JPH07133296A - ＴＧＦ−β誘発された遺伝子及びタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規ＴＧＦ−β誘発性遺伝子及びタンパク質
に関する。 【構成】 長さ約６８３個のアミノ酸残基の配列を有
し、そして配列番号２に実質的に対応するタンパク質を
含んで成る実質的に純粋なタンパク質であって、前記タ
ンパク質が哺乳類細胞を増殖停止するために前記細胞と
トランスフォーミング増殖因子βとを接触することによ
って誘発されることを特徴とするタンパク質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の技術分野 本発明は、新規ＴＧＦ−β誘発性遺伝子、βｉｇ−ｈ
３、及び特定のヒト細胞系のＴＧＦ−β仲介増殖阻害に
応答して生成されるこの誘発された遺伝子、βＩＧ−Ｈ
３によりコードされるタンパク質に関する。

【０００２】発明の背景 トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）
は、細胞増殖及び分化の多官能レギュレーターである。
それは種々の効果、たとえばモンキー腎細胞の増殖の阻
害（Ｔｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆ．，Ｇ．Ｄ．Ｓｈｉｐｌｅ
ｙ，Ｈ．Ｌ．Ｍｏｓｅｓ ＆ Ｒ．Ｗ．Ｈｏｌｌｅｙ
（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：７０５−７０
７），いくつかのヒト癌細胞系の阻害（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ，Ａ．Ｂ．，Ｍ．Ａ．Ａｎｚａｎｏ，Ｌ．Ｍ．Ｗａｋ
ｅｆｉｌｅｄ，Ｎ．Ｓ．Ｒｏｃｈｅｓ，Ｄ．Ｆ．Ｓｔｅ
ｒｎ ＆ Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ（１９８５）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１１９−
１２３；Ｒａｎｃｈａｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｌ．Ｅ．Ｇｅ
ｎｔｒｙ，Ｙ．Ａｇａｗａ，Ｓ．Ｍ．Ｓｅｙｅｄｉｎ，
Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｐｕｒｃｈｉｏ ＆
Ｄ．Ｒ．Ｔｗａｒｄｚｉｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４８：
７８３−７８９），マウス角化細胞の阻害（Ｃｏｆｆｅ
ｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｎ．Ｊ．Ｓｉｐｅｓ，Ｃ．Ｃ．Ｂａｓｃ
ｕｍ，Ｒ．Ｇｒａｖｅｓｄｅａｌ，Ｃ．Ｐｅｎｎｉｎｇ
ｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＆ Ｈ．Ｌ．Ｍｏ
ｓｅｓ（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：１５
９６−１６０２；Ｒｅｉｓｓ，Ｍ．＆ Ｃ．Ｌ．Ｄｉｂ
ｂｌｅ（１９８８ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅ
ｖ．Ｂｉｏｌ．２４−５３７−５４４），ＡＫＲ−２Ｂ
繊維芽細胞（Ｔｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆ．，Ｍ．Ｅ．Ｏｌｋ
ｅｎａｎｔ，Ｅ．Ｌ．Ｂｒａｎｕｍ ＆ Ｈ．Ｌ．Ｍｏ
ｓｅｓ（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３：１５
８１−１５８６）及び正常なラット腎繊維芽細胞（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．，Ｍ．Ａ．Ａｎｚａｎｏ，Ｌ．
Ｃ．Ｌａｍｂ，Ｊ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｍ．Ｂ．Ｓｐ
ｏｒｎ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７８：５３３９−５３４３の刺激，フィ
ブロネクチン及びコラーゲンの合成及び分泌の刺激（Ｉ
ｇｎｏｔｚ，Ｒ．Ａ．＆ Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９
８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４３３７−４
３４５；Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ，Ｍ．，Ｔ．Ｌ．ＭｃＣａ
ｒｔｈｙ ＆Ｅ．Ｃａｎａｌｉｓ（１９８７）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：２８６９−２８７４）筋肉間
葉細胞における軟骨特異的高分子生成の誘発（Ｓｅｙｅ
ｄｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ａ．Ｙ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈ．Ｂ
ｅｎｔｚ，Ｄ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎ，Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏ
ｎ，Ａ．Ｃｏｎｔｉｎ，Ｎ．Ｒ．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｇ．
Ｒ．Ｇａｌｌｕｐｐｉ ＆ Ｋ．Ａ．Ｐｉｅｚ（１９８
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：５６９３−５６
９５）及びＴ及びＢリンパ球の増殖阻害，（Ｋｅｈｒ
ｌ，Ｊ．Ｈ．，Ｌ．Ｍ．Ｗａｋｅｆｉｌｅｄ，Ａ．Ｂ．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｊａｋｅｏｖｉｅｗ，Ｍ．Ａｌｖ
ａｒｅｚ−Ｍｏｎ，Ｒ．Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｍ．Ｂ．Ｓｐ
ｏｒｎ ＆ Ａ．Ｓ．Ｆａｕｃｉ（１９８６）Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０；Ｋｅｈｒ
ｌ，Ｊ．Ｈ．，Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．Ｗａ
ｋｅｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｊａｋｏｖｉｅｗ，Ｍ．Ｂ．Ｓｐ
ｏｒｎ＆ Ａ．Ｓ．Ｆａｕｃｉ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３７：３８５５−３８６０；Ｋａｓｉｄ，
Ａ．，Ｇ．Ｉ．Ｂｅｌｌ ＆ Ｅ．Ｐ．Ｄｉｒｅｃｔｏ
ｒ（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：６９０−
６９８；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｄ．Ａ．Ｈｕｎｔ，Ｈ．
Ｌ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｎ．ＭｃＣａ
ｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌ．Ｍ．Ｗａｈｌ．Ｌ．
Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，
Ｇ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ＆ Ｍ．Ｂ．Ｓ
ｐｏｒｎ（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３
０２６−３０３２）を引き起すことができる。

