"Moule de sonde de détection de séquence d'ADN et préparation d'un tel moule et d'une telle sonde" Moule de sonde de détection de séquence d'ADN et préparation d'un tel moule et d'une telle sonde.
La présente invention est relative à un moule de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'acide désoxyribonucléique
(ADN) monobrin, comprenant une partie d'ADN vecteur monobrin et une séquence d'ADN monobrin insérée sur le vecteur et complémentaire de la sonde recherchée, une région complémentaire d'une amorce de séquence étant située juste en amont de la séquence insérée.
Elle concerne également un procédé de préparation de moule de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'acide désoxyribonucléique (ADN) monobrin, comprenant la réalisation d'un ADN recombinant cyclique contenant une partie d'ADN vecteur monobrin et une séquence d'ADN monobrin insérée sur le vecteur et complémentaire de la sonde recherchée, une région complémentaire d'une amorce de séquence étant située juste en amont de la séquence insérée et au moins un site de restriction étant situé juste en aval de la séquence d'ADN insérée, ainsi que les moules obtenus.
Elle concerne aussi un procédé de préparation de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'acide désoxyribonucléique
(ADN) monobrin, comprenant l'appariement d'une amorce de séquence à une région complémentaire d'un moule monobrin de la sonde, l'allongement de l'amorce de séquence appariée au moins jusqu'à la formation de la sonde le long du moule et l'isolement de la sonde formée, ainsi que les sondes obtenues et leur application, notamment à des procédés de diagnostic et d'analyse de gènes.
Les techniques d'analyse de gène tirent profit de l'état double brin de l'ADN. La capacité des brins d'ADN de former des structures doubles permet la détection de séquences spécifiques par hybridation avec un brin-sonde complémentaire marqué. Aussi, en fonction de la méthodologie utilisée, des différences subtiles entre ces brins hybridés peuvent être détectées. Le besoin de procédés permettant une préparation aisée de brins spécifiques d'ADN est évident. L'efficacité globale des hybridations d'ADN peut être augmentée par l'utilisation de sondes monobrin et certaines nouvelles techniques reposent sur l'utilisation de fragments d'ADN monobrin. De courtes séquences peuvent être aisément produites par synthèse chimique d'ADN. Cependant cette technique n'est pas appropriée, lorsqu'on traite des fragments longs de plusieurs centaines de bases.
Actuellement, on connaît des procédés de préparation de grandes sondes monobrin d'ADN à partir de précurseurs double brin, par sédimentation (v.G.A. RICHA, J.M. TAYLOR et J.E. KALINYAK, Simple r.apid method for the synthesis of radioactively labeledcDNA hybridization probes utilizing bacteriophage M13mp7, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, Vol.79, p.724-728, Février 1982).
On connaît également des procédés de préparation de moule de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'acide désoxyribonucléique, tels que celui décrit au début. On utilise les moules obtenus par ces procédés pour la préparation de sondes, cette préparation comprenant l'appariement de l'amorce de séquence au moule, l'allongement de l'amorce de séquence appariée au moins jusqu'au site de restriction précité, de façon à former un brin complémentaire au moins de la séquence insérée entière, le clivage du moule alors partiellement à double brin au site de restriction susdit de façon à assurer sa linéarisation,
et l'application de conditions de dénaturation qui séparent d'une extrémité du moule un fragment du brin complémentaire qui correspond à la sonde monobrin recherchée et de l'autre extrémité du moule le reste du brin complémentaire, la sonde étant isolée ensuite du moule linéaire et du reste de brin complémentaire par des processus connus, tels qu'une électrophorèse
(v. R.M. MYERS, N. LUMELSKY, L.S. LERMAN et T. MANIATIS, Détection of single base substitutions in total genomic DNA, Nature, vol.313, Février 1985, p. 495 à 498; M. ANTONIOU, K.GUZMAN, S. CHAKRABORTY et M.R. BANERJEE, A generally applicable improved method for préparation of single stranded cDNA probes from clones constructed in M 13 vectors, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 203-212).
Tous ces procédés de préparation de moule se limitent à la préparation d'un moule cyclique, destiné à être perdu après son utilisation pour la préparation d'une seule sonde. L'isolement de la sonde dans un milieu contenant non seulement celle-ci mais aussi le moule alors linéaire et d'éventuels fragments du brin complémentaire clivé, ne correspondant pas à la sonde recherchée, est une opération longue, compliquée et coûteuse.
Une synthèse in vitro de sondes d'acide ribonucléique
(ARN) constitue aussi une voie attirante pour la préparation de sondes monobrin spécifiques, mais comme des hybrides d'ADN-ARN sont alors formés, cela peut gêner l'analyse ultérieure basée sur les propriétés d'ADN double brin (par exemple le comportement à la fusion, les digestions enzymatiques). La manipulation de molécules d'ARN est aussi assez pénible étant donné le soin extrême qui est nécessaire pour éviter une dégradation par de la ribonucléase. En fait, le moule d'ADN doit être éliminé par une digestion ultérieure par de la désoxyribonucléase "exempte de ribonucléase".
La présente invention a pour but la mise au point d'un moule de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'ADN monobrin qui puisse supporter plusieurs opérations successives de synthèse amorcée de sonde et qui permette un isolement rapide et aisé des copies obtenues par libération dans de simples conditions de dénaturation. L'invention a également pour but la préparation d'un tel moule et la préparation répétitive de sondes à partir d'un tel moule, ainsi que l'application de ces sondes à des procédés de diagnostic ou d'analyse de gènes, et ce sans les inconvénients des procédés selon la technique antérieure.
On a résolu ces problèmes, suivant l'invention, en prévoyant un moule tel que décrit au début, ce moule étant, sous une forme linéarisée, en position immobilisée sur un support approprié par une région du brin située en dehors de la séquence insérée, celle-ci étant disposée à l'extrémité du côté aval du moule immobilisé.
