JPH07121232B2

JPH07121232B2 - 細胞増殖状態のモニタ−方法及びそのモニタ−装置

Info

Publication number: JPH07121232B2
Application number: JP62046173A
Authority: JP
Inventors: 晋伊東; 敏男宇都宮
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1987-02-27
Publication date: 1995-12-25
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: JPS63212862A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、正確且つ短時間で細胞状態を計測することが
出来る細胞増殖状態のモニター方法及びそのモニター装
置に関するものである。

［従来の技術］マイクロプレートなどの細胞培養容器内で細胞を培養す
る場合、生細胞の濃度が濃くなり過ぎると、フルグロー
スと呼ばれる状態になって、死滅する細胞が出てくる。
このため、フルグロース状態になる前に、継代培養をす
る必要がある。また細胞融合を行った場合には、目的と
する抗体を産生しているかどうかを、細胞が増殖してき
た適当な時期にチェックする必要がある。これらの継代
培養の時期、抗体産生の時期は、これまで、作業者が顕
微鏡を用いて培養容器内の細胞増殖状態を観察し、経験
に頼っていた。

［発明が解決しようとする問題点］経験に頼る従来の方法では、培養細胞の増殖状態すなわ
ち生細胞濃度の把握は、非常に曖昧なものとなり定量性
がなかった。また、もし、顕微鏡下で、生細胞の数を数
えようとすれば、非常に時間がかかってしまい、多量の
培養細胞の増殖状態をすべて把握することは困難であっ
た。

顕微鏡の観察に代わり、画像処理による細胞認識方法、
例えば、単に二値化だけで行う方法（特開昭59−78681
号公報）も提唱されているが、認識率が悪いものであっ
た。これは、寒天培地上に形成された細胞コロニーの場
合のようなバックグランドが単純な場合には、認識が容
易であるが、培養液中の培養では、死細胞、ゴミ、その
他の異物が含まれているため、パターンおよびバックグ
ランドが複雑であるためである。これを改良する方法と
して、空間フィルター処理を用いた方法も提唱されてい
る（特開昭60−201332号公報）。

しかし、この方法は空間フィルターを用いるため、精度
は良いが、時間がかかるという問題点がある。

［問題点を解決するための手段］本発明は、複雑なパターン、バックグランドを有する場
合にも、正確に且つ短時間で細胞の増殖状態を計測する
ためになされたもので、その第１の発明は、顕微鏡に接
続された撮像装置を介して、画像処理装置に取り込ま
れ、デイジタル化された細胞画像を、適切な画素数（水
平4n画素×垂直4n画素:n≧１）のブロックに分割し、ブ
ロック毎に２次元アダマール（Hadamard）変換を行った
後、判別分析を用いた処理により、各ブロック中の生細
胞の有無を判別することによって、細胞増殖状態をモニ
ターする方法を提供するものであり、その第２の発明
は、顕微鏡と、該顕微鏡に接続された撮像装置と、該撮
像装置からの信号をデイジタル信号化するA/D変換器
と、デイジタル化された画像データを記憶する記憶手段
と、画像データを指定された数に分割する画像分割手段
と、分割によって得られる各ブロックの画像データをア
ダマール変換する変換手段と、アダマール変換後のアダ
マール変換係数データを記憶する手段と、記憶されたア
ダマール変換係数データのうちから指定された一部又は
全部を用いて判別関数の計算を行い、得られた数値を基
準値と比較する判別分析手段と、各ブロツクの判別結果
を記憶する手段と、全画像に対する同一の判別結果のブ
ロックの集合の割合を計算する演算手段と、計算された
割合を出力する出力手段からなる細胞増殖状態のモニタ
ー装置を提供するものである。

［作用］図面を参照にして、本発明を説明する。

第１図は、本発明の細胞増殖状態のモニター方法の手順
を示すフロー図である。

観察手段である顕微鏡に接続されたテレビカメラ等の撮
像装置を用いて、培養容器中の細胞の画像を画像処理装
置に入力する。

培養細胞画像の取り込みは、１個の生細胞の直径が、指
定したサイズのブロックの一辺の大きさの1/2〜１倍に
なる倍率、すなわち、分割ブロックのサイズを4n×4n画
素（ｎ≧１）とした場合、培養生細胞の大きさは、一般
に10〜20μｍであるので、１画素の大きさが、最小5/2n
［μｍ］，最大10/n［μｍ］となる倍率で行う。これ
は、生細胞が指定されたサイズのブロックより大き過ぎ
ても、反対に小さ過ぎても認識効率が悪くなるからであ
る。

