JPH0670767A - ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチド及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】(Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.
Leu.Lys.又は(Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.
Leu.Leu.Glu.（ヒト血液凝固第ＸIII 因子の酵素作用に
より血栓と共有結合を生ずるオリゴペプチド）を、天然
型ヒトプロウロキナーゼの全アミノ酸配列のうち 144位
ロイシンから 411位ロイシンまでのポリペプチドのＮ端
側に付したヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチド 【効果】本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチド
は、血栓特異性及び血栓溶解性が高く、血栓浸透性が優
れ且つ生体内半減期が長く、血栓溶解剤として優れてい
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト低分子プロウロキ
ナーゼ様ポリペプチドに関するものであり、該ポリペプ
チドは血栓溶解剤としての機能を有する。

【０００２】

【従来の技術】

技術の背景 ヒトウロキナーゼは人尿中に微量存在する酵素で、不活
性のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化する作用を
有し、生成したプラスミンは、血栓を溶解することがで
きる。このためヒトウロキナーゼは血栓症治療薬として
広く臨床使用されている。しかしヒトウロキナーゼは血
栓との親和性が極めて低く、且つ活性型であるため血栓
部位に存在するプラスミノーゲンのみならず、循環血中
のプラスミノーゲンをも活性化し、循環血中に大量のプ
ラスミンを生成する。循環血中に過剰に生成したプラス
ミンは血小板の機能変換をもたらし、フィブリノーゲ
ン、血液凝固第Ｖ因子及び第ＶIII 因子を分解し、全身
性出血傾向の副作用を惹起し死に至らしめる危険があ
る。

【０００３】理想的な血栓治療薬は血栓成分を攻撃する
が、循環血中の血小板や血液凝固因子の消費を伴う凝固
系の崩壊を起こさず、且つ望ましい体内半減期を有する
ものである。近年第二世代の血栓治療薬として、ヒトプ
ロウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー（以後ｔＰＡと略称する）が開発されている。これ等
は血栓特異的にプラスミノーゲンを活性化する。従って
大量投与しても全身性出血傾向を惹起させる危険性が少
ない。しかしヒトプロウロキナーゼはヒトウロキナーゼ
に比較して血栓親和性が増しているが、なお不充分であ
る。又ｔＰＡは血中にインヒビター（プラスミノーゲン
アクチベーターインヒビターＩ）が多量に存在するこ
と、血中半減期が短く、大量投与しなければ治療効果が
出ないこと、血栓溶解による動脈再開通後再閉塞を起こ
すことが多い等の欠陥がある。血栓溶解剤の体内での半
減期を延長する試みが多々なされているが、半減期の延
長に伴って血栓親和性が低下する傾向がみられ、上記の
出血傾向を回避するには問題がある。（スロンボシス・
ヘモスタシス；Thrombosis Haemostasis 第66巻 88頁
1991年）

【０００４】類似技術 理想的な血栓症治療薬として、プラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビターＩで不可逆的に失活されることの
ないヒトプロウロキナーゼの血栓親和性の増大した物質
が想定され、かかる物質の創製が試みられている。かか
る物質としてヒトプロウロキナーゼ誘導体のＮ端にヒト
血液凝固第ＸIII 因子の基質となるオリゴペプチドを付
加したヒトウロキナーゼ様ポリペプチドが提案されてい
る。（特開平４−７５５８４）

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトプロウ
ロキナーゼよりも血栓親和性が著しく高められ、且つ体
内の半減期が改善されたヒト低分子プロウロキナーゼ様
ポリペプチドであり、さらに該ポリペプチドの経済的製
造方法を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、(Met.)Gln.Gl
u.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.Leu.Lys.（以下Ｖ30と
いう) 又は(Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Le
u.Leu.Glu.（以下Ｖ31という) [ (Met.)は場合によって
は存在することがあるメチオニン] （以下Ｖ30及びV31
を総括して本オリゴペプチドという) を、天然型ヒトプ
ロウロキナーゼの全アミノ酸配列のうち 144位ロイシン
から 411位ロイシンまでのポリペプチド（以下本ヒト低
分子プロウロキナーゼという）のＮ端側に付したことを
特徴とするヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチド
（以下本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチドと
いう）であり、本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペ
プチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡセグメントであり、該ＤＮＡセグメント及びそ
の発現のための制御領域を含有し、なおかつ大腸菌で複
製するのに必要なＤＮＡ配列を含有するプラスミド、及
び、該大腸菌を培養し、その培養菌体から採取すること
を特徴とする本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプ
チドの製造方法である。

