JPH0699A - 核酸の検出法 - Google Patents
核酸の検出法Info
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- JPH0699A JPH0699A JP4159349A JP15934992A JPH0699A JP H0699 A JPH0699 A JP H0699A JP 4159349 A JP4159349 A JP 4159349A JP 15934992 A JP15934992 A JP 15934992A JP H0699 A JPH0699 A JP H0699A
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- nucleic acid
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- polyamine
- precursor
- dna
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 容易、安全、確実、簡便な核酸検出法を提供
すること。 【構成】 核酸を付着または含有している疑のある固形
担体に、測定可能なシグナルを発生し得る標識またはそ
の前駆体を結合させたポリアミンを接触させて、核酸と
ポリアミンとの間で複合体を形成させ、前駆体を用いた
場合は標識に変換し、その前または後に複合体を形成し
ていないポリアミンを除去し、その後、標識を検索する
ことを特徴とする、核酸の検出法。
すること。 【構成】 核酸を付着または含有している疑のある固形
担体に、測定可能なシグナルを発生し得る標識またはそ
の前駆体を結合させたポリアミンを接触させて、核酸と
ポリアミンとの間で複合体を形成させ、前駆体を用いた
場合は標識に変換し、その前または後に複合体を形成し
ていないポリアミンを除去し、その後、標識を検索する
ことを特徴とする、核酸の検出法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ポリアミンが核酸と
静電気的に結合する性質を利用した核酸の検出法に関す
るものである。
静電気的に結合する性質を利用した核酸の検出法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】核酸
の検出法としては、従来、臭化エチジウムを用いる方法
が広く行なわれている。この方法は、核酸に臭化エチジ
ウムを複合(インターカレーション)させ、その際発せら
れる蛍光によって核酸の位置を知る方法である。しか
し、この方法によるときは明所では蛍光を確認できない
ため、暗所で紫外線照射下に撮影した像を現物と対照し
て核酸の位置を知らねばならず、不便であった。また、
臭化エチジウムは強い発がん性を有するので[例えば
「遺伝子操作マニュアル」(講談社サイエンティフィッ
ク)第２頁第１８−２１行]、取扱いが危険であった。そ
のほかの方法として、アニオン性金コロイドを用いる方
法およびカチオン性カコジル酸鉄コロイドを用いる方法
[ジーン・アナリシス・テクニックス(Ｇene Ａnal．Ｔ
echn．)１９８６年、１−５頁]が知られている。しか
し、これらは何れも感度が悪く、また金コロイドによる
方法は背景染色であるから識別が容易でなく、さらに染
色後のハイブリダイゼーションが影響を受けるという欠
点があり、鉄コロイドによる方法はハイブリダイゼーシ
ョン後の染色ができないという欠点があった。したがっ
て、上記のような欠点のない、容易、安全、確実、簡便
な核酸検出法の開発が望まれていた。
の検出法としては、従来、臭化エチジウムを用いる方法
が広く行なわれている。この方法は、核酸に臭化エチジ
ウムを複合(インターカレーション)させ、その際発せら
れる蛍光によって核酸の位置を知る方法である。しか
し、この方法によるときは明所では蛍光を確認できない
ため、暗所で紫外線照射下に撮影した像を現物と対照し
て核酸の位置を知らねばならず、不便であった。また、
臭化エチジウムは強い発がん性を有するので[例えば
「遺伝子操作マニュアル」(講談社サイエンティフィッ
ク)第２頁第１８−２１行]、取扱いが危険であった。そ
のほかの方法として、アニオン性金コロイドを用いる方
法およびカチオン性カコジル酸鉄コロイドを用いる方法
[ジーン・アナリシス・テクニックス(Ｇene Ａnal．Ｔ
echn．)１９８６年、１−５頁]が知られている。しか
し、これらは何れも感度が悪く、また金コロイドによる
方法は背景染色であるから識別が容易でなく、さらに染
色後のハイブリダイゼーションが影響を受けるという欠
点があり、鉄コロイドによる方法はハイブリダイゼーシ
ョン後の染色ができないという欠点があった。したがっ
て、上記のような欠点のない、容易、安全、確実、簡便
な核酸検出法の開発が望まれていた。
【０００３】ポリアミンがＤＮＡに結合し、またＲＮＡ
にも親和性を有することは既に知られている[バイオケ
ミカル・ジャーナル（Biochem.J.）103巻,811-815頁(19
67)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Boil.）24巻,113-122頁(1967)、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Boil.）42
巻,363-373頁(1969)、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（J.Mol.Boil.）121巻,327-337頁(1978)
等]。また、ポリアミンで修飾した蛋白質相補的ポリヌ
クレオチドと共有結合させてなるプローブを、標的ポリ
ヌクレオチドの検出に用いることも公知である（特表昭
６０−５０１４８８号、その公告公報である特公平２−
５９７２０号およびその分割出願である特開平１−１２
４４００号）。しかし、標識したポリアミンを核酸に複
合させることによる核酸検出法は知られていない。
にも親和性を有することは既に知られている[バイオケ
ミカル・ジャーナル（Biochem.J.）103巻,811-815頁(19
67)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Boil.）24巻,113-122頁(1967)、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Boil.）42
巻,363-373頁(1969)、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（J.Mol.Boil.）121巻,327-337頁(1978)
等]。また、ポリアミンで修飾した蛋白質相補的ポリヌ
クレオチドと共有結合させてなるプローブを、標的ポリ
