JPH0678773A - 電圧作動カルシウムチヤネルのヒトニユーロンベータサブユニツト - Google Patents
電圧作動カルシウムチヤネルのヒトニユーロンベータサブユニツトInfo
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- JPH0678773A JPH0678773A JP5048720A JP4872093A JPH0678773A JP H0678773 A JPH0678773 A JP H0678773A JP 5048720 A JP5048720 A JP 5048720A JP 4872093 A JP4872093 A JP 4872093A JP H0678773 A JPH0678773 A JP H0678773A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 配列２９１７８−１ないし２９１７８−３を
有する電圧作動カルシウムチャネルのヒトベータサブユ
ニットのｃＤＮＡ。 【効果】 カルシウムチャネルの活性を調節する薬剤を
見付け出すために有用である。
有する電圧作動カルシウムチャネルのヒトベータサブユ
ニットのｃＤＮＡ。 【効果】 カルシウムチャネルの活性を調節する薬剤を
見付け出すために有用である。
Description
【０００１】本発明は、電圧作動カルシウムチャネル
（voltage-operated calcium channels）のヒトニュー
ロンベータサブユニット（human neuronal beta subuni
ts）、並びに薬剤を見付け出すためのスクリーニング方
法におけるそれらの使用に関する。
（voltage-operated calcium channels）のヒトニュー
ロンベータサブユニット（human neuronal beta subuni
ts）、並びに薬剤を見付け出すためのスクリーニング方
法におけるそれらの使用に関する。
【０００２】カルシウムイオンは、全ての生物学的シス
テムの中で幅広い種類の機能を有している。細胞のカル
シウム恒常性は、神経細胞の生理で特異的に必須的な役
割を果している。細胞内カルシウム濃度は、神経細胞外
では１ｍＭであるのに比べて、約０．１μＭである。こ
のように鋭角な濃度勾配（ｘ１０，０００）は、主に、
電圧作動カルシウムチャンネル（ＶＯＣＣ）によって調
節されており、これらは、特定のカルシウム拮抗薬によ
って遮断され得る。大脳虚血（発作）中、梗塞の影響を
受けた領域中のニューロンにおけるカルシウム恒常性が
かなり変化する。これらの電圧作動カルシウムチャンネ
ルは、長引いた膜脱分極によって開放状態に維持され、
この結果として多量のカルシウムイオンが流入する。こ
の間に、細胞内カルシウム濃度が１００倍上昇する。こ
の大過剰のカルシウムが、カルモジュリンに結合するこ
とにより、種々のカルシウム／カルモジュリン依存性細
胞酵素システム、例えばキナーゼ、プロテアーゼおよび
ホスホリパーゼを活性化し、そして活性化が長引いた場
合、これらが一緒になって、神経細胞に不可逆的な損傷
をもたらす。
テムの中で幅広い種類の機能を有している。細胞のカル
シウム恒常性は、神経細胞の生理で特異的に必須的な役
割を果している。細胞内カルシウム濃度は、神経細胞外
では１ｍＭであるのに比べて、約０．１μＭである。こ
のように鋭角な濃度勾配（ｘ１０，０００）は、主に、
電圧作動カルシウムチャンネル（ＶＯＣＣ）によって調
節されており、これらは、特定のカルシウム拮抗薬によ
って遮断され得る。大脳虚血（発作）中、梗塞の影響を
受けた領域中のニューロンにおけるカルシウム恒常性が
かなり変化する。これらの電圧作動カルシウムチャンネ
ルは、長引いた膜脱分極によって開放状態に維持され、
この結果として多量のカルシウムイオンが流入する。こ
の間に、細胞内カルシウム濃度が１００倍上昇する。こ
の大過剰のカルシウムが、カルモジュリンに結合するこ
とにより、種々のカルシウム／カルモジュリン依存性細
胞酵素システム、例えばキナーゼ、プロテアーゼおよび
ホスホリパーゼを活性化し、そして活性化が長引いた場
合、これらが一緒になって、神経細胞に不可逆的な損傷
をもたらす。
【０００３】大脳虚血における神経保護に対する１つの
治療学的アプローチは、神経細胞の中に多量のカルシウ
ムが流入するのを可逆的に遮断することである。これら
の電圧作動ニューロンカルシウムチャンネルは、この場
合における適切な薬学的標的である。これらのＶＯＣＣ
は、種々の筋肉細胞（管、心臓および骨格筋）、ニュー
ロン、並びに組織に特異的な生理学的特性を有する分泌
細胞の中に存在している。
治療学的アプローチは、神経細胞の中に多量のカルシウ
ムが流入するのを可逆的に遮断することである。これら
の電圧作動ニューロンカルシウムチャンネルは、この場
合における適切な薬学的標的である。これらのＶＯＣＣ
は、種々の筋肉細胞（管、心臓および骨格筋）、ニュー
ロン、並びに組織に特異的な生理学的特性を有する分泌
細胞の中に存在している。
【０００４】電気生理学的調査（Tsien他、 1988、 Trend
s in Neurol. Sci 11: 431-438）により、少なくとも３
種の異なる種類のＶＯＣＣ（Ｌ、ＮおよびＴチャンネ
ル）が存在していることが示されている。１，４−ジヒ
ドロピリジン類（ＤＨＰ）は、筋肉細胞および神経細胞