【０００３】最近の研究は、ＴＧＦ−β１が、密接に関
連する増殖調節タンパク質，たとえばＴＧＦ−β２，
（Ｓｅｙｅｄｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｐ．Ｒ．Ｓｅｇａｒｉｎ
ｉ，Ｄ．Ｍ．Ｒｏｓｅｎ，Ａ．Ｙ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，
Ｈ．Ｂｅｎｔｚ ＆ Ｊ．Ｇｒａｙｃａｒ（１９８７）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１９４６−１９４
９；Ｃｈｅｉｆｅｔｚ，Ｓ．，Ｊ．Ａ．Ｗｅａｔｈｅｒ
ｂｅｅ，Ｍ．Ｌ．−Ｓ．Ｔｓａｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｍｏｌｅ，Ｒ．Ｌｕｃａｓ ＆Ｊ．
Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：４０９
−４１５；Ｉｋｅｄａ，Ｔ．，Ｍ．Ｍ．Ｌｉｏｕｂｉｎ
＆ Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（１９８７）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ２６：２４０６−２４１０）ＴＧＦ−
β３，（ＴｅｎＤｉｊｋｅ，Ｐ．，Ｐ．Ｈａｎｓｅｎ，
Ｋ．Ｉｗａｔａ，Ｃ．Ｐｉｅｌｅｒ＆ Ｊ．Ｇ．Ｆｏｕ
ｌｋｅｓ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４７１５−４７１９；Ｄｅｒｙ
ｎｃｋ，Ｒ．，Ｐ．Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ａ．Ｌｅｅ，
Ｄ．Ｗｅｎ，Ｊ．Ｔａｍｍ，Ｊ．Ｌ．Ｇｒａｙｃａｒ，
Ｌ Ｒｈｅｅ，Ａ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｍｉｌｌ
ｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｆｆｅｙ，Ｈ．Ｌ．Ｍｏｓｅｓ ＆
Ｅ．Ｙ．Ｃｈｅｎ（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：３７
３７−３７４３；Ｊａｋｏｗｌｅｗ，Ｓ．Ｂ．，Ｐ．
Ｊ．Ｄｉｌｌａｒｄ，Ｐ．Ｋｏｎｄａｉａｈ，Ｍ．Ｂ．
Ｓｐｏｒｎ ＆ Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９８８）
Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２：７４７−７
５５）ＴＧＦ−β４，（Ｊａｋｏｗｌｅｗ，Ｓ．Ｂ．，
Ｐ．Ｊ．Ｄｉｌｌａｒｄ，Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ ＆
Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２：１１８６−１１９５）Ｍｕｌ
ｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｕｂｓｔａｎ
ｃｅ，（Ｃａｔｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｒ．Ｊ．Ｍａｔｔａｌｉ
ａｎｏ，Ｃ．Ｈｅｓｓｉｏｎ，Ｒ．Ｔｉｚａｒｄ，Ｎ．
Ｍ．Ｆａｂｅｒ，Ａ．Ｃｈｅｕｎｇ，Ｅ．Ｇ．Ｎｉｎｆ
ａ，Ａ．Ｚ．Ｆｒｅｙ，Ｄ．Ｊ．Ｄａｓｈ，Ｅ．Ｐ．Ｃ
ｈｏｗ，Ｒ．Ａ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｔｏｎ
ｉｓ，Ｇ．Ｔｏｒｒｅｓ，Ｂ．Ｐ．Ｗａｌｌｎｅｒ，
Ｋ．Ｌ．Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒａｇｉ
ｎ，Ｔ．Ｆ．Ｍａｎｇａｎａｒｏ，Ｄ．Ｔ．Ｍａｃｌａ
ｕｇｈｌｉｎ ＆ Ｐ．Ｋ，Ｄｏｎａｈｏｅ（１９８
６）Ｃｅｌｌ ４５：６８５−６９８）及びインヒビン
（Ｍａｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｓ．Ｈａｙｆｌｉｃｋ，
Ｎ．Ｌｉｎｇ，Ｆ．Ｅｓｃｈ，Ｎ．Ｕｅｎｏ，Ｓ．−
Ｙ．Ｙｉｎｇ，Ｒ．Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ，Ｈ．Ｎｉａｌ
ｌ ＆ Ｐ．Ｈ．Ｓｅｅｂｕｒｇ（１９８５）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１８：６５９−６６３）の種類のメンバーであ
ることを示した。

【０００４】ＴＧＦ−β１は、２つの同一のジスルフィ
ド結合された１２ＫＤのサブユニットから成る２４−Ｋ
Ｄａのタンパク質である（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．，
Ａ．Ｋｏｍｏｒｉｙａ，Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ，Ｄ．
Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ（１９８
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：７１５５−７１
６０；Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．，Ｌ．Ｌ．Ｄａｒｔ，
Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆
Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３６７６−３６８
０；Ｆｒｏｌｉｋ，Ｃ．Ａ．，Ｌ．Ｍ．Ｗａｋｅｆｉｌ
ｅｄ，Ｄ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ
（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０９
９５−１１０００）。ヒト，（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．，
Ｊ．Ａ．Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｅ．Ｙ．Ｃｈｅｍ，Ｄ．Ｈ．
Ｅａｔｏｎ，Ｊ．Ｒ．Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｋ．Ａｓｓｏｉａ
ｎ，Ａ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｂ．Ｓｐｏｒｎ ＆
Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１６：７０１−７０５）ネズミ，（Ｄｅｒｙｎｃｋ，
Ｒ．，Ｊ．Ａ．Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｅ．Ｙ．Ｃｈｅｍ，＆
Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６１：４３７７−４３７９）及びサル（Ｓ
ｈａｒｐｌｅｓ，Ｋ．，Ｇ．Ｄ．Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｔ．
Ｍ．Ｒｏｓｅ，Ｄ．Ｒ．Ｔｗａｒｄｚｉｋ ＆ Ａ．
Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ（１９８７）ＤＮＡ ６：２３９−
２４４）ＴＧＦ−β１をコードするｃＤＮＡクローンの
分析は、このタンパク質が大きな３９０個のアミノ酸プ
レープローＴＧＦ−β１前駆体として合成されることを
示し；カルボキシル末端の１１２個のアミノ酸タンパク
質が、ＴＧＦ−β１モノマーを生成するためにタンパク
質分解的に切断される。

【０００５】サルＴＧＦ−β１ ｃＤＮＡクローンは、
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に高レベル
で発現された。部位特異的抗ペプチド抗体、ペプチド地
図及びタンパク質配列を用いての、これらの細胞により
分泌されるタンパク質の分析は、ＴＧＦ−βの成熟及び
前駆体形の両者が生成され、そして複雑に並んだジスル
フィト結合により一部、一緒に保持されることを示した
（Ｇｅｎｔｒｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｎ．Ｒ．Ｗｅｂｂ，Ｊ．Ｌ
ｉｍ，Ａ．Ｍ．Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｒａｎｃｈａ
ｌｉｓ，Ｄ．Ｒ．Ｔｗａｒｄｚｉｋ，Ｍ．Ｎ．Ｌｉｏｕ
ｂｉｎ，Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ＆ Ａ．Ｆ．Ｐｕｒ
ｃｈｉｏ（１９８７）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７：
３４１８−３４２７；Ｇｅｎｔｒｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｍ．
Ｎ．Ｌｉｏｕｂｉｎ，Ａ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ ＆
Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．８：４１６２−４１６８）。２４ＫＤの
成熟ｒＴＧＦ−β１からの精製に基づけば、９０〜１１
０ＫＤの前駆体複合体が、次の３種類の種から成ること
が見出された：ｐｒｏ−ＴＧＦβ１，ＴＧＦ−β１前駆
体のプロ領域及び成熟ＴＧＦ−β１（Ｇｅｎｔｒｙ，
Ｌ．Ｅ．，Ｎ．Ｒ．Ｗｅｂｂ，Ｊ．Ｌｉｍ，Ａ．Ｍ．Ｂ
ｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｒａｎｃｈａｌｉｓ，Ｄ．Ｒ．
Ｔｗａｒｄｚｉｋ，Ｍ．Ｎ．Ｌｉｏｕｂｉｎ，Ｈ．Ｍａ
ｒｑｕａｒｄｔ ＆Ａ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ（１９８
７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：３４１８−３４
２７；Ｇｅｎｔｒｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｍ．Ｎ．Ｌｉｏｕｂｉ
ｎ，Ａ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ ＆ Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒ
ｄｔ（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４
１６２−４１６８）。最適な生物学的活性の検出は、分
析の前、酸性化を必要とし、これはｒＴＧＦ−β１が潜
在形で分泌されたことを示す。

【０００６】ＴＧＦ−β１前駆体のプロー領域は、３つ
の部位（Ａｓｎ８２，Ａｓｎ１３６及びＡｓｎ１７６）
でグリコシル化されることが見出され、そしてこれらの
うち最初の２つ（Ａｓｎ８２及びＡｓｎ１３６）はマン
ノース−６−ホスフェート残基を含む（Ｂｒｕｎｎｅ
ｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌ．Ｅ．Ｇｅｎｔｒｙ，Ｊ．Ａ．Ｃｏｏ
ｐｅｒ ＆ Ａ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ（１９８８）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：２２２９−２２３２；Ｐ
ｕｒｃｈｉｏ，Ａ．Ｆ．，Ｊ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ａ．
Ｍ．Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｍ．Ｎ．Ｌｉｏｕｂｉｎ，Ｌ．
Ｅ．Ｇｅｎｔｒｙ，Ｋ．Ｓ．Ｋｏｖａｃｉｎａ，Ｒ．
Ａ．Ｒｏｔｈ ＆ Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（１９８
８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４２１１−１
４２１５）。さらに、ｒＴＧＦ−β１前駆体は、マンノ
ース−６−ホスフェートレセプターに結合することがで
き、そしてタンパク質分解工程が生じることができるリ
ソソームに運ぶための機構を包含することができる（Ｋ
ｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．（１９８６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．７７：１〜６）。