画像処理装置に取り込んだ画像をデイジタル化した後、
ブロック分割する。分割するブロックのサイズは、4n×
4n画素（ｎ≧１）のものを用いる。これは、２次元アダ
マール変換を行うために用いるアダマール行列は、次数
が４の倍数でなければならないからである。

次に各ブロックについて、それぞれ、２次元アダマール
変換を行い、ブロックのサイズと同じ次数のアダマール
行列を用いて行う。一例に、ブロックサイズを８画素×
８画素に設定した場合に用いる８次のナチュラル型アダ
マール行列を式（１）に示す。

アダマール変換係数の行列C_4nは、分割したブロック内
の輝度値の行列をX_4nとする式（２）で与えられる。

C_4n＝H_4nX_4nH_4n （２）ここで、C_4n:4n×4nアダマール変換係数行列、X_4n:4n×
4n画素サイズのブロックの輝度値の行列、H_4n:4n×4nア
ダマール行列、n:n≧１の整数である。

特に、4n＝2^k（ｋはｋ≧２の整数）の場合のナチュラル
型アダマール行列は、このアダマール変換後の係数行列C_4nの各値は、アダマ
ール行列で表される各シーケンシー成分の振幅を表して
いる。このC_4nの全部の値、または、一部の値を用い
て、分割したブロック内に生細胞が存在するか否かを判
別する。

ブロック内の生細胞の有無判別には、マハラノビス汎距
離を用いた２群判別を用いることができる。

アダマール変換後の係数行列C_4nの全要素またはその一
部を要素とする特徴パラメータベクトルをその要素の数をｐ個とする。

また、群数ｊ＝２とすると、ブロック内の生細胞の有無
は判別関数ＺＺ＝x^tR^-1（_１−_２） −（_１＋_２）^tR^-1（_１−_２）/2 （３）の符号によって決定することができる。

ここで、x:特徴パラメータベクトル、x_j:各群内の平均
値ベクトル、R:分散・共分散行列を表し、右肩のt,−１
は、それぞれ転置行列，逆行列であることを示す。

予め、サンプル画像を用いて₁,_２およびR^-1（_１
−_２）を求めておけば、各ブロックのアダマール変換
係数をこの式に代入することによって、生細胞の有無を
判定できる。

また、培養細胞の増殖度は、生細胞が存在すると判定し
たブロック数の全ブロック数に対する割合で表すことが
できる。

第２図は、第２の発明の細胞増殖状態のモニター装置の
ブロック図である。（１）は顕微鏡、（２）は顕微鏡
（１）と接続したテレビカメラ等の撮像装置である。撮
像装置（２）からの画像信号は、A/D変換器（３）によ
ってデイジタル化されてフレームメモリー（４）に記憶
される。

一方、（５）はブロック分割器で、フレームメモリー中
に記憶された画像データを、ブロック数入力手段（６）
から入力されたブロック数に分割する。

一ブロックにおける画像データをアダマール変換器
（７）によってアダマール変換し、アダマール変換係数
を算出する。算出されたアダマール変換係数は、アダマ
ール変換係数メモリー（８）に記憶される。他の各ブロ
ックにおける画像データについても同様に、アダマール
変換係数が算出され記憶される。（９）は、判別分析に
使用するアダマール変換係数のデータを選択する係数デ
ータ選択手段で、選択データ入力手段（10）から入力さ
れた選択されるべき変換係数に基づいて選択する。

選択された係数のデータは、判別分析手段（11）によっ
て、予め基準値入力手段（12）から入力され基準値記憶
設定装置（13）に設定されている基準値と比較され、各
ブロックにおける生細胞の有無が判別される。

各ブロックにおける生細胞の有無は、判別分析結果メモ
リー（14）に記憶され、増殖率計算手段（15）によっ
て、記憶された各ブロックにおける生細胞の有無から増
殖率が計算される。

（16）は、増殖率を表示するための出力装置で、例え
ば、プリンター、デイスプレイ装置等が使用される。

［実施例］死細胞、異物等の中に生細胞のコロニーが存在するよう
な顕微鏡像をテレビカメラ、８ビットA/D変換器を介し
て、画像処理装置に入力した。一つの画像は、512×480
画素で構成されており、細胞の直径が４画素程度になる
ように入力系の倍率を調整した。

画像のブロック分割は、１ブロックが８画素×８画素と
なるように行い、式（１）に示した８×８アダマール行
列を用いて、各ブロック毎に２次元アダマール変換を施
した。

