JPH07111432B2 - レーザ磁気免疫測定方法に用いられる検査容器 - Google Patents

レーザ磁気免疫測定方法に用いられる検査容器

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JPH07111432B2
JPH07111432B2 JP10291588A JP10291588A JPH07111432B2 JP H07111432 B2 JPH07111432 B2 JP H07111432B2 JP 10291588 A JP10291588 A JP 10291588A JP 10291588 A JP10291588 A JP 10291588A JP H07111432 B2 JPH07111432 B2 JP H07111432B2
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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は極めて微量の検体から特定の抗体または抗原を
定量的に検出可能なレーザ磁気免疫測定方法に用いて好
適な検査容器に関するものである。
〔従来の技術〕
後天性免疫不全症候群、成人T細胞白血病等のような新
型ウイルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法とし
て、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現
在、世界的規模で推進されている。
従来から知られる一次反応を利用した微量免疫測定方法
としては、ラジオイムノアッセイ(以下、RIA法と記
す)、酵素イムノアッセイ(EIA)、蛍光イムノアッセ
イ法等が既に実用化されている。これらの方法は、それ
ぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加し
た抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体
または抗原の有無を検出する方法である。
RIA法は、標識化されたアイソトープの放射線量を測定
することにより抗原抗体反応に寄与した検体量を定量す
るものであり、ピコグラム程度の超微量測定が可能な現
在唯一の方法である。しかしながら、この方法は放射性
物質を利用するので、特殊設備を必要とし、また、半減
期等による標識効果の減衰等を考慮しなければならない
ので、実施には大きな制約がある。更に、放射性廃棄物
処理が社会問題となっている現状を考慮すると、その実
施は自ずと制限される。
一方、酵素、蛍光体を標識として用いる方法は、抗原抗
体反応に寄与した検体量を、発色や発光を観測すること
により検出する方法であり、RIA法の如き実施上の制約
はない。しかしながら、発色あるいは発光を精密に定量
することは困難であり、検出限界はナノグラム程度であ
る。
また、レーザ光を利用して抗原抗体反応の有無を検出す
る方法として、主に肝臓癌の検出を目的として開発され
たAFP(アルファ・フェトプロテイン)を利用した方法
がある。
この方法は、AFPに対する抗体をプラスチック微粒子に
付加し、抗原抗体反応によってプラスチック粒子が凝集
して生じる質量変化から調べる方法であり、10-10gの
検出感度を達成している。これは、従来のレーザー光を
用いた方法の百倍以上の感度であるが、RIA法に比較す
ると百分の一以下に過ぎない。更に、この方法が水溶液
中における抗原抗体複合物のブラウン運動の変化を利用
しているために、抗体を含む水溶液の温度、揺乱の影響
あるいは水溶液に混在する不純物粒子の影響を極めて受
け易く、これ以上に検出感度を高めることは原理的に望
外のものである。
上述のように、従来の免疫測定手段においては、高い検
出感度を有するRIA法は、放射性物質を使用するため
に、その実施については多くの制約があり、一方、実施
の容易な酵素イムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法
等は感度が低く、精密な定量的測定ができなかった。
そこで、本発明者らは、従来の方法とは原理を異にする
免疫測定方法の研究を行ない、先に、特願昭61-224567
号、特願昭61-252427号、特願昭61-254164号、特願昭62
-22062号、特願昭62-22063号、特願昭62-152791号、特
願昭62-152792号、特願昭62-184902号、特願昭62-26431
9号、特願昭62-267481号としてレーザ磁気免疫測定方法