【０００７】ＴＧＦ−β２はまた、同一のジスルフィド
結合された１１２個のアミノ酸サブユニットの２４−Ｋ
Ｄのホモダイマーである（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｈ．，
Ｍ．Ｎ．Ｌｉｏｕｂｉｎ ＆ Ｔ．Ｉｋｅｄａ（１９８
７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２１２７−１
２１３１）。ヒト（Ｍａｄｉｓｅｎ，Ｌ．，Ｎ．Ｒ．Ｗ
ｅｂｂ，Ｔ．Ｍ．Ｒｏｓｅ，Ｈ．Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，
Ｔ．Ｉｋｅｄａ，Ｄ．Ｔｗａｒｄｚｉｋ，Ｓ．Ｓｅｙｅ
ｄｉｎ ＆ Ａ．Ｆ．Ｐｕｒｃｈｉｏ（１９８８）ＤＮ
Ａ ７：１−８；ＤｅＭａｒｔｉｎ，Ｒ．，Ｂ．Ｐｌａ
ｅｎｄｌｅｒ，Ｒ．Ｈｏｅｆｅｒ−Ｗａｒｂｉｎｅｋ，
Ｈ．Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｗｒａｎｎ，Ｈ．Ｓｃｈ
ｌｕｓｅｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｓ．Ｂｏｄ
ｍｅｒ，Ａ．Ｆｏｎｔａｎａ ＆ Ｅ．Ｈｏｅｆｅｒ．
ＥＭＢＯ Ｊ．６：３６７３−３６７７）及びサル（Ｈ
ａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｒ．Ａｒｍｏｕｒ，Ｊ．Ｈ．Ｂａ
ｌｄｗｉｎ，Ｆ．Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ｊ．Ｓｐｉｅｓ
ｓ ＆ Ｒ．Ｗ．Ｈｏｌｌｅｙ（１９８８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７９−８
２）ＴＧＦ−β２をコードするｃＤＮＡクローンの分析
は、それがまた、大きな前駆体タンパク質として合成さ
れることを示した。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の成
熟領域は７０％の相同性を示し、ところが３０％の相同
性は前駆体のプロー領域に存在する。プロー領域におい
て２８個のアミノ酸挿入により異なるサル及びヒトＴＧ
Ｆ−β２前駆体タンパク質の場合、それらの２種のタン
パク質をコードするｍＲＮＡが差異スプライシングを通
して生じると思われる（Ｗｅｂｂ，Ｎ．Ｒ．，Ｌ．Ｍａ
ｄｉｓｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｒｏｓｅ ＆ Ａ．Ｆ．Ｐｕｒｃ
ｈｉｏ（１９８８）ＤＮＡ ７：４９３−４９７）。

【０００８】ＴＧＦ−βの効果は、ほとんどの細胞の表
面上に存在する特異的レセプターへの結合により介在さ
れると思われる（Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．など（１９８
５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６３６−２６
４５；Ｓｅｇａｒｉｎｉ，Ｐ．Ｒ．など（１９８９）Ｍ
ｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ．３：２６１−２７２；Ｔｕ
ｃｋｅｒ，Ｒ．Ｆ．，など（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６７５７−６
７６１；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．，など（１９８
７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：９６５−９７
５）．細胞表面成分への〔 ¹²⁵Ｉ〕−ラベルされたＴＧ
Ｆ−βの化学的架橋は、５３〜７０ＫＤＡ（タイプＩレ
セプター），８０〜１２０ＫＤａ（タイプIIレセプタ
ー）及び２５０〜３５０ＫＤａ（タイプIII レセプタ
ー）の分子量を有する固定された３種のレセプターサイ
ズのクラスを有する。タイプＩ及びIIレセプターは、シ
グナルトランスダクションに包含され（Ｂｕｙｄ，Ｆ．
Ｔ．など．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
４：２２７２〜２２７８；Ｌａｉｈｏ，Ｍ．，など．
（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１８５
１８〜１８５２４），そしてタイプIII レセプターは、
貯蔵タンパク質として作用することが示された（Ｓｅｇ
ａｒｉｎｉ，Ｐ．Ｒ．など（１９８９）Ｍｏｌ．Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏ．３：２６１〜２７２）。レセプター・リ
ガンド相互作用の後に生じる関連するシグナルトランス
ダクション機構はほとんど知られていない。

【０００９】ＴＧＦ−βの多面的効果は、他の遺伝子の
転写に影響を及ぼすその能力による。ＴＧＦ−βは、Ａ
ＫＲ−２Ｂ細胞においてｆｏｓ，ｍｙｃ及びｓｉｓを誘
発し（Ｌｅｏｆ，Ｅ．Ｂ．，など．（１９８６）Ｐｒｕ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１４
５３〜１４５８），Ａ５４９細胞においてｃ−ｊｕｎＢ
の発現を増強し（Ｐｅｒｔｏｖａａｒａ，Ｌ．，など．
（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：１２５５〜１２６４），
マトリックス タンパク質のためのｍＲＮＡ（Ｒｅｎｔ
ｔｉｎｅｎ，Ｒ．Ｐ．，など（１９８８）Ｐｒｕｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１１０５〜１
１１０），ＩＬ−６（Ｅｌｉａｓ，Ｊ．Ａ．など（１９
９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３４３７〜３４４
６）及びＥＧＦ−レセプター（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｋ．
Ｌ．など（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
３：１９５１９〜１９５２８）を高め、そしてＰＤＧＦ
レセプターαサブユニットの発現を低める（Ｂａｔｌｅ
ｇａｙ，Ｅ．Ｊ．，など（１９９０）Ｃｅｌｌ．６３：
５１５〜５２４）。それは、骨悪性腫細胞におけるイン
テグリン発現のパターンを変え（Ｈｅｉｎｏ，Ｊ．，な
ど（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１
８０６〜２１８１３），そして表皮ケラチン細胞におけ
るｃ−ｍｙｃの発現を低める（Ｃｏｆｆｅｙ，Ｒ．Ｊ．
など（１９８８ｂ）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：１５９
６〜１６０２）。ＴＧＦ−βは、ヒト末梢血液単球にお
けるＩ１−１β，ＴＮＦ−α，ＰＤＧＦ及びｂＦＧＦの
発現を誘発する（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉ
ｓ，Ｎ．，など（１９９１）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：２９３〜３００）。

【００１０】発明の要約 本発明は、哺乳類細胞におけるトランスフォーミング増
殖因子β（ＴＧＦ−β）により誘発される新規タンパク
質及び遺伝子に向けられる。ＴＧＦ−βの効果のいくつ
かを仲介することに包含され得るタンパク質生成物をコ
ードする新規遺伝子を同定するためには、ｃＤＮＡライ
ブラリィーが、ＴＧＦ−βへの暴露により増殖停止され
た哺乳類細胞、たとえばヒト肺腺癌細胞から単離される
ｍＲＮＡから構成された。いくつかのクローンが単離さ
れた。ＴＧＦ−β誘発性遺伝子−ｈ３（βｉｇ−ｈ３）
と称する１つのクローンは、６８３個のアミノ酸残基を
含む新規タンパク質、βＩＧ−Ｈ３をコードした。

