JPH05320194A - 組織に特異的なヒトニユーロンのカルシウムチヤンネルサブタイプおよびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 組織に特異的なヒトニューロンのカルシウム
チャンネルサブタイプおよびそれらの使用。 【構成】 クローン化したヒトニューロンのカルシウム
チャンネル類、並びに該カルシウムチャンネルを用いた
カルシウムチャンネル拮抗剤の試験方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】カルシウムイオンは、全ての生物学的シス
テムにおいて多数の機能を有する。細胞のカルシウム恒
常性は、神経細胞の生理学に関して特に必須な役割を果
している。神経細胞の外では１ｍＭであるのに対して、
細胞内のカルシウム濃度は約０．１μＭである。この強
濃度勾配（１０，０００倍）は、主に、特定のカルシウ
ム拮抗剤によって遮断され得る電圧作動カルシウムチャ
ンネル（ＶＯＣＣ）によって調節されている。大脳虚血
（大脳の出血）中、この影響を受けた梗塞領域のニュー
ロンに関するカルシウム恒常性が相当に変化する。この
電圧依存カルシウムチャンネルは、長引いた膜脱分極に
より、開放状態で維持され、その結果として、カルシウ
ムイオンの多量流入が生じる。この過程中、細胞内カル
シウム濃度が１０００倍にまで上昇する。このカルシウ
ム大過剰により、カルモジュリンとの結合が生じること
で、種々のカルシウム／カルモジュリン依存細胞酵素
系、例えばキナーゼ、プロテアーゼおよびホスホリパー
ゼが活性化される。これらの酵素系は、長期間活性化さ
れたとき一緒になって、神経細胞に不可逆的損傷をもた
らす。

【０００２】大脳虚血中の神経保護に対する治療学的方
法は、多量のカルシウムが神経細胞に流入するのを可逆
的に遮断することである。従って、この電圧依存性ニュ
ーロンカルシウムチャンネルが適切な薬学的標的であ
る。ＶＯＣＣは、種々の筋肉細胞（脈管の筋肉、心臓の
筋肉および骨格の筋肉）、ニューロン、並びに組織に特
異的な生理学的特性を有する分泌細胞、の中に存在して
いる。

【０００３】電気生理学的調査（Tsien他、 1988、 Trend
s in Neurol. Sci. 11: 431-438）で、少なくとも３種
から成る異なる種類のＶＯＣＣ（Ｌ−、Ｎ−およびＴ−
チャンネル）が存在していることが示唆された。１，４
−ジヒドロピリジン類（ＤＨＰ）は、Ｌ型カルシウムチ
ャンネルの可能な遮断剤であり、これらは、筋肉細胞お
よびまた神経細胞の中に見いだされる。ラビットの骨格
筋肉ジヒドロピリジンレセプタが生化学的に特徴づけら
れ、そしてクローン化された（Tanabe他、 1987、 Nature
328: 313-318）。ｃＤＮＡデータから誘導されたとこ
ろの、ＶＯＣＣのこのα１サブユニットの主要配列は、
５個のＮ−グリコシル化部位と７個の可能な燐酸化部位
とを有する２１２ｋＤのトランスメンブラン蛋白質に一
致している。この蛋白質は、互いに類似した４つのトラ
ンスメンブランドメインを含んでおり、これらのドメイ
ンの各々は、６個の推定α−螺旋の膜浸透セグメント
（Ｓ１〜Ｓ６）を有している。各場合共、各々のドメイ
ンの第四トランスメンブランセグメント（Ｓ４）は、正
電荷（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を有する規則的パターンを含ん
でおり、これが該カルシウムチャンネルの電圧センサー
を形成し得る。このクローン化したα１サブユニットの
構造は、ＤＨＰに敏感なカルシウムチャンネルのイオン
伝導性電圧制御単位に一致している。

