JP4127192B2

JP4127192B2 - 水晶振動子電極表面へのレセプタ固定方法およびレセプタ固定水晶振動子の製造方法

Info

Publication number: JP4127192B2
Application number: JP2003383335A
Authority: JP
Inventors: 卓孝野口
Original assignee: Meidensha Corp
Current assignee: Meidensha Corp
Priority date: 2003-11-13
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2023-11-13
Also published as: JP2005147778A

Description

本発明は、水晶振動子の電極表面にガス、溶液等の試料が付着して起こる電極表面の重量変化により、水晶振動子の発振周波数、インピーダンス等の特性が変化する原理を利用して試料の成分を検知、定量するＱＣＭ(ＱｕａｒｔｚＣｒｙｓｔａｌＭｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ)センサに係り、特に、検知、検量の対象となる試料のレセプタを水晶振動子の電極表面に固定する技術に関する。

生化学、電気化学などの分野において、反応量や生成物の質量の定量は重要な技術であるが、極めて微量の反応量や生成物の質量に対して十分な検出感度を得ることは困難であった。

そこで近年は、ＡＴカット水晶振動子の電極表面に抗体(または抗原)を固定し、測定試料と抗体(または抗原)とを抗原−抗体反応させ、この反応による重量変化を周波数応答として測定するタイプのＱＣＭセンサが注目を集めている。

ＡＴカット水晶振動子は、その主共振周波数が振動子の板厚に反比例し、水晶振動子の電極表面に試料成分が膜成したり、物質の付着が起こると電極表面に存在する物質の単位面積当たりの重量に対応して周波数のシフトが起こる。下記の式１に付着物の重量と周波数のシフト量との関係式を示す。

ＡＴカット水晶振動子は広い温度範囲において周波数が安定しているため、安定した検出感度が期待でき、また、抗原−抗体反応は、抗原と抗体とが極めて低い濃度でも反応するという特徴があるので、抗体(または抗原)固定ＡＴカット水晶振動子を用いることでナノグラムレベルでの試料の検出がリアルタイムで可能になる。

前記技術の例として、水晶振動子たん白質センサが開示されている。この技術は、水晶振動子の表面にたん白質結合性色素固定化膜を形成させてたん白質の検出、定量を行うもので、この水晶振動子たん白質センサにより、たん白質の検出定量の簡素化が実現されている(例えば、特許文献１参照。)。
特許第２７９４７６３号明細書

水晶振動子に付着した試料のうち検知、定量できるのは水晶振動子の電極に付着したもののみである。したがって、水晶振動子の電極以外の部分に試料の付着が起こると測定感度の低下や測定精度の低下が生じてしまうという問題がある。

また、水晶振動子の電極表面にレセプタである抗体(または抗原)を固定する技術としては、数マイクロミリリットル程度の抗体(または抗原)溶液を電極上にスポットする方法が一般的であるが、これは抗体(または抗原)溶液を電極上にスポットするだけのものであり固定面積が安定せず、固定処理には長時間を要してしまうため抗体(または抗原)溶液が蒸発し抗体(または抗原)活性が失われてしまうという問題がある。

本発明は、かかる事情に鑑みなされたもので、その目的は、前記問題を解決した水晶振動子電極表面へのレセプタ(例えば、抗体、抗原など)固定方法、レセプタ(例えば、抗体、抗原など)固定水晶振動子の製造方法を提供することにある。

そこで前記課題を解決するために、請求項１に記載の水晶振動子電極表面へのレセプタ固定方法は、水晶基板の上下両表面に電極を対向配置した水晶振動子の電極表面に測定試料のレセプタを固定する方法であって、フォトレジストを水晶振動子表面に塗布する第１工程と、第１工程を経た水晶振動子に露光処理と現像処理とを行い、電極表面を除く水晶振動子表面のフォトレジストを除去する第２工程と、第２工程を経た水晶振動子をブロッキング溶液に浸漬し、電極表面を除く水晶振動子表面にブロッキング材を固定する第３工程と、第３工程を経た水晶振動子をレジストはく離液に浸漬し、電極表面のフォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材とをはく離させる第４工程と、第４工程を経た水晶振動子をレセプタを含む溶液に浸漬し、水晶振動子の電極表面にレセプタを固定する第５工程とからなることを特徴とする。