<EMI ID=1.1> pour former la chaîne moléculaire d'un ADN s'effectue dans un sens déterminé, et, par les termes amont et aval, il faut entendre une position relative sur le brin d'ADN en fonction de ce sens de synthèse.
Suivant une forme de réalisation avantageuse de l'invention, le support utilisé est un papier diazoté.
On a également prévu, suivant l'invention, un procédé de préparation de moule, tel que décrit au début, ce procédé comprenant l'appariement de l'amorce de séquence à l'ADN recombinant, l'allongement de l'amorce de séquence appariée au moins jusqu'au site de restriction susdit, de façon à former un brin protecteur complémentaire au moins de la séquence insérée entière, le clivage du recombinant alors partiellement double brin au site de restriction susdit de façon à assurer sa linéarisation, l'immobilisation du recombinant linéarisé sur un support approprié par sa région non protégée par le brin protecteur ou un fragment de ce dernier, et l'élimination ultérieure du brin protecteur ou des fragments de celui-ci dans des conditions de dénaturation, avec formation d'un moule qui, sous forme linéarisée,
est en position immobilisée sur le support par une région située en dehors de la séquence insérée complémentaire
de la sonde, la séquence insérée étant disposée à l'extrémité du côté aval du moule immobilisé avec la région complémentaire de l'amorce de séquence située juste en amont.
Il est aussi prévu, suivant l'invention, un procédé de préparation de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'ADN monobrin, tel que décrit au début, ce procédé comprenant l'appariement susdit à un moule immobilisé tel que décrit ci-dessus et/ou tel qu'obtenu selon un procédé de préparation de moule immobilisé tel que décrit ci-dessus, l'allongement de l'amorce de séquence appariée jusqu'à l'extrémité du côté aval du moule immobilisé, ce qui forme une sonde complémentaire de la séquence insérée du moule, et la libération et l'isolement de la sonde obtenue dans de simples conditions de dénaturation, le moule restant immobilisé sur son support.
Suivant une forme de réalisation avantageuse de ce procédé, il comprend sa répétition à plusieurs reprises sur le même moule immobilisé, en permettant la formation d'un nombre correspondant de sondes parfaitement identiques.
Suivant une forme de réalisation perfectionnée de ce procédé, il comprend le marquage d'une manière appropriée quelconque de la sonde, de manière à permettre sa détection lors d'une mise en oeuvre ultérieure.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après à titre non limitatif et avec référence à la figure unique annexée qui représente de manière schématique un procédé de préparation de sonde suivant l'invention.
L'étape 1 du procédé consiste en la préparation d'un ADN recombinant monobrin cyclique. Cette préparation a lieu selon des méthodes standards et n'est donc pas décrite de manière plus détaillée. Elle consiste dans le clonage d'une séquence d'ADN recherchée
(I) dans un ADN vecteur (V), par exemple un bactériophage M 13.
Il doit être entendu que la partie de vecteur (V) du recombinant n'est en aucune façon critique pour l'invention. Les seules conditions nécessaires du recombinant préparé sont la disposition juste en amont de la séquence insérée d'une région complémentaire
(A') d'une amorce de séquence et la présence d'un site de restriction
(SR.) juste en aval de la séquence insérée (I). Le recombinant illustré dans l'étape 1 de la figure présente en outre un second site de restriction (SR2) entre la région complémentaire (A') et la séquence insérée
(I).
Dans l'étape 2, l'ADN recombinant monobrin passe partiellement à l'état double brin par appariement d'une amorce de séquence (A) à la région complémentaire (A') et par allongement de cette amorce de séquence (A) conventionnelle de telle façon qu'un brin, appelé brin protecteur (BP), couvre toute la séquence insérée (I), tout en laissant la plus grande part de la partie de vecteur M 13 (V) à l'état monobrin. L'ADN est ensuite étalé en ligne par digestion dans l'étape 3 avec une enzyme de restriction (ER) qui, ainsi qu'il est illustré par la flèche F, coupe la région à double brin en aval de la séquence insérée (I) (par rapport au site d'amorçage),
<EMI ID=2.1> 4, couplée à du papier diazoté (PD). Comme le couplage requiert de l'ADN monobrin, la présence du second brin ou brin protecteur
(BP) empêche tout couplage au niveau du site de la séquence insérée
(I) et du site d'amorçage (A). Ce brin de protection (BP) est ensuite éliminé par dénaturation dans l'étape 5, ce qui laisse un moule linéaire immobilisé, prêt pour la préparation d'une sonde. Après appariement et allongement d'une amorce de séquence (A) de M 13, un second brin est formé dans l'étape 6 et il recouvre la séquence insérée
(I) en se terminant au point de clivage correspondant au site de restriction SRI. Par dénaturation dans l'étape 7 de cet hybride, le monobrin d'ADN souhaité, c'est-à-dire une sonde (S), est libéré. Le brin servant de moule, qui est couplé au papier, peut être réutilisé plusieurs fois successivement.
Etape 2 :
Synthèse du brin protecteur (BP) : On définit tout d'abord les conditions nécessaires pour obtenir une synthèse efficace du brin protecteur sur l'ADN recombinant monobrin. Dans le cas illustré il s'agit du recombinant M13mp8 contenant un fragment génomique Pst 1 d'une longueur de 1.400 b du gène de la thyroglobuline de boeuf. Un excès molaire modéré (2,5) d'amorce de séquence (A) est utilisé en vue de permettre l'efficacité optimale de l'appariement de l'amorce de séquence (A) à la région complémentaire (A') du recombinant. Des allongements sont effectués dans différentes conditions et en présence de dNTP's et d'ADN polymérase (EP). Les longueurs des brins synthétisés sont analysées par électrophorèse sur gel dans des conditons de dénaturation (non représentées).
Un mélange des réactifs à 0[deg.]C pendant 5 minutes et le passage du mélange résultant à 65[deg.]C directement permettent une synthèse efficace de brins d'une longueur de 1.400 à 2.100 b ( b = bases).