ヌクレオチドの検出に用いることも公知である（特表昭
６０−５０１４８８号、その公告公報である特公平２−
５９７２０号およびその分割出願である特開平１−１２
４４００号）。しかし、標識したポリアミンを核酸に複
合させることによる核酸検出法は知られていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この発明は、(１)核酸を
付着または含有している疑のある固形担体に、測定可能
なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体を結合さ
せたポリアミンを接触させて、核酸とポリアミンとの間
で複合体を形成させ、前駆体を用いた場合は標識に変換
し、その前または後に複合体を形成していないポリアミ
ンを除去し、その後、標識を検索することを特徴とす
る、核酸の検出法、(２)標的核酸を付着または含有して
いる疑のある固形担体に、(イ)測定可能なシグナルを発
生し得る標識またはその前駆体を結合させた標的核酸に
ハイブリダイズし得るプローブをハイブリダイゼーショ
ン条件下で接触させて、ハイブリッドを形成させ、前駆
体を用いた場合は標識に変換し、その前または後にハイ
ブリッドを形成していないプローブを除去し、その後、
標識を検索することを含む第１の検出操作、および(ロ)
測定可能なシグナルを発生し得る別の標識またはその前
駆体を結合させたポリアミンを接触させて、核酸とポリ
アミンとの間で複合体を形成させ、前駆体を用いた場合
は標識に変換し、その前または後に複合体を形成してい
ないポリアミンを除去し、その後、標識を検索すること
を含む第２の検出操作、を組合わせて任意の順序で実施
することを特徴とする、標的核酸とそれ以外の核酸の識
別検出法および(３)(イ)酵素で標識したポリアミン、お
よび(ロ)酵素作用によりシグナルを発生する色原体を含
む、核酸検出用キットを提供するものである。
付着または含有している疑のある固形担体に、測定可能
なシグナルを発生し得る標識またはその前駆体を結合さ
せたポリアミンを接触させて、核酸とポリアミンとの間
で複合体を形成させ、前駆体を用いた場合は標識に変換
し、その前または後に複合体を形成していないポリアミ
ンを除去し、その後、標識を検索することを特徴とす
る、核酸の検出法、(２)標的核酸を付着または含有して
いる疑のある固形担体に、(イ)測定可能なシグナルを発
生し得る標識またはその前駆体を結合させた標的核酸に
ハイブリダイズし得るプローブをハイブリダイゼーショ
ン条件下で接触させて、ハイブリッドを形成させ、前駆
体を用いた場合は標識に変換し、その前または後にハイ
ブリッドを形成していないプローブを除去し、その後、
標識を検索することを含む第１の検出操作、および(ロ)
測定可能なシグナルを発生し得る別の標識またはその前
駆体を結合させたポリアミンを接触させて、核酸とポリ
アミンとの間で複合体を形成させ、前駆体を用いた場合
は標識に変換し、その前または後に複合体を形成してい
ないポリアミンを除去し、その後、標識を検索すること
を含む第２の検出操作、を組合わせて任意の順序で実施
することを特徴とする、標的核酸とそれ以外の核酸の識
別検出法および(３)(イ)酵素で標識したポリアミン、お
よび(ロ)酵素作用によりシグナルを発生する色原体を含
む、核酸検出用キットを提供するものである。
【０００５】この発明で使用する用語について説明する
と次の通りである。「核酸」は、プリンまたはピリミジ
ン塩基、ペントースおよびりん酸が結合してなるヌクレ
オチドを基本単位とし、りん酸のエステル結合によって
重合したポリマーである。塩基としては、アデニン、シ
トシン、グアニン、チミン、ウラシルおよびそれらの修
飾塩基が含まれる。また、核酸には糖部分の違いによっ
てＤＮＡとＲＮＡがあり、さらに１本鎖、２本鎖等およ
び立体構造の違いがある。「固形担体」は、核酸の分離
または検出に用いられる薄板、シート、ストリップ、ス
ラブ、フィルム、メンブラン等を包含する。代表的なも
のは、アガロースゲル、ナイロン膜、濾紙、ニトロセル
ロース膜等である。
と次の通りである。「核酸」は、プリンまたはピリミジ
ン塩基、ペントースおよびりん酸が結合してなるヌクレ
オチドを基本単位とし、りん酸のエステル結合によって
重合したポリマーである。塩基としては、アデニン、シ
トシン、グアニン、チミン、ウラシルおよびそれらの修
飾塩基が含まれる。また、核酸には糖部分の違いによっ
てＤＮＡとＲＮＡがあり、さらに１本鎖、２本鎖等およ
び立体構造の違いがある。「固形担体」は、核酸の分離
または検出に用いられる薄板、シート、ストリップ、ス
ラブ、フィルム、メンブラン等を包含する。代表的なも
のは、アガロースゲル、ナイロン膜、濾紙、ニトロセル
ロース膜等である。
【０００６】「標識」は、測定可能なシグナルを発生す
る物質であり、酵素(基質との組合わせとして)、スピン
化合物、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、吸光物
質等が含まれる。好ましい標識は酵素である。酵素とし
ては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコ
ース−６−りん酸脱水素酵素等が含まれる。酵素活性の
測定法には、吸光度法、蛍光法および化学発光法があ
る。例えば、ペルオキシダーゼは色原体としては２,２'
−アジノジ(３−エチルベンズチアゾリン)−６'−スル
ホン酸(ＡＢＴＳ)のような基質を用い、生じた色素を吸
光度法で測定する。グルコースオキシダーゼはグルコー
スを基質として過酸化水素を生ずるので、ペルオキシダ
ーゼと共役させて上と同様に測定できる。β−ガラクト
シダーゼはo−ニトロフェニル−β−Ｄ−カラクトシド
を基質として測定できる。蛍光法としては、例えばペル
オキシダーゼはp−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を
基質として、β−ガラクトシダーゼはフルオレスセイン
−β−Ｄ−ガラクトシドまたは４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として、またホスフ
ァターゼはウンベリフェリルりん酸またはブロモクロロ
インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム
を基質として測定できる。化学発光法としては、例えば
ペルオキシダーゼはルミノールと過酸化水素を基質とし
て測定できる。標識(例えば酵素)をポリアミンに結合さ
せるには、例えばベンゾキノン(キンヒドロン)、ビス
[２−(スクシンイミドカルボニルオキシ)エチル]スルホ
ン(ＢＳＯＣＯＥＳ)、ビス(スルホスクシンイミジル)ス
ベラート(ＢＳ３)、１,２−ジフルオロ−２,４−ジニト