【００１１】本発明において、ＴＧＦ−β誘発性タンパ
ク質は、増殖停止された哺乳類細胞に生成され、そして
好ましくは約６８３個のアミノ酸残基を含む。ＴＧＦ−
β誘発性タンパク質は好ましくは、それぞれ約１４０個
のアミノ酸の４個の相同反復領域を含み、そしてそのカ
ルボキシ末端近くにＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有す
る。哺乳類細胞、たとえばヒト腺癌細胞及び胚間葉細胞
のＴＧＦ−βによる処理は、本発明のタンパク質をコー
ドする３．４KbのＲＮＡ構造体のそれらの細胞における
１０〜２０倍の上昇をもたらす。

【００１２】本発明はさらに、配列番号２に対応する６
８３個のアミノ酸残基配列を含み、そして図５及び６に
示されるアミノ酸の残基６４２−６４４でＡｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐを含むタンパク質βＩＧ−Ｈ３にも関する。
βＩＧ−Ｈ３は、お互い少なくとも１６％の相同性を共
有する４個の相同反復領域を含む。

【００１３】本発明はまた、発現がＴＧＦ−βにより強
く誘発される遺伝子をコードするヌクレオチド配列にも
関する。本発明のヌクレオチド配列は、約３．４KbのＲ
ＮＡ転写体の生成を誘発し、そして好ましくはβＩＧ−
Ｈ３の発現をコードする。

【００１４】好ましい態様の記載 本発明は、ヌクレオチド配列、及びＴＧＦ−βに応答し
て哺乳類細胞に誘発されるタンパク質に向けられる。Ｔ
ＧＦ−βによる処理による特定定の哺乳類細胞、たとえ
ばヒト胚腺癌細胞の増殖の停止は、新規の遺伝子生成物
の高められた誘発をもたらした。ＴＧＦ−βは、多く細
胞型の増殖及び合化を調節することが知られているひじ
ょうに関連する二量体タンパク質の種類を言及する。本
明細書において使用される場合、用語″ＴＧＦ−β″と
は、ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＧＦ−β３，ＴＧ
Ｆ−β４，ＴＧＦ−β５及び５−βと称するＴＧＦ−β
１／β２ハイブリッド分子を包含するトランスフォーミ
ング増殖因子βの種類のいづれかのメンバーを言及す
る。

【００１５】ＴＧＦ−βは、いくつかの遺伝子、たとえ
ばｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｓｉｓ及び血小板由来の増殖因子レ
セプターをコードする遺伝子の転写を調節することが知
られている。本発明において、タンパク質生成物がＴＧ
Ｆ−βのいくつかの多面的効果を仲介することに包含さ
れ得る新規遺伝子を同定する試みが行なわれた。本発明
の結果として、新規遺伝子生成物が、ＴＧＦ−βにより
増殖停止された哺乳類細胞に同定された。

【００１６】本発明において同定されたすべてのアミノ
酸残基は、Ｌ−形態の性質のものである。標準のポリペ
プチド命名法において、アミノ酸残基のための略語は次
の通りである： 記 号 アミノ酸 ３文字 １文字 アラニン Ａｌａ Ａ アルギニン Ａｒｇ Ｒ アスパラギン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸又はアスパラギン Ａｓｘ Ｂ システイン Ｃｙｓ Ｃ グルタミン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ グリシン Ｇｌｙ Ｇ グルタミン酸又はグルタミン Ｇｌｘ Ｚ ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ ロイシン Ｌｅｕ Ｌ リシン Ｌｙｓ Ｋ メチオニン Ｍｅｔ Ｍ フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ プロリン Ｐｒｏ Ｐ セリン Ｓｅｒ Ｓ トレオニン Ｔｈｒ Ｔ トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ チロシン Ｔｙｒ Ｙ バリン Ｖａｌ Ｖ

【００１７】本発明においては、実質的に純粋なタンパ
ク質が単離される。このタンパク質は、哺乳類細胞の増
殖を停止するために十分なＴＧＦ−βと哺乳類細胞とを
接触することに応答してその細胞に生成される。本明細
書で使用される場合、用語″哺乳類細胞″とは、哺乳
類、又は哺乳類腫瘍、たとえばヒト細胞、たとえばヒト
肺腺癌、ヒト胚口蓋間葉細胞及びヒト前立腺癌細胞に由
来する細胞を言及する。

【００１８】本明細書で使用される場合、用語″誘発さ
れた″とは、標的細胞における転写又は翻訳の刺激、促
進及び／又は増幅を言及する。本発明の好ましい態様に
おいては、ＲＮＡ又はタンパク質生成が哺乳類細胞にお
いてＴＧＦ−βにより誘発され得る。

【００１９】特に好ましい態様においては、本発明のＴ
ＧＦ−β誘発性タンパク質は、約６８３個のアミノ酸残
基のアミノ酸残基配列を有する。哺乳類細胞、たとえば
ヒト肺腺癌がＴＧＦ−β１により処理される場合、細胞
の増殖阻害がもたらされる。ｃＤＮＡライブラリィー
が、ＴＧＦ−β１処理された細胞から調製されるｃＤＮ
Ａプローブへの高められたハイブリダイゼーションを示
すクローンを単離するために構成され、そしてスクリー
ンされた。１つのクローンが単純され、そしてβｉｇ−
ｈ３と命名された。

【００２０】ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の個々は、
細胞においてβｉｇ−ｈ３を誘発したことが見出され
た。その誘発は可逆性であり、そして転写の上昇に起因
した。誘発されたβｉｇ−ｈ３ ＤＮＡの分析は、分泌
リーダーシグナル配列及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列
を含む、新規の６８３個のアミノ酸タンパク質、βＩＧ
−Ｈ３をコードする読み取り枠を示した。βＩＧ−Ｈ３
は４個の内部反復領域を含んだ。これらの反復領域は、
グラスホッパー及びショウジョウバエ ファスシクリン
（ｆａｓｃｉｃｌｉｎ）−Ｉ及びマイコバクラリウム
ボバス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｕｓ）か
らのＭｐｂ７０の短い領域を制限された相同性を示す。
ファスシクリン−Ｉは、昆虫胚における軸索末のサブセ
ット上に発現される表面認識糖タンパク質である。ファ
スシクリン−Ｉは４個の相同の１５０個のアミノ酸ドメ
インを含み、そしてグラスホッパーとショウジョウバエ
との間に約４０％の相同性を有する（Ｚｉｍｍなど．
（１９８８）Ｃｅｌｌ．５３：５７７〜５８３）。従っ
て、βｉｇ−ｈ３は新規の表面認識タンパク質をコード
することができることが本発明において考慮される。フ
ァスシクリン−Ｉについて提案される場合、４個の相同
反復体は、個々の鎖内二量体での２つの結合部位を有す
る四量体構造を示唆する。この構造体は、２つの異なっ
た細胞上での表面タンパク質への１つのβＩＧ−Ｈ３分
子の結合を可能にする。さらに、ファスシクリン−Ｉに
存在しない、βＩＧ−Ｈ３におけるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ配列は、種々のインテグリンとの相互作用を可能に
することができる。

【００２１】βＩＧ−Ｈ３は、ＴＧＦ−βにより誘発さ
れる新規遺伝子生成物を表わし、そして遺伝子転写を調
節するその能力に一部、よるようにＴＧＦ−βの多面性
効果を示すことができる。ＴＧＦ−βによる増殖阻害
は、ＰＲＢ，すなわち網膜芽腫感受性遺伝子の生成物の
リン酸化の阻害に関連されていることが最近見出された
（Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ，など．（１９９０）Ｃｅｌｌ
６１：７７７−７５；Ｌａｉｋｏなど．（１９９０）Ｃ
ｅｌｌ ６２：１７５〜１８５）。βＩＧ−Ｈ３が細胞
表面認識に関与される場合、それは細胞−細胞伝達及び
負の増殖制御に関与される細胞内シグナルの伝達に関係
することができる。