【０００７】本発明は、ヒトプロウロキナーゼのＮ端に
付加されたとき、ヒト血液凝固第ＸIII 因子の酵素作用
により速やか且つ高率に血栓と共有結合を生ずることで
選択されたオリゴペプチドを、本来全く血栓親和性を有
しないヒト低分子プロウロキナーゼのうちそのＮ端に本
オリゴペプチドが付加された構造によって相乗的に血栓
親和性が向上したことから選択されたヒト低分子プロウ
ロキナーゼのＮ端側に付したものである。

【０００８】次に本発明を詳細に説明する。 （Ａ）本オリゴペプチドについて 本オリゴペプチドとは血液凝固第ＸIII 因子の酵素作用
により速やかに血栓と共有結合を生ずる構造を有するオ
リゴペプチドとして特開平４−７５５８４で提案された
−Ｇｌｎ−＊−＊−Ｖａｌ−＊−Ｐｒｏ−のアミノ酸配
列を有するオリゴペプチドの内から選択された下記のオ
リゴペプチドである。 (Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.Leu.Lys. ( Ｖ30) 及び (Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.Leu.Glu. (Ｖ31) 〔(Met.)は場合によっては存在することがあるメチオニン〕

【０００９】（Ｂ）本ヒト低分子プロウロキナーゼにつ
いて〔ＣＵＫ（ー、ｋ）〕 ヒト低分子プロウロキナーゼのうちそのＮ端に本オリゴ
ペプチドが付加された構造によって相乗的に血栓親和性
が向上したことから選択されたヒト低分子プロウロキナ
ーゼ、即ち天然型ヒトプロウロキナーゼの全アミノ酸配
列のうち、144位ロイシンから 411位ロイシンまでのポ
リペプチド〔ＣＵＫ（ー、ｋ）と略称する〕。

【００１０】（Ｃ）本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドについて 本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチドは、本オ
リゴペプチドと本ヒト低分子プロウロキナーゼとの組合
せ即ちＶ30−ＣＵＫ（ー、ｋ）及びＶ31−ＣＵＫ（ー、
ｋ）を指す。

【００１１】（Ｄ）本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドの遺伝子系と製造方法について 本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコード
するＤＮＡセグメントは、本オリゴペプチドをコードす
るＤＮＡと本ヒト低分子ウロキナーゼをコードするＤＮ
Ａとを連結したものからなる。斯かるＤＮＡは、各アミ
ノ酸をコードするコドンを連続させたもので、天然に存
在するＤＮＡをそのまま用いることができるが、化学合
成または人工的な変異の導入によってアミノ酸配列を変
化させないようなコドンの組合せができることはよく知
られている。

【００１２】本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプ
チドをコードするＤＮＡセグメントは、発現型プラスミ
ドに組換えられ、適切な宿主に形質転換されることによ
って遺伝子発現される。その結果、本ヒト低分子プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドが宿主細胞内または細胞外に
蓄積される。目的物質が宿主細胞内に不溶化されて蓄積
する場合には、ホモジナイザー等によって細胞を破砕す
ることによって不溶性画分を回収したあとで、塩酸グア
ニジンまたは尿素等の水溶液に溶解後、チオール化合物
存在下に空気酸化を行い、目的物質本来の立体構造を復
元する。ついで硫安塩析、疎水的相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手法を
用いて精製されるが、これら以外の通常用いられる生化
学的精製技術を用いることもできる。かくて本ヒトプロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドが経済的に安価に製造され
る。

【００１３】

【実施例】次に実施例により本発明を具体的に説明す
る。 工程１ 合成２本鎖ＤＮＡの作製 本オリゴペプチドをコードする合成２本鎖ＤＮＡは各単
鎖のＤＮＡオリゴマーをアミダイト法により合成し、Ｏ
ＰＣカートリッジ（アプライドバイオシステム社製）で
精製後、各対の単鎖ＤＮＡを20mMトリス塩酸、1mM エチ
レンジアミンテトラアセテート緩衝液(pH 8.0)に溶解し
て65℃で１５分間加熱した後、徐々に室温まで冷却する
ことによって、アニールし、下記２本鎖ＤＮＡを得た。 合成２本鎖ＤＮＡオリゴマー名 ＤＮＡ塩基配列 Ｖ30 5' C ATG CAG GAA CAG GTG TCT CCG CTG ACC TTG C 3' GTC CTT GTC CAC AGA GGC GAC TGG AAC GAA TT Ｖ31 5' C ATG CAG GAA CAG GTG TCT CCG CTG ACC TTG CTT GAG CT 3' GTC CTT GTC CAC AGA GGC GAC TGG AAC GAA C