ロベンゼン(ＤＦＤＮＢ)、４,４'−ジイソチオシアノ−
２,２'−ジスルホスチルベン、ジナトリウム塩(ＣＤＩ
ＤＳ)、アジピンイミド酸ジメチル・ジ塩酸塩、Ｎ−(γ
−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド(ＧＭＢ
Ｓ)、Ｎ−(４−アジドフェニルチオ)フタルイミド(ＡＰ
ＴＰ)、Ｎ−スクシンイミジル−６−(４'−アジド−フ
ェニル)−１,３'−ジチオプロピオナート(ＳＡＤＰ)、
ピリジンジスルフィド、チオフタルイミド等の架橋試薬
を用いる。「標識前駆体」は、例えば阻害物質でブロック
された標識のように、標識に転換され得る物質である。
「シグナル」は、可視光、蛍光、放射能、その他の電磁波
等である。測定値をそれを発生した物質の量と関連づけ
ることができるものが好ましい。「標識の探索」は、上記
のようなシグナルを肉体的または機械的手段で検出する
ことを含む。
る物質であり、酵素(基質との組合わせとして)、スピン
化合物、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、吸光物
質等が含まれる。好ましい標識は酵素である。酵素とし
ては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコ
ース−６−りん酸脱水素酵素等が含まれる。酵素活性の
測定法には、吸光度法、蛍光法および化学発光法があ
る。例えば、ペルオキシダーゼは色原体としては２,２'
−アジノジ(３−エチルベンズチアゾリン)−６'−スル
ホン酸(ＡＢＴＳ)のような基質を用い、生じた色素を吸
光度法で測定する。グルコースオキシダーゼはグルコー
スを基質として過酸化水素を生ずるので、ペルオキシダ
ーゼと共役させて上と同様に測定できる。β−ガラクト
シダーゼはo−ニトロフェニル−β−Ｄ−カラクトシド
を基質として測定できる。蛍光法としては、例えばペル
オキシダーゼはp−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を
基質として、β−ガラクトシダーゼはフルオレスセイン
−β−Ｄ−ガラクトシドまたは４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として、またホスフ
ァターゼはウンベリフェリルりん酸またはブロモクロロ
インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム
を基質として測定できる。化学発光法としては、例えば
ペルオキシダーゼはルミノールと過酸化水素を基質とし
て測定できる。標識(例えば酵素)をポリアミンに結合さ
せるには、例えばベンゾキノン(キンヒドロン)、ビス
[２−(スクシンイミドカルボニルオキシ)エチル]スルホ
ン(ＢＳＯＣＯＥＳ)、ビス(スルホスクシンイミジル)ス
ベラート(ＢＳ３)、１,２−ジフルオロ−２,４−ジニト
ロベンゼン(ＤＦＤＮＢ)、４,４'−ジイソチオシアノ−
２,２'−ジスルホスチルベン、ジナトリウム塩(ＣＤＩ
ＤＳ)、アジピンイミド酸ジメチル・ジ塩酸塩、Ｎ−(γ
−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド(ＧＭＢ
Ｓ)、Ｎ−(４−アジドフェニルチオ)フタルイミド(ＡＰ
ＴＰ)、Ｎ−スクシンイミジル−６−(４'−アジド−フ
ェニル)−１,３'−ジチオプロピオナート(ＳＡＤＰ)、
ピリジンジスルフィド、チオフタルイミド等の架橋試薬
を用いる。「標識前駆体」は、例えば阻害物質でブロック
された標識のように、標識に転換され得る物質である。
「シグナル」は、可視光、蛍光、放射能、その他の電磁波
等である。測定値をそれを発生した物質の量と関連づけ
ることができるものが好ましい。「標識の探索」は、上記
のようなシグナルを肉体的または機械的手段で検出する
ことを含む。
【０００７】「ポリアミン」は、第１級アミノ基を２個以
上有する脂肪族骨格の化合物であり、天然(生体)アミン
および合成ポリマーが含まれる。通常炭素原子数３〜５
０、好ましくは６〜１５または２０程度の脂肪族鎖の両
端に第１級アミノ基があり、鎖がイミノ基で中断される
ことがあり得る。代表的な天然ポリアミンは、１,３−
ジアミノプロパン、プトレツシン、カダベリン、ノルス
ペルミジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノ
プロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモス
ペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミ
ジン、Ｎ,Ｎ'−ビス(アミノプロピル)カダベリン、カル
ドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミ
ン等である。代表的な合成ポリアミンには、ジエチレン
トリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレン
ペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサメチレ
ンジアミン、ポリエチレンイミン(平均分子量約１０,０
００−約２００,０００、好ましくは約２０,０００−約
１００,０００、例えば約５０,０００−約６０,０００
のもの、例えばＢＡＳＦ社のポリミンＧ３５)等が含ま
れる。
上有する脂肪族骨格の化合物であり、天然(生体)アミン
および合成ポリマーが含まれる。通常炭素原子数３〜５
０、好ましくは６〜１５または２０程度の脂肪族鎖の両
端に第１級アミノ基があり、鎖がイミノ基で中断される
ことがあり得る。代表的な天然ポリアミンは、１,３−
ジアミノプロパン、プトレツシン、カダベリン、ノルス
ペルミジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノ
プロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモス
ペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミ
ジン、Ｎ,Ｎ'−ビス(アミノプロピル)カダベリン、カル
ドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミ
ン等である。代表的な合成ポリアミンには、ジエチレン
トリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレン
ペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサメチレ
ンジアミン、ポリエチレンイミン(平均分子量約１０,０
００−約２００,０００、好ましくは約２０,０００−約