の両方で見付け出されるＬ型カルシウムチャンネルの可
能な遮断剤である。ラビット骨格筋ジヒドロピリジンレ
セプタが生化学的に特徴づけられ、そしてクローン化さ
れた（Tanabe他、 1987、 Nature 328: 313-318）。この
ＶＯＣＣのα１ ＳＵの主要配列が、ｃＤＮＡデータか
ら誘導されており、そしてこれは、５つのＮ−グリコシ
ル化部位と７つの可能な燐酸化部位を有する２１２ｋＤ
のトランスメンブラン蛋白質に一致している。この蛋白
質は、４つの互いに類似したトランスメンブランドメイ
ンを含んでおり、これらの各々は、６つの（恐らくはα
−ヘリカルの）トランスメンブランセグメント（Ｓ１−
Ｓ６）を有している。各々のドメインの第四トランスメ
ンブランセグメント（Ｓ４）は、配列したパターンの正
電荷（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を含んでおり、これがカルシウ
ムチャンネルの電圧センサーを形成している可能性があ
る。このクローン化したα１ ＳＵの構造は、ＤＥＰ感
受性を示すカルシウムチャンネルの、イオンを伝導す
る、電圧で制御される単位と一致している。
s in Neurol. Sci 11: 431-438）により、少なくとも３
種の異なる種類のＶＯＣＣ（Ｌ、ＮおよびＴチャンネ
ル）が存在していることが示されている。１，４−ジヒ
ドロピリジン類（ＤＨＰ）は、筋肉細胞および神経細胞
の両方で見付け出されるＬ型カルシウムチャンネルの可
能な遮断剤である。ラビット骨格筋ジヒドロピリジンレ
セプタが生化学的に特徴づけられ、そしてクローン化さ
れた（Tanabe他、 1987、 Nature 328: 313-318）。この
ＶＯＣＣのα１ ＳＵの主要配列が、ｃＤＮＡデータか
ら誘導されており、そしてこれは、５つのＮ−グリコシ
ル化部位と７つの可能な燐酸化部位を有する２１２ｋＤ
のトランスメンブラン蛋白質に一致している。この蛋白
質は、４つの互いに類似したトランスメンブランドメイ
ンを含んでおり、これらの各々は、６つの（恐らくはα
−ヘリカルの）トランスメンブランセグメント（Ｓ１−
Ｓ６）を有している。各々のドメインの第四トランスメ
ンブランセグメント（Ｓ４）は、配列したパターンの正
電荷（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を含んでおり、これがカルシウ
ムチャンネルの電圧センサーを形成している可能性があ
る。このクローン化したα１ ＳＵの構造は、ＤＥＰ感
受性を示すカルシウムチャンネルの、イオンを伝導す
る、電圧で制御される単位と一致している。
【０００５】実際のカルシウムチャンネルを形成してい
るアルファ−１サブユニットに加えて、他の４つの蛋白
質が、完成したチャンネルコンプレックス（channel co
mplex）の構造に関与しており、これらはアルファ−
２、ベータ、ガンマおよびデルタサブユニットと呼ばれ
ている。
るアルファ−１サブユニットに加えて、他の４つの蛋白
質が、完成したチャンネルコンプレックス（channel co
mplex）の構造に関与しており、これらはアルファ−
２、ベータ、ガンマおよびデルタサブユニットと呼ばれ
ている。
【０００６】最近の調査で、特にベータサブユニットが
チャンネル機能の重要なパラメーターに影響を与えてい
ることが示され、α1とβ ＳＵを一緒にインビトロで発
現させると、カルシウムフラックス、このチャンネルコ
ンプレックスの活性化および不活性化速度、並びにジヒ
ドロピリジンへの結合親和力が変化する（Singer他、199
1、 Science 253: 1553；Lacerda他、 1991、 Nature 352:
527; Varadi他、 1991、 Nature 352: 159）。
チャンネル機能の重要なパラメーターに影響を与えてい
ることが示され、α1とβ ＳＵを一緒にインビトロで発
現させると、カルシウムフラックス、このチャンネルコ
ンプレックスの活性化および不活性化速度、並びにジヒ
ドロピリジンへの結合親和力が変化する（Singer他、199
1、 Science 253: 1553；Lacerda他、 1991、 Nature 352:
527; Varadi他、 1991、 Nature 352: 159）。
【０００７】従って、このベータサブユニットの完全な
ｃＤＮＡクローンが利用できることは、真核細胞中の遺
伝子発現による、生理学的に関連しているチャンネル構
造の再構成にとって、非常に重要である。
ｃＤＮＡクローンが利用できることは、真核細胞中の遺
伝子発現による、生理学的に関連しているチャンネル構
造の再構成にとって、非常に重要である。
【０００８】ラビット骨格筋由来ベータサブユニットの
ＤＮＡ配列（Ruth他、 1989、 Science 245: 1115）から
誘導されたオリゴヌクレオチドを用いることで、ヒトニ
ューロンサブユニットをコードする３種の異なるｃＤＮ
Ａ型を単離することができた。これらのクローン化した
ベータサブユニットは、形質転換した動物細胞（例えば
コス細胞、マウスＬ細胞、ＣＨＯ細胞など）中、ニュー
ロンアルファ−１クローンのサブタイプ（既に存在して
いる）と一緒に発現させるべきである（Gluzman、 1981、
Cell 23: 175およびChen他、 1987、 Mol. Cell. Biol.
