JPH0712695A - 水晶振動子式バイオセンサの製法及び水晶振動子式バイオセンサ - Google Patents

水晶振動子式バイオセンサの製法及び水晶振動子式バイオセンサ

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JPH0712695A
JPH0712695A JP15862093A JP15862093A JPH0712695A JP H0712695 A JPH0712695 A JP H0712695A JP 15862093 A JP15862093 A JP 15862093A JP 15862093 A JP15862093 A JP 15862093A JP H0712695 A JPH0712695 A JP H0712695A
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寛 田口
Kiyoko Kuwabara
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Masaji Aono
正司 青野
Bin Datsuku Chiyau
ビン ダック チャウ
Hiromi Kitaura
博己 北浦
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 高感度のバイオセンサを簡易に提供する方法
を提供する。 【構成】 水晶振動子電極表面上にゼラチン薄膜形を成
し、この薄膜を臭化シアンで活性化させた後、レセプタ
ー形成成分の水性液と接触させてレセプターの固定化膜
を形成する水晶振動子式バイオセンサの製法及び当該製
法にて得られる水晶振動子式バイオセンサ。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は水晶振動子式バイオセン
サの製法に関する。さらに詳しくは、本発明は水晶振動
子電極上にレセプターの固定化膜を形成するバイオセン
サの製法に関する。本発明はさらに当該製法を用いて製
造されるバイオセンサに関する。
【0002】
【従来の技術】近年、酵素、抗原、抗体等の生体物質を
その活性を保ったまま利用するバイオセンサが開発され
ている。バイオセンサとは、測定物質の分子(リガン
ド)と特異的に反応する主に生物由来のレセプターを、
このレセプターとリガンドの反応を電気信号に変えるト
ランスデューサー部に固定化したセンサである。このよ
うなバイオセンサは特異性が高く、立体異性体や構造類
似体をほぼ完全に区別し、真にバイオアクティブな特定
の物質のみを定量でき、さらには生体試料等を精製する
ことなく微量成分を測定することができるため、医療、
臨床検査あるいは各種工業プロセスにおける分析、環境
監視等の分野で多用されている。
【0003】バイオセンサのレセプターとリガンドの反
応は、酸素濃度の変化を感知する酸素電極、特定のイオ
ンの消費量あるいは生成量を感知するイオン電極、電極
上での反応による重量変化を感知する水晶振動子あるい
は発光量を感知する光デバイス等様々なトランスデュー
サーによって検出される。このうち、水晶振動子電極に
レセプターの固定化膜を形成したセンサは、レセプター
とリガンドの結合や解離によるごくわずかな重量変化を
検出することができ、特に抗原抗体反応等の比較的分子
量の大きなリガンドの反応を利用するセンサを構築する
場合に有用である。
【0004】このような水晶振動子上へタンパク質であ
るレセプターを固定化する手段としては、従来から振動
子上に直接共有結合により固定化する方法や水に不溶の
担体を形成させてその上に固定化する方法等が用いられ
ている。例えば、架橋剤であるグルタルアルデヒドでレ
セプターを結び付けて固定化する方法が特開平2−27
6966号に開示されている。
【0005】
【従来技術の問題点】水晶振動子は高周波に対して非常
に高感度であるため、レセプターの固定化膜が均一、安
定に形成されていない場合にはノイズの影響が大きくな
りすぎて定量が難しい。従来のように水晶振動子表面上
に直接レセプターを共有結合させる場合には均一な膜を
得ることが困難であり、得られる固定化膜も剥がれ易い
という問題がある。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は安定かつ均一
な固定膜を水晶振動子上に形成させる方法を提供し、高
感度のバイオセンサを簡易に提供することを目的とす
る。
【0007】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は水晶振
動子電極表面上にゼラチン薄膜を形成し、この薄膜を臭
化シアンで活性化させた後、レセプター形成成分の水性
液と接触させてレセプターの固定化膜を形成する水晶振
動子式バイオセンサの製法および当該製法により得られ
るバイオセンサに関する。
【0008】本発明に用いる水晶振動子は、特定の周波
数に対して電気的インピーダンスが低下する。この特定
の周波数は共振周波数とも呼ばれ、水晶振動子の密度や
厚さによって以下の式:
【0009】
【数1】
【0010】[△f:共振周波数の変化(Hz)、△
m:電極表面の重量変化(g)、f:基本共振周波数
(Hz)、A:電極の面積(cm2)、ρ:水晶の密度
(g/cm3)、t:水晶の厚さ(cm)]の関係を満た
す。ここで、
【0011】
【数2】
【0012】とおくと式(1)は △f=K・△m (2) と表される。従って、電極表面にレセプターを固定化す
れば、リガンドの結合により重量が増加し、これが共振
周波数の変化となって現れる。水晶振動子としては、共
振周波数の温度による変化が極めて少ないATカットの
ものが好ましい。例えば面積0.5cm2(直径8mm)
の水晶片に、0.20cm2(直径5mm)の金電極を取
り付けた共振周波数が9MHzである振動子を用いれ
ば、1ngの重量変化で1Hzの周波数変化が得られ、
測定限界が10ngオーダーの感度のセンサが得られ
る。
【0013】水溶液による水晶振動子電極の腐食を防ぐ
ために本発明の製法に用いる水晶振動子には金製の電極
および金メッキを施したリード線を取り付けるのが好ま
しい。
【0014】本発明のバイオセンサの製法においては、
まず水晶振動子の表面上にゼラチン薄膜を形成させる。
本発明の好ましい態様において、ゼラチン薄膜はゼラチ
ンの水またはアルコール等の溶媒溶液に浸漬、スプレ
ー、塗布などにより形成させる。ゼラチン濃度は15%
程度の水溶液とするのが好ましい。好ましくは室温で乾
燥させる。また、ゼラチン以外でも接着力が大きく、O
H基を多く有する物質をゼラチンの代替として好適に用
いることができる。
【0015】ゼラチン薄膜は不活性であるため、臭化シ