【０００４】クローン化したコイ骨格筋肉ＤＨＰ−Ｒの
ｃＤＮＡクローン（Grabner他、 1991、 Proc. Natl. Ac
a. Sci. (USA) 88:727-731）を雑種形成用プローブとし
て用いることで、ニューロンから、関係したヒトカルシ
ウムチャンネルを単離し、そしてそれらの特徴づけを行
った。このクローン化方策により、ヒトニューロンのｃ
ＤＮＡライブラリーから得られる数多くの種々の相同性
ｃＤＮＡクローンを単離しそして特徴づけすることが可
能となり、そして我々は、種々のカルシウムチャンネル
サブタイプがヒトの中枢神経系に存在している、ことに
対する明確な証拠を得た。更に一層のニューロンサブタ
イプは、今日までそれ用のいかなるリガンド（作動剤、
拮抗剤）も開示されていないところの、新規なレセプタ
部位を有している。このクローン化されたカルシウムチ
ャンネルのサブタイプは、形質転換した動物細胞（例え
ばcos細胞、マウスＬ細胞、CHO細胞など）内で発現すべ
きものであり（Gluzman、 1981、 Cell 23:175およびChen
他、 1987、 Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752）、そしてこ
れらは、新規でサブタイプに特異的なリガンドをスクリ
ーニングするための結合分析および／または機能試験分
析で用いられる。これには、適切な真核発現ベクター中
への、種々のカルシウムチャンネルサブタイプ（心臓チ
ャンネル、脈管チャンネルおよび骨格筋肉チャンネルを
含む）の完全もしくは部分的ｃＤＮＡ遺伝子のクローン
化を伴う（Sambrook他著、「分子クローン化、実験室マ
ニュアル」（Molecular Cloning, A laboratory manua
l）Chris Nolan編集、 Cold Spring Harbor Laboratory
Press、 New York、 N.Y.、 1989）。蛋白質の発現は、相
同性を示す調節要素（プロモーターおよびエンハンサ
ー）か、或は公知のエンハンサーおよびＲＮＡプロセシ
ングシグナル（キャッピング、ポリＡ）との組み合わせ
における、非相同性を示すプロモーター（ウイルス性、
例えばＳＶ４０、ＢＰＶ、ＣＭＶなど、或は誘発性、例
えばメタロチオニン、ｃＡＭＰ、カルシウム、温度な
ど）のどちらかで制御される。

【０００５】更に本発明は、これらの組換え型細胞系を
用いた機能的カルシウムフラックス分析法を開発するこ
とを意図したものであり、これを補助として用いること
で、特異的リガンドに関して、それらが有する作動もし
くは拮抗効果が試験できる。通常の分析方法と比較した
ときの該組換え体分析方法の特徴および主要利点（大脳
膜調製、細胞系）は、該レセプタ／チャンネル調製の純
度に在る、と言うのは、これは排他的に、いかなる所望
の数でも、移入した動物細胞の表面上に存在していると
ころの、組換え型発現したニューロンカルシウムチャン
ネルサブタイプであるからである。これは、非ニューロ
ン組織型のカルシウムチャンネルに影響を与えない特異
的ニューロンカルシウムチャンネルのリガンドを選択す
るための必須条件である。

【０００６】以下の章で、上述した組換え体スクリーニ
ング分析法の使用に関するいくつかの例を挙げる。

【０００７】１． レセプタ結合分析 ヒトカルシウムチャンネルのサブタイプで形質転換した
動物細胞（例：上を参照）を培養し、そしてこれらを、
膜調製で使用する。競合分析で新規なリガンドをスクリ
ーニングするため、これらの膜調製物を、種々の放射能
標識物質の組（実施例１〜５）を用いた結合試験で使用
する。公知のカルシウムチャンネル結合物質の例には次
のものがある： １．フェニルアルキルアミン類、２．ベンゾチアゼピン
類、３．ジヒドロピリジン類、４．ビスフェニルブチル
ピペリジン類、５．オメガ−コノトキシン類。