Ces conditions ne sont pas critiques, elles sont en fait appropriées pour la longueur de la séquence insérée choisie (1). Elles sont aussi utilisées pour des longueurs de séquence insérées plus petites (voir ci-dessous). Lorsqu'on traite des séquences insérées plus grandes, il est préférable d'effectuer une courte incubation à la température ambiante avant de chauffer le mélange réactionnel à 65[deg.]C (par exemple l'introduction d'une minute d'incubation à la température ambiante conduit à une synthèse de brins de 1.700 à
2.850 b ).
Etape 3 :
En vue d'obtenir la production de sondes monobrin de longueurs définies, le recombinant doit être coupé en aval de la séquence insérée. Une enzyme de restriction appropriée pour le site de restriction SRI est alors mise en présence du recombinant et elle agit à l'endroit marqué par la flèche F sur la figure. Cela est habituellement contrôlé par analyse d'un aliquote d'ADN restreint sur du gel d'agarose neutre.
Etapes 4 et 5 :
Il est connu de coupler de l'ADN dénaturé sur du papier diazoté, et cette opération est habituellement effectuée à un pH de 4 (v. M.L. GOLDBERG, R.P. LIFTON, G.R. STARK et J.G. WILLIAMS, Isolation of specific RNAs using DNA covalenthy linked to diazobenzyloxymethyl cellulose or paper, Methods in Enzymology,
68 (1979) 206-220; J.C. ALWINE, D.J. KEMP, B.A. PARKER, J. REISER, 3. RE NART, G.R. STARK et G.M. WAHL, Détection of specific RNA s or specific fragments of DNA by fractionation in gels and transfer to diazobenzyloxymethyl-paper, Methods in Enzymology, 68 (1979) 220-242; D. CHRISTOPHE, H. BROCAS et G. VASSART, Improved synthesis of DBM-paper, Anal. Biochem. 120 (1982) 259-261) ce qui représente un compromis tenant compte des stabilités à la fois de la fonction diazonium et de l'ADN.
Lorsque la fixation sur du papier diazoté de l'ADN partiellement double brin de l'étape 4 a été effectuée à ce pH, il n'a jamais été possible de copier efficacement ensuite la séquence insérée. L'augmentation du pH du milieu de couplage à 4,5 a pour effet la production d'un moule immobilisé, totalement fonctionnel. Des résultats plus médiocres sont obtenus lorsque la fixation est effectuée à un pH de 5 ce qui a probablement été dû au fait que l'efficacité du couplage diminue de manière prononcée à un tel pH. L'étape de couplage- élimination de la protection peut être contrôlée simplement par comptage lorsque le brin protecteur
(BP) est marqué de façon radioactive.
Dans les expériences préliminaires les échantillons ont aussi passé sur du gel d'agarose dénaturant et ont été autoradiographiés en vue de vérifier l'intégrité du brin de protection. Une immobilisation appropriée a pour résultat la libération d'une quantité importante de ce brin dans les solutions de lavage à base de NaOH 0,1 M.
Il faut noter que le papier diazonium est un exemple de réalisation de support approprié pour l'immobilisation du moule. Il doit évidemment être entendu que tous les supports appropriés dans ce but sont compris dans le cadre de l'invention. On peut entre autres citer, outre les papiers diazotés tels que les papiers DBM (diazobenzyloxyméthyle ou ABM aminobenzyloxyméthyle), DPT (diazophénylthioéther ou APT aminothiophénol), des papiers activés à l'halogénure de cyanogène, par exemple au chlorure ou au bromure de cyanogène.
Les conditions d'immobilisation seront évidemment différentes en fonction du support choisi.
Etape 6 :
Au moule immobilisé ainsi produit, on apparie une amorce de séquence de M13 (A) et l'allongement de celle-ci engendre la synthèse d'une copie fidèle de la sonde attendue (S). Comme dans l'étape 2, cette synthèse s'effectue en présence de dNTP's et d'ADN polymérase (EP).
Etape 7 :
Après séparation de la sonde (S) par dénaturation, on peut utiliser plusieurs fois, sans perte apparente de sécurité, le même moule immobilisé pour la fabrication de sondes successives. Une certaine diminution de la quantité d'ADN synthétisé peut être observée après des usages répétés. L'activité spécifique des brins synthétisés peut être ajustée par modification de l'activité spécifique des désoxynucléotides précurseurs. Dans le cas présent, l'activité spécifique attendue est d'environ 109 cpm/jjg d'ADN (en supposant une teneur de 25% de résidus de désoxyadénosine d'une activité spécifique de 800 Ci/mmole). A partir de cela on peut estimer la quantité d'ADN synthétisé qui varie de 10 à 100 ng par moule considéré.
Un exemple de procédé de préparation de moule et de procédé de préparation de sonde suivant l'invention va à présent être décrit de manière plus détaillée, à titre illustratif, et non limitatif.
Exemple 1
a) Préparation de manière connue d'ADN recombinant monobrin cyclique à partir d'un clone de bactériophage M 13 et d'un ADN génomique prédéterminé. b) Appariement d'une amorce de séquence, son allongement sur le recombinant et clivage ultérieur de ce dernier :
<EMI ID=3.1>
à 56[deg.]C pendant 30 minutes et refroidissement à la température ambiante (15 minutes). Le mélange est alors placé sur de la glace et
<EMI ID=4.1>
de dATP (désoxyadénosine triphosphate) + dCTP (désoxycytidine triphosphate) + dGTP (désoxyguanine triphosphate) + dTTP (désoxythymidine triphosphate) (0,5 mM chacun), éventuellement 1,5 )il de
<EMI ID=5.1>
et 2,5 )il (12,5 U) du grand fragment (de Klenow) d'ADN-polymérase I (Boehringer). Après abandon à 0[deg.]C pendant 5 minutes, on transfère le mélange dans un bain-marie, préchauffé à 65[deg.]C, et on l'abandonne là pendant 10 minutes. L'allongement de l'amorce de séquence a pour effet la formation d'un brin protecteur complémentaire de la séquence insérée au moins jusqu'au site de restriction prévu. On effectue alors une digestion ultérieure de l'ADN partiellement double brin résultant avec une enzyme de restriction appropriée pour ce site de restriction, ce qui donne un ADN linéarisé, partiellement double brin. On ne procède pas à une purification ultérieure.