【００１４】工程２ プラスミドpV30CUK(-,k)/5の作製 工程２及び工程３に記載の各制限酵素等はニュー・イン
グランド・バイオラブズ社製のものを用いた。各酵素の
反応は、製造者が推奨する条件の下で行った。プラスミ
ドpACUK(-,q)/0（特開平4-75584 に記載）のAflII 並び
に BamHIによる二重消化断片(約0.8Kb)、プラスミドpFP
UK(q,q)/5（特開平4-75584 に記載）のNcoI並びに BamH
Iによる二重消化断片(約5.1Kb)及び工程１の合成ＤＮＡ
オリゴマーＶ30をT4ＤＮＡリガーゼにて連結し、プラス
ミドpV30CUK(-,q)/5を得た。さらにプラスミドpV30CUK
(-,q)/5のBalI並びにBamHI による二重消化断片(約5.2K
b)及びプラスミドpAPUK(k,k)/5（特開平4-75584 に記
載）の BalI 並びに BamHIによる二重消化断片(約0.7K
b)をT4ＤＮＡリガーゼにて連結し、プラスミドpV30CUK
(-,k)/5を得た。プラスミドpV30CUK(-,k)/5を含有する
大腸菌E.coli KY1436 は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第ＢＰ−４３２７号〔ＦＥＲＭ ＢＰ−
４３２７（微工研条寄第Ｐ−１３０１７号から移管）〕
として寄託されている。

【００１５】工程３ プラスミドpV31CUK(-,k)/5の作製 プラスミドpCUK(-,q)/0（特開平4-75584に記載）のSacI
並びにBamHI による二重消化断片（約0.8Kb）、プラス
ミドpFPUK(q,q)/5（特開平4-75584に記載）のNcoI並び
に BamHIによる二重消化断片（約 5.1Kb）及び工程１の
合成ＤＮＡオリゴマーＶ31をT4ＤＮＡリガーゼにて連結
し、プラスミド pV31CUK(-,q)/5 を得た。さらにプラス
ミドpV31CUK(-,q)の BalI 並びにBamHI による二重消化
断片（約5.2Kb）及びプラスミドpAPUK(k,k)/5の BalI
並びにBamHI による二重消化断片（約0.7Kb）をT4ＤＮ
Ａリガーゼにて連結し、プラスミドpV31CUK(-,k)/5を得
た。

【００１６】工程４ 大腸菌による本ヒト低分子プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチド遺伝子の発現 工程２により得られたプラスミドpV30CUK(-,k)/5を大腸
菌 JM103株に慣用法に従ってて形質転換した。得られた
組換体を50mlのＬ−ブロス中に37℃で好気培養し、600n
m における吸光度が約 0.5に達したとき、100mMのイソ
プロピルチオガラクトピラノシド(IPTG) 0.5mlを添加
し、さらに４時間培養を続け各本ヒト低分子プロウロキ
ナーゼ様ポリペプチド V30CUK(-,k)を生産させた。

