。21. The method of claim 20, wherein the first primer and the second primer are the same.
離され、次に上記プライマーは上記延長したプライマー
に沿って延長されるように、繰り返しサイクリングを得
る条件が選択される「請求項20」または「請求項2
1」記載の方法。22. The “claim 20” or “claim” wherein the conditions for repeated cycling are selected such that the extended primer is dissociated from its template and then the primer is extended along the extended primer. Item 2
The method described in 1 ”.
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