【０００８】２． ４５カルシウムフラックス分析 ヒトカルシウムチャンネルのサブタイプで形質転換した
培養細胞の細胞膜（上を参照）を、カリウムイオンまた
はアルカロイド類、例えばベラトリジンなどで脱分極す
る。膜脱分極により、カルシウムチャンネルが開き、そ
の結果として、カルシウムイオンが該細胞に流入する。
この電圧依存カルシウム流入を、放射能標識したカルシ
ウム（４５Ｃａ）（例えば、Messing他、 1985、 J. Phar
macologyand Exp. Therapeutics 235:407-411）で測定
し、そしてこれを、カルシウムチャンネルの拮抗剤もし
くは作動剤の機能試験／スクリーニングのために用い
る。 ３． フラ−２試験 該カルシウムチャンネルが開きそして遮断された後の細
胞内カルシウム濃度を測定するため（例えば、Rosario
他、 1989、 Neurosci. 29、 735-747）、カルシウムに敏
感な蛍光染料（例えばフラ−２またはフルオロ−３）の
存在下で、ヒトカルシウムチャンネルを発現する動物細
胞（上を参照）を用いる。細胞内カルシウム濃度の変化
を蛍光定量法（分光光度法）で測定する。この組換え型
細胞系を、サブタイプに特異的なカルシウムチャンネル
のリガンド（作動剤および拮抗剤）を見つけ出すための
機能試験で用いる。

【０００９】４． 電気生理学 膜脱分極によって生じるカルシウムフラックスを電気生
理学的に測定する（例えば、Carbone他、 1990、 Pfluege
rs Arch.、 416: 170-179）。該組換え型動物細胞系（上
を参照）を補助として用いることで、ヒトカルシウムチ
ャンネル類を、可能性のあるカルシウムチャンネル拮抗
剤もしくは作動剤の効果を直接物理的に測定しそして薬
理学的特徴づけを行うために用いる。

【００１０】５． 間接的測定方法 細胞内カルシウムイオン濃度によって数多くの細胞過程
が制御されている（例えば、レセプタを介在するシグナ
ル伝達、種々の酵素反応、例えば燐酸化反応、脱燐酸化
反応、神経伝達物質の放出、カルシウム依存遺伝子の調
節など）。これらの生化学的反応のいくつかを、特異的
分析で測定する。従って、細胞内のカルシウム依存過程
に対するカルシウムチャンネル調節因子の効果を間接的
に（生理学的に）評価するため、組換え型カルシウムチ
ャンネル発現細胞系を使用する（例えば、Zernig他、 19
86、 Eur. J. Pharmacol. 128、 221-229）。

【００１１】更に、標的となる変異誘発によって導入さ
れる変化、例えば種々のカルシウムチャンネルサブタイ
プのＤＮＡセグメントに関する点変異、挿入、欠失、変
更などにより、評価すべき生理学的過程に対する直接的
効果が可能になる（例えば、YoolおよびSchwarz、 1991、
Nature 349: 700-704）。

【００１２】１． ｃＤＮＡ方法／バンク 相同性スクリーニングを用いてヒトニューロンのカルシ
ウムチャンネルを単離する目的で、下記の市販ｃＤＮＡ
ライブラリーを用いた。

【００１３】ａ） ヒト神経芽細胞腫細胞系からのｃＤ
ＮＡライブラリー ベクター： ラムダ gt10 入手先： Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto、 CA. USA: （Cat. No. HL 1007a） ｂ） ヒト海馬からのｃＤＮＡライブラリー ベクター： ラムダ ZAPII 入手先： Stratagene Inc.、 La Jolla、 CA. US
A: （Cat. No. 936205） ｃ） ヒト側頭皮質からのｃＤＮＡライブラリー ベクター： ラムダ ZAPII 入手先： Stratagene Inc.、 La Jolla、 CA. US
A: （Cat. No. 935205） ｄ） ヒト視覚皮質からのｃＤＮＡライブラリー ベクター： ラムダ gt10 入手先： Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto、 CA. USA: （Cat. No. HL 1081a） ｅ） ヒト前頭皮質からのｃＤＮＡライブラリー ベクター： ラムダ ZAPII 入手先： Stratagene Inc.、 La Jolla、 CA. US
A: （Cat. No. 935205）２． ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ２．１ ｃＤＮＡライブラリーのプレーティングおよび
ニトロセルロースフィルターの処理 製造業者の指示に従うか、或はSambrook他の方法、1989
（Molecular Cloning、A laboratory manual、 Chris Nol
an編集、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 New Y
ork、 N.Y.）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーのプレー
ティングおよびニトロセルロースフィルターの処理を行
った。