c) Immobilisation de l'ADN linéarisé obtenu sur un support. Comme support, du papier diazoté du type DBM (diazobenzyloxyméthyle) est préparé d'une manière connue à l'exception du fait que seuls
56 mg de NBPC (chlorure de N-(3-nitrobenzyloxyméthyl)-pyridinium) <EMI ID=6.1> (9cm de diamètre). Par conséquent une diazotation de cercles de
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
d'eau; on ajoute alors 4 )il d'acétate de sodium 2,5 M (pH de 4,5) et on imprègne de cette solution le confetti de papier DBM, préalablement essoré au buvard.
d) Application de conditions dénaturantes et formation du moule.
<EMI ID=9.1>
Tris HCI [pH de 8], ImM de EDTA (éthylènediaminetétracétate))
<EMI ID=10.1>
(longueur de fragment moyenne de 0,5 à lkb) à 37[deg.]C pendant 15 minutes. On poursuit le lavage à la température ambiante, à trois
<EMI ID=11.1>
est ensuite entreposé à 4[deg.]C dans du TE.
e) Synthèse de sonde à partir du moule immobilisé.
<EMI ID=12.1>
tampon H et de 10 )il de solution d'amorce de séquence (PL Biochemicals n[deg.] 1534). Après chauffage à 37[deg.]C pendant 20 minutes et refroidissement à la température ambiante (15 minutes), on ajoute un mélange
<EMI ID=13.1>
Klenow) d'ADN-polymérase I (Boehringer). Après abandon pendant 1 heure à la température ambiante, le confetti est lavé à 5 reprises avec du TE (5 ml par lavage). La sonde formée est libérée pendant deux incubations successives dans 0,5 ml de NaOH 0,1 M à la température ambiante. Le confetti est ensuite lavé à deux reprises avec du NaOH 0,1 M, puis à deux reprises avec du TE, avant d'être à nouveau entreposé en vue de sa réutilisation pour la préparation d'une nouvelle sonde.
f) Hybridations de la sonde de détection.
Des buvardages selon Southern d'ADN génomique restreint sont réalisés en utilisant des membranes Hybond-N (Amersham). Les buvardages sont effectués, comme recommandé par le fabricant des membranes. La sonde (libérée du confetti dans lml de NaOH
<EMI ID=14.1>
de sperme de saumon cisaillé, dénaturé). On effectue l'hybridation et les lavages à 65[deg.]C. Les membranes sont autoradiographiées (films Kodak XAR-5) après un lavage final dans 0,1 x SSC.
Pour l'hybridation en solution, la sonde est neutralisée par addition de 0,25 ml d'acétate de sodium 2,5M (pH de 4,5) et
<EMI ID=15.1>
génomique restreint. L'ADN est précipité dans de l'éthanol et redissous
<EMI ID=16.1>
de t-ARN) sont ensuite ajoutées et on laisse le mélange incuber pendant 1 heure à 50[deg.]C. On interrompt la digestion par addition d'un volume égal d'une solution de Tris HC1 0,3M (pH de 8), EDTA
<EMI ID=17.1>
l'ADN dans de l'éthanol. On analyse les hybrides ultérieurement restreints sur des gels d'urée 8M - 8% d'acrylamide. Les gels sont séchés avant d'être autoradiographiés.
Ainsi qu'il vient d'être décrit ci-dessus dans l'exemple de réalisation donné, les sondes produites peuvent être appliquées pour détecter des fragments spécifiques de gènes, par hybridation. D'autres exemples d'application vont être donnés ci-dessous, à titre non limitatif.
Exemple 2
Une sonde de 1400 bases produite suivant l'invention peut être utilisée dans des expériences de buvardage selon Southern pour détecter des fragments spécifiques de gène de thyroglobuline.
Cette sonde permet notamment une visualisation distincte d'un fragment génomique EcoRI de 8,8 kb qui contient la séquence de 1400 bp.
Exemple 3
L'état monobrin et la haute activité spécifique des sondes suivant l'invention peuvent être exploités pour révéler de très petites séquences uniques dans l'ADN génomique total en utilisant une hybridation en solution et une électrophorèse sur gel d'acrylamide d'hybrides restreints. Le procédé est dérivé de celui décrit par Williamson et par Myers et coll. En abrégé, on utilise une sonde monobrin marquée, par exemple par un isotope radioactif de phosphore. Comme on a pu le voir ce marquage peut être effectué dans l'étape 6 du procédé illustré sur la figure annexée, par mise en oeuvre, par exemple parmi les dNTP's de la réaction, de désoxyadénosine
<EMI ID=18.1>
d'autres types de marquage sont concevables.
La sonde monobrin marquée et isolée est hybridée avec l'ADN génomique restreint, dénaturé. Une digestion par de la nucléase S est alors effectuée en vue d'éliminer l'excès de sonde et pour rogner toute matière monobrin des hybrides. Les hybrides sont ensuite digérés par une endonucléose de restriction. Les fragments résultants sont séparés sur un gel d'acrylamide dénaturant et visualisés par autoradiographie du gel. On a appliqué cette technique à la détection de petits fragments MboII de la région amont du gène humain de thyroglobuline dans l'ADN génomique humain total. La région promotrice du gène humain de thyroglobuline contient une très longue séquence
(209 bp) de poly(purine)-poly(pyrimidine) qui révèle cinq sites de restriction Mboll. Des fragments internes de 12, 32, 40 et 44 bp sont attendus de la séquence disponible.