【００２２】本発明は次の例によりさらに記載される
が、それは例示目的であって、本発明を制限するもので
はない。

【００２３】

【実施例】例１ βｉｇ−ｈ３の同定及びＴＧＦ−βによる誘発 いくつかのヒト細胞系を培養し、そしてそれらの研究に
使用した。Ａ５４９及びＨ２９８１（両者ともヒト肺腺
癌）細胞、及びヒト乳癌細胞系（ＭＤＡ４５３，ＭＤＡ
４６８及び２９３）を、ダルベッコ変性イーグル培地
（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）において
増殖せしめた。ヒト乳癌系ＭＣＦ−７を、６０ng／mlの
インシュリンを含む、ＤＭＥＭ＋１０％ＰＢＳにおいて
増殖し、そしてヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を、１０
％ＦＢＳを含む、ＤＭＥＭ及びハンクスＦ−１２培地
（１：１）の混合物において増殖した。いくつかの日常
の一般的な方法が用いられ、そして本明細書に引用され
る文献に記載される。

【００２４】Ａ５４９細胞の集密性皿を１：１０に分け
た。２０時間後、それらを、完全培地における２０ng／
mlの組換えＴＧＦ−β１により７２時間、処理した。こ
れは、ＤＮＡ合成の８０〜９０％阻害率をもたらした。
ＴＧＦ−β１により処理されなかったＡ５４９細胞は対
照として使用された。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを抽出し、
そしてｃＤＮＡライブラリィーを、Ｗｅｂｂなど．（１
９８７）ＤＮＡ ６：７１〜７８（引用により本明細書
に組込まれる）に記載される方法によりλｇｔ−１０に
構成した。重複フィルターが、処理された及び処理され
ていない細胞から〔³²Ｐ〕−ラベルされたｃＤＮＡをス
クリーンした。処理されたプローブに対しての高められ
たハイブリダイゼーションを示すプラークを、三段階を
通して精製し、そしてｃＤＮＡ挿入体を、Ｄｅｎｔｅな
ど．（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１１：１６４５〜１６５４に記載されるようにして、ｐ
ＥＭＢＬ中にサブクローンした。いくつかのクローンを
単離し、そして１つのクローンｐβｉｇ−ｈ３ａを追加
の研究のために選択した。

【００２５】ｐβｉｇ−ｈ３のＤＮＡ配列分析は、ＴＧ
Ｆ−β１による７２時間後、Ａ５４９細胞に約１０倍誘
発される３．４Kbの主要転写体を検出する（図１，
Ａ）。図１，Ａのより長い暴露は、βｉｇ−ｈ３転写体
が処理されていない細胞において低レベルで検出され
（図１，Ｃ），βｉｇ−ｈ３がまた、図１，Ｄに示され
るようにＴＧＦ−β２により誘発され、そして従ってＴ
ＧＦ−β誘発性遺伝子であると思われることを示す。時
間経過誘発は図２に示され、そしてＡ５４９細胞におけ
るＴＧＦ−β１によるβｉｇ−ｈ３の最大刺激が、ＴＧ
Ｆ−β１処理の４８時間後に生じることを示した（処理
されていない細胞よりも２０倍高い）。

【００２６】Ａ４５９細胞の著しい形態学的変化がＴＧ
Ｆ−β処理に基づいて生じる。細胞はより大きく、より
広がっているように見え、そして平らな形態学を取る。
それらの表現型の変化は、ＴＧＦ−βの除去及び完全培
地における細胞の再増殖に基づいて逆転される。培養培
地からのＴＧＦ−β１の除去は、処理されていない細胞
に見出されるレベルへのβｉｇ−ｈ３の発現の低下をも
たらした（図３）。この発見は、それらの細胞の可逆性
増殖阻害と一致する。

【００２７】全ＲＮＡを、処理されていない細胞及び上
記のようにしてＴＧＦ−βにより処理された細胞の両者
から抽出した。ＲＮＡを、Ｌｅｈｒａｃｈなど．（１９
７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：４７４３〜４
７５１の方法に従って、１％アガロース−ホルムアルデ
ヒドゲル上で分別し、ナイロン膜（Ｈｙｂｕｎｄ Ｎ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、そしてＭａｄｉｓｅｎな
ど．（１９８８）ＤＮＡ７：１〜８に記載される方法に
従って〔³²Ｐ〕−ラベルされたプローブにハイブリダイ
ズした。バンドを、Ｍｕｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒを用いて定量化し
た。

【００２８】βｉｇ−ｈ３ ＲＮＡの上昇は、転写の上
昇か又は半減期の上昇のいづれかによる。βｉｇ−ｈ３
転写体の半減期を、処理されていない及びＴＧＦ−β１
処理されたＡ５４９細胞において決定した。図４に示さ
れる結果は、処理されていない細胞におけるβｉｇ−ｈ
３ ＲＮＡについての半減期は約５時間であり、そして
ＴＧＦ−β１処理され、転写的に阻害された（アクチノ
マイシンＤ−処理された）細胞において７時間にわずか
に高められることを示す。従って、βｉｇ−ｈ３ ＲＮ
Ａにおける主な上昇は、半減期の上昇よりもむしろ、転
写の上昇によると思われる。図２に示されるように、β
ｉｇ−ｈ３情報蓄積の運動学は、７〜１１時間の半減期
を包含し、これはアクチノマイシンＤ研究において観察
されるのと同じ範囲である。これは、情報安定性がそれ
らの研究においてアクチノマイシンＤにより総体的に変
更されないことを示唆する。

【００２９】いくつかのヒト正常及び癌細胞系を、βｉ
ｇ−ｈ３の誘発について試験した。ＨＥＰＭ（ヒト胚口
蓋間葉）細胞、すなわちＨ２９８１細胞のＴＧＦ−β１
処理は、βｉｇ−ｈ３ ｍＲＮＡの上昇をもたらした。
βｉｇ−ｈ３情報は、２９３細胞においても、又は乳癌
細胞系ＭＣＦ−７，ＭＤＡ４５３又はＭＤＡ４６８にお
いてもＴＧＦ−β１により誘発されなかった。βｉｇ−
ｈ３がすべての細胞型に誘発されない事実は、ＴＧＦ−
βによる他の遺伝子の誘発が種々の細胞系において変化
することが知られているので、特別な発見ではない。た
とえば、ｃ−ｍｙｃは、ＡＫＲ−２Ｂ繊維芽細胞におい
て刺激されることが報告されているが（Ｌｅｏｆなど．
（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８３：１４５３〜１４５８）、しかし角化細胞に
おいては衰えて調節されることが報告されている（Ｃｏ
ｆｆｅｙなど．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４
８：１５９６〜１６０２）。

【００３０】例２ 配列分析 ＤＮＡ配列分析を、Ｓａｎｇｅｒなど．（１９７７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：
５４６３〜５４６７９の方法により行なった。Ｐβｉｇ
−ｈ３ａのヌクレオチド配列分析は、それが一部の読み
取り枠を含むことを示した。従って、ｃＤＮＡライブラ
リィーを、全読み取り枠をコードするいくつかのオーバ
ーラップクローンが得られるまで、〔³²Ｐ〕−ラベルさ
れたβｉｇ−ｈ３ａプローブにより再スクリーンした。
βＩＧ−Ｈ３のヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配
列が図５及び６に示され、そして配列番号１及び２に記
載される。ｃＤＮＡは、６８３個のアミノ酸タンパク
質、βＩＧ−Ｈ３をコードする単一の読み取り枠を含
む。βＩＧ−Ｈ３は、アミノ末端シグナルペプチド、及
びカルボキシ末端に位置するＲＧＤ配列（残基６４２〜
６４４）を含む。このモチーフは、いくつかのインテグ
リンのためのリガンド認識配列として作用することが以
前に示されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３３６９〜１
３３７１）。Ｎ−結合グリコシル化の予測される部位は
存在しない。ポリアデニル化シグナルは、ヌクレオチド
残基２６２４に存在する。