7: 2745-2752）。これらの構築物は、ニューロンカルシ
ウムチャンネルのサブタイプに特異的な新規リガンドを
見付け出すために用いられる結合アッセイおよび／また
は機能アッセイシステムで利用される。
ＤＮＡ配列（Ruth他、 1989、 Science 245: 1115）から
誘導されたオリゴヌクレオチドを用いることで、ヒトニ
ューロンサブユニットをコードする３種の異なるｃＤＮ
Ａ型を単離することができた。これらのクローン化した
ベータサブユニットは、形質転換した動物細胞（例えば
コス細胞、マウスＬ細胞、ＣＨＯ細胞など）中、ニュー
ロンアルファ−１クローンのサブタイプ（既に存在して
いる）と一緒に発現させるべきである（Gluzman、 1981、
Cell 23: 175およびChen他、 1987、 Mol. Cell. Biol.
7: 2745-2752）。これらの構築物は、ニューロンカルシ
ウムチャンネルのサブタイプに特異的な新規リガンドを
見付け出すために用いられる結合アッセイおよび／また
は機能アッセイシステムで利用される。
【０００９】これらの組換え型細胞システムは、更に、
機能的カルシウムフラックスアッセイ（これを用いるこ
とで、特異的なリガンドの作動もしくは拮抗作用を検査
することが可能である）を開発するために用いられ得
る。これらの組換え型アッセイが有するところの、通常
のアッセイ（脳膜調製物、細胞系）とは異なっておりそ
して主要な利点は、レセプタ／チャンネル調製物の純度
である、と言うのは、組換え的に発現したニューロンカ
ルシウムチャンネルサブタイプのみが、動物細胞表面上
に適切な数で存在しているからである。これは、特異的
なニューロンリガンド（これらは、可能ならば、非ニュ
ーロン組織型のカルシウムチャンネルに影響を全く与え
るべきではない）の選択にとって必須条件である。
機能的カルシウムフラックスアッセイ（これを用いるこ
とで、特異的なリガンドの作動もしくは拮抗作用を検査
することが可能である）を開発するために用いられ得
る。これらの組換え型アッセイが有するところの、通常
のアッセイ（脳膜調製物、細胞系）とは異なっておりそ
して主要な利点は、レセプタ／チャンネル調製物の純度
である、と言うのは、組換え的に発現したニューロンカ
ルシウムチャンネルサブタイプのみが、動物細胞表面上
に適切な数で存在しているからである。これは、特異的
なニューロンリガンド（これらは、可能ならば、非ニュ
ーロン組織型のカルシウムチャンネルに影響を全く与え
るべきではない）の選択にとって必須条件である。
【００１０】上に記述した組換え型スクリーニングアッ
セイの使用に関するいくつか例を以下に挙げる。
セイの使用に関するいくつか例を以下に挙げる。
【００１１】１． レセプタ結合アッセイ ヒトカルシウムチャンネルを用いて形質転換した動物細
胞（例えば上を参照）を培養した後、膜の調製で用いる
ことが可能である。これらの膜調製物は、新規なリガン
ドをスクリーニング（競合アッセイ）するための、種々
の種類の放射能標識物質を用いた結合試験（実施例１−
５）で用いられ得る。公知のカルシウムチャンネル結合
物質の例は、 １． フェニルアルキルアミン類、 ２． ベンゾチアゼピン類、 ３． ジヒドロピリジン類、 ４． ビスフェニルブチルピペリジン類、 ５． オメガコノトキシン類、 である。
胞（例えば上を参照）を培養した後、膜の調製で用いる
ことが可能である。これらの膜調製物は、新規なリガン
ドをスクリーニング（競合アッセイ）するための、種々
の種類の放射能標識物質を用いた結合試験（実施例１−
５）で用いられ得る。公知のカルシウムチャンネル結合
物質の例は、 １． フェニルアルキルアミン類、 ２． ベンゾチアゼピン類、 ３． ジヒドロピリジン類、 ４． ビスフェニルブチルピペリジン類、 ５． オメガコノトキシン類、 である。
【００１２】２． カルシウム−４５フラックスアッセ
イ ヒトカルシウムチャンネルのサブタイプを用いて形質転
換した培養細胞の細胞膜は、カリウムイオンまたはアル
カロイド類、例えばベラトリジン（Veratridine）など
を用いて脱分極され得る。膜脱分極により、カルシウム
チャンネルの開放がもたらされ、これによってカルシウ
ムイオンが細胞の中に流入（フラックス）する。このよ
うな電圧依存カルシウム流入は、放射能標識したカルシ
ウム（45Ｃａ）を用いて測定され（例：Messing他、 198
5、 J. Pharmacology and Exp. Therapeutics 235: 407-
411）、そしてカルシウムチャンネル拮抗薬もしくは作
動薬の機能試験／スクリーニングで用いられ得る。
イ ヒトカルシウムチャンネルのサブタイプを用いて形質転
換した培養細胞の細胞膜は、カリウムイオンまたはアル
カロイド類、例えばベラトリジン（Veratridine）など
を用いて脱分極され得る。膜脱分極により、カルシウム
チャンネルの開放がもたらされ、これによってカルシウ
ムイオンが細胞の中に流入（フラックス）する。このよ
うな電圧依存カルシウム流入は、放射能標識したカルシ
ウム（45Ｃａ）を用いて測定され（例：Messing他、 198
5、 J. Pharmacology and Exp. Therapeutics 235: 407-
411）、そしてカルシウムチャンネル拮抗薬もしくは作
動薬の機能試験／スクリーニングで用いられ得る。
【００１３】３． フラ２（Fura 2）アッセイ ヒトカルシウムチャンネル発現動物細胞（上を参照）
は、カルシウムチャンネルを開放および遮断した後の細
胞内カルシウム濃度を測定する目的で、カルシウムに敏
感性を示す蛍光染料（例えばフラ２またはフルオロ３）
の存在下で用いられ得る（例：Rosario他、 1989、 Neuro
sci. 29、 735-747）。この場合、細胞内カルシウム濃度
の変化は、蛍光計（分光光度計）を用いて測定され得
る。このような組換え型細胞システムは、サブタイプに
特異的なカルシウムチャンネルリガンド（作動薬および
拮抗薬）を見付け出すための機能アッセイとして用いら
れ得る。
は、カルシウムチャンネルを開放および遮断した後の細
胞内カルシウム濃度を測定する目的で、カルシウムに敏
感性を示す蛍光染料（例えばフラ２またはフルオロ３）