【００１７】工程５ 大腸菌からの遺伝子産物の抽出と
精製 工程４で得られた湿菌体を 10g当り 100mlの10mMトリス
-HCl緩衝液(pH8.0) に懸濁し、超音波により菌体を破砕
した。続いて、４℃、12、000rpmの遠心分離により沈澱物
を回収した。得られた沈澱物を、500ml の100mM トリス
塩酸緩衝液(pH8.0) に懸濁させ、さらに等量の8M塩酸グ
アニジンを加えて溶解させた後、1mM EDTA及び0.2mM 還
元型グルタチオンを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)
を３Ｌ加え、一晩室温に放置した。その後、限外濾過膜
によって蛋白成分を濃縮し、次いで 55%飽和硫安によっ
て塩析される画分を粗精製品として回収した。粗精製品
を1M塩酸グアニジン及び1M硫安を含む50mMトリス塩酸緩
衝液 (pH8.0)に溶解後、同緩衝液で平衡化されたフェニ
ルセファロース（ファルマシア社製）カラムに吸着さ
せ、同緩衝液で充分洗浄した後、1M塩酸グアニジン及び
0.6M硫安を含む50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0)で溶出
し、目的物を含む溶出画分を採取した。当画分を亜鉛キ
レートセファロース（ファルマシア社製）カラムに吸着
させ、0.5M食塩を含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0) で充分
洗浄した後、0.5M食塩を含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液
(pH5.6) で溶出し、目的物を含む画分を限外濾過膜 PM-
10（アミコン社製）を用いて濃縮脱塩し、本ヒト低分子
プロウロキナーゼ様ポリペプチド V30CUK(-,k)の精製品
を得た。精製品（精製収率４１．６％）の比活性はカビ
社製合成基質Ｓ−２４４４に対する分解活性および精製
品の紫外吸収光度（Ａ₂₈₀)から、１．８２×10⁵ ＩＵ／
Ａ₂₈₀ と計算された。

【００１８】工程６ 工程３で得られたプラスミドpV31CUK(-,k)/5を工程４及
び５と同様に処理して本ヒト低分子プロウロキナーゼ様
ポリペプチド V31CUK(-,k)の精製品を得た。精製品（精
製収率４３．６％）の比活性はカビ社製合成基質Ｓ−２
４４４に対する分解活性および精製品の紫外吸収光度
（Ａ₂₈₀)から、１．７３×10⁵ ＩＵ／Ａ₂₈₀ と計算され
た。

【００１９】以下試験例により優れた性質を示す。 試験例１ 血栓の主成分フィブリンに対する結合試験 精製された本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドのフィブリンに対する結合試験を次のように行った。 （試薬） (1) トリス塩酸緩衝液：50mMトリス塩酸、38mM食塩、0.
01% トリトンX-100、 pH7.5 (2) フィブリノーゲン溶液：シグマ社製プラスミノーゲ
ンフリーヒトフィブリノーゲン5mg/mlトリス塩酸緩衝液 (3) トロンビン溶液：シグマ社製ヒトトロンビン100単
位/mlトリス塩酸緩衝液 (4) プラスミン溶液：カビ社製ヒトプラスミン15cu/ml
蒸留水 (5) トリプシンインヒビター溶液：シグマ社製トリプシ
ンインヒビター5mg/ml蒸留水 (6) ヒルジン溶液：シグマ社製ヒルジン (7) 被験サンプル溶液：被験サンプル5000国際単位／ml
トリス塩酸緩衝液 （方法）氷温下で 1.5ml容のエッペンドルフ管にフィブ
リノーゲン溶液 75μl及び0.1M塩化カルシウム水溶液5
μlを採り、これにトリス塩酸緩衝液を加えて 197μl
としてよく混合した後、トロンビン溶液 3μl を加えて
混合後37℃の水浴中で15分処理し、フィブリン塊を生成
させた。次いで、１単位のヒルジンを含む各被験サンプ
ル 101μl を加え、37℃の水浴中で60分間保温した。直
ちに氷温下に移し、楊子でフィブリン塊を巻取った。巻
取られたフィブリン塊を10μl のプラスミン溶液を加え
て溶解した後、同容のトリプシンインヒビター溶液を加
えて反応を停止した。フィブリン塊の溶解液に含まれる
被験サンプルの活性をカビ社製合成基質S-2444の分解活
性から求め、フィブリン塊に結合した被験サンプル量を
見積った。

【００２０】試験例２ 血栓の主成分フィブリンに対す
る溶解試験 （試薬） クエン酸添加血漿：ジョージ・キング社製ヒト正常血漿 ヘパリン添加血漿：化血研製ヒト血漿（凍結乾燥品）を
１単位／ｍｌのヘパリンを含む25mM塩化カルシウム水溶
液に溶解したもの。 （方法）クエン酸添加血漿25μl を 2ml容のエッペンド
ルフ管の底に採り、ヒトトロンビン50単位／ｍｌ及び0.
5M塩化カルシウムを含む水溶液 3μl を加えて37℃で30
分間保温し、血栓を生成させた。次いでヘパリン添加血
漿 100μl 及び各被験サンプル 5μl を順次血栓が生成
したエッペンドルフ管に加え、37℃で１時間保温した。
溶けなかった血栓を楊子で巻き取り、生理食塩水で洗浄
した後、血栓に含まれる蛋白質量をチロシン法にて定量
し、溶解した血栓の量を見積った。