及び測定装置についての発明を特許出願している。これ
らの新しい免疫測定方法は標識材料として磁性微粒子を
用いる点に特徴があり、アイソトープを用いないでピコ
グラムの超微量検出が可能である。検出方法は検体に照
射したレーザ光の散乱光、透過光、反射光、干渉光、回
折光の何れを検出してもよい。本発明者らは上述の特許
に基づき、磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、初
めてウイルスの検出等を行なった。この新しいレーザ磁
気免疫測定方法は、従来最も検出感度が高いとされてい
るRIA法よりも検出感度が高いことが確認されつつあ
る。例えば、本発明者らが日本ウイルス学会第35回総会
(昭和62年11月 講演番号4011「新しく開発した免疫測
定装置を用いたウイルスの検出実験」)で発表したよう
に、不活性化したインフルエンザウイルスA、B型をウ
イルスのモデルとして用いて、ウイルス検出実験を行な
ったところ、1ml中に1個程度のウイルスが存在する場
合でも検出できた。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は前記の新しい原理のレーザ磁気免疫測定方法の
効果を最大に発揮するための検査容器を提供することに
ある。レーザ磁気免疫測定方法を実施する一つの方法と
して、レーザ光線を上方に開口を有する検査容器に斜め
から入射して、検体からの反射光、干渉光、等を検出す
る方法が有効である。この方法は、ガラスセル等の検査
容器の側面からレーザ光を入射する従来の方法に比べ、
検査容器の傷や付着物の影響を受けないため、S/N比の
高い、超高感度な測定に適している。しかし、その反
面、検体溶液の水面形状が非常に問題になることが分か
った。即ち、上述したEIA法等に用いられる従来のこの
種マイクロプレートの場合、該検査容器は疎水性であっ
て、水に濡れにくいため、水面形状が不定である。その
ため、既存の検査容器を用いた場合、該検査容器の水面
に斜めからレーザ光線を入射すると、反射光の向き及び
反射光量はまったく定まらない。従って、検体からの信
号を検出するための受光器の位置を測定の都度毎に調整
し、光量の補正をする必要があった。
さらに、本発明者らは先に干渉法による測定方法を特願
昭62-184902号「レーザ磁気免疫測定方法及び測定装
置」として発明しているが、干渉の生じるメカニズムを
研究した結果、水面が下向きに凸形状、即ちメニスカス
を形成することが不可欠であることが分かった。かかる
問題を第4図を参照してさらに説明する。
第4図は、従来の疎水性物質から構成された検査容器1
及び傾斜磁界発生装置の断面図である。EIA法等で多用
されている検査容器1は、通常マイクロプレートと称さ
れるアクリル樹脂等のプラスチック製品である。周知の
ように、ほとんどのプラスチックは疎水性であって、水
には濡れにくいため、図に示すように、容器1内の検体
緩衝液2の水面2−2は上に凸の形状をしている。な
お、ガラス製品の場合、ガラス表面の洗浄を完全に行な
わなければ水に濡れにくいから、ガラス製品を検査容器
1として使用した場合も水面2−2の形状は上に凸か、
濡れが一様でなければ、水面の形状は不定である。
この第4図は、レーザ入射光線Lを検査容器1の水面2
−2に斜めから入射させた時の、水面2−2からの反射
光Rの反射方向を模式的に示している。レーザ入射光線
Lは前記検体緩衝液2中の磁性体標識複合体3の磁石4
および磁極片5からなる傾斜磁界発生装置による濃縮位
置よりも充分ビーム径が広い。図において、入射光L1
L2、L3はレーザ光線Lの一部であって、勿論並行光線で
ある。この従来の検査容器1にあっては、水面2−2は
上に凸状となっているので、R1が最も反射角度が大き
く、続いて、R2、R3の順になっている。従って、反射光
は発散することになるから、反射光同士の間では干渉が
起こらない。また、図には示さなかったが、水面が完全
な平面の場合、反射光は平行ビームとなるから、反射光
をスクリーン上で受けると輝度の著しく高いスポットの
みで干渉縞はほとんど観察できない。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、前記課題を解決するためになされたもので、
本発明によれば親水性の内壁を有することを特徴とする
レーザ磁気免疫測定に用いられる検査容器が提供され
る。
本発明の1つの実施形態として、前記内壁が親水性物質
あるいは吸水性物質で被覆されていることが好ましい。
また、別の実施態様として、前記内壁が多数の微小溝に