また、請求項２に記載のレセプタ固定水晶振動子の製造方法は、水晶基板の上下両表面に電極を対向配置した水晶振動子の電極表面に測定試料のレセプタを固定したレセプタ固定水晶振動子の製造方法であって、フォトレジストを水晶振動子表面に塗布する第１工程と、第１工程を経た水晶振動子に露光処理と現像処理とを行い、電極表面を除く水晶振動子表面のフォトレジストを除去する第２工程と、第２工程を経た水晶振動子をブロッキング溶液に浸漬し、電極表面を除く水晶振動子表面にブロッキング材を固定する第３工程と、第３工程を経た水晶振動子をレジストはく離液に浸漬し、電極表面のフォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材とをはく離させる第４工程と、第４工程を経た水晶振動子をレセプタを含む溶液に浸漬し、水晶振動子の電極表面にレセプタを固定する第５工程とから製造されることを特徴とする。

請求項１または２に記載の第１工程において、フォトレジストはポジ型、ネガ型のどちらを用いてもよい。

第２工程において、露光処理と現像処理ととは、ポジ型フォトレジストを用いた場合であれば、電極表面に塗布されたフォトレジストを除くフォトレジストに光を照射し、その後、現像液に浸漬することで光を照射したフォトレジストを現像液に溶解させることを意味し、ネガ型フォトレジストを用いた場合であれば、電極表面に塗布されたフォトレジストに光を照射し、その後、現像液に浸漬することで光を照射していないフォトレジストを現像液に溶解させることを意味する。

第３工程において、電極表面にはフォトレジストが固定されているため、電極表面にはブロッキング材は固定されず、電極表面に固定されたフォトレジストの上にブロッキング材が固定される。

第４工程において、水晶振動子をレジストはく離液に浸漬すると、レジストはく離液がフォトレジストに到達し、フォトレジストを溶解させ、フォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材とをはく離させる。

第５工程において、電極表面を除く水晶振動子にはブロッキング材が固定されているので、電極表面のみにレセプタが固定されるように位置決めがされている。これにより電極表面にのみレセプタが固定される。

なお、レセプタは、各種の抗体、抗原、その他低濃度の測定試料と結合するものであればよい。また、水晶振動子にはＡＴカット水晶振動子を用いることができる。

請求項１または２に記載の発明によれば、電極表面を除く水晶振動子表面にはブロッキング材が固定されており電極表面にのみレセプタが固定されているので、電極以外の水晶振動子表面には試料が付着せず、測定感度の低下や測定精度の低下を生じない。また、レセプタが電極表面に固定される部分がブロッキング材により位置決めされているのでレセプタの固定面積が安定する。また、浸漬によりレセプタの固定を行うのでレセプタ溶液が蒸発してレセプタの活性が失われてしまうこともない。

本発明の水晶振動子を用いれば、非常に低濃度の試料の検出、定量を正確に行うことができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。図１は本発明の抗体固定水晶振動子の製造方法の工程図である。

図１に示すように、第１工程において、ＡＴカットした水晶基板の上下両表面に電極を対向配置したＡＴカット水晶振動子を５％γ−ＡＰＴＥＳ水溶液に４５℃で９０分間浸漬し、水晶振動子の表面にアミノ基を導入する。

第２工程において、アミノ基を導入した水晶振動子を５％グルタルアルデヒド水溶液に３７℃で２時間浸漬し、アミノ基を活性化させる。

第３工程において、アミノ基を活性化させた水晶振動子を蒸留水で洗浄した後、フォトレジストを水晶振動子表面にスピンコートし、露光、現像処理して、電極部位外のフォトレジストを除去する。なお、フォトレジストは、ポジ型、ネガ型のどちらを用いてもよい。ポジ型フォトレジストとしては、例えば東京応化製のＯＦＰＲ８００等を用いることができる。

第４工程において、電極部位外のフォトレジストを除去した水晶振動子をブロッキング溶液に浸漬し、電極部位外の水晶振動子表面にブロッキング材を固定する。

このブロッキング溶液、ブロッキング材、浸漬方法については下記の表１に示す条件で操作を行うことができる。

第５工程において、ブロッキング材を固定した水晶振動子を蒸留水で洗浄した後、これをアセトンに浸漬し、１００ｋＨｚの超音波を照射して、電極上のフォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材を除去する。

第６工程において、電極上のフォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材を除去した水晶振動子を蒸留水で洗浄した後、抗ＡＦＰ抗体を含むＰＢＳ溶液に水晶振動子を４℃で２４時間浸漬して、電極表面上に抗ＡＦＰ抗体を固定させ、抗体固定水晶振動子を完成させる。