Un moule immobilisé sur confetti est réalisé par utilisation du clone M13 4S-4 qui contient la séquence insérée "SstI", d'une longueur de 400b, qui comprend le segment de poly(purine). La sonde monobrin corrspondante est préparée et hybridée à l'ADN restreint SstI provenant du foie ou
<EMI ID=19.1>
les hybrides sont coupés par Mboll et les fragments résultants sont analysés par électrophorèse sur urée-gel d'acrylamide et autoradiographie.
Les fragments internes attendus sont aisément détectés.
On a donc développé un nouveau procédé qui permet
la préparation aisée de fragments d'ADN monobrin spécifiques. De plus, étant donné l'immobilisation covalente du brin servant de moule, plusieurs opérations successives de synthèse d'ADN monobrin peuvent être obtenues sur le même ADN servant de moule. Si des précurseurs radioactifs sont utilisés dans l'étape de synthèse, des sondes d'ADN monobrin d'activité spécifique choisie sont obtenues.
Ces sondes remplacent avantageusement l'ADN marqué double brin, utilisé couramment dans des expériences d'hybridation d'ADN. Elles peuvent aussi être utilisées pour détecter de très petites séquences uniques dans le génome total. Sous ce rapport, elles représentent un outil de base pour l'étude du polymorphisme de longueur de fragment de restriction mettant en oeuvre des endonucléases de restriction qui coupent l'ADN fréquemment.
Les moules suivant l'invention, immobilisés sur confetti sous forme linéaire, peuvent être entreposés sous une forme prête
à l'usage et sont aisés à manipuler. Conjointement à la simplicité de la synthèse de sonde et des étapes de libération de celle-ci, cela rend plus attirant le procédé pour l'utilisation future dans des systèmes d'analyse de gène courants.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux modes de réalisation décrits ci-dessus
et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir
du cadre du présent brevet.
On peut par exemple concevoir d'autres conditions
de dénaturation ou de marquage que celles appliquées dans les exemples. Le marquage peut par exemple ne pas être un marquage radioactif. Des supports autres que ceux à base de papier entrent également dans le cadre de la présente invention, par exemple des membranes ou tout autre support poreux, tel que des microbilles entre autres.
REVENDICATIONS
1. Moule de sonde de détection d'une séquence prédéterminée d'acide désoxyribonucléique (ADN) monobrin, comprenant une partie d'ADN vecteur monobrin et une séquence d'ADN monobrin insérée sur le vecteur et complémentaire de la sonde recherchée, une région complémentaire d'une amorce de séquence étant située juste en amont de la séquence insérée, caractérisé en ce que le moule est, sous une forme linéarisée, en position immobilisée sur un support approprié par une région située en dehors de la séquence insérée et en ce que la séquence insérée est disposée à l'extrémité du côté aval du moule immobilisé.
"DNA sequence detection probe mold and preparation of such a mold and such a probe" DNA sequence detection probe mold and preparation of such a mold and such a probe.
The present invention relates to a probe mold for detecting a predetermined sequence of deoxyribonucleic acid.
Single-stranded (DNA), comprising a portion of single-stranded vector DNA and a single-stranded DNA sequence inserted into the vector and complementary to the desired probe, a region complementary to a primer sequence being located just upstream of the inserted sequence.
It also relates to a method for preparing a probe mold for detecting a predetermined sequence of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA), comprising the production of a cyclic recombinant DNA containing a part of single-strand vector DNA and a DNA sequence single strand inserted on the vector and complementary to the desired probe, a region complementary to a primer sequence being located just upstream of the inserted sequence and at least one restriction site being located just downstream of the inserted DNA sequence, as well as the molds obtained.
It also relates to a method for preparing a probe for detecting a predetermined sequence of deoxyribonucleic acid.
Single-stranded (DNA), comprising pairing a sequence primer to a region complementary to a single-stranded mold of the probe, lengthening the paired sequence primer at least until the formation of the probe along of the mold and the isolation of the probe formed, as well as the probes obtained and their application, in particular to methods of diagnosis and analysis of genes.
Gene analysis techniques take advantage of the double stranded state of DNA. The ability of the DNA strands to form double structures allows the detection of specific sequences by hybridization with a labeled complementary probe strand. Also, depending on the methodology used, subtle differences between these hybridized strands can be detected. The need for methods for easy preparation of specific strands of DNA is evident. The overall efficiency of DNA hybridizations can be increased by the use of single-stranded probes, and some new techniques rely on the use of single-stranded DNA fragments. Short sequences can be easily produced by chemical synthesis of DNA. However, this technique is not suitable, when treating fragments long from several hundred bases.
Currently, processes are known for preparing large single-stranded DNA probes from double-stranded precursors, by sedimentation (vGA RICHA, JM TAYLOR and JE KALINYAK, Simple r.apid method for the synthesis of radioactively labeledcDNA hybridization probes utilizing bacteriophage M13mp7 , Proc. Natl. Acad. Sci.USA, Vol. 79, p. 724-728, February 1982).
Also known are methods for preparing a probe mold for detecting a predetermined sequence of deoxyribonucleic acid, such as that described at the beginning. The molds obtained by these methods are used for the preparation of probes, this preparation comprising the pairing of the sequence primer with the mold, the extension of the paired sequence primer at least to the aforementioned restriction site, so as to form a complementary strand at least of the entire inserted sequence, the cleavage of the mold then partially double stranded at the aforementioned restriction site so as to ensure its linearization,
and the application of denaturing conditions which separate from one end of the mold a fragment of the complementary strand which corresponds to the desired single-strand probe and from the other end of the mold the rest of the complementary strand, the probe then being isolated from the linear mold and the rest of the complementary strand by known processes, such as electrophoresis
(v. RM MYERS, N. LUMELSKY, LS LERMAN and T. MANIATIS, Detection of single base substitutions in total genomic DNA, Nature, vol. 313, February 1985, p. 495 to 498; M. ANTONIOU, K. GUZMAN, S. CHAKRABORTY and MR BANERJEE, A generally applicable improved method for preparation of single stranded cDNA probes from clones constructed in M 13 vectors, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 203-212).