加工されていることが好ましい。
〔作用〕
第1図は本発明の作用を説明する検査容器1及び傾斜磁
界発生装置の断面図である。本発明の検査容器1は内壁
が親水性物質1−1で構成されているから、水溶性の検
体緩衝液2を検査容器1に注ぐと、検体緩衝液2の水面
2−2は下に凸のメニスカスを形成する。通常、このメ
ニスカスは内壁近傍で見られるものであるが、検査容器
1の直径が小さい場合、検査容器1の中央部まで影響を
及ぼす。この検査容器1は磁石4と磁極片5から成る傾
斜磁界発生装置の中に設置されている。前記磁石4から
出た磁束は磁極片5で集められるので、磁極片5の真下
の水面の磁界が最も高くなっている。従って、液中の磁
性体標識検体複合体3は磁極片5の真下の水面に濃縮さ
れ、その水面の一部は磁極片5に吸引されるので盛り上
っている。この部分が濃縮位置である。このように、傾
斜磁界中で検体を局部的に濃縮することが、本発明者ら
が先に発明したレーザ磁気免疫測定法の特徴である。そ
のためには検査容器1は非磁性体もしくは磁束を局部的
に集中させるのに適した材料で作製される必要がある。
図において、前記同様に入射光L1、L2、L3はレーザ光線
Lの一部であって、勿論並行光線である。本発明の検査
容器1を用いた場合、水面2−2は下に凸状のメニスカ
スを形成しているから、入射光L1の反射光R1が最も低角
度で、続いて、R2、R3の順に反射角度が大きくなってい
る。従って、反射光R1、R2、R3は交差するから、これら
反射光の間で干渉を生じる。この干渉法は特別な参照光
を用いないで、下に凸のメニスカス水面2−2からの反
射光自身の光路差を利用するものである。さらに詳述す
ると、磁極片5の真下の水面にレーザ光を斜めから照射
すると、水面の盛り上がり部分とその周辺部分とでは反
射光の光路差が異なっているから、メニスカス作用で混
合されたこれら反射光同士の間で干渉を起こす。そのた
めに特別な参照光は不要である。
このように、本発明者らが先に発明した干渉法で検体を
高感度検出する方法は、本発明の検査容器の使用で再現
よく実施することが可能となった。
以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述する
が、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発
明の技術的範囲を何等制限するものではない。
〔実施例1〕 第2図(a)(b)は本発明の一実施例を説明する検査
容器6の全体図及び部分拡大図である。検査容器本体は
ポリスチレン製であって、複数個の検体収容部6aが形成
されている。これら検体収容部6aは直径12mm、深さ5mm
の円筒形状であって、その内壁にはピッチ0.2mmの楔状
の溝7が円筒軸に平行して多数設けられている。また、
この検体収容部6a内面には親水性を向上するために、60
Wの低圧水銀灯のもとで、2時間、紫外線照射されてい
る。この紫外線照射処理によって、水との接触角は85度
から20度に低下し、親水性が著しく改善された。また、
円筒軸に平行した前記の微小な溝7の加工によって、毛
細管現象が生じた。燐酸緩衝液(PBS)を本発明の検査
容器6の検体収容部6aに注入したところ、円筒軸に対称
な下に凸のメニスカスが、再現よく形成できた。
表面を変性する方法としては、紫外線照射の他、前記検
体収容部6a内壁あるいは検査容器6の表面全体に、γ線
照射やプラズマ処理によって、COOH基、SO3基、NH2基、
等の親水基をプラスチック表面へ導入する親水性付与処
理が適用できる。また、前記検体収容部6a内壁の微小溝
7の加工の他、梨地(不定形微小溝)状の粗面に加工す
ることによっても濡れ性の改善に役立つ。
〔実施例2〕 第3図は本発明の他の実施例を説明する検査容器8の拡
大図である。検査容器本体はアクリル系樹脂製であっ
て、その中に直径15mm、深さ7mmの円柱状凹部形状の検
体収容部8aが設けられている。この検体収容部8aの内壁
には3mmの幅でポリビニルアルコールからなる吸水性物
質9が約0.2mmの厚さで被覆されている。この吸水性物
質9による皮膜を作製する方法としては、例えは、ゲル
状のポリビニールアルコールを塗布し、乾燥させること
によって作製できる。燐酸緩衝液(PBS)を本発明の検
査容器8の検体収容部8aに注入したところ、円筒軸に対
称な下に凸のメニスカスが、再現よく形成できた。
なお、前記吸水性皮膜は少なくとも内壁上部の水面近傍
にあれば効果が発揮できるが、内壁全面を覆っていても
勿論差し支えない。
前記吸水性物質としては、ポリビニールアルコールの