アンにより活性化させる。臭化シアンは以下のような活
性化機構でゼラチン薄膜表面の水酸基を活性化すること
が知られている。
【0016】
【化1】
【0017】臭化シアンによる活性化は、一般によく使
われる5%の臭化シアン水溶液中にゼラチン薄膜を形成
させた水晶振動子を置き、室温下で撹拌することによっ
て行う。臭化シアンによる活性化後、必要により緩衝液
で洗浄し、活性化ゼラチン薄膜形成水晶振動子を得るこ
の活性化ゼラチン薄膜形成水晶振動子に所望のレセプタ
ーを固定化する。固定化条件はレセプターの種類により
異なるが、例えば活性化振動子をレセプターの緩衝液溶
液に浸し、氷冷下で約一晩置く。固定化終了後、適当な
緩衝液で洗浄し、本発明のバイオセンサを得る。
【0018】本発明の製法に用いられるレセプターは、
臭化シアンで活性化されたゼラチン膜に担持され、検出
しようとする物質と特異的に反応する物質であれば特に
限定はない。例えば酵素、抗体、抗原、各種ホルモンレ
セプター、レクチン、アビジン、レチノール結合タンパ
ク、微生物、細胞内小器官等が好適に用いられる。反対
にレセプターに対するリガンドである、例えば基質、ホ
ルモン等を電極表面に固定化し、酵素、あるいはホルモ
ンレセプターの検出、定量に用いることも可能である。
【0019】緩衝液は固定化させるレセプターの性質に
よって適宜選択するが、レセプターの活性発現に悪影響
を及ぼさない組成、pHあるいは緩衝能のものを選択し
なくてはならない。例えばレセプターとしてイムノグロ
ブリンGを用いる場合には、pH7付近のリン酸緩衝生
理的食塩水が特に好適に用いられる。必要に応じて、レ
セプター活性保持のため、必要に応じて緩衝液の冷却等
の処置を行う。
【0020】形成されるゼラチン薄膜は、異常発振しな
い範囲であればその厚さは特に限定的でない。
【0021】本発明のバイオセンサは例えば図1に示し
たような形状のセンサとする。また、水晶振動子の両面
にそれぞれ異なったレセプターの固定化膜を形成させ、
図2に示すごとく、複数の蛋白質の検出するマルチチャ
ンネルセンサとすることも可能である。本発明のセンサ
は、例えば図3に示した如く、発振部、周波数カウンタ
ーおよびデータ処理部をつなぎ、バイオセンサシステム
を構成する。発振部としては安定して高周波数の振動を
与えることができる水晶発振回路が好ましく、具体的に
はNANDゲートと水晶発振子とを用いた水晶発振回路
等が特に好適に用いられる。周波数カウンターとして
は、微小な変化を正確に読み取ることの可能なカウンタ
ーであることが望ましく、具体的には測定限界が100
MHzであり、精度が1Hz以上のカウンターが好適に
用いられる。
【0022】本発明の製法によって均一かつ安定なレセ
プターの固定化膜を水晶振動子電極上に形成させること
が可能となり、高感度のバイオセンサを得ることができ
る。
【0023】
【実施例1】ヒト血清アルブミン(以下HSA)を認識
する抗体を水晶振動子電極表面に固定化したバイオセン
サを製造した。水晶振動子としてはATカット、面積
0.5cm2(直径8mm)、基本周波数9MHzのもの
を用いた。この水晶振動子に直径0.20cm2の金電極
および金メッキを施したリード線を取り付けたものを水
晶振動子電極として用いた。
【0024】水晶振動子の両面に15%ゼラチン水溶液
(ナカライテスク社製)を塗布し、室温で60分間乾燥
させてゼラチン薄膜を形成させた。この振動子を5%臭
化シアン水溶液10mlに投入し、8分間撹拌し、ゼラ
チン薄膜を活性化させ、その後氷冷した0.1M炭酸−
重炭酸緩衝溶液(pH9.0)20mlで5回洗浄して
活性化ゼラチン薄膜形成水晶振動子を得た。この活性化
ゼラチン薄膜形成水晶振動子をウサギ抗ヒト血清アルブ
ミンIgG(Organon Teknika社製(25mg/m
l))120μlと0.1M炭酸−重炭酸緩衝溶液12
0μlの混合溶液に浸し、2時間、時々動かしながら氷
冷した後、冷蔵庫中に一夜静置した。
【0025】得られたIgG固定水晶振動子を氷冷した
0.02Mホウ酸緩衝溶液(pH8.0)20mlで5回
洗浄し、さらに0.15M塩化ナトリウム20mlで5
回洗浄し、その後0.02MエタノールアミンのPBS
(pH7.0)溶液中に10分間浸した。PBS(pH
7.0)で5回洗浄した後に空気中で乾燥させ、実施例
1の水晶振動子式バイオセンサを得た。
【0026】実施例1の水晶振動子式バイオセンサを用
いて図3のごとくバイオセンサシステムを構築し、PB
S単独およびPBS10mlにHSAを100μg添加
した試料に浸し、約10分間の周波数変化量を調べた。
結果を図4に示す。PBS単独の場合とPBSにHSA
を添加したものとでは、明らかに周波数の変化量に差が
認められ、本発明のバイオセンサがPBS中のHSAを
選択的に測定できることを示す。
【0027】
【参考例1】実施例1で用いた水晶振動子電極の表面全
体に、ウサギIgG、20%ウシ血清アルブミン(シグ
マ社製)(BSA)水溶液および25%グルタルアルデ
ヒド水溶液(ナカライテスク社製)(GA)が、Ig
G:BSA:GA=10:5:1となるよう混合した溶
液をピペットで薄くのばし、室温で60分間乾燥して参
考例1のバイオセンサを得た。
【0028】参考例1により得られたバイオセンサを用
いて図3のごとくバイオセンサシステムを構築し、尿単
独および尿10mlにHSAを100μg添加した試料
に浸し、10分間の周波数変化量を調べた。結果を図5
に示す。尿単独と尿にHSAを添加したものとでは、明
らかに周波数変化量の差が認められ、本参考例により得
られたバイオセンサが尿中のHSAの測定に有効である
ことを示す。
【0029】
【発明の効果】本発明の製法により、高感度で安定の良
いバイオセンサを簡易に得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の水晶振動子電極の一例を示す概略図
である。
【図2】 本発明の水晶振動子式バイオセンサの一例を
示す概略図である。
【図3】 本発明のバイオセンサを用いて構築されるバ
イオセンサシステムの一例である。
【図4】 本発明の実施例1のバイオセンサを用いて測
定したPBS中のHSA濃度のグラフである。
【図5】 本発明の参考例1のバイオセンサを用いて測
定した尿中のHSA濃度のグラフである。
【符号の説明】
1:電極、2:水晶振動子、3:リード線、5:水晶
片、6Aおよび6B:担体面
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャウ ビン ダック 大阪府大阪市淀川区三国本町1丁目10番40 号 和泉電気株式会社内 (72)発明者 北浦 博己 大阪府大阪市淀川区三国本町1丁目10番40 号 和泉電気株式会社内