の存在下で用いられ得る（例：Rosario他、 1989、 Neuro
sci. 29、 735-747）。この場合、細胞内カルシウム濃度
の変化は、蛍光計（分光光度計）を用いて測定され得
る。このような組換え型細胞システムは、サブタイプに
特異的なカルシウムチャンネルリガンド（作動薬および
拮抗薬）を見付け出すための機能アッセイとして用いら
れ得る。
【００１４】４． 電気生理学 膜脱分極によって生じるカルシウム電流は、電気生理学
的に測定され得る（例：Carbone他、 1990、 Pfluegers A
rch.、 416: 170-179）。組換え型の動物細胞系（上を参
照）を用い、ヒトカルシウムチャンネルに対する可能な
カルシウムチャンネル拮抗薬もしくは作動薬の効果を、
物理的に測定しそして直接薬学的に特徴づけすることが
可能である。
的に測定され得る（例：Carbone他、 1990、 Pfluegers A
rch.、 416: 170-179）。組換え型の動物細胞系（上を参
照）を用い、ヒトカルシウムチャンネルに対する可能な
カルシウムチャンネル拮抗薬もしくは作動薬の効果を、
物理的に測定しそして直接薬学的に特徴づけすることが
可能である。
【００１５】５． 間接的な測定方法 細胞内カルシウムイオン濃度によって数多くの細胞過程
が調節されている（例えばレセプタ仲介シグナル伝達、
種々の酵素反応、例えば燐酸化、脱燐酸化、ニューロト
ランスミッター放出、Ｃａ依存性遺伝子調節など）。特
異的なアッセイを用いることで、これらの生化学的反応
のいくつかを測定することが可能である。従って、組換
え型カルシウムチャンネル発現細胞システム中で、カル
シウム依存性細胞過程に対するカルシウムチャンネル活
性調節因子の効果を間接的（生理学的）に検出すること
が可能である（例：Zernig他、 1986、 Eur. J. Pharmaco
l.128、 221-229）。
が調節されている（例えばレセプタ仲介シグナル伝達、
種々の酵素反応、例えば燐酸化、脱燐酸化、ニューロト
ランスミッター放出、Ｃａ依存性遺伝子調節など）。特
異的なアッセイを用いることで、これらの生化学的反応
のいくつかを測定することが可能である。従って、組換
え型カルシウムチャンネル発現細胞システム中で、カル
シウム依存性細胞過程に対するカルシウムチャンネル活
性調節因子の効果を間接的（生理学的）に検出すること
が可能である（例：Zernig他、 1986、 Eur. J. Pharmaco
l.128、 221-229）。
【００１６】更に、標的変異誘発、例えば種々のカルシ
ウムチャンネルサブタイプのＤＮＡセグメントに関する
ポイント変異、挿入、欠失、置換などを用いて導入した
修飾物によって、生理学的過程に対する直接的な影響を
検出することが可能である（例：YoolおよびSchwarz、 1
991、 Nature 349: 700-704）。
ウムチャンネルサブタイプのＤＮＡセグメントに関する
ポイント変異、挿入、欠失、置換などを用いて導入した
修飾物によって、生理学的過程に対する直接的な影響を
検出することが可能である（例：YoolおよびSchwarz、 1
991、 Nature 349: 700-704）。
【００１７】クローン化方策 １． ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング １．１． ｃＤＮＡライブラリーのプレーティングおよ
びニトロセルロースフィルターの処理 ｃＤＮＡライブラリー（Strategene Inc.、 La Jolla、 C
A USA;カタログ番号936205によって供給されたラムダＺ
ＡＰＩＩ中のヒト海馬）およびニトロセルロースフィル
ターのプレーティングを、製造業者が記述しているか、
或はSambrook他著、 1989、「分子クローン化、実験室マ
ニュアル」（Molecular Cloning、 A laboratory manua
l）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 New Yor
k、 N.Y.、 USAに記述されている如く実施した。
びニトロセルロースフィルターの処理 ｃＤＮＡライブラリー（Strategene Inc.、 La Jolla、 C
A USA;カタログ番号936205によって供給されたラムダＺ
ＡＰＩＩ中のヒト海馬）およびニトロセルロースフィル
ターのプレーティングを、製造業者が記述しているか、
或はSambrook他著、 1989、「分子クローン化、実験室マ
ニュアル」（Molecular Cloning、 A laboratory manua
l）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 New Yor
k、 N.Y.、 USAに記述されている如く実施した。
【００１８】１．２． ハイブリッド形成プローブ 用いた主要なハイブリッド形成プローブは、ラビット骨
格筋由来ベータサブユニットのＤＮＡ配列が有する下記
の４０塩基長フラグメント（ｐｏｓ．３６１−４００）
に相補性を示す合成アンチセンスオリゴヌクレオチドで
あった： 5'-CTTAAGGCTTCCCGGTCCTCCTCCAGGGAGACATCAGAGT-3' 上記ＤＮＡ配列は、アクセス番号Ｍ２５８１７下でＥＭ
ＢＬデータバンクから入手可能である。
格筋由来ベータサブユニットのＤＮＡ配列が有する下記
の４０塩基長フラグメント（ｐｏｓ．３６１−４００）
に相補性を示す合成アンチセンスオリゴヌクレオチドで
あった： 5'-CTTAAGGCTTCCCGGTCCTCCTCCAGGGAGACATCAGAGT-3' 上記ＤＮＡ配列は、アクセス番号Ｍ２５８１７下でＥＭ
ＢＬデータバンクから入手可能である。
【００１９】このオリゴヌクレオチドを用い、１．９ｋ
Ｂ長のｃＤＮＡフラグメントＨＢ２６を、上述したｃＤ
ＮＡライブラリーから単離した。このフラグメントを、
次に示す全てのスクリーニング実験におけるハイブリッ
ド形成プローブとして用いた。
Ｂ長のｃＤＮＡフラグメントＨＢ２６を、上述したｃＤ
ＮＡライブラリーから単離した。このフラグメントを、
次に示す全てのスクリーニング実験におけるハイブリッ
ド形成プローブとして用いた。