【００２１】試験例３ 家兎循環血中での安定性試験 （１）家兎の総頚動脈及び総頚靜脈を露出し、双方にカ
ニューレを挿入して、これらを連結し、間に三方コック
を設置してここから採血した。被検物質は総頚靜脈のカ
ニューレから投入し、実験中はヘパリンを同静脈から５
００単位／Kgの速度で注入した。被験物質の投与量は各
々１００，０００ＩＵ／ｋｇ、施行回数は各々５例。 （２）ユーグロブリン画分の調製とウロキナーゼ活性の
測定 採血された血液に直ちに０．３８（w/V)％のクエン酸ナ
トリウムを添加した後、遠沈により血漿画分を得た。血
漿１００μｌに２ｍｌの０．０１％酢酸を加えた後、遠
沈して得られるユーグロブリン画分を集めた。ユーグロ
ブリン画分に含まれるウロキナーゼ量をＳ−２４４４
（カビ社製）の分解活性により測定した。 試験例１〜３の試験結果を下記表１に示す。

【００２２】 表１ 試験結果 被 験 １時間後のフィブリン結合率 血栓溶解能 家兎循環血中 サンプル フィブリン塊 フィブリン塊 １時間で血 での半減期（分） 形成後 形成過程 栓の50％を （５回の平均値） 溶解するに 必要な濃度 （μｇ／ｍｌ） 本 発 明 V30CUK(-,k) 53 80 0.75 6.7 V31CUK(-,k) 52 83 0.75 6.7 対 比 例ヒトフ゜ロウロキナーセ゛ 7 10 3.74 3.2 APUK(k,q) 32 43 1.48 3.4 APUK(k,k) 45 52 1.52 3.1 ACUK(-,q) 22 31 1.22 6.7 ALUK(-,q) 26 28 1.48 6.6 V3PUK(k,q) 52 81 1.14 3.5 V3PUK(k,k) 48 80 1.10 3.6 V30PUK(k,k) 37 83 1.00 3.5 V30LUK(-,k) 43 57 1.10 6.8 上記表１中、比較に使用したヒトプロウロキナーゼ（ま
たはヒト低分子プロウロキナーゼ）様ポリペプチドは下
記表２の各オリゴペプチドを下記表３の各ヒトプロウロ
キナーゼ誘導体のＮ端に付加した構造を有するものであ
る。

【００２３】 表２ オリゴペプチド 名称 構造 A (Met.)Asn.Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.Leu.Lys. V3 (Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Gln.Thr.Leu.Leu.Lys. V30 (Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.Leu.Lys. V31 (Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.Leu.Leu.Glu.

【００２４】 表３ ヒトプロウロキナーゼ誘導体（アミノ酸Ｎｏ．は天然型ヒトプロウロキナーゼの アミノ酸Ｎｏ. をしめす） 名称 構造ヒトフ゜ロウロキナーセ゛ 天然型ヒトプロウロキナーゼ PUK(k,k) 天然型ヒトプロウロキナーゼ Leu4 -Leu411 PUK(k,q) PUK(k,k)のArg.156をGln.に変異したもの LUK(-,k) 天然型ヒトプロウロキナーゼ Pro.137 -Leu411 LUK(-,q) LUK(-,k)のArg.156をGln.に変異したもの CUK(-,k) 天然型ヒトプロウロキナーゼ Leu144 -Leu411 CUK(-,q) CUK(-,k)のArg.156をGln.に変異したもの 上記試験成績からＶ30ＣＵＫ（ー、ｋ）及びＶ31ＣＵＫ
（ー、ｋ）は血栓親和性、血栓溶解性が高く、血中半減
期が長く特開平４−７５５８４に提案されたヒトプロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドの中で最も優れた血栓溶解剤
であることが判明した。念の為に、Ｖ30ＣＵＫ（ー、
ｋ）のＤＮＡ及び対応するアミノ酸の配列を配列 配列番号：１に、及びＶ31ＣＵＫ（ー、ｋ）を配列番
号：２に示す。