【００１４】２．２ 雑種形成用プローブ 使用した雑種形成用プローブは、５’および３’非翻訳
領域を含む、コイ（Cyprinus carpio）骨格筋肉カルシ
ウムチャンネルのα₁サブユニット（ＳＵ）のコード化
領域全体を含んでいるところの、長さが６．１ｋｂのｃ
ＤＮＡクローン（図１）であった（Grabner他、 1990、 P
roc. Natl. Acad. Sci. (USA)、 88: 727-731）。このク
ローンの以下に示す部分を、相同性スクリーニング（図
１）のために用いた： −全体ｃＤＮＡクローン（６．１ｋｂ） −サブフラグメント１，３３６ −サブフラグメント１，５０９ −サブフラグメント１，２４７。

【００１５】ｃＤＮＡバンクに関する更に一層のスクリ
ーニングのため、ヒトカルシウムチャンネルｃＤＮＡク
ローンの下記フラグメントを用いた： −クローンp 1247-9.1.1.2の挿入断片（811 bp） −クローンp 1247-14.1.1.1のサブフラグメント（EcoRI
-KpnI; 205 bp） −クローンp 1247-5.1.2.1.1のサブフラグメント（EcoR
I-SacI; 710 bp） −クローンpCA 33の挿入断片（684 bp） −クローンpCA 3のサブフラグメント（EcoRI-EcoRI、 64
0 bp; PstI-PstI、 198 bp; PstI-Pst、 600 bp） ２．３ 放射能を示すＤＮＡ前駆体を用いたＤＮＡフラ
グメントの標識 二本鎖ＤＮＡフラグメントを標識するため、市販の「ラ
ンダム開始標識用キット」（Ramdom Primed Labeling K
it）（Boehringer Mannheim GmbH、 Post Box 310120、 D
-6800 Mannheim; Cat. No. 1004 760）に関連した標準
プロトコル（Sambrook他、 1989、 Molecular Cloning、 A
laboratory manual、 Chris Nolan編集、Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press、 New York、 N.Y.）を用いた。

【００１６】２．４ 雑種形成および洗浄のための条件 ４２℃の３０％ホルムアミド、５ｘDenhardt溶液、５ｘ
ＳＳＣ中の放射能標識ｃＤＮＡフラグメントを用いて、
ニトロセルロースフィルターを一晩雑種形成した後、下
記のように洗浄した： −室温の２ｘＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中、２ｘ２０分
間 −４５℃の０．２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、２ｘ２
０分間 −室温の０．２ｘＳＳＣ中、１ｘ２０分間。

【００１７】増感紙を用い、−８０℃で種々の時間、こ
れらのフィルターにコダックX-OMATAR Ｘ線フィルムを
暴露した。

【００１８】３． ラムダファージの単離：ｃＤＮＡ挿
入断片のサブクローニングおよび配列決定 ３．１ ラムダgt10からのｃＤＮＡ挿入断片 ラムダ−ファージＤＮＡを単離した後、EcoRIで開裂
し、ｐＵＣ誘導体（pT7T318U：Pharmacia製造）中でこ
れらのｃＤＮＡ挿入断片をサブクローン化し、そしてそ
の後、Sequenase（USB、 Cleveland、 Ohio、 USA製造）を
用いたSangerのジデオキシ末端方法（Sanger他、 1977、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 74:5463-5467）を用いて
ヌクレオチド配列を測定した。

【００１９】３．２ ラムダZAPIIからのｃＤＮＡ挿入
断片 ３．２．１ ラムダファージからの完全ｃＤＮＡ挿入断
片の切除、並びにプラスミドへのこれらの断片の導入 陽性のラムダ−ZAPIIファージから得られるｃＤＮＡ挿
入断片を、ｆ１誘導ヘルパーファージを用い、製造業者
（Stratagene）のプロトコルに従って切除した後、プラ
スミド形態に変換した。