【００３１】βｉｇ−ｈ３読み取り枠に関するＧｅｎｅ
ｈａｎｋ ａｎｄ ＥＭＢＬの研究は、そのタンパク質
がユニークであることを示した。グラスホッパー及びシ
ョウジョウバエ ファスシクリン−Ｉ及びマイコバクテ
リウム ボバスからのＭｐｂ７０に対して相同性を有す
る短い領域を同定した。図７は、それらのタンパク質か
ら複数の整列した領域を示す。

【００３２】βＩＧ−Ｈ３のドットマトリックス分析に
基づけば、約１４０個のアミノ酸の４種の相相ドメイン
が示された。これらの反復体の比較は、図８に示され、
そして３１％（ドメイン２と４との間）〜１６％（ドメ
イン１と３との間）の範囲のドメイン間相同性を示し、
そしてドメイン３が最っとも異なっている。これらのド
メイン間相同性は、ファスシクリン−Ｉに見出される相
同性に類似し、ここで反復体２は最っとも異なるように
見える。βＩＧ−Ｈ３及びファスシクリン−Ｉのドメイ
ンは、３種の高く保存されたアミノ酸ストレッチを共有
する。１つのストレッチは、アミノ末端で保存される１
０個のアミノ酸（ＴＸＦＡＤＳＮＥＡＷ）のうち９個を
含む。第２のストレッチはアミノ末端からの約３０個の
残基を保存する８個のアミノ酸（ＲＸＩＬＮＸＨＩ）の
うち６個を有し；そしてカルボキシ末端近くの第３の領
域は保存される１６個のアミノ酸（ＡＴＮＧＶＶＨＸＩ
ＤＸＶＬＸＸＰ）のうち１２個を有する。これらの比較
は、図７に示される。

【００３３】大部分のＭｐｂ７０は、マイコバクテリウ
ム ボバスからのタンパク質、すなわちウシ結核の原因
物質を分泌した。Ｍｐｂ７０は、カルボキシ末端の９７
個のアミノ酸におけるβＩＧ−Ｈ３ドメインに対して３
３％の相同性を有する１６３個のアミノ酸モノマーのダ
イマーとして存在する。アミノ末端の６６個のアミノ酸
は、マイコバクテリウム特異的エピトープを担持する
（Ｒｅｄｆｏｒｄなど．（１９９０）Ｊ．ｏｆ Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：２６５〜２７２）。
前述の記載及び例は、本発明の例示目的であって、制限
するものではない。種々の変更及び修飾が本発明の請求
の範囲内で行なわれ得る。

【００３４】

【配列表】

（Ａ）住所：Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ
ｂ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｂ）通り：３００５ １^st Ａｖｅ． （Ｃ）町 ：シアトル （Ｄ）州 ：ワシントン （Ｅ）国 ：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：９８１２１ （ｖ）コンピューター読取り可能フォーム： （Ａ）メディアムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉ
ｂｌｅ （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｒｅｌｅ
ａｓｅ ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）アトニー／エージェント情報： （Ａ）名称：Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ，Ｊｕｓｅｐｈ
Ｍ． （Ｂ）登録番号：３２，５９８ （Ｃ）参照／ドケット番号：ＯＮＯＵ９２− （ix）電信： （Ａ）電話：２０６／７２８−４８００ （Ｂ）ファックス：２０６／７２７−３６０１ （１）遺伝子情報： （ｉ）出願者：Ｐｕｒｃｈｉｏ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｆ． Ｓｋｏｎｉｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇ． （ii）発明の名称：ＴＧＦ−β誘発された遺伝子及びタ
ンパク質 （iii ）配列の数：２ （iv）対応住所：

【００３５】（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２６９１個の塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iii ）ハイポセティカル：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｆ）組織の種類：肺 （Ｇ）細胞の種類：腺癌 （Ｈ）セルライン：Ａ５４９ （xi）配列：配列番号１： GCTTGCCCGT CGGTCGCTAG CTCGCTCGGT GCGCGTCGTC CCGCTCCATG 50 GCGCTCTTCG TGCGGCTGCT GGCTCTCGCC CTGGCTCTGG CCCTGGGCCC 100 CGCCGCGACC CTGGCGGGTC CCGCCAAGTC GCCCTACCAG CTGGTGCTGC 150 AGCACAGCAG GCTCCGGGGC CGCCAGCACG GCCCCAACGT GTGTGCTGTG 200 CAGAAGGTTA TTGGCACTAA TAGGAAGTAC TTCACCAACT GCAAGCAGTG 250 GTACCAAAGG AAAATCTGTG GCAAATCAAC AGTCATCAGC TACGAGTGCT 300 GTCCTGGATA TGAAAAGGTC CCTGGGGAGA AGGGCTGTCC AGCAGCCCTA 350 CCACTCTCAA ACCTTTACGA GACCCTGGGA GTCGTTGGAT CCACCACCAC 400 TCAGCTGTAC ACGGACCGCA CGGAGAAGCT GAGGCCTGAG ATGGAGGGGC 450 CCGGCAGCTT CACCATCTTC GCCCCTAGCA ACGAGGCCTG GGCCTCCTTG 500 CCAGCTGAAG TGCTGGACTC CCTGGTCAGC AATGTCAACA TTGAGCTGCT 550 CAATGCCCTC CGCTACCATA TGGTGGGCAG GCGAGTCCTG ACTGATGAGC 600 TGAAACACGG CATGACCCTC ACCTCTATGT ACCAGAATTC CAACATCCAG 650 ATCCACCACT ATCCTAATGG GATTGTAACT GTGAACTGTG CCCGGCTCCT 700 GAAAGCCGAC CACCATGCAA CCAACGGGGT GGTGCACCTC ATCGATAAGG 750 TCATCTCCAC CATCACCAAC AACATCCAGC AGATCATTGA GATCGAGGAC 800 ACCTTTGAGA CCCTTCGGGC TGCTGTGGCT GCATCAGGGC TCAACACGAT 850 GCTTGAAGGT AACGGCCAGT ACACGCTTTT GGCCCCGACC AATGAGGCCT 900 TCGAGAAGAT CCCTAGTGAG ACTTTGAACC GTATCCTGGG CGACCCAGAA 950 GCCCTGAGAG ACCTGCTGAA CAACCACATC TTGAAGTCAG CTATGTGTGC 1000 TGAAGCCATC GTTGCGGGGC TGTCTGTAGA GACCCTGGAG GGCACGACAC 1050 TGGAGGTGGG CTGCAGCGGG GACATGCTCA CTATCAACGG GAAGGCGATC 1100 ATCTCCAATA AAGACATCCT AGCCACCAAC GGGGTGATCC ACTACATTGA 1150 TGAGCTACTC ATCCCAGACT CAGCCAAGAC ACTATTTGAA TTGGCTGCAG 1200 AGTCTGATGT GTCCACAGCC ATTGACCTTT TCAGACAAGC CGGCCTCGGC 1250 AATCATCTCT CTGGAAGTGA GCGGTTGACC CTCCTGGCTC CCCTGAATTC 1300 TGTATTCAAA GATGGAACCC CTCCAATTGA TGCCCATACA AGGAATTTGC 1350 TTCGGAACCA CATAATTAAA GACCAGCTGG CCTCTAAGTA TCTGTACCAT 1400 GGACAGACCC TGGAAACTCT GGGCGGCAAA AAACTGAGAG TTTTTGTTTA 1450 TCGTAATAGC CTCTGCATTG AGAACAGCTG CATCGCGGCC CACGACAAGA 1500 GGGGGAGGTA CGGGACCCTG TTCACGATGG ACCGGGTGCT GACCCCCCCA 1550 ATGGGGACTG TCATGGATGT CCTGAAGGGA GACAATCGCT TTAGCATGCT 1600 GGTAGCTGCC ATCCAGTCTG CAGGACTGAC GGAGACCCTC AACCGGGAAG 1650 GAGTCTACAC AGTCTTTGCT CCCACAAATG AAGCCTTCCG AGCCCTGCCA 1700 CCAAGAGAAC GGAGCAGACT CTTGGGAGAT GCCAAGGAAC TTGCCAACAT 1750 CCTGAAATAC CACATTGGTG ATGAAATCCT GGTTAGCGGA GGCATCGGGG 1800 CCCTGGTGCG GCTAAAGTCT CTCCAAGGTG ACAAGCTGGA AGTCAGCTTG 1850 AAAAACAATG TGGTGAGTGT CAACAAGGAG CCTGTTGCCG AGCCTGACAT 1900 CATGGCCACA AATGGCGTGG TCCATGTCAT CACCAATGTT CTGCAGCCTC 1950 CAGCCAACAG ACCTCAGGAA AGAGGGGATG AACTTGCAGA CTCTGCGCTT 2000 GAGATCTTCA AACAAGCATC AGCGTTTTCC AGGGCTTCCC AGAGGTCTGT 2050 GCGACTAGCC CCTGTCTATC AAAAGTTATT AGAGAGGATG AAGCATTAGC 2100 TTGAAGCACT ACAGGAGGAA TGCACCACGG CAGCTCTCCG CCAATTTCTC 2150 TCAGATTTCC ACAGAGACTG TTTGAATGTT TTCAAAACCA AGTATCACAC 2200 TTTAATGTAC ATGGGCCGCA CCATAATGAG ATGTGAGCCT TGTGCATGTG 2250 GGGGAGGAGG GAGAGAGATG TACTTTTTAA ATCATGTTCC CCCTAAACAT 2300 GGCTGTTAAC CCACTGCATG CAGAAACTTG GATGTCACTG CCTGACATTC 2350 ACTTCCAGAG AGGACCTATC CCAAATGTGG AATTGACTGC CTATGCCAAG 2400 TCCCTGGAAA AGGAGCTTCA GTATTGTGGG GCTCATAAAA CATGAATCAA 2450 GCAATCCAGC CTCATGGGAA GTCCTGGCAC AGTTTTTGTA AAGCCCTTGC 2500 ACAGCTGGAG AAATGGCATC ATTATAAGCT ATGAGTTGAA ATGTTCTGTC 2550 AAATGTGTCT CACATCTACA CGTGGCTTGG AGGCTTTTAT GGGGCCCTGT 2600 CCAGGTAGAA AAGAAATGGT ATGTAGAGCT TAGATTTCCC TATTGTGACA 2650 GAGCCATGGT GTGTTTGTAA TAATAAAACC AAAGAAACAT A 2691