１００,０００、例えば約５０,０００−約６０,０００
のもの、例えばＢＡＳＦ社のポリミンＧ３５)等が含ま
れる。
【０００８】「複合」または「複合体」は、静電的および／
または物理的結合または結合物を意味し、共有結合また
は結合物を意味しない。通常、複合は可逆的であり、容
易に解離させることができる。「ハイブリダイズ」または
「ハイブリダイゼーション」とは、２本の１本鎖ポリヌク
レオチドが相補的またはほぼ(例えば７０％以上、好ま
しくは８０または８５％以上、特に９０または９５％以
上)相補的である場合に、結合して２本鎖を形成するこ
とをいう。「ハイブリダイゼーション条件下」とは、ハイ
ブリダイズし得るポリヌクレオチドがハイブリッドを形
成する条件をいう。一般に、この条件は、温度として約
７０℃以下、好ましくは約６０℃以下、通常、約４０−
５５℃を含む。時間は短時間で充分である。「標的」は、
関心の対象であることを表わす。「プローブ」は、標的Ｄ
ＮＡまたはその一部分と相補性が高いＤＮＡであり、通
常、標的ＤＮＡより短く、約５−５０塩基、好ましくは
約１０−４０塩基、例えば約２０−３０塩基からなる。
または物理的結合または結合物を意味し、共有結合また
は結合物を意味しない。通常、複合は可逆的であり、容
易に解離させることができる。「ハイブリダイズ」または
「ハイブリダイゼーション」とは、２本の１本鎖ポリヌク
レオチドが相補的またはほぼ(例えば７０％以上、好ま
しくは８０または８５％以上、特に９０または９５％以
上)相補的である場合に、結合して２本鎖を形成するこ
とをいう。「ハイブリダイゼーション条件下」とは、ハイ
ブリダイズし得るポリヌクレオチドがハイブリッドを形
成する条件をいう。一般に、この条件は、温度として約
７０℃以下、好ましくは約６０℃以下、通常、約４０−
５５℃を含む。時間は短時間で充分である。「標的」は、
関心の対象であることを表わす。「プローブ」は、標的Ｄ
ＮＡまたはその一部分と相補性が高いＤＮＡであり、通
常、標的ＤＮＡより短く、約５−５０塩基、好ましくは
約１０−４０塩基、例えば約２０−３０塩基からなる。
【０００９】代表的な実施方法を概説すると次の通りで
ある。ベンゾキノンを用いる酵素とポリアミンの結合を
例にとると、反応は、下記反応式に従って進行すると考
えられている。
ある。ベンゾキノンを用いる酵素とポリアミンの結合を
例にとると、反応は、下記反応式に従って進行すると考
えられている。
【化１】 [上式中、ＥＮＺは酵素からアミノ基を除いた残基、Ｐ
Ａはポリアミンからアミノ基を除いた残基、Ｘは第１級
または第２級アミノ基である]
Ａはポリアミンからアミノ基を除いた残基、Ｘは第１級
または第２級アミノ基である]
【００１０】この反応は、例えば次のように行なわれ
る。透析のような手段で精製した酵素(約１５０部)にベ
ンゾキノン(約１部)を加え、好ましくは僅かに加温して
反応させるとワイン赤色の反応液となる。これをゲル濾
過等の方法でクロマトグラフィー的に分離すると紫色、
黄色およびワイン赤色のフラクションに分かれる。ワイ
ン赤色のフラクションをとり、弱塩基の存在下にポリア
ミン(酵素の数分の１量)を僅かな加温下に反応させ、適
宜精製すると酵素標識したポリアミンが得られる。
る。透析のような手段で精製した酵素(約１５０部)にベ
ンゾキノン(約１部)を加え、好ましくは僅かに加温して
反応させるとワイン赤色の反応液となる。これをゲル濾
過等の方法でクロマトグラフィー的に分離すると紫色、
黄色およびワイン赤色のフラクションに分かれる。ワイ
ン赤色のフラクションをとり、弱塩基の存在下にポリア
ミン(酵素の数分の１量)を僅かな加温下に反応させ、適
宜精製すると酵素標識したポリアミンが得られる。
【００１１】核酸の検出は、例えば次のようにして行う
ことができる。 (イ)核酸試料をメンブランにドットスポットするか、ま
たはアガロースゲル電気泳動後メンブランにエレクトロ
トランスファーし、ベーキングして固定する。緩衝液に
入れたうし血清アルブミンで処理後、標識または前駆体
を結合したポリアミンを加えて反応させる。洗浄後、標
識前駆体の場合は標識に変換し、検索する。 (ロ)ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動に付
し、サザンブロッティングする。放射能標識したプロー
ブを用いて、加温下にプレハイブリダイゼーション後、
ハイブリダイゼーションを行なう。洗浄後、Ｘ線フィル
ムでＤＮＡの位置を調べる。その後、標識または前駆体
を結合したポリアミンを反応させ、適宜発色させて検索
する。 (ハ)ＤＮＡフラグメントをドットブロッティングによる
かまたはアガロースゲル電気泳動後のサザンブロッティ
ングによりメンブランに固定し、プレハイブリダイゼー
ション後Ｂio−ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼ
ーションを行なう。洗浄、ブロック後、酵素標識したス
トレプトアビジンを反応させ、洗浄、プレインキュベー
ション後さらに別の酵素で標識したポリアミンを反応さ
せる。洗浄後、それぞれの酵素の発色処理に付すると、
２色の発色により、ハイブリダイズしたＤＮＡとハイブ
リダイズしないＤＮＡが異なる色に発色した像が得られ
る。例えば、アルカリホスファターゼ／ＢＣＩＰ−ＮＢ
Ｔ系は紫、ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ系は褐色に発色す
る。この方法において、プローブとポリアミンの処理順
序は逆にすることもできる。
ことができる。 (イ)核酸試料をメンブランにドットスポットするか、ま
たはアガロースゲル電気泳動後メンブランにエレクトロ
トランスファーし、ベーキングして固定する。緩衝液に
入れたうし血清アルブミンで処理後、標識または前駆体
を結合したポリアミンを加えて反応させる。洗浄後、標
識前駆体の場合は標識に変換し、検索する。 (ロ)ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動に付
し、サザンブロッティングする。放射能標識したプロー
ブを用いて、加温下にプレハイブリダイゼーション後、
ハイブリダイゼーションを行なう。洗浄後、Ｘ線フィル
ムでＤＮＡの位置を調べる。その後、標識または前駆体
を結合したポリアミンを反応させ、適宜発色させて検索
する。 (ハ)ＤＮＡフラグメントをドットブロッティングによる
かまたはアガロースゲル電気泳動後のサザンブロッティ
ングによりメンブランに固定し、プレハイブリダイゼー
ション後Ｂio−ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼ
ーションを行なう。洗浄、ブロック後、酵素標識したス
トレプトアビジンを反応させ、洗浄、プレインキュベー
ション後さらに別の酵素で標識したポリアミンを反応さ