【００２０】１．３ 放射能ＤＮＡ前駆体を用いたハイ
ブリッド形成プローブの標識32 Ｐ−ｄＣＴＰを用いて酵素的にオリゴヌクレオチドに
標識を付けた（「ＤＮＡテーリングキット」（"DNA Tai
ling Kit"）、Boehringer Mannheim GmbH、 Postfach 31
0120、 D-6800 Mannheim; カタログ番号1028707）。
ブリッド形成プローブの標識32 Ｐ−ｄＣＴＰを用いて酵素的にオリゴヌクレオチドに
標識を付けた（「ＤＮＡテーリングキット」（"DNA Tai
ling Kit"）、Boehringer Mannheim GmbH、 Postfach 31
0120、 D-6800 Mannheim; カタログ番号1028707）。
【００２１】「ランダム開始標識用キット」（Random P
rimed Labeling Kits）（Boehringer Mannheim GmbH、
カタログ番号10004760）を用い、ｃＤＮＡフラグメント
に32Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。
rimed Labeling Kits）（Boehringer Mannheim GmbH、
カタログ番号10004760）を用い、ｃＤＮＡフラグメント
に32Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。
【００２２】１．４ ハイブリッド形成および洗浄条件 １．４．１． オリゴヌクレオチド類 下記の溶液中４２℃で一晩、放射能標識したハイブリッ
ド形成プローブにニトロセルロースフィルターをハイブ
リッド形成させた： ５ｘのDenhardtの溶液 ５ｘのＳＳＣ ５０μ／ｍＬのヘリング精液ＤＮＡ ５０ミリモル／Ｌの燐酸Ｎａ １ミリモル／Ｌのピロ燐酸Ｎａ ６０μｇ／ｍＬのＡＴＰ。
ド形成プローブにニトロセルロースフィルターをハイブ
リッド形成させた： ５ｘのDenhardtの溶液 ５ｘのＳＳＣ ５０μ／ｍＬのヘリング精液ＤＮＡ ５０ミリモル／Ｌの燐酸Ｎａ １ミリモル／Ｌのピロ燐酸Ｎａ ６０μｇ／ｍＬのＡＴＰ。
【００２３】これらのフィルターを５５℃の２ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。
【００２４】１．４．２． ｃＤＮＡフラグメント ５０％のホルムアミドを用い４２℃で一晩作成した以外
は１．４．１．で述べた溶液中で、放射能標識したプロ
ーブにニトロセルロースフィルターをハイブリッド形成
させる。
は１．４．１．で述べた溶液中で、放射能標識したプロ
ーブにニトロセルロースフィルターをハイブリッド形成
させる。
【００２５】これらのフィルターを５５℃の２ｘＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。
Ｃ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。
【００２６】その後、増感スクリーンを用い、−８０℃
で種々の時間、これらのフィルターにコダックＸ−Ｏｍ
ａｔ ＡＲ Ｘ線フィルムを暴露した。
で種々の時間、これらのフィルターにコダックＸ−Ｏｍ
ａｔ ＡＲ Ｘ線フィルムを暴露した。
【００２７】２． ラムダファージの単離、サブクロー
ン化、およびｃＤＮＡ挿入断片の配列決定 ２．１ プラスミドへのｃＤＮＡ挿入断片の変換 ｆｌ誘導（fl-derived）ヘルパーファージを用い、製造
業者（Stratagene）のプロトコルに従い、正のラムダＺ
ＡＰＩＩファージ由来ｃＤＮＡ挿入物を取り出した後、
プラスミド形態に変換した。
ン化、およびｃＤＮＡ挿入断片の配列決定 ２．１ プラスミドへのｃＤＮＡ挿入断片の変換 ｆｌ誘導（fl-derived）ヘルパーファージを用い、製造
業者（Stratagene）のプロトコルに従い、正のラムダＺ
ＡＰＩＩファージ由来ｃＤＮＡ挿入物を取り出した後、
プラスミド形態に変換した。
【００２８】２．２ 大きさの測定、およびｃＤＮＡ挿
入断片の配列決定分析 組換え型pBluescriptプラスミドを有するＸＬ１−ブル
ー細胞からプラスミドＤＮＡを調製し（Sambrook J.他
著、 (1989)、「分子クローン化、実験室マニュアル」
（Molecular Cloning、 A laboratory manual）、Cold S
pring Harbor Laboratory Press、 New York、 N.Y.）、
そしてこのＤＮＡのサンプル０．５μｇを、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで処理した。これらの得られるＤＮＡフラグメ
ントの数および大きさから、該挿入ｃＤＮＡの全長を推
定することが可能であった。存在しているｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を、２本鎖ＤＮＡに関するSanger方法に
より、SEQUENASE（USB、 Cleveland、 Ohio、 USA）を用い
て測定した。
入断片の配列決定分析 組換え型pBluescriptプラスミドを有するＸＬ１−ブル
ー細胞からプラスミドＤＮＡを調製し（Sambrook J.他
著、 (1989)、「分子クローン化、実験室マニュアル」
（Molecular Cloning、 A laboratory manual）、Cold S
pring Harbor Laboratory Press、 New York、 N.Y.）、
そしてこのＤＮＡのサンプル０．５μｇを、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで処理した。これらの得られるＤＮＡフラグメ
ントの数および大きさから、該挿入ｃＤＮＡの全長を推
定することが可能であった。存在しているｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を、２本鎖ＤＮＡに関するSanger方法に
より、SEQUENASE（USB、 Cleveland、 Ohio、 USA）を用い
て測定した。
【００２９】３． ヒトニューロンベータサブユニット