【００３６】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：６８３個のアミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （iii ）ハイポセティカル：Ｙｅｓ （ｖ）フラグメントタイプ：内部 （vi）起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （Ｆ）組織の種類：肺 （Ｇ）細胞の種類：腺癌 （Ｈ）セルライン：Ａ５４９ （xi）配列：配列番号２： Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Lue Ala Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr 20 25 30 Gln Leu Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly 35 40 45 Pro Asn Val 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly 65 70 75 Lys Ser Thr Val Ile Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys 80 85 90 Val Pro Gly Glu Lys Gly Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn 95 100 105 Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu 110 115 120 Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro 125 130 135 Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Ala Ser 140 145 150 Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val Ser Asn Val Asn Ile 155 160 165 Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val Cys Ala Val Gln 170 175 180 Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn Gly Arg Arg 185 190 195 Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr Ser Met 200 205 210 Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly Ile 215 220 225 Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 230 235 240 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile 245 250 255 Thr Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu 260 265 270 Thr Leu Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Let 275 280 285 Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala 290 295 300 Phe Glu Lys Ile Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp 305 310 315 Pro Glu Ala Leu Arg Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser 320 325 330 Ala Met Cys Ala Glu Ala Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr 335 340 345 Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu 350 355 360 Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala 365 370 375 Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp Glu Leu Leu Ile Pro Asp 380 385 390 Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu leu Ala Ala Glu Ser Asp Val Ser 395 400 405 Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu Gly Asn His Leu 410 415 420 Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu Asn Ser Val 425 430 435 Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu 440 445 450 Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Leu 455 460 465 Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 470 475 480 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile 485 490 495 Ala Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met 500 505 510 Asp Arg Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu 515 520 525 Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser 530 535 540 Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val 545 550 555 Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu 560 565 570 Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu 575 580 585 Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly 590 595 600 Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val 605 610 615 Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala 620 625 630 Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr 635 640 645 Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln Glu Arg Gly Asp 650 655 660 Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln Ala Ser Ala 665 670 675 Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro Val Tyr 680 685 690 Gln Lys Leu Leu Glu Arg Met Lys His 695

【図面の簡単な説明】

【図１】これは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２による
処理の後、Ａ５４９細胞におけるβＩＧ−Ｈ３の発現を
示す。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにおいて増殖されたＡ５
４９細胞の集密的皿を１：１０に分けた。２０時間後、
それらを２０ng／mlのｒＴＧＦ−β１（Ａ及びＣ）又は
ｒＴＧＦ−β２〔Ｄ〕により７２時間、処理された。全
体のＲＮＡを単離し、そして２５μｇをアガロース−ホ
ルムアルデヒドゲル上で分別し、そして〔³²Ｐ〕−ラベ
ルされたβＩＧ−Ｈ３プローブを用いてノザシブロット
により分析した。レーン１，処理されていない細胞から
のＲＮＡ；レーン２，ＴＧＦ−β処理された細胞からの
ＲＮＡ。Ａ及びＤのための暴露時間、１０時間；Ｃのた
めの暴露時間、３日間。パネルＢは、メチレンブルーに
よるパネルＡ染色におけるゲルの写真である。バンド
は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓ
ｐｈｕｉｍａｇｅｒを用いて定量化された。

【図２】これは、ＴＧＦ−β１によるβＩＧ−Ｈ３ ｍ
ＲＮＡの誘発のための時間経過を示す。Ａ５４９細胞の
集密的皿を１：１０に分けた。２０時間後、それらをＴ
ＧＦ−β１（２０ng／ml）により６時間（レーン２），
２４時間（レーン３），４８時間（レーン４），７２時
間（レーン５）又は９６時間（レーン６）処理し：ＲＮ
Ａを単離し、そして〔³²Ｐ〕−ラベルされたβｉｇ−ｈ
３プローブにハイブリダイズした。

【図３】これは、Ａ５４９細胞の培養培地からのＴＧＦ
−β１の除去がβｉｇ−ｈ３ＲＮＡの合成の低下を誘発
することを示す。Ａ５４９細胞をＴＧＦ−β１（２０ng
／ml）により３日間処理した。次に、細胞を洗浄し、そ
してＴＧＦ−β１を含まない完全培地において２４時間
（レーン２），４８時間（レーン３），７２時間（レー
ン４）又は３週間（レーン５）増殖せしめた。ＲＮＡを
抽出し、そして〔³²Ｐ〕−ラベルされたβｉｇ−ｈ３プ
ローブを用いてノザンブロットにより分析した。レーン
１は、ＴＧＦ−β１により３日間、処理されたＡ５４９
細胞からのＲＮＡを含む。