All these mold preparation methods are limited to the preparation of a cyclic mold, intended to be lost after its use for the preparation of a single probe. Isolation of the probe in a medium containing not only the latter but also the then linear mold and possible fragments of the cleaved complementary strand, not corresponding to the desired probe, is a long, complicated and expensive operation.
An in vitro synthesis of ribonucleic acid probes
(RNA) also constitutes an attractive route for the preparation of specific single-strand probes, but as DNA-RNA hybrids are then formed, this can hinder further analysis based on the properties of double-stranded DNA (e.g. behavior with fusion, enzymatic digestions). The manipulation of RNA molecules is also quite painful given the extreme care which is necessary to avoid degradation by ribonuclease. In fact, the DNA mold must be removed by subsequent digestion with "ribonuclease free" deoxyribonuclease.
The object of the present invention is to develop a probe mold for detecting a predetermined sequence of single-stranded DNA which can withstand several successive operations of primed probe synthesis and which allows rapid and easy isolation of the copies obtained by release under simple denaturing conditions. Another object of the invention is the preparation of such a mold and the repetitive preparation of probes from such a mold, as well as the application of these probes to methods of diagnosis or analysis of genes, and this without the disadvantages of the methods according to the prior art.
These problems have been resolved, according to the invention, by providing a mold as described at the start, this mold being, in a linearized form, in position immobilized on a suitable support by a region of the strand located outside the inserted sequence, the latter being arranged at the end of the downstream side of the immobilized mold.
<EMI ID = 1.1> to form the molecular chain of DNA takes place in a determined direction, and, by the terms upstream and downstream, it is necessary to hear a relative position on the DNA strand according to this sense of synthesis.
According to an advantageous embodiment of the invention, the support used is a diazotized paper.
There is also provided, according to the invention, a mold preparation method, as described at the beginning, this method comprising the pairing of the sequence primer with the recombinant DNA, the elongation of the sequence primer paired at least to the above restriction site, so as to form a protective strand complementary at least to the entire inserted sequence, the cleavage of the recombinant then partially double stranded to the above restriction site so as to ensure its linearization, immobilization of the linearized recombinant on an appropriate support by its region not protected by the protective strand or a fragment thereof, and the subsequent removal of the protective strand or fragments thereof under denaturing conditions, with the formation of a mold which, in linearized form,
is in position immobilized on the support by a region located outside the complementary inserted sequence
of the probe, the inserted sequence being placed at the end of the downstream side of the immobilized mold with the region complementary to the sequence primer located just upstream.
There is also provided, according to the invention, a method for preparing a probe for detecting a predetermined sequence of single-stranded DNA, as described at the start, this method comprising the above-mentioned pairing to an immobilized mold as described above. above and / or as obtained according to an immobilized mold preparation process as described above, the elongation of the primer of paired sequence up to the end of the downstream side of the immobilized mold, which forms a probe complementary to the inserted sequence of the mold, and the release and isolation of the probe obtained under simple denaturation conditions, the mold remaining immobilized on its support.
According to an advantageous embodiment of this process, it includes its repetition several times on the same immobilized mold, allowing the formation of a corresponding number of perfectly identical probes.
According to an improved embodiment of this method, it comprises the labeling in any suitable manner of the probe, so as to allow its detection during a subsequent implementation.
Other details and particularities of the invention will emerge from the description given below without implied limitation and with reference to the single appended figure which schematically represents a method for preparing a probe according to the invention.
Step 1 of the method consists in the preparation of a cyclic single-stranded recombinant DNA. This preparation takes place according to standard methods and is therefore not described in more detail. It consists in the cloning of a DNA sequence sought
(I) in a vector DNA (V), for example a bacteriophage M 13.
It should be understood that the vector part (V) of the recombinant is in no way critical to the invention. The only necessary conditions for the prepared recombinant are the arrangement just upstream of the inserted sequence of a complementary region.
(A ') of a primer sequence and the presence of a restriction site
(SR.) Just downstream of the inserted sequence (I). The recombinant illustrated in step 1 of the figure also has a second restriction site (SR2) between the complementary region (A ') and the inserted sequence
(I).
In step 2, the single-stranded recombinant DNA partially passes into the double-stranded state by pairing a primer with sequence (A) to the complementary region (A ') and by lengthening this primer with conventional sequence (A) in such a way that a strand, called protective strand (BP), covers the entire inserted sequence (I), while leaving most of the vector part M 13 (V) in the single strand state. The DNA is then spread online by digestion in step 3 with a restriction enzyme (ER) which, as illustrated by the arrow F, cuts the double-stranded region downstream of the inserted sequence (I ) (relative to the boot site),
<EMI ID = 2.1> 4, coupled with diazotized paper (PD). As the coupling requires single-strand DNA, the presence of the second strand or protective strand
(BP) prevents any coupling at the site of the inserted sequence
(I) and the priming site (A). This protective strand (BP) is then removed by denaturation in step 5, which leaves a linear mold immobilized, ready for the preparation of a probe. After pairing and elongation of a primer of sequence (A) of M 13, a second strand is formed in step 6 and it covers the inserted sequence
(I) ending at the cleavage point corresponding to the SRI restriction site. By denaturation in step 7 of this hybrid, the desired DNA strand, that is to say a probe (S), is released. The strand serving as a mold, which is coupled to the paper, can be reused several times successively.
2nd step :
Synthesis of the protective strand (BP): First, the conditions necessary for obtaining an efficient synthesis of the protective strand on the recombinant single-strand DNA are defined. In the illustrated case it is the recombinant M13mp8 containing a Pst 1 genomic fragment with a length of 1,400 b of the beef thyroglobulin gene. A moderate molar excess (2.5) of primer of sequence (A) is used in order to allow optimal efficiency of the pairing of the primer of sequence (A) to the complementary region (A ') of the recombinant. . Extensions are carried out under different conditions and in the presence of dNTP's and DNA polymerase (EP). The lengths of the strands synthesized are analyzed by gel electrophoresis under denaturation conditions (not shown).