に関して今日までに単離したｃＤＮＡクローンの記述 ３．１．ＨＢ２６：長さ１．９ｋＢ １．２．の下で記述したオリゴヌクレオチドを用いて、
このｃＤＮＡクローンを単離した。これは、コーディン
グ領域の大部分と、約４５０塩基対から成るイントロン
を含んでいる。
に関して今日までに単離したｃＤＮＡクローンの記述 ３．１．ＨＢ２６：長さ１．９ｋＢ １．２．の下で記述したオリゴヌクレオチドを用いて、
このｃＤＮＡクローンを単離した。これは、コーディン
グ領域の大部分と、約４５０塩基対から成るイントロン
を含んでいる。
【００３０】ヒト海馬ラムダＺＡＰＩＩライブラリーか
ら他の特異的なｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡプロ
ーブとしてＨＢ２６を用いた。
ら他の特異的なｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡプロ
ーブとしてＨＢ２６を用いた。
【００３１】３．２．ＨＢＢ１：長さ１．６ｋＢ このクローンは、ラビット筋肉由来のベータサブユニッ
トに９２％の相同性を示すヒトニューロンベータサブユ
ニットの完全なコーディング領域を含んでいる。ＨＢＢ
１は、全体の長さが１．９ｋＢの、ＨＢ２６−３の配列
決定部分である。
トに９２％の相同性を示すヒトニューロンベータサブユ
ニットの完全なコーディング領域を含んでいる。ＨＢＢ
１は、全体の長さが１．９ｋＢの、ＨＢ２６−３の配列
決定部分である。
【００３２】３．３． ＨＢＢ２：長さ１．８ｋＢ このクローンは、ラビット筋肉由来のベータサブユニッ
トに７４％の相同性を示す別のサブタイプのヒトニュー
ロンベータサブユニットである。ＨＢ２８ｔ７は、完全
なＨＢＢ２クローンの部分配列である。
トに７４％の相同性を示す別のサブタイプのヒトニュー
ロンベータサブユニットである。ＨＢ２８ｔ７は、完全
なＨＢＢ２クローンの部分配列である。
【００３３】３．４． ＨＢＢ３：長さ１．８ｋＢ このクローンは、３番目のサブタイプのヒトニューロン
ベータサブユニットを表している。位置１２８８に及ん
で、このｃＤＮＡは、ラビット筋肉由来のベータサブユ
ニットに９２％の相同性を示す。位置１２８９から後で
は、ラビット筋肉型に対する相同性は検出されない。
ベータサブユニットを表している。位置１２８８に及ん
で、このｃＤＮＡは、ラビット筋肉由来のベータサブユ
ニットに９２％の相同性を示す。位置１２８９から後で
は、ラビット筋肉型に対する相同性は検出されない。
【００３４】挙げた４種のクローン全ては、ラビット筋
肉のベータサブユニットに比較して、４５個のアミノ酸
から成る欠失を示しており、これは、ニューロンベータ
サブユニットの特徴である。
肉のベータサブユニットに比較して、４５個のアミノ酸
から成る欠失を示しており、これは、ニューロンベータ
サブユニットの特徴である。
【００３５】ＨＢＢ１配列の表は、１６１２ｂｐを含ん
でおり、そして完全なコーディング領域を含んでいる。
でおり、そして完全なコーディング領域を含んでいる。
【００３６】ＨＢＢ２配列の表は、１８３０ｂｐを含ん
でおり、そして完全なコーディング領域を含んでいる。
でおり、そして完全なコーディング領域を含んでいる。
【００３７】ＨＢＢ３配列の表は、１８０５ｂｐを含ん
でおり、そして同様に完全なコーディング領域を含んで
いる。
でおり、そして同様に完全なコーディング領域を含んで
いる。
【００３８】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
ある。
【００３９】１． 配列２９１７８−１ないし２９１７
８−３を有する電圧作動カルシウムチャネルのヒトベー
タサブユニットのｃＤＮＡ。
８−３を有する電圧作動カルシウムチャネルのヒトベー
タサブユニットのｃＤＮＡ。
【００４０】２． 第１項記載のｃＤＮＡから誘導され
る蛋白質。
る蛋白質。
【００４１】３． アフリカツメガエル卵母細胞におけ
る第１項記載のｃＤＮＡの発現。
る第１項記載のｃＤＮＡの発現。
【００４２】４． 昆虫細胞における第１項記載のｃＤ
ＮＡの発現。
ＮＡの発現。
【００４３】５． 哺乳動物細胞における第１項記載の
ｃＤＮＡの発現。
ｃＤＮＡの発現。
【００４４】６． 種々の種由来の電圧作動カルシウム
チャネルのアルファ−１およびアルファ−２サブユニッ
トに関するｃＤＮＡと第１項記載のｃＤＮＡとの共発
現。
チャネルのアルファ−１およびアルファ−２サブユニッ
トに関するｃＤＮＡと第１項記載のｃＤＮＡとの共発
現。
【００４５】７． 電圧作動カルシウムチャネルの活性
を調節する物質を見付け出しそしてそれらを特徴づける
スクリーニングシステムとしての、第６項で得られる組
換え型発現システムの使用。
を調節する物質を見付け出しそしてそれらを特徴づける
スクリーニングシステムとしての、第６項で得られる組
換え型発現システムの使用。
【００４６】
配列番号２９１７８−１ 国際コード：ＨＢＢ１ 長さ：１６１２ｂｐ 種類：ＤＮＡ＋アミノ酸
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】配列番号２９１７８−２ 国際コード：ＨＢＢ２ 長さ：１８３０ｂｐ 種類：ＤＮＡ＋アミノ酸
【００５１】
【表４】
【００５２】
【表５】
【００５３】
【表６】
【００５４】配列番号２９１７８−３ 国際コード：ＨＢＢ３ 長さ：１８０５ｂｐ 種類：ＤＮＡ＋アミノ酸
【００５５】
【表７】
【００５６】
【表８】
【００５７】
【表９】
Claims (1)
- 【請求項１】 配列２９１７８−１ないし２９１７８−
３を有する電圧作動カルシウムチャネルのヒトベータサ
ブユニットのｃＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4204716 | 1992-02-17 | ||
| DE4204716.1 | 1992-07-06 | ||
| DE4222126A DE4222126A1 (de) | 1992-02-17 | 1992-07-06 | Humane neuronale beta-untereinheiten spannungsabhaengiger calciumkanaele und deren verwendung |