他、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ポリアク
リルアミド、アミロース、アラビアゴム等の公知の水溶
性高分子や親水性物質が適用できる。
〔実施例3〕 厚さ2mmの板ガラスに直径16mm、深さ1.5mmの窪み状の検
体収容部を有するマイクロウエルプレートの表面をシラ
ンカップリング処理した後、平均粒径1μmのコロイド
シリカを前記検体収容部の内壁に吸着させて、本発明の
検査容器得た。燐酸緩衝液(PBS)を本発明の検査容器
の検体収容部に注入したところ、円筒軸に対称な下に凸
のメニスカスが、再現よく形成できた。
本発明の変形例として、ガラス製あるいはプラスチック
製のマイクロウエルプレートに水溶液との濡れ性を改善
する界面活性剤を前記内壁に吸着させる方法も好まし
い。
〔発明の効果〕
以上詳述のように、本発明に従うレーザ磁気免疫測定に
用いられる検査容器は、水溶性液体に対して、その検体
収容部の内壁が濡れやすいように構成されているから、
検体を該検体収容部に注入すると水面が下向きに凸形状
のメニスカスを再現よく形成する。そのため、この水面
にレーザ光線を斜めから入射すると、水面からの反射光
の向き及び反射光量は常に一定になる。従って、反射光
の受光器の位置を測定の都度調整する必要はなくなり、
測定データの定量性、再現性の向上に著しい効果があ
る。さらに、上述の干渉法で検体を定量することが、本
発明の検査容器を使用することによって、初めて可能に
なった。
このように、本発明の検査容器は、レーザ磁気免疫測定
装置の性能を発揮するためには、不可欠のものである。
レーザ磁気免疫測定方法は上述したウイルス等の感染症
や癌の早期診断はもとより、ペプチドホルモン等の種々
のホルモンあるいは種々の酵素、ビタミン、薬剤などの
測定にも応用することが可能である。従って、従来は、
限定された施設でRIA法によらなければ実施できなかっ
た極微量の生理活性物質や免疫の測定を、RIA法よりも
優れた検出感度で一般的な環境で広く実施できる。この
ように、本発明が医学・医療の分野で果たす効果は計り
知れない。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の作用を説明する検査容器及び傾斜磁界
発生装置の断面図、第2図は本発明の一実施例を説明す
る検査容器の全体図及び部分拡大図、第3図は本発明の
一実施例を説明する検査容器の拡大図、第4図は比較対
照であって、従来の疎水性物質から構成された検査容器
及び傾斜磁界発生装置の断面図である。 1……検体容器、1−1……親水性物質、2……検体緩
衝液、2−2……水面、3……磁性体標識検体複合体、
4……磁石、5……磁極片、6,8……検査容器、6a,8a…
…検体収容部、7……微小溝、9……吸水性物質、L…
…レーザ入射光、R……反射光。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】所定の抗原あるいは抗体に磁性体微粒子を
    標識として付加した磁性体標識体と検体たる抗体あるい
    は抗原とを抗原抗体反応させる第1工程と、前記第1工
    程後の磁性体標識体と検体との複合体である磁性体標識
    検体複合体を含む溶液に磁界を作用させてレーザ光照射
    領域に前記磁性体標識検体複合体を誘導・濃縮させる第
    2工程と、該磁性体標識検体複合体を含む溶液の液面に
    レーザ光を反射させ、その反射光を検出する第3工程
    と、を少なくとも含むレーザ磁気免疫測定方法に用いら
    れる前記磁性体標識検体複合体を含む溶液を収容する検
    査容器であって、 容器内壁が親水性であることを特徴とするレーザ磁気免
    疫測定方法に用いられる検査容器。
  2. 【請求項2】前記容器内壁が親水性物質により被覆され
    ることによって親水性を付与されていることを特徴とす
    る請求項1記載のレーザ磁気免疫測定方法に用いられる
    検査容器。
  3. 【請求項3】前記容器内壁が吸水性物質により被覆され
    ることによって親水性を付与されていることを特徴とす
    る請求項1記載のレーザ磁気免疫測定方法に用いられる
    検査容器。
  4. 【請求項4】前記容器内壁が該内壁面に多数の微小溝が
    形成されることによって親水性を付与されていることを
    特徴とする請求項1記載のレーザ磁気免疫測定方法に用
    いられる検査容器。
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