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 水晶振動子電極表面上にゼラチン薄膜を
    形成し、この薄膜を臭化シアンで活性化させた後、レセ
    プター形成成分の水性液と接触させてレセプターの固定
    化膜を形成する水晶振動子式バイオセンサの製法。
  2. 【請求項2】 レセプターがタンパク質である請求項1
    記載の製法。
  3. 【請求項3】 レセプターが抗体である請求項1記載の
    製法。
  4. 【請求項4】 レセプターがウサギ抗ヒト血清アルブミ
    ンIgGである請求項2記載の製法。
  5. 【請求項5】 水晶振動子電極表面上に臭化シアンで活
    性化させたゼラチン薄膜を有し、その上にレセプターの
    固定化膜を形成してなる水晶振動子式バイオセンサ。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007093573A (ja) * 2005-08-30 2007-04-12 Seiko Instruments Inc バイオセンサ計測システム、粘性率測定方法、および微量質量測定方法
JP2009162528A (ja) * 2007-12-28 2009-07-23 Nippon Dempa Kogyo Co Ltd 圧電センサ及び感知装置

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007093573A (ja) * 2005-08-30 2007-04-12 Seiko Instruments Inc バイオセンサ計測システム、粘性率測定方法、および微量質量測定方法
JP4646813B2 (ja) * 2005-08-30 2011-03-09 セイコーインスツル株式会社 バイオセンサ計測システム、粘性率測定方法、および微量質量測定方法
JP2009162528A (ja) * 2007-12-28 2009-07-23 Nippon Dempa Kogyo Co Ltd 圧電センサ及び感知装置

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