| DE4222126.9 | 1992-07-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678773A true JPH0678773A (ja) | 1994-03-22 |
Family
ID=25911933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5048720A Pending JPH0678773A (ja) | 1992-02-17 | 1993-02-16 | 電圧作動カルシウムチヤネルのヒトニユーロンベータサブユニツト |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5643750A (ja) |
| EP (1) | EP0556651B2 (ja) |
| JP (1) | JPH0678773A (ja) |
| AT (1) | ATE124723T1 (ja) |
| CA (1) | CA2085502A1 (ja) |
| DE (2) | DE4222126A1 (ja) |
| DK (1) | DK0556651T4 (ja) |
| ES (1) | ES2075727T5 (ja) |
| GR (2) | GR3017001T3 (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989009834A1 (en) | 1988-04-04 | 1989-10-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associ | Calcium channel compositions and methods |
| US6096514A (en) * | 1988-04-04 | 2000-08-01 | Sibia Neurosciences, Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US5407820A (en) * | 1988-04-04 | 1995-04-18 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Calcium channel α-2 subunit DNAs and cells expressing them |
| US5851824A (en) * | 1988-04-04 | 1998-12-22 | Sibia Neurosciences, Inc. | Human calcium channel α-1C/α-1D, α-2, β-1, and γsubunits and cells expressing the DNA |
| US5846757A (en) * | 1988-04-04 | 1998-12-08 | Sibia Neurosciences, Inc. | Human calcium channel α1, α2, and β subunits and assays using them |
| US5876958A (en) * | 1988-04-04 | 1999-03-02 | Sibia Neurosciences, Inc. | Assays of cells expressing human calcium channels containing α1 β subunits |
| US6653097B1 (en) | 1991-08-15 | 2003-11-25 | Merck & Co., Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US6387696B1 (en) | 1988-04-04 | 2002-05-14 | Merck & Co., Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US5874236A (en) * | 1988-04-04 | 1999-02-23 | Sibia Neurosciences. Inc. | DNA encoding human calcium channel α-1A, β1, β-2, and β-4 subunits, and assays using cells that express the subunits |
| US20040018510A1 (en) | 1990-11-08 | 2004-01-29 | Merck & Co., Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US5386025A (en) * | 1990-02-20 | 1995-01-31 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Calcium channel compositions and methods |
| US5429921A (en) * | 1988-04-04 | 1995-07-04 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Assoc. Inc. | Assays for agonists and antagonists of recombinant human calcium channels |
| US5670113A (en) | 1991-12-20 | 1997-09-23 | Sibia Neurosciences, Inc. | Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same |
| US6090623A (en) * | 1993-08-11 | 2000-07-18 | Merck & Co., Inc. | Recombinant human calcium channel β4 subunits |
| WO1996022307A1 (en) | 1995-01-19 | 1996-07-25 | The Research Foundation Of State University Of New York | Genes encoding an insect calcium channel |