A mixture of the reagents at 0 [deg.] C for 5 minutes and the passage of the resulting mixture at 65 [deg.] C directly allow efficient synthesis of strands with a length of 1,400 to 2,100 b (b = bases).
These conditions are not critical, they are in fact appropriate for the length of the selected inserted sequence (1). They are also used for shorter inserted sequence lengths (see below). When processing larger inserted sequences, it is preferable to perform a short incubation at room temperature before heating the reaction mixture to 65 [deg.] C (for example the introduction of one minute incubation at ambient temperature leads to a synthesis of strands from 1,700 to
2,850 b).
Step 3:
In order to obtain the production of single-strand probes of defined lengths, the recombinant must be cut downstream of the inserted sequence. A restriction enzyme suitable for the SRI restriction site is then brought into contact with the recombinant and it acts at the location marked by the arrow F in the figure. This is usually checked by analysis of an aliquot of restricted DNA on neutral agarose gel.
Steps 4 and 5:
It is known to couple denatured DNA on diazotized paper, and this operation is usually carried out at a pH of 4 (see ML GOLDBERG, RP LIFTON, GR STARK and JG WILLIAMS, Isolation of specific RNAs using DNA covalenthy linked to diazobenzyloxymethyl cellulose or paper, Methods in Enzymology,
68 (1979) 206-220; JC ALWINE, DJ KEMP, BA PARKER, J. REISER, 3. RE NART, GR STARK and GM WAHL, Detection of specific RNA s or specific fragments of DNA by fractionation in gels and transfer to diazobenzyloxymethyl-paper, Methods in Enzymology, 68 (1979) 220-242; D. CHRISTOPHE, H. BROCAS and G. VASSART, Improved synthesis of DBM-paper, Anal. Biochem. 120 (1982) 259-261) which represents a compromise taking into account the stabilities of both the diazonium function and the DNA.
When the partially double-stranded DNA from step 4 was fixed on diazotized paper at this pH, it was never possible to effectively copy the inserted sequence afterwards. Increasing the pH of the coupling medium to 4.5 has the effect of producing an immobilized, fully functional mold. Poorer results are obtained when the fixation is carried out at a pH of 5, which was probably due to the fact that the efficiency of the coupling decreases markedly at such a pH. The coupling-removal stage of the protection can be checked simply by counting when the protective strand
(BP) is radioactively labeled.
In the preliminary experiments, the samples were also passed over denaturing agarose gel and were autoradiographed in order to verify the integrity of the protective strand. Appropriate immobilization results in the release of a large amount of this strand in 0.1 M NaOH wash solutions.
It should be noted that diazonium paper is an exemplary embodiment of a support suitable for immobilizing the mold. It should obviously be understood that all the supports suitable for this purpose are included within the scope of the invention. Among other things, apart from diazotized papers such as DBM (diazobenzyloxymethyl or ABM aminobenzyloxymethyl), DPT (diazophenylthioether or APT aminothiophenol) papers, mention may also be made of papers activated with cyanogen halide, for example with cyanogen chloride or bromide.
The immobilization conditions will obviously be different depending on the support chosen.
Step 6:
To the immobilized mold thus produced, a primer of sequence of M13 (A) is matched and the lengthening of the latter generates the synthesis of a faithful copy of the expected probe (S). As in step 2, this synthesis is carried out in the presence of dNTP's and DNA polymerase (EP).
Step 7:
After separation of the probe (S) by denaturation, the same immobilized mold can be used several times, without apparent loss of security, for the manufacture of successive probes. A certain decrease in the amount of DNA synthesized can be observed after repeated use. The specific activity of the synthesized strands can be adjusted by modifying the specific activity of the precursor deoxynucleotides. In the present case, the specific activity expected is approximately 109 cpm / jg of DNA (assuming a content of 25% of deoxyadenosine residues with a specific activity of 800 Ci / mmol). From this we can estimate the amount of DNA synthesized which varies from 10 to 100 ng per mold considered.
An example of a mold preparation process and a probe preparation process according to the invention will now be described in more detail, by way of illustration, and not by way of limitation.
Example 1
a) Preparation in a known manner of cyclic single-stranded recombinant DNA from a bacteriophage M13 clone and from a predetermined genomic DNA. b) Pairing of a sequence primer, its lengthening on the recombinant and subsequent cleavage of the latter:
<EMI ID = 3.1>
at 56 [deg.] C for 30 minutes and cooling to room temperature (15 minutes). The mixture is then placed on ice and
<EMI ID = 4.1>
dATP (deoxyadenosine triphosphate) + dCTP (deoxycytidine triphosphate) + dGTP (deoxyguanine triphosphate) + dTTP (deoxythymidine triphosphate) (0.5 mM each), optionally 1.5)
<EMI ID = 5.1>
and 2.5) il (12.5 U) of the large fragment (from Klenow) of DNA polymerase I (Boehringer). After leaving at 0 [deg.] C for 5 minutes, the mixture is transferred to a water bath, preheated to 65 [deg.] C, and left there for 10 minutes. The extension of the sequence primer has the effect of forming a protective strand complementary to the inserted sequence at least up to the intended restriction site. The resulting partially double stranded DNA is then digested with a restriction enzyme suitable for this restriction site, resulting in linearized, partially double stranded DNA. No further purification is carried out.
c) Immobilization of the linearized DNA obtained on a support. As a support, diazotized paper of the DBM (diazobenzyloxymethyl) type is prepared in a known manner except that only
56 mg of NBPC (N- (3-nitrobenzyloxymethyl) -pyridinium chloride) <EMI ID = 6.1> (9cm in diameter). Therefore a diazotation of circles of
<EMI ID = 7.1>
<EMI ID = 8.1>
water; 4) of 2.5 M sodium acetate (pH 4.5) is then added and the DBM paper confetti, previously wrung in blotting paper, is impregnated with this solution.
d) Application of denaturing conditions and mold formation.