前記製造方法により製造した抗体固定水晶振動子は、電極以外の水晶振動子表面がブロッキング材により保護されているので電極以外の水晶振動子表面には試料が付着せず、測定感度の低下や測定精度の低下を生じない。また、抗体が電極表面に固定される部分がブロッキング材により位置決めされているので抗体の固定面積が安定する。また、浸漬により抗体の固定を行うので抗体溶液が蒸発して抗体活性が失われてしまうこともない。

図１に示す抗体固定水晶振動子の製造方法により、電極面積が０．０３４６ｍｍ²(Φ＝２．１ｍｍ)で、振動周波数が３０ＭＨｚの水晶振動子を作製した。なお、この抗体固定水晶振動子の電極表面への抗ＡＦＰ抗体の固定量は約２０ｎｇであった。

この抗体固定水晶振動子を用いて、図２に示すように、抗体固定水晶振動子１を容器２内に保持させ、その周辺をＯリング３等でシールし、抗体固定水晶振動子１の電極１Ａ、１Ｂからリード線を使って発振回路、またはインピーダンス測定回路４に接続して測定セルを構成し、容器２に濃度が２１ｎｇ／ｍＬであるＡＦＰのＰＢＳ溶液を３００μＬ投入し、４℃で２４時間、抗原−抗体反応を行わせた。

この抗原−抗体反応によりＡＦＰと抗ＡＦＰ抗体とが結合する。そして、この結合により、電極表面に付着した物質の重量が変化し、これにともない抗体固定水晶振動子の振動周波数が変化する。この振動周波数の変化量を測定することで抗ＡＦＰ抗体に結合したＡＦＰの重量を求めることができる。なお、投入したＡＦＰの重量と抗ＡＦＰ抗体に結合したＡＦＰの重量との差を算出することで、抗体固定水晶振動子の抗ＡＦＰ抗体以外の部分に付着したＡＦＰの重量を求めることができる。

ここで図３に抗ＡＦＰ抗体に結合したＡＦＰの重量と抗体固定水晶振動子の製造に用いたブロッキング材との関係図を示す。図３に示すようにＢＳＡ、ＭＰＣをブロッキング材に用いた抗体固定水晶振動子をセンサに用いた場合が特にＡＦＰの結合量が多いという結果を得た。つまり、これらの抗体固定水晶振動子をセンサに用いた場合は、抗体固定水晶振動子の抗ＡＦＰ抗体以外の部分へのＡＦＰの付着が特に少ないことを示しており、測定感度の低下や測定精度の低下を生じるという問題の解決に特に適している。

本発明の抗体固定水晶振動子の製造方法の工程図。測定セルの構成図。抗ＡＦＰ抗体に結合したＡＦＰの重量と抗体固定水晶振動子の製造に用いたブロッキング材との関係図。

符号の説明

１…抗体固定水晶振動子
１Ａ、１Ｂ…電極
２…容器
３…Ｏリング
４…発振回路またはインピーダンス測定回路

Claims

水晶基板の上下両表面に電極を対向配置した水晶振動子の電極表面に測定試料のレセプタを固定する方法であって、
フォトレジストを水晶振動子表面に塗布する第１工程と、
水晶振動子に露光処理と現像処理とを行い、電極表面を除く水晶振動子表面のフォトレジストを除去する第２工程と、
水晶振動子をブロッキング溶液に浸漬し、電極表面を除く水晶振動子表面にブロッキング材を固定する第３工程と、
水晶振動子をレジストはく離液に浸漬し、電極表面のフォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材とをはく離させる第４工程と、
水晶振動子をレセプタを含む溶液に浸漬し、水晶振動子の電極表面にレセプタを固定する第５工程とからなることを特徴とする水晶振動子電極表面へのレセプタ固定方法。
水晶基板の上下両表面に電極を対向配置した水晶振動子の電極表面に測定試料のレセプタを固定したレセプタ固定水晶振動子の製造方法であって、
フォトレジストを水晶振動子表面に塗布する第１工程と、
水晶振動子に露光処理と現像処理とを行い、電極表面を除く水晶振動子表面のフォトレジストを除去する第２工程と、
水晶振動子をブロッキング溶液に浸漬し、電極表面を除く水晶振動子表面にブロッキング材を固定する第３工程と、
水晶振動子をレジストはく離液に浸漬し、電極表面のフォトレジストとこの上に固定されたブロッキング材とをはく離させる第４工程と、
水晶振動子をレセプタを含む溶液に浸漬し、水晶振動子の電極表面にレセプタを固定する第５工程とから製造されることを特徴とするレセプタ固定水晶振動子の製造方法。