【００２０】３．２．２ 単離したｃＤＮＡ挿入断片の
サイズ測定および配列決定分析 組換え型pBluescriptプラスミド（Sambrook J.他、 198
9、 Molecular Cloning、A laboratory manual、 Chris No
lan編集、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 New
York、 N.Y.）を有するXL1-Blue細胞からプラスミドＤＮ
Ａを調製した後、このＤＮＡの０．５μｇ一定分量を、
制限酵素EcoRIで処理した。この挿入したｃＤＮＡの全
長は、生じてくるＤＮＡフラグメントの数および大きさ
から計算できる。存在するｃＤＮＡのヌクレオチド配列
を、Sequenase（USB、 Cleveland、Ohio、 USA製造）を用
いたSangerの方法により、二本鎖ＤＮＡに対して測定し
た。

【００２１】４． 今日までに単離されたヒトニューロ
ンカルシウムチャンネルｃＤＮＡクローンの記述 今日までに下記のｃＤＮＡクローンを単離し、そしてこ
れらを、他の公知のカルシウムチャンネル配列（例えば
ラビットの骨格筋肉から得られるカルシウムチャンネル
ヌクレオチド配列（Tanabe他、 Nature 328、 313-318);
ヌクレオチドもしくはアミノ酸に対する番号の割り当て
は、EMBLデータバンクにおける番号の割り当てに類似し
ている）と、ＤＮＡおよびアミノ酸配列に関して比較す
ることにより、カルシウムチャンネルとして同定した。

【００２２】同一ヌクレオチド配列を用いた重なりカル
シウムチャンネルｃＤＮＡサブクローンの組み合わせ 同一の重なり配列を有するｃＤＮＡサブクローンを、適
切な制限開裂部位によって組み合わせることで、特定の
カルシウムチャンネルサブタイプをコード化するところ
の、完全もしくは部分的ｃＤＮＡクローンを生じさせ
る。このｃＤＮＡ遺伝子を、真核発現ベクターにより、
哺乳動物細胞中で発現させ、そしてこれを、実施例項１
〜３に記述する分析で用いた。

【００２３】１． pCA33： 長さ：６８３個のヌクレオチド、位置ＡＡ １，０００
〜１，２３０（３’追加的３ＡＡ）；ＩＩＩｓ６からの
第三ドメインから第四ドメインIVs3に至る配列から成
る。

【００２４】２． p1247-5.1.2.1.1： 長さ：約４，９１９ｂｐ；位置ＡＡ３４３からコード化
領域の末端；従って、ドメインＩ後の完全遺伝子を含
む。

【００２５】３． p1247-9.1.2： 長さ８１１ｂｐ；位置ＡＡ１，１１５〜１，３９０、従
って全体のドメインＩＶ（ｓ１〜ｓ６）および両側に側
面を接する配列を包含する。

【００２６】４． p1247-10.1.1.1： 長さ１，３５４ｂｐ；位置ＡＡ１，０５０〜１，５１
２、従って第三ドメインの端（ＩＩＩｓ６）、全体のド
メインＩＶ、そしてＣ末端を接する約１３０個のＡＡを
含み、これらは、この蛋白質の最終細胞質部分の一部で
ある。

【００２７】５． p1247-14.1.1： 長さ：５，４３８ｂｐ；位置ＡＡ９６７〜１，３２７。
このクローンは大きく（位置１〜３，２３８）クローン
pR14-5.3.3.1.（位置２，９８８〜４，２３２）に重な
っている。これらの２つのクローンは、重なり部分に関
してほとんど同一である。pR14-5.3.3.1.との相違は、
下記である（pR14-5.3.3.1中のヌクレオチドおよび位置
は、各場合共、括弧内に示してある）： （１）位置５２０中のシトシン（Ｔ：３，５０７）：誘
導した蛋白質配列には変化無し。

【００２８】（２）位置７７５中のシトシン（Ｇ：３，
７６８）：誘導した蛋白質配列には変化無し。

【００２９】（３）位置１，６１７中のシトシン（Ｔ：
４，６１１）。

【００３０】（４）位置２，３６０中のアデノシン
（Ｇ：５，３５３）。

【００３１】（５）位置７０８で６個のヌクレオチド欠
失（ＣＧＧＡＡＡ：３，６９５〜３，７００）。

【００３２】（６）位置１，０３０でアデノシン残基欠
失；pR14-5.3.3.1と比較したとき、これは、読み枠シフ
トを生じ、その結果として停止コドンが、位置１，０２
８〜１，０３０に在る誘導された蛋白質を停止させる。