得られたアダマール変換係数の内、第３図に示したシー
ケンシー成分に対応する８個のアダマール変換係数を判
別分析のパラメータとして用いた。

画像から生細胞の存在するブロックと存在しないブロ
ックを100ブロックづつ抽出し、これらより、式（３）
のＲ、_１および_２を算出した。ここで、（a₁,a₂…a₈）＝｛R^-1（_１−_２）｝で表される結合
係数a₁を表１に示す。

また、３種類の画像〜を対象として、この結合係数
a_iを用いて実施した識別結果を表２に示す。

この結果、判別関数の結合係数a_iを求めた画像はもとよ
り、他の細胞画像についても80％程度の識別率が得られ
た。

ここで、識別率は、識別率［％］＝（生細胞の有無を正しく判定したブロッ
ク数）／（１画素中の全ブロック数）×100で求めた。

［発明の効果］生細胞を含む画像の適当なサイズのブロック分割と各ブ
ロックの輝度分布をシーケンシー成分に変換するアダマ
ール変換の組み合わせにより、生細胞の特徴を表すシー
ケンシー成分の大きさを容易に測定することができるの
で、複雑なパターン、複雑なバックグランドの画像であ
っても、その中より生細胞を含むブロックを識別するこ
とができる。

また、（イ）アダマール行列が“1"と“−1"だけで構成
されているので、アダマール変換は加減算だけで計算す
ることが出来る。（ロ）アダマール変換は、分割したブ
ロックの数だけ行えば良く、フィルタリング等で必要な
画素毎の処理が不要である。（ハ）アダマール変換係数
の全部を使わなくても、ブロック内の生細胞の有無を判
別することができる。（ニ）判別分析の結合係数は、一
度求めれば、各画像について求める必要がない。

以上の理由により、処理を高速で行え、短時間で大量の
培養細胞の増殖状態をモニターすることができる。

従って、継代培養の時期や抗体産生のチェック時期を迅
速かつ適切に決定でき、同時に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はアダマール変換と判断分析を用いた細胞増殖状
態のモニター方法の処理フロー図、第２図は本発明の細
胞増殖状態のモニター装置のブロック図、第３図は実施
例において各ブロック中の生細胞の有無の判断に用いた
アダマール変換係数に対応するシーケンシー成分を示す
図である。（１）……顕微鏡、（２）……撮像装置、（３）……A/
D変換器、（４）……フレームメモリー、（５）……ブ
ロック分割器、（７）……アダマール変換器、（８）…
…アダマール変換係数メモリー、（９）……係数データ
選択手段、（11）……判別分析手段、（13）……基準値
記憶設定装置、（14）……判別分析結果メモリー、（1
5）……増殖率計算手段、（16）……出力装置

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】培養細胞の状態を顕微鏡に接続された撮像
装置で撮り、その画像をA/D変換器にてデイジタル化
し、次いで該画像を適当な画素数（水平4n×垂直4n:n≧
１整数）からなるブロツクに分割し、各ブロツク毎に２
次元アダマール変換を行った後、判別分析を用いて、各
ブロツク中の生細胞の有無を判別することを特徴とする
細胞増殖状態のモニター方法。
【請求項２】判別分析が、アダマール変換の結果得られ
るアダマール変換係数（4n）個のうちの全部又は一部を
用いる特許請求の範囲第（１）項記載の細胞増殖状態の
モニター方法。
【請求項３】判別分析が、マハラノビス汎距離を用いた
２群判別である範囲第（１）項記載の細胞増殖状態モニ
ター方法。
【請求項４】顕微鏡と、該顕微鏡に接続された撮像装置
と、該撮像装置からの信号をデイジタル信号化するA/D
変換器と、デイジタル化された画像データを記憶する記
憶手段と、画像データを指定された数に分割する画像分
割手段と、分割によって得られる各ブロックの画像デー
タをアダマール変換する変換手段と、アダマール変換後
のアダマール変換係数データを記憶する手段と、記憶さ
れたアダマール変換係数データのうちから指定された一
部又は全部を用いて判別関数の計算を行い、得られた数
値を基準値と比較する判別分析手段と、各ブロツクの判
別結果を記憶する手段と、全画像に対する同一の判別結
果のブロックの集合の割合を計算する演算手段と、計算
された割合を出力する出力手段からなる細胞増殖状態の
モニター装置。
【請求項５】判別分析手段が、アダマール変換の結果得
られる（4n）個のうちの全部又は一部を用いる手段であ
る特許請求の範囲第（４）項記載の細胞増殖状態のモニ
ター装置。
【請求項６】判別分析手段が、マハラノビス汎距離を用
いた２群判別を行う手段である範囲第（４）項記載の細
胞増殖状態モニター装置。