せる。洗浄後、それぞれの酵素の発色処理に付すると、
２色の発色により、ハイブリダイズしたＤＮＡとハイブ
リダイズしないＤＮＡが異なる色に発色した像が得られ
る。例えば、アルカリホスファターゼ／ＢＣＩＰ−ＮＢ
Ｔ系は紫、ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ系は褐色に発色す
る。この方法において、プローブとポリアミンの処理順
序は逆にすることもできる。
【００１２】上記のようにして発色処理したものは、Ｘ
線フィルムとしてではなくメンブランそのものが発色し
ているので、直接メンブラン上に核酸を確認することが
できる。また、ＰＣＲの場合、同程度の分子量をもつが
配列が異なる増幅物を、ハイブリダイゼーションにより
区別することができる。この発明の方法は、危険な試薬
を用いる必要がなく、高感度(例えば、ＤＮＡは数ピコ
グラム、ＲＮＡは数十ピコグラム)であり、しかも、操
作が容易であるという利点を有する。なお、この発明の
実施に必要な試薬類をキットにしておくと、操作がさら
に容易となる。
線フィルムとしてではなくメンブランそのものが発色し
ているので、直接メンブラン上に核酸を確認することが
できる。また、ＰＣＲの場合、同程度の分子量をもつが
配列が異なる増幅物を、ハイブリダイゼーションにより
区別することができる。この発明の方法は、危険な試薬
を用いる必要がなく、高感度(例えば、ＤＮＡは数ピコ
グラム、ＲＮＡは数十ピコグラム)であり、しかも、操
作が容易であるという利点を有する。なお、この発明の
実施に必要な試薬類をキットにしておくと、操作がさら
に容易となる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例によりこの発明の具体的実施態
様を説明する。 実施例１ (ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ標識
ポリエチレンイミンの製造)アルカリホスファターゼ(Ｃ
ＩＰ、ベーリンガー・マイハイム社、グレードＩ)０．
８１ml／４．０５mg／７５００単位または西洋わさびペ
ルオキシダーゼ(ベーリンガー・マンハイム社製)を、４
０℃で一夜、０．１Ｍりん酸緩衝液で透析し、イムノケ
ミストリー(Ｉmmuno Ｃhemistry)１４巻７６７−７７４
頁(１９７７年)記載の方法にしたがって、p−ベンゾキ
ノン(１２０μl／３０mg／エタノール)と遮光下３７℃
で６０分間反応させ、セファデックスＧ−２５でゲル濾
過後、ワイン赤色のフラクション(２．７ml)を分取し
た。これに３００μlの１Ｍ−ＮaＨＣＯ3(pＨ９．０)、
３０μlのポリエチレンイミン(エポミン)を加え、よく
混合した。これを３７℃で遮光下に一夜反応させた後、
５mＭりん酸緩衝液(pＨ６．８)で透析して酵素・ポリエ
チレンイミン・コンジュゲートを得た。本品は４℃で１
年以上安定であった。
様を説明する。 実施例１ (ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ標識
ポリエチレンイミンの製造)アルカリホスファターゼ(Ｃ
ＩＰ、ベーリンガー・マイハイム社、グレードＩ)０．
８１ml／４．０５mg／７５００単位または西洋わさびペ
ルオキシダーゼ(ベーリンガー・マンハイム社製)を、４
０℃で一夜、０．１Ｍりん酸緩衝液で透析し、イムノケ
ミストリー(Ｉmmuno Ｃhemistry)１４巻７６７−７７４
頁(１９７７年)記載の方法にしたがって、p−ベンゾキ
ノン(１２０μl／３０mg／エタノール)と遮光下３７℃
で６０分間反応させ、セファデックスＧ−２５でゲル濾
過後、ワイン赤色のフラクション(２．７ml)を分取し
た。これに３００μlの１Ｍ−ＮaＨＣＯ3(pＨ９．０)、
３０μlのポリエチレンイミン(エポミン)を加え、よく
混合した。これを３７℃で遮光下に一夜反応させた後、
５mＭりん酸緩衝液(pＨ６．８)で透析して酵素・ポリエ
チレンイミン・コンジュゲートを得た。本品は４℃で１
年以上安定であった。
【００１４】(メンブラン上の核酸のブロッティング)
「モレキュラー・クローニング」(“Ｍolecular Ｃlonin
g", １９８２年、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー)記載の方法に従って、ナイロンメンブラン
(ポール社製Ｂiodyne Ａ)上に変性したλＨind ＩＩＩ
ＤＮＡまたはエシエリキア・コリ(Ｅ．coli)Ｋ−１２ r
ＲＮＡをドットブロッティングした。また、ベクター p
ＢＲ３２２のＨind ＩＩＩ 部位にランダムクローニン
グしたスタフィロコッカス・アウレウス(Ｓt．aureus)
ゲノムＤＮＡのクローンを、定法により増幅、抽出した
後、Ｈind ＩＩＩで処理した。試料を１％アガロースゲ
ル電気泳動で分離後、メンブラン上にエレクトロブロッ
ティングした。(４０Ｖ，４時間）。同様に、λＨind
ＩＩＩ ＤＮＡもブロッティングした。これらのＤＮＡ
またはＲＮＡ試料はベーキング(８０℃、２時間)するこ
とにより、メンブラン上に固定した。
「モレキュラー・クローニング」(“Ｍolecular Ｃlonin
g", １９８２年、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー)記載の方法に従って、ナイロンメンブラン
(ポール社製Ｂiodyne Ａ)上に変性したλＨind ＩＩＩ
ＤＮＡまたはエシエリキア・コリ(Ｅ．coli)Ｋ−１２ r
ＲＮＡをドットブロッティングした。また、ベクター p
ＢＲ３２２のＨind ＩＩＩ 部位にランダムクローニン
グしたスタフィロコッカス・アウレウス(Ｓt．aureus)
ゲノムＤＮＡのクローンを、定法により増幅、抽出した
後、Ｈind ＩＩＩで処理した。試料を１％アガロースゲ
ル電気泳動で分離後、メンブラン上にエレクトロブロッ
ティングした。(４０Ｖ，４時間）。同様に、λＨind
ＩＩＩ ＤＮＡもブロッティングした。これらのＤＮＡ
またはＲＮＡ試料はベーキング(８０℃、２時間)するこ
とにより、メンブラン上に固定した。
【００１５】(メンブラン上にブロットした核酸の検出)
固定されたＤＮＡまたはＲＮＡを含むメンブランを５m
Ｍりん酸緩衝液−１％うし血清アルブミン(ＢＳＡ、シ
グマ社、フラクションＶ)に浸し、室温で６０分間イン
キュベートした。次に、アルカリホスファターゼ(また
はペルオキシダーゼ)標識ポリエチレンイミンを１００
μl／２０mlの割合で加え、３７℃で１２０分間インキ
ュベートした。メンブランを５mＭりん酸緩衝液−１％
ＢＳＡ−０．１％ツイーン２０で１０分間づつ３回洗浄
し、０．１ＭトリスＨＣl(pＨ９．５)−１０mＭ−ＭgＣ
l2でリンスした。ブロモクロロインドリルホスフェート
(ＢＣＩＰ)７５mg／ml ０.１ＭトリスＨＣｌ（pＨ９.