| US5712158A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-27 | Warner-Lambert Company | Cell line for the rapid expression of functional calcium channels |
| US6040436A (en) * | 1996-09-16 | 2000-03-21 | American Home Products Corporation | Nucleic acid encoding human neuronal calcium channel subunits |
| US6528630B1 (en) | 1997-12-03 | 2003-03-04 | Merck & Co., Inc. | Calcium channel compositions and methods |
| AU4125699A (en) | 1998-06-02 | 1999-12-20 | University Technologies International Inc. | Retinal calcium channel (alpha)1f-subunit gene |
| US6365337B1 (en) | 1998-07-27 | 2002-04-02 | University Of Iowa Research Foundation | Genes encoding neuronal voltage-gated calcium channel gamma subunits |
| US20030180712A1 (en) * | 2002-03-20 | 2003-09-25 | Biostratum Ab | Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels |
| CA2539681A1 (en) * | 2003-10-02 | 2005-04-21 | Merck & Co., Inc. | Nucleic acid molecules encoding novel human low-voltage activated calcium channel proteins, designated - alpha 1i-1 and alpha 1i-2, encoded proteins and methods of use thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4950739A (en) * | 1988-02-10 | 1990-08-21 | New York University | Membrane calcium channels and factors and methods for blocking, isolating and purifying calcium channels |
| US5429921A (en) * | 1988-04-04 | 1995-07-04 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Assoc. Inc. | Assays for agonists and antagonists of recombinant human calcium channels |
| US5386025A (en) * | 1990-02-20 | 1995-01-31 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Calcium channel compositions and methods |
-
1992
- 1992-07-06 DE DE4222126A patent/DE4222126A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-02-04 ES ES93101719T patent/ES2075727T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-04 DE DE59300318T patent/DE59300318D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-04 DK DK93101719T patent/DK0556651T4/da active
- 1993-02-04 EP EP93101719A patent/EP0556651B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-04 AT AT93101719T patent/ATE124723T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-02-12 CA CA002085502A patent/CA2085502A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-16 JP JP5048720A patent/JPH0678773A/ja active Pending
-
1994
- 1994-11-21 US US08/343,733 patent/US5643750A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-08-02 GR GR950402120T patent/GR3017001T3/el unknown
-
2000
- 2000-01-27 GR GR20000400201T patent/GR3032507T3/el not_active IP Right Cessation
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| CA2085502A1 (en) | 1993-08-18 |
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