【００３３】（７）位置３，２４０から後、pR14-5.3.
3.1中には存在していない３’非翻訳領域の、更に２，
１９９個のヌクレオチドが存在している。これに続い
て、ポリアデニレートテールの一部が存在している。

【００３４】クローンp1247-14.1.1.1とpR14-5.3.3.1と
の高い類似性により、位置１，０１３に在るヌクレオチ
ドの欠失はｃＤＮＡ合成における人為産物である。

【００３５】６． pR9112-4.1.1： 長さ約１，７２２ｂｐ；位置ＡＡ１，２２３〜１，８７
０；従ってこのクローンは、ｓ４から後、第四ドメイン
のＣ末端部分、そしてこの蛋白質の実際上のＣ末端に対
する完全なコード化配列を含んでいる。このクローン
は、クローン1247-9.1.1.2の重なり配列とほとんど同じ
である。pR9112-4.1.1.1およびpR9112-2.1.1.1の配列は
本質的に同じであり（今日までに配列決定された重なり
の１，４６４個のヌクレオチド中１ｂｐの差）；そして
これらのクローンは、恐らくは、同じｍＲＮＡの重なり
ｃＤＮＡクローンである。

【００３６】７． pR9112-10.1.1.1： 長さ２，０４９ｂｐ；位置ＡＡ９９１〜１，６５０。こ
のクローンは、ドメインＩＩＩの一部（ｓ６）、第四ド
メイン全体、そしてこの蛋白質のＣ末端細胞質部分の一
部、をコード化するｃＤＮＡ配列を含んでいる。クロー
ンpR9112-10.1.1.1は、５７ｂｐ挿入断片（１，４５４
〜１，５１０）だけ、pR9112-2.1.1.1およびpR9112-4.
1.1.1とは異なっている。この挿入断片は、両端にスプ
ライシング共通配列を有しており、従ってこのことは、
この代替スプライシングがその差の原因になっているこ
とを示唆している。

【００３７】８． pR9112-12.1.1.1： 長さ９９７ｂｐ；位置ＡＡ１，５０９まで。このｃＤＮ
Ａクローンの配列は、クローンp1247-１4.1.1.1のそれ
とほとんど同じである。このクローンの５’末端は、ク
ローニング人為産物として追加的に、約２５０ｂｐのミ
トコンドリアＤＮＡと、３９ｂｐのポリ（Ａ）部分を含
んでいる。

【００３８】９． pR9112-2.1.1.1： 長さ１，４７１ｂｐ；ｃＤＮＡクローンpR9112-4.1.1.1
と同様。このクローンは、ＩＶｓ３−４から後、この蛋
白質の実際上のＣ末端までのコード化領域全体、そして
また、約５００ｂｐの、該ｍＲＮＡの３’非翻訳領域、
を含んでいる。

【００３９】１０． pRR5-8： 長さ２，６５５ｂｐ；このクローンは、５’末端に在る
２３５ｂｐの非翻訳配列に続いて、ＡＴＧ開始コドン
（位置２３６〜２３８）を含んでいる。この開始コドン
から、このクローンの３’末端に向かってオープン読み
枠が広がっている。そこから誘導される蛋白質は、カル
シウムチャンネルｃＤＮＡ遺伝子の実際上のＮ末端から
始まって、ドメインＩおよびＩＩ、並びにドメインＩＩ
とＩＩＩの間に在る細胞内ループの一部を含んでいる。
位置１，３１８から３’末端に向かって、このクローン
はクローンp1247-5.1.2.1.1と重なっている。この２つ
のクローンは、例えば共有するXhoI開裂部位（pRR5-8の
場合、位置１，５０６〜１，５１１）で、互いに結合し
て、細胞質Ｎ末端に加えて、ドメインＩ〜ＩＶおよびこ
のカルシウムチャンネルの隣接する細胞質Ｃ末端領域、
をコード化するｃＤＮＡを生じさせる。