【００２５】

【発明の効果】本ヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペ
プチド：｛Ｖ30ＣＵＫ（ー、ｋ）及びＶ31ＣＵＫ（ー、
ｋ）｝は、血栓特異性及び血栓溶解製が高く、低分子量
のため血栓浸透性が優れ且つ生体内半減期が長く血栓溶
解剤として最も優れている。この為、本ヒト低分子プロ
ウロキナーゼ様ポリペプチド｛Ｖ30ＣＵＫ（ー、ｋ）及
びＶ31ＣＵＫ（ー、ｋ）｝はヒトプロウロキナーゼより
格段に優れた血栓溶解剤として使用される。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）及びｃＤＮＡ tｏ
mＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 株名： 正常細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：10..25 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：Domain 存在位置：23..58 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：Domain 存在位置：59..862 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：Binding-site 存在位置：26..28 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：Mutation 存在位置：59..64 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCTAGATAAG GAGGTGAAAA CC ATG CAG GAA CAG GTG TCT CCG CTG ACC TTG 52 Met Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Thr Leu 1 5 10 CTT AAG CTC AAG TTT CAG TGT GGC CAA AAG ACT CTG AGG CCC CGC TTT 100 Leu Lys Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe 15 20 25 AAG ATT ATT GGG GGA GAA TTC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG TTT 148 Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe 30 35 40 GCG GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT 196 Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys 45 50 55 GGA GGC AGC CTC ATC AGC CCT TGC TGG GTG ATC AGC GCC ACA CAC TGC 244 Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys 60 65 70 TTC ATT GAT TAC CCA AAG AAG GAG GAC TAC ATC GTC TAC CTG GGT CGC 292 Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg 75 80 85 90 TCA AGG CTT AAC TCC AAC ACG CAA GGG GAG ATG AAG TTT GAG GTG GAA 340 Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu 95 100 105 AAC CTA ATC CTA CAC AAG GAC TAC AGC GCT GAC ACG CTT GCT CAC CAC 388 Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His 110 115 120 AAC GAC ATT GCC TTG CTG AAG ATC CGT TCC AAG GAG GGC AGG TGT GCG 436 Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Lys Ala 125 130 135 CAG CCA TCC CGG ACT ATA CAG ACC ATC TGC CTG CCC TCG ATG TAT AAC 484 Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn 140 145 150 GAT CCC CAG TTT GGC ACA AGC TGT GAG ATC ACT GGC TTT GGA AAA GAG 532 Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu 155 160 165 170 AAT TCT ACC GAC TAT CTC TAT CCG GAG CAG CTG AAA ATG ACT GTT GTG 580 Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val 175 180 185 AAG CTG ATT TCC CAC CGG GAG TGT CAG CAG CCC CAC TAC TAC GGC TCT 628 Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser 190 195 200 GAA GTC ACC ACC AAA ATG CTG TGT GCT GCT GAC CCA CAG TGG AAA ACA 676 Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr 205 210 215 GAT TCC TGC CAG GGA GAC TCA GGG GGA CCC CTC GTC TGT TCC CTC CAA 724 Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln 220 225 230 GGC CGC ATG ACT TTG ACT GGA ATT GTG AGC TGG GGC CGT GGA TGT GCC 772 Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala 235 240 245 250 CTG AAG GAC AAG CCA GGC GTC TAC ACG AGA GTC TCA CAC TTC TTA CCC 820 Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro 255 260 265 TGG ATC CGC AGT CAC ACC AAG GAA GAG AAT GGC CTG GCC CTC TGAGGGTC 870 Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu 270 275 CCCAGGGAGG AAACGGGCAC CACCCGCTTT CTTGCTGGTT GCTATTTTGC AGTAGAGTCA 930 940 950 960 970 980 990 TCTCCATCAG CTGTAAGAAG AGCTGGGAAT ATAGGCTCTG CACAGATGAT TGCCTGTGCC 990 1000 1010 1020 1030 1032 ACCGACCAGG GCGAACGACA ATAGCTTTAC CCTCACAAGC TT 1032