<EMI ID = 9.1>
Tris HCI [pH 8], ImM of EDTA (ethylenediaminetetracetate))
<EMI ID = 10.1>
(average fragment length from 0.5 to 1kb) at 37 [deg.] C for 15 minutes. Washing continues at room temperature at three
<EMI ID = 11.1>
is then stored at 4 [deg.] C in TE.
e) Synthesis of probe from the immobilized mold.
<EMI ID = 12.1>
buffer H and 10) il of sequence primer solution (PL Biochemicals n [deg.] 1534). After heating to 37 ° C. for 20 minutes and cooling to room temperature (15 minutes), a mixture is added.
<EMI ID = 13.1>
Klenow) of DNA polymerase I (Boehringer). After leaving for 1 hour at room temperature, the confetti is washed 5 times with TE (5 ml per wash). The probe formed is released during two successive incubations in 0.5 ml of 0.1 M NaOH at room temperature. The confetti is then washed twice with 0.1 M NaOH, then twice with TE, before being stored again for reuse for the preparation of a new probe.
f) Hybridizations of the detection probe.
Southern blots of restricted genomic DNA are made using Hybond-N membranes (Amersham). Blotches are performed as recommended by the membrane manufacturer. The probe (released from the confetti in lml of NaOH
<EMI ID = 14.1>
denatured sheared salmon semen). Hybridization and washing are carried out at 65 [deg.] C. The membranes are autoradiographed (Kodak XAR-5 films) after a final wash in 0.1 x SSC.
For hybridization in solution, the probe is neutralized by adding 0.25 ml of 2.5M sodium acetate (pH 4.5) and
<EMI ID = 15.1>
restricted genomics. DNA is precipitated in ethanol and redissolved
<EMI ID = 16.1>
of t-RNA) are then added and the mixture is left to incubate for 1 hour at 50 [deg.] C. Digestion is interrupted by adding an equal volume of a 0.3M Tris HC1 solution (pH 8), EDTA
<EMI ID = 17.1>
DNA in ethanol. The subsequently restricted hybrids are analyzed on 8M urea gels - 8% acrylamide. The gels are dried before being autoradiographed.
As has just been described above in the exemplary embodiment given, the probes produced can be applied to detect specific fragments of genes, by hybridization. Other examples of application will be given below, without implied limitation.
Example 2
A 1400 base probe produced according to the invention can be used in Southern blot experiments to detect specific fragments of thyroglobulin gene.
This probe notably allows a separate visualization of an 8.8 kb EcoRI genomic fragment which contains the 1400 bp sequence.
Example 3
The single-strand state and the high specific activity of the probes according to the invention can be exploited to reveal very small sequences unique in the total genomic DNA by using hybridization in solution and electrophoresis on acrylamide gel of restricted hybrids. The process is derived from that described by Williamson and by Myers et al. For short, a single-stranded probe is used, for example with a radioactive isotope of phosphorus. As we have seen, this labeling can be carried out in step 6 of the process illustrated in the appended figure, by using, for example among the dNTP's of the reaction, deoxyadenosine
<EMI ID = 18.1>
other types of marking are conceivable.
The isolated and labeled single-strand probe is hybridized with the denatured, restricted genomic DNA. A digestion with nuclease S is then carried out in order to eliminate the excess of probe and to cut off any single-stranded material of the hybrids. The hybrids are then digested with restriction endonucleosis. The resulting fragments are separated on a denaturing acrylamide gel and visualized by autoradiography of the gel. This technique was applied to the detection of small MboII fragments from the upstream region of the human thyroglobulin gene in total human genomic DNA. The promoter region of the human thyroglobulin gene contains a very long sequence
(209 bp) of poly (purine) -poly (pyrimidine) which reveals five Mboll restriction sites. Internal fragments of 12, 32, 40 and 44 bp are expected from the available sequence.
A mold immobilized on confetti is produced by using the clone M13 4S-4 which contains the inserted sequence "SstI", with a length of 400b, which includes the poly (purine) segment. The corresponding single-strand probe is prepared and hybridized to SstI restricted DNA from the liver or
<EMI ID = 19.1>
the hybrids are cut by Mboll and the resulting fragments are analyzed by electrophoresis on urea-acrylamide gel and autoradiography.
The expected internal fragments are easily detected.
So we developed a new process that allows
easy preparation of specific single strand DNA fragments. In addition, given the covalent immobilization of the strand serving as a mold, several successive operations for the synthesis of single strand DNA can be obtained on the same DNA serving as a mold. If radioactive precursors are used in the synthesis step, single-strand DNA probes of selected specific activity are obtained.
These probes advantageously replace double-stranded DNA, commonly used in DNA hybridization experiments. They can also be used to detect very small unique sequences in the whole genome. In this respect, they represent a basic tool for studying the restriction fragment length polymorphism using restriction endonucleases which cut DNA frequently.
The molds according to the invention, immobilized on confetti in linear form, can be stored in a ready form
to use and are easy to handle. Together with the simplicity of probe synthesis and the steps for releasing it, this makes the method more attractive for future use in common gene analysis systems.
It should be understood that the present invention is in no way limited to the embodiments described above
and that many modifications can be made without leaving
of the scope of this patent.
One can for example conceive other conditions
denaturing or marking than those applied in the examples. The labeling may for example not be a radioactive labeling. Supports other than those based on paper also fall within the scope of the present invention, for example membranes or any other porous support, such as microbeads among others.
CLAIMS
1. A probe mold for detecting a predetermined sequence of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA), comprising a part of single-stranded vector DNA and a sequence of single-stranded DNA inserted into the vector and complementary to the probe sought, a complementary region of a sequence primer being located just upstream of the inserted sequence, characterized in that the mold is, in a linearized form, in position immobilized on a suitable support by a region located outside the inserted sequence and in that the inserted sequence is placed at the end of the downstream side of the immobilized mold.