【００４０】１１． pR14-5.3.3.1： 長さ：６，２３２ｂｐ；位置ＡＡ３５８からカルシウム
チャンネルのＣ末端まで。このクローンは、５’末端
に、ヒトＡｌｕ繰り返し配列に対して８５％の相同性を
示しそしてｃＤＮＡクローニング中に残りの５，９８０
ｂｐのカルシウムチャンネルｃＤＮＡと人工的に結合さ
せられたところの、２５２ｂｐを含んでいる。このカル
シウムチャンネルをコード化するｃＤＮＡストランドの
オープン読み枠は、１，９３１ＡＡをコード化し、そし
てこれは、ドメインＩＩ〜ＩＶ、およびこのカルシウム
チャンネルのＣ末端細胞質部分を含む。これに続いて、
位置６，２１５〜６，２２０に在るポリアデニレート化
シグナルを含む１８７ｂｐの３’非翻訳領域が在り、そ
してポリ−Ａテール（４４アデノシン残基）で終結す
る。

【００４１】１２． pCA3 長さ２，８３７ｂｐ；内部EcoRI開裂部位（２個のサブ
フラグメント：２，１９７ｂｐ、６４０ｂｐ）を有す
る。このｃＤＮＡクローンの５’末端はドメインＩＩと
ＩＩＩの間に位置しており、そして３’末端はＡＡ１，
６２２に在る。このクローンは、完全ドメインＩＩＩと
ＩＶ、並びにＣ末端コード化配列の一部を包含してい
る。このｃＤＮＡクローンの５’末端は、８３０ｂｐの
長さに渡って、クローンpCA9.3の３’末端と重なってい
る。両方のｃＤＮＡクローンは６７１ｂｐに渡って同一
であるが、クローンpCA3の５’末端の第一１５９ｂｐの
みが、クローンpCA9.3の相当する部分に対して相同性を
示していない（図２、影を付けた部分）。クローンpCA3
とpCA9.3は、重なり領域中の共通Pm1I制限開裂部位を通
して結合できる。

【００４２】１３． pCA9.3 長さ１，８５７ｂｐ；このｃＤＮＡクローンの５’末端
はドメインＩ（ＡＡ３３７）の直後で開始し、３’末端
はＡＡ９２２に在り、そしてこのｃＤＮＡクローンは、
ドメインＩＩＩの第四トランスメンブラン領域（ＩＩＩ
Ｓ４）に向かいそしてそれを含んでいる第二細胞質部分
（ドメインＩとＩＩの間）の配列を包含している。

【００４３】１４． p1247-4.2.1.1： 長さ９２０ｂｐ；ラビットの骨格筋肉α₁サブユニット
（ドメインＩＶｓ３〜ＩＶｓ６）の位置ＡＡ１，１７８
〜1，４９６。クローンp1247-4.2.1.1の配列は、クロー
ンp1247-10.1.1.1の配列の範囲内に完全に含まれてい
る。両方のクローンは、クローン1247-4中の６個の塩基
対から成る挿入断片（位置８８〜９３）を除いて同じで
あり、そして更に２つの塩基交換が在る。

【００４４】１５． pRR5-6cort 長さ１，４２４ｂｐ；位置ＡＡ２５〜４５８。このクロ
ーンは、５’末端に、位置６０に在る推定スプライスの
ドナー部位を含んでおり、このことは、最初の６０個の
ヌクレオチドはイントロン配列を代表している可能性が
あることを意味している。このカルシウムチャンネルコ
ード化領域（位置６１から後）は、Ｎ末端の細胞質領域
の一部、並びにドメインＩ全体とドメインＩＩの第一膜
浸透領域（Ｓ１）を包含している。

【００４５】１６． pR5-4cort 長さ９１０ｂｐ；位置ＡＡ０９〜７１３。このクローン
は、これの５’末端に、クローンpR5-6cortの３’末端
に対して１５１ｂｐの重なりを有している（１５１ｂｐ
に渡って１００％の同一性）。従って、これらの２つの
クローンは、独立して、単一ｍＲＮＡのクローン化され
たｃＤＮＡ部分を表しており、そしてこれらは、例えば
共有するStu I制限開裂部位を通して互いに結合でき
る。