５）−１０mＭ−ＭgＣl2 ２０mlおよびニトロブルーテ
トラゾリウム(ＮＢＴ)５０mg／ml各３００μl／５０ml
を加えた発色液中でメンブランを発色させた。
固定されたＤＮＡまたはＲＮＡを含むメンブランを５m
Ｍりん酸緩衝液−１％うし血清アルブミン(ＢＳＡ、シ
グマ社、フラクションＶ)に浸し、室温で６０分間イン
キュベートした。次に、アルカリホスファターゼ(また
はペルオキシダーゼ)標識ポリエチレンイミンを１００
μl／２０mlの割合で加え、３７℃で１２０分間インキ
ュベートした。メンブランを５mＭりん酸緩衝液−１％
ＢＳＡ−０．１％ツイーン２０で１０分間づつ３回洗浄
し、０．１ＭトリスＨＣl(pＨ９．５)−１０mＭ−ＭgＣ
l2でリンスした。ブロモクロロインドリルホスフェート
(ＢＣＩＰ)７５mg／ml ０.１ＭトリスＨＣｌ（pＨ９.
５）−１０mＭ−ＭgＣl2 ２０mlおよびニトロブルーテ
トラゾリウム(ＮＢＴ)５０mg／ml各３００μl／５０ml
を加えた発色液中でメンブランを発色させた。
【００１６】(サザン・ブロット・ハイブリダイゼーシ
ョン)スタフィロコッカス・アウレウス(Ｓt．aureus)ゲ
ノムkbpフラグメントＤＮＡを使用し、常法に従って32
Ｐ−dＣＴＰまたはＢio−１１−dＵＴＰ(ＢＲＬ)を用い
てニックトランスレーション反応を実施し、32Ｐ−ＤＮ
ＡまたはＢio−ＤＮＡを調製した。変性したプローブを
含むハイブリダイゼーション緩衝液(５×ＳＳＣ、０．
１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０)により、メンブラ
ンを４２−５５℃で一夜ハイブリダイゼーション処理し
た。その後、５５℃で３０分間、０．１６×ＳＳＣ−
０．１％ツイーン２０で洗浄した(時点Ａ)。32Ｐ−ＤＮ
Ａプローブを用いた場合は、時点Ａでメンブランを湿っ
たままサランラップに包み、Ｘ線フィルムに露出してシ
グナルを検出した。その後、メンブランを４２℃で３時
間以上にわたり３％ＢＳＡ−０．１％ツイーン２０−り
ん酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)でブロッキング処理し、ペルオ
キシダーゼ標識ポリエチレンイミンを１００μl／シー
トの割で０．１％ＢＳＡ−０．１％ツイーン−ＰＢＳに
加え、２−３時間反応させた。ついで、０．１％ツイー
ン２０−ＰＢＳで２０分間づつ３回洗浄し、ジアミノベ
ンジデイン(ＤＡＢ)−Ｈ2Ｏ2系で発色させた。Ｂio−Ｄ
ＮＡプローブを用いた場合は、時点Ａ後、ＰＢＳ−０．
５％ツイーン２０を用いて室温で６０分間処理した。つ
いで、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン
を含むＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０により室温で２
０分間処理後、ＰＢＳ−０．５％ツイーン２０で１０分
間づつ２回洗浄した。次に、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．
１％ＢＳＡ−０．１％ツイーン２０を用い室温で２０分
間プレインキュベーション後ペルオキシダーゼ標識ポリ
エチレンイミンを加え、４２℃で３時間反応させた。メ
ンブランをＰＢＳ−０．１％ツイーン２０で１０分間づ
つ３回洗浄後、０.１ＭトリスＨＣｌ（pＨ９.５）−１
０mＭ−ＭgＣl2でリンスし、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ系を用い
て室温で２０分間発色処理した。ＰＢＳで１０分間づつ
３回洗浄後、さらにＤＡＢ−Ｈ2Ｏ2系で発色処理した。
メンブランをＰＢＳ−０．１％ツイーン２０で洗浄後保
存した。
ョン)スタフィロコッカス・アウレウス(Ｓt．aureus)ゲ
ノムkbpフラグメントＤＮＡを使用し、常法に従って32
Ｐ−dＣＴＰまたはＢio−１１−dＵＴＰ(ＢＲＬ)を用い
てニックトランスレーション反応を実施し、32Ｐ−ＤＮ
ＡまたはＢio−ＤＮＡを調製した。変性したプローブを
含むハイブリダイゼーション緩衝液(５×ＳＳＣ、０．
１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０)により、メンブラ
ンを４２−５５℃で一夜ハイブリダイゼーション処理し
た。その後、５５℃で３０分間、０．１６×ＳＳＣ−
０．１％ツイーン２０で洗浄した(時点Ａ)。32Ｐ−ＤＮ
Ａプローブを用いた場合は、時点Ａでメンブランを湿っ
たままサランラップに包み、Ｘ線フィルムに露出してシ
グナルを検出した。その後、メンブランを４２℃で３時
間以上にわたり３％ＢＳＡ−０．１％ツイーン２０−り
ん酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)でブロッキング処理し、ペルオ
キシダーゼ標識ポリエチレンイミンを１００μl／シー
トの割で０．１％ＢＳＡ−０．１％ツイーン−ＰＢＳに
加え、２−３時間反応させた。ついで、０．１％ツイー
ン２０−ＰＢＳで２０分間づつ３回洗浄し、ジアミノベ
ンジデイン(ＤＡＢ)−Ｈ2Ｏ2系で発色させた。Ｂio−Ｄ
ＮＡプローブを用いた場合は、時点Ａ後、ＰＢＳ−０．
５％ツイーン２０を用いて室温で６０分間処理した。つ
いで、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン
を含むＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０により室温で２
０分間処理後、ＰＢＳ−０．５％ツイーン２０で１０分
間づつ２回洗浄した。次に、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ−０．
１％ＢＳＡ−０．１％ツイーン２０を用い室温で２０分
間プレインキュベーション後ペルオキシダーゼ標識ポリ
エチレンイミンを加え、４２℃で３時間反応させた。メ
ンブランをＰＢＳ−０．１％ツイーン２０で１０分間づ
つ３回洗浄後、０.１ＭトリスＨＣｌ（pＨ９.５）−１
０mＭ−ＭgＣl2でリンスし、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ系を用い
て室温で２０分間発色処理した。ＰＢＳで１０分間づつ
３回洗浄後、さらにＤＡＢ−Ｈ2Ｏ2系で発色処理した。
メンブランをＰＢＳ−０．１％ツイーン２０で洗浄後保
存した。
【００１７】(結果) (イ) λＤＮＡまたはエシエリキア・コリ(Ｅ．coli)rＲ