【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：１０３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）及び cＤＮＡ to
mＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 株名： 正常細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：10..25 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：Domain 存在位置：23..58 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：Domain 存在位置：59..862 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：Binding-site 存在位置：26..28 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：Mutation 存在位置：59..64 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCTAGATAAG GAGGTGAAAA CC ATG CAG GAA CAG GTG TCT CCG CTG ACC TTG 52 Met Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Thr Leu 1 5 10 CTT GAG CTC AAG TTT CAG TGT GGC CAA AAG ACT CTG AGG CCC CGC TTT 100 Leu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe 15 20 25 AAG ATT ATT GGG GGA GAA TTC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG TTT 148 Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe 30 35 40 GCG GCC ATC TAC AGG AGG CAC CGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT 196 Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys 45 50 55 GGA GGC AGC CTC ATC AGC CCT TGC TGG GTG ATC AGC GCC ACA CAC TGC 244 Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys 60 65 70 TTC ATT GAT TAC CCA AAG AAG GAG GAC TAC ATC GTC TAC CTG GGT CGC 292 Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg 75 80 85 90 TCA AGG CTT AAC TCC AAC ACG CAA GGG GAG ATG AAG TTT GAG GTG GAA 340 Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu 95 100 105 AAC CTA ATC CTA CAC AAG GAC TAC AGC GCT GAC ACG CTT GCT CAC CAC 388 Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His 110 115 120 AAC GAC ATT GCC TTG CTG AAG ATC CGT TCC AAG GAG GGC AGG TGT GCG 436 Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala 125 130 135 CAG CCA TCC CGG ACT ATA CAG ACC ATC TGC CTG CCC TCG ATG TAT AAC 484 Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn 140 145 150 GAT CCC CAG TTT GGC ACA AGC TGT GAG ATC ACT GGC TTT GGA AAA GAG 532 Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu 155 160 165 170 AAT TCT ACC GAC TAT CTC TAT CCG GAG CAG CTG AAA ATG ACT GTT GTG 580 Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val 175 180 185 AAG CTG ATT TCC CAC CGG GAG TGT CAG CAG CCC CAC TAC TAC GGC TCT 628 Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser 190 195 200 GAA GTC ACC ACC AAA ATG CTG TGT GCT GCT GAC CCA CAG TGG AAA ACA 676 Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr 205 210 215 GAT TCC TGC CAG GGA GAC TCA GGG GGA CCC CTC GTC TGT TCC CTC CAA 724 Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln 220 225 230 GGC CGC ATG ACT TTG ACT GGA ATT GTG AGC TGG GGC CGT GGA TGT GCC 772 Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala 235 240 245 250 CTG AAG GAC AAG CCA GGC GTC TAC ACG AGA GTC TCA CAC TTC TTA CCC 820 Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro 255 260 265 TGG ATC CGC AGT CAC ACC AAG GAA GAG AAT GGC CTG GCC CTC TGAGGGTC 870 Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu 270 275 CCCAGGGAGG AAACGGGCAC CACCCGCTTT CTTGCTGGTT GCTATTTTGC AGTAGAGTCA 930 940 950 960 970 980 990 TCTCCATCAG CTGTAAGAAG AGCTGGGAAT ATAGGCTCTG CACAGATGAT TGCCTGTGCC 990 1000 1010 1020 1030 1032 ACCGACCAGG GCGAACGACA ATAGCTTTAC CCTCACAAGC TT 1032

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中村 浩昭 神奈川県小田原市高田字柳町345 日本曹 達株式会社小田原研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.Thr.
   Leu.Leu.Lys.又は(Met.)Gln.Glu.Gln.Val.Ser.Pro.Leu.
   Thr.Leu.Leu.Glu.〔(Met.) は場合によっては存在する
   ことがあるメチオニン〕を、天然型ヒトプロウロキナー
   ゼの全アミノ酸配列のうち 144位ロイシンから 411位ロ
   イシンまでのポリペプチドのＮ端側に付したことを特徴
   とするヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリペプチド
2. 【請求項２】請求項１記載のヒト低分子プロウロキナー
   ゼ様ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド
   をコードするＤＮＡセグメント。
3. 【請求項３】請求項２記載のＤＮＡセグメント及びその
   発現のための制御領域を含有し、なおかつ大腸菌で複製
   するのに必要なＤＮＡ配列を含有するプラスミド。
4. 【請求項４】請求項３記載の大腸菌を培養し、その培養
   菌体から請求項１のヒト低分子プロウロキナーゼ様ポリ
   ペプチドを採取することを特徴とするヒト低分子プロウ
   ロキナーゼ様ポリペプチドの製造方法。