【００４６】１７． pRR14-35（このクローンの５’末
端） 長さ約３，４００ｂｐ（これの１，１００ｂｐを今日ま
でに配列決定した）；位置：このクローンの５’末端は
ＡＡ２５７に在り、従ってドメインＩの膜通路Ｓ５とＳ
６の間に在る。配列決定した領域の中には、このクロー
ンとpRR14-5.3.3.1との間に、配列が同一の重なりが在
る（位置２５３〜９６４）。従って、これらの２つのク
ローンpRR14-35とpRR14-5.3.3.1は、ｍＲＮＡに関する
独立してクローン化された２個のｃＤＮＡフラグメント
であると見なすことができる。クローンpRR14-35は、pR
R14-5.3.3.1中に含まれているカルシウムチャンネルｃ
ＤＮＡの５’末端に１２９ＡＡを加え、従ってこのクロ
ーンの５’末端に人工的に存在させたＡｌｕ繰り返し配
列を削除している。これらの２つのクローンは、連結Bg
l II制限開裂部位を通して互いに結合できる。

【００４７】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。

【００４８】１． クローン化したヒトニューロンのカ
ルシウムチャンネル類。

【００４９】２． 配列番号27980/1〜27980/17を有す
るクローン化したヒトニューロンのカルシウムチャンネ
ル類。

【００５０】３． 第１項のカルシウムチャンネルを用
いたカルシウムチャンネル拮抗剤の試験方法。

【００５１】４． 第２項のカルシウムチャンネル類の
１個以上を用いたカルシウムチャンネル拮抗剤の試験方
法。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１の上の部分（Ａ）は、コイの骨格筋肉カル
シウムチャンネルのｃＤＮＡを表すと共に、いくつかの
制限エンドヌクレアーゼのための開裂部位と、スクリー
ニング用プローブとして用いたサブフラグメントも示
す。下の部分（Ｂ）は、ヒトクローンp1247-5.1.2.1.1
およびp1247-14.1.1のＤＮＡフラグメントを示してお
り、これらは、制限酵素EcoRI/SacIまたはEcoRI/KpnIを
用いて調製したものであり、そしてクローンp1247-9.1.
1.2のｃＤＮＡ挿入断片全体（これはまたスクリーニン
グ用プローブとしても用いた）を示している。

【図２】図２の上の部分（Ａ）は、ラビットの骨格筋肉
カルシウムチャンネルのα₁サブユニットの図を示して
いる。ドメインは箱型で示し、そしてローマ数字で番号
を付ける。これらのドメインの中に、黒い箱型の形でト
ランスメンブラン領域を強調して示す。下の部分（Ｂ）
は、今日までに単離したヒトニューロンのカルシウムチ
ャンネルの一部を示し、そしてこれらを、それらの大き
さ、並びにラビット骨格筋肉カルシウムチャンネルの蛋
白質に対するそれらの相同性に従って配置する。

【図３】組織に特異的なヒトニューロンのカルシウムチ
ャンネルサブタイプのクローニングおよび発現の図、並
びに分析システムにおけるそれらの使用。カルシウムチ
ャンネルのサブタイプをコード化する完全ｃＤＮＡを、
適切な制限開裂部位を用いた重なりラムダファージから
組み立て、そして真核発現ベクター中にクローン化し
た。適切な真核細胞を形質転換するために上記ベクター
を用い、そしてカルシウムチャンネルサブタイプの蛋白
質を発現する安定な細胞系を生じさせる。その後、これ
らの安定な細胞系を、上述したレセプタ結合分析で用い
る。このカルシウムチャンネルのコード化ｃＤＮＡ中に
導入する追加的変異は、構造／機能ドメインを同定する
ための補助を意図したものである。

【化１】

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フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アクセル・ウンテルベツク ドイツ連邦共和国デー5060ベルギツシユグ ラートバツハ２・ロメルシヤイダーヘーエ ３ (72)発明者 ピーター・ラエ アメリカ合衆国コネチカツト州06516ウエ ストヘブン・モーガンレイン400 マイル ス・インコーポレーテツド内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 クローン化したヒトニューロンのカルシ
   ウムチャンネル類。