ＮＡをドットスポットし、アルカリホスファターゼ標識
ポリエチレンイミンで検出した結果をそれぞれ図１およ
び図２に示す。スポット量は、図１の上からλＤＮＡ
４.７μｇ、４７０ng、４７ng、４.７ng、４７
０pg、４７pg、４.７pg、４７０fg、図２の上か
らγＲＮＡ５μg、５００ng、５０ng、５ng、
５００pg、５０pgである。ＤＮＡでは４７０fg、Ｒ
ＮＡでは５０pgの感度で検出できた。 (ロ) λＨind ＩＩＩ ＤＮＡの希釈系列を作り、その各
試料をアガロースゲル電気泳動で分り後、ゲルからメン
ブランへエレクトロブロッティングしたものを、アルカ
リホスファターゼ標識ポリエチレンイミンで検出した結
果を図３に示す。ここでは、希釈系列(０.０６μg)の試
料においても、ゲル分り後のエチジウムブロミド染色パ
ターンと、ブロッティングの検出パターンは完全に一致
していた。これによりこの発明の方法の正しさが裏づけ
られた。 (ハ) λＨind ＩＩＩ ＤＮＡのサイズマーカーを含むp
ＢＲ３２２に挿入されたＤＮＡ断片を、制限酵素で切り
出した後、アガロースゲル電気泳動で分りし、メンブラ
ン上にエレクトロブロッティングし、32Ｐ−ＤＮＡプロ
ーブでハイブリダイズして、そのハイブリッドをＸ線フ
ィルムに露出して、シグナル（図５）を得た。このハイ
ブリダイズしたＤＮＡの種類を特定するために、そのメ
ンブランをペルオキシダーゼ標識ポリエチレンイミン処
理し、すべてのブロッティングされたＤＮＡの位置（図
４）を確認した。 (ニ) 上記(ハ)と同様に行なったものを、Ｂio−ＤＮＡ
プローブを用いた系でハイブリダイズすることにより、
ハイブリダイズしたＤＮＡとハイブリダイズしなかった
ＤＮＡを同時に検出した。ここでは、Ｂio−プローブと
アルカリホスファターゼストレプトアビジン、ペルオキ
シダーゼ標識ポリエチレンイミンのそれぞれ酵素を使い
分けることにより、ハイブリダイズしたＤＮＡと非ハイ
ブリダイズＤＮＡを２重染色することにより区別するこ
とができた。結果を図７に示す。また、色の違いを図８
に示す。図中、斜線部は褐色（ペルオキシダーゼ標識ポ
リエチレンイミン系）、黒色部は紫色（アルカリホスフ
ァターゼ／ストレプトアビジン系）を示す。そのパター
ンは、同様に行なってエチジウムブロミド染色した結果
（図６）と一致していた。
ＮＡをドットスポットし、アルカリホスファターゼ標識
ポリエチレンイミンで検出した結果をそれぞれ図１およ
び図２に示す。スポット量は、図１の上からλＤＮＡ
４.７μｇ、４７０ng、４７ng、４.７ng、４７
０pg、４７pg、４.７pg、４７０fg、図２の上か
らγＲＮＡ５μg、５００ng、５０ng、５ng、
５００pg、５０pgである。ＤＮＡでは４７０fg、Ｒ
ＮＡでは５０pgの感度で検出できた。 (ロ) λＨind ＩＩＩ ＤＮＡの希釈系列を作り、その各
試料をアガロースゲル電気泳動で分り後、ゲルからメン
ブランへエレクトロブロッティングしたものを、アルカ
リホスファターゼ標識ポリエチレンイミンで検出した結
果を図３に示す。ここでは、希釈系列(０.０６μg)の試
料においても、ゲル分り後のエチジウムブロミド染色パ
ターンと、ブロッティングの検出パターンは完全に一致
していた。これによりこの発明の方法の正しさが裏づけ
られた。 (ハ) λＨind ＩＩＩ ＤＮＡのサイズマーカーを含むp
ＢＲ３２２に挿入されたＤＮＡ断片を、制限酵素で切り
出した後、アガロースゲル電気泳動で分りし、メンブラ
ン上にエレクトロブロッティングし、32Ｐ−ＤＮＡプロ
ーブでハイブリダイズして、そのハイブリッドをＸ線フ
ィルムに露出して、シグナル（図５）を得た。このハイ
ブリダイズしたＤＮＡの種類を特定するために、そのメ
ンブランをペルオキシダーゼ標識ポリエチレンイミン処
理し、すべてのブロッティングされたＤＮＡの位置（図
４）を確認した。 (ニ) 上記(ハ)と同様に行なったものを、Ｂio−ＤＮＡ
プローブを用いた系でハイブリダイズすることにより、
ハイブリダイズしたＤＮＡとハイブリダイズしなかった
ＤＮＡを同時に検出した。ここでは、Ｂio−プローブと
アルカリホスファターゼストレプトアビジン、ペルオキ
シダーゼ標識ポリエチレンイミンのそれぞれ酵素を使い
分けることにより、ハイブリダイズしたＤＮＡと非ハイ
ブリダイズＤＮＡを２重染色することにより区別するこ
とができた。結果を図７に示す。また、色の違いを図８
に示す。図中、斜線部は褐色（ペルオキシダーゼ標識ポ
リエチレンイミン系）、黒色部は紫色（アルカリホスフ
ァターゼ／ストレプトアビジン系）を示す。そのパター
ンは、同様に行なってエチジウムブロミド染色した結果
（図６）と一致していた。
【図１】実施例１におけるλＤＮＡの検出結果を示す図
である。
である。
【図２】実施例１におけるエシエリキア・コリ(Ｅ．col
i)rＲＮＡの検出結果を示す図である。
i)rＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図３】実施例１におけるλＨind III ＤＮＡの電気泳
動の写真である。
動の写真である。
【図４】実施例１において、pＢＲ３２２に挿入された
ＤＮＡ断片を制限酵素で消化したもの（本発明による発
色）の電気泳動の写真である。
ＤＮＡ断片を制限酵素で消化したもの（本発明による発
色）の電気泳動の写真である。
【図５】実施例１において、pＢＲ３２２に挿入された
ＤＮＡ断片を制限酵素で消化したもの（Ｘ線像）の電気
泳動の写真である。
ＤＮＡ断片を制限酵素で消化したもの（Ｘ線像）の電気
泳動の写真である。
【図６】実施例１におけるλＨind III ＤＮＡの電気泳
動の写真である。
動の写真である。
【図７】実施例１における図６と同じλＨind III ＤＮ
Ａの電気泳動の写真である。
Ａの電気泳動の写真である。
【図８】図７における色の違いを示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 核酸を付着または含有している疑のある
固形担体に、測定可能なシグナルを発生し得る標識また
はその前駆体を結合させたポリアミンを接触させて、核
酸とポリアミンとの間で複合体を形成させ、前駆体を用
いた場合は標識に変換し、その前または後に複合体を形
成していないポリアミンを除去し、その後、標識を検索
することを特徴とする、核酸の検出法。 - 【請求項２】 標的核酸を付着または含有している疑の
ある固形担体に、(イ)測定可能なシグナルを発生し得る
標識またはその前駆体を結合させた標的核酸にハイブリ
ダイズし得るプローブをハイブリダイゼーション条件下
で接触させて、ハイブリッドを形成させ、前駆体を用い