【図４】これは、βｉｇ−ｈ３ ｍＲＮＡ半減期の決定
を示す。Ａ５４９細胞をＴＧＦ−β（２０ng／ml）によ
り４８時間、処理した。次にアクチノマイシンＤ（１０
ng／ml）を添加し、そしてＲＮＡを示される時間で抽出
し、そして〔³²Ｐ〕−ラベルされたβｉｇ−ｈ３プロー
ブを用いてのノザンブロットにより分析した。バンド
を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｉｍａｇｅｒを用いて定量化し、そして３．４Kb
のβｉｇ−ｈ３ ＲＮＡバンドに残る、ｃｐｍの百分率
としてプロットする。○−○は処理されていない細胞で
あり；●−●はＴＧＦ−β処理された細胞である。

【図５】これは、βＩＧ−Ｈ３のヌクレオチド及び推定
されるアミノ酸配列を示す。配列決定を記載のようにし
て行ない（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，など．（１９７７）Ｐ
ｒｕｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：
５４６３〜５４６７）、として２種の依存性クローンを
個々の領域について配列決定した。シグナル配列はオー
バーラップされ、そして矢印は切断部位を示し：ＲＧＤ
配列は四角で囲まれる。反復体１〜４を括弧に入れ、そ
してヌクレオチド２６２５でのポリアデニルイヒシグナ
ルを示す（水平の括弧）。

【図６】これは、βＩＧ−Ｈ３のヌクレオチド及び推定
されるアミノ酸配列を示し、図５の続きである。

【図７】これは、ショウジョウバエ ファスシクリン−
Ｉ（ＤｒＦ−３），グラスホッパー ファスシクリン−
Ｉ（ＧｒＦ−３）及びマイコバクテリウム ボバス タ
ンパク質Ｍｐｂ７０のカルボキシ末端半分からの３つの
反復体と比較されるβＩＧ−Ｈ３の４種の相同ドメイン
を示す。四角で囲まれたアミノ酸は、その同じ位置で少
なくとも２つの他のアミノ酸と同一である。

【図８】これは、直接的に比較されるβＩＧ−Ｈ３の４
つの反復体を示す。四角で囲まれたアミノ酸は、その同
じ位置で少なくとも１つの他のアミノ酸と同一である。
複数の整合がＵＷ／ＧＣＧソフトウェアーのプログラム
Ｐｉｌｅｕｐを用いて生成された。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年５月６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】これは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２による
処理の後、Ａ５４９細胞におけるβＩＧ−Ｈ３の発現を
示す電気泳動の写真である。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに
おいて増殖されたＡ５４９細胞の集密的皿を１：１０に
分けた。２０時間後、それらを２０ng／mlのｒＴＧＦ−
β１（Ａ及びＣ）又はｒＴＧＦ−β２〔Ｄ〕により７２
時間、処理された。全体のＲＮＡを単離し、そして２５
μｇをアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分別し、
そして〔³²Ｐ〕−ラベルされたβＩＧ−Ｈ３プローブを
用いてノザシブロットにより分析した。レーン１，処理
されていない細胞からのＲＮＡ；レーン２，ＴＧＦ−β
処理された細胞からのＲＮＡ。Ａ及びＤのための暴露時
間、１０時間；Ｃのための暴露時間、３日間。パネルＢ
は、メチレンブルーによるパネルＡ染色におけるゲルの
写真である。バンドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｕｉｍａｇｅｒを用いて定量化
された。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】これは、ＴＧＦ−β１によるβＩＧ−Ｈ３ ｍ
ＲＮＡの誘発のための時間経過を示す電気泳動の写真で
ある。Ａ５４９細胞の集密的皿を１：１０に分けた。２
０時間後、それらをＴＧＦ−β１（２０ng／ml）により
６時間（レーン２），２４時間（レーン３），４８時間
（レーン４），７２時間（レーン５）又は９６時間（レ
ーン６）処理し：ＲＮＡを単離し、そして〔³²Ｐ〕−ラ
ベルされたβｉｇ−ｈ３プローブにハイブリダイズし
た。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】これは、Ａ５４９細胞の培養培地からのＴＧＦ
−β１の除去がβｉｇ−ｈ３ＲＮＡの合成の低下を誘発
することを示す電気泳動の写真である。Ａ５４９細胞を
ＴＧＦ−β１（２０ng／ml）により３日間処理した。次
に、細胞を洗浄し、そしてＴＧＦ−β１を含まない完全
培地において２４時間（レーン２），４８時間（レーン
３），７２時間（レーン４）又は３週間（レーン５）増
殖せしめた。ＲＮＡを抽出し、そして〔³²Ｐ〕−ラベル
されたβｉｇ−ｈ３プローブを用いてノザンブロットに
より分析した。レーン１は、ＴＧＦ−β１により３日
間、処理されたＡ５４９細胞からのＲＮＡを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン イー．スコニアー アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル，トゥエンティフィフス アベニュ ノースウエスト 6749 (72)発明者 マイケル ジー．ニューバウアー アメリカ合衆国，ワシントン 98109，シ アトル，セカンド アベニュ ノース 2109

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 長さ約６８３個のアミノ酸残基の配列を
   有し、そして配列番号２に実質的に対応するタンパク質
   を含んで成る実質的に純粋なタンパク質であって、前記
   タンパク質が哺乳類細胞を増殖停止するために前記細胞
   とトランスフォーミング増殖因子βとを接触することに
   よって誘発されることを特徴とするタンパク質。
2. 【請求項２】 前記トランスフォーミング増殖因子β
   が、ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＧＦ−β３，ＴＧ
   Ｆ−β１／β２ハイブリッド分子及びそれらのフラグメ
   ントから選択される請求項１記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 前記タンパク質がβＩＧ−Ｈ３（ＴＧＦ
   −β誘発性遺伝子−ｈ３）である請求項１記載のタンパ
   ク質。
4. 【請求項４】 前記タンパク質が４種の相同反復領域を
   含む請求項１記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 前記哺乳類細胞がヒト細胞である請求項
   １記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 前記ヒト細胞が肺腺癌細胞、胚口蓋間葉
   細胞及び前立腺癌細胞から成る群から選択される請求項
   １記載のタンパク質。
7. 【請求項７】 配列番号２及び図５及び６に実質的に対
   応する約６８３個のアミノ酸残基のアミノ酸残基配列を
   含んで成る実質的に純粋なタンパク質であるβＩＧ−Ｈ
   ３であって、前記タンパク質が、図５及び６におけるア
   ミノ酸残基に対応するカルボキシ末端アミノ酸にＡｒｇ
   −Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むことを特徴とするβＩＧ−
   Ｈ３。
8. 【請求項８】 前記タンパク質が図６及び７に記載され
   るような４種の相同反復領域を含む請求項７記載のβＩ
   Ｇ−Ｈ３。
9. 【請求項９】 前記反復領域がお互い少なくとも１６％
   の相同性を有する請求項８記載のβＩＧ−Ｈ３。
10. 【請求項１０】 配列番号１及び図５及び６に実質的に
    対応するヌクレオチド配列を含んで成る、発現が哺乳類
    細胞とトランスフォーミング増殖因子βとを接触するこ
    とによって誘発される遺伝子をコードする実質的に純粋
    なヌクレオチド配列。
11. 【請求項１１】 前記トランスフォーミング増殖因子β
    が前記遺伝子からの３．４キロ塩基のＲＮＡ転写体の生
    成を誘発する請求項１０記載のヌクレオチド配列。
12. 【請求項１２】 前記トランスフォーミング増殖因子β
    がＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＧＦ−β３，ＴＧＦ
    −β１／β２ハイブリッド分子及びそれらのフラグメン
    トから成る群から選択される請求項１０記載のヌクレオ
    チド配列。
13. 【請求項１３】 前記遺伝子がβＩＧ−Ｈ３の発現をコ
    ードする請求項１０記載のヌクレオチド配列。