た場合は標識に変換し、その前または後にハイブリッド
を形成していないプローブを除去し、その後、標識を検
索することを含む第１の検出操作、および(ロ)測定可能
なシグナルを発生し得る別の標識またはその前駆体を結
合させたポリアミンを接触させて、核酸とポリアミンと
の間で複合体を形成させ、前駆体を用いた場合は標識に
変換し、その前または後に複合体を形成していないポリ
アミンを除去し、その後、標識を検索することを含む第
２の検出操作、を組合わせて任意の順序で実施すること
を特徴とする、標的核酸とそれ以外の核酸の識別検出
法。 - 【請求項３】(イ)酵素で標識したポリアミン、および
(ロ)酵素作用によりシグナルを発生する色原体を含む、
核酸検出用キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4159349A JP2651317B2 (ja) | 1992-06-18 | 1992-06-18 | 核酸の検出法 |
| US08/592,293 US5824474A (en) | 1992-06-18 | 1993-08-10 | Method for detecting nucleic acid |
| PCT/JP1993/001124 WO1995004832A1 (fr) | 1992-06-18 | 1993-08-10 | Procede de detection d'un acide nucleique |
| TW82106442A TW309590B (ja) | 1992-06-18 | 1993-08-11 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4159349A JP2651317B2 (ja) | 1992-06-18 | 1992-06-18 | 核酸の検出法 |
| PCT/JP1993/001124 WO1995004832A1 (fr) | 1992-06-18 | 1993-08-10 | Procede de detection d'un acide nucleique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0699A true JPH0699A (ja) | 1994-01-11 |
| JP2651317B2 JP2651317B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=26434425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4159349A Expired - Fee Related JP2651317B2 (ja) | 1992-06-18 | 1992-06-18 | 核酸の検出法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5824474A (ja) |
| JP (1) | JP2651317B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020058244A (ja) * | 2018-10-05 | 2020-04-16 | 国立大学法人山形大学 | 電気化学式非標識核酸検出の測定方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002359679B2 (en) * | 2001-12-11 | 2009-01-08 | Cellgate, Inc. | Guanidinium transport reagents and conjugates |
| CA2529147A1 (en) * | 2003-06-21 | 2005-01-06 | Aprilis, Inc. | Acquisition of high resolution biometric images |
| US7728959B2 (en) | 2003-06-21 | 2010-06-01 | Aprilis, Inc. | Acquisition of high resolution biometric images |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3310337A1 (de) * | 1983-03-22 | 1984-09-27 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL), 6900 Heidelberg | Verfahren zur durchfuehrung von hybridisierungsreaktionen |
| IT1212742B (it) * | 1983-05-17 | 1989-11-30 | Dompe Farmaceutici Spa | Derivati dibenzo [1,4]diazepinonici pirido [1,4] benzodiazepinonici,pirido [1,5] benzodiazepinonici e loro attivita' farmacologica |
| US5599667A (en) * | 1987-03-02 | 1997-02-04 | Gen-Probe Incorporated | Polycationic supports and nucleic acid purification separation and hybridization |
-
1992
- 1992-06-18 JP JP4159349A patent/JP2651317B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-08-10 US US08/592,293 patent/US5824474A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020058244A (ja) * | 2018-10-05 | 2020-04-16 | 国立大学法人山形大学 | 電気化学式非標識核酸検出の測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2651317B2 (ja) | 1997-09-10 |
| US5824474A (en) | 1998-10-20 |
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