JPH0666801A

JPH0666801A - 免疫測定法

Info

Publication number: JPH0666801A
Application number: JP22385492A
Authority: JP
Inventors: Hideo Oya; 英郎大屋; Morihito Inoue; 守人井上; Akiho Takei; 亮穂武井; Kyuji Mutsukawa; 玖治六川; Masatake Tomimura; 真武冨村
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 1992-08-24
Filing date: 1992-08-24
Publication date: 1994-03-11

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、測定感度を高めることができるとと
もに短時間で微量の被測定物質を定量しようとするもの
である。【構成】金属螢光体(20)の表面に各種被測定物質(14a,1
4b) のうち測定目的とする被測定物質に対応する第１抗
体(13a,13b) を添加する。この場合、例えば金属螢光体
(20)には各種被測定物質(14a,14b) に対応する複数の第
１抗体(13a,13b)がそれぞれ各領域(A,B) 別に添加され
る。次に金属螢光体(20)に対して被測定物質(14a,14b)
を含んだサンプルを添加し、次に被測定物質(14a,14b)
に対応しかつ螢光ブロック物質(15)が付加された第２抗
体(16a,16b) を金属螢光体(20)に対して添加する。次に
金属螢光体(20)に対して光を照射しこのときの螢光量を
検出して被測定物質(14a,14b) の定量の測定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応を利用し
てα−フェトプロチインなどの微量物質を定量する免疫
測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】かかる免疫測定法は図６(a) に示すよう
に測定容器１に測定試薬、例えばラテックスなどの不溶
性微粒子２に被測定物質に対する抗体３を付けたものを
含む溶液を入れる。次に同図(b) に示すように測定試薬
の内に細菌などの微量の被測定物質４を含むサンプルを
滴下する。そうすると、測定容器１では抗原抗体反応が
生じ、この結果同図(c) に示すように凝集反応が生じ
る。この凝集反応が生じているときに分光光度計を用い
て凝集の濁度が計測され、この濁度から被測定物質４が
定量される。

【０００３】しかしながら、凝集の濁度の測定は分光光
度計により行うが、この測定は凝集した物質に対する吸
光により求めるので、吸光のダイナミックレンジの限界
から測定感度に制限が生じる。

【０００４】又、抗原抗体反応そのものに基づく凝集反
応は、安易な測定法であるが、感度が低い。そこで、凝
集反応の感度を向上させるために上記の如く不溶性微粒
子２に被測定物質に対する抗体３を付けた測定試薬を用
いているが、それでも測定感度を高めるには未だ不十分
となっている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように凝集の濁
度測定を分光光度計により行うが、吸光のダイナミック
レンジの限界から測定感度に制限が生じる。又、凝集反
応自体が高感度測定に限界がある。そこで本発明は、測
定感度を高めることができるとともに短時間で微量の被
測定物質を定量できる免疫測定法を提供することを目的
とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段と作用】本発明は、先ず、
螢光機能を有する金属螢光体などの測定板の表面に各種
被測定物質のうち測定目的とする被測定物質に対応する
第１抗体が固定化される。この場合、例えば測定板には
各種被測定物質に対応する複数の第１抗体がそれぞれ各
領域別に固定化される。次にこの測定板に対して被測定
物質を含んだサンプルが添加され、一定時間で一定時間
の下で反応させて後、洗浄によりサンプルを除去する。
次に被測定物質に対応しかつ螢光ブロック物質、例えば
ラテックス粒子等、物理的光路妨害剤、又は螢光或いは
発光のピーク波長に吸収帯を持つ色素、特定励起波長を
吸収する色素等が付加された第２抗体が測定板に対して
添加されれ、一定時間で一定時間の下で反応をさせた
後、洗浄により過剰の第２抗体が除去される。次に測定
板に対して光を照射しこのときの螢光量を検出して被測
定物質の定量が行われる。

【０００７】又、本発明は、上記免疫測定法において測
定板として発光機能を有するもの、例えば金属板又は樹
脂体の表面に発光物質が塗布されたものが用いられる。
次に測定板の表面に各種被測定物質のうち測定目的とす
る被測定物質に対応する第１抗体が固定化され、次にこ
の測定板に対して被測定物質を含んだサンプルが添加さ
れ、一定時間で一定時間の下で反応させる。次に被測定
物質に対応しかつ螢光ブロック物質が付加された第２抗
体が測定板に対して添加される。一定時間で一定時間の
下で反応させた後、洗浄により過剰の第２抗体を除去す
る。そして、このときの測定板における発光量を検出し
て被測定物質の定量が行われる。

【０００８】

【実施例】以下、本発明の一実施例について図１に示す
免疫測定法の測定流れ図を参照して説明する。

【０００９】先ず、測定板として金属螢光体１０が用意
される。この金属螢光体１０は例えば図２に示すように
円板状に形成され、かつ所定角度づつに隔壁１１によっ
て複数の領域（チャンネルＣｈ）Ａ、Ｂ、Ｃ…に分割さ
れている。なお、各隔壁１１は、各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…に
おける各反応が他の領域に及すのを防止するためのもの
で、図１では各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…を平面で示している。
この金属螢光体１０としては例えばＭｎ²⁺螢光体が用い
られている。図３はＬａ₂Ｏ₃・11Ａｌ₂Ｏ₃：Ｍｎ²⁺
の発光強度と励起スペクトルを有している。すなわち、
室温での発光バンドは幅1000〜2000cm^-1の構造のないも
ので、ピーク波長は 490〜 750nmにある。又、Ｍｎ²⁺の
残光時間は通常ミリ秒よりも長い。

【００１０】この金属螢光体１０が用意されると、この
金属螢光体１０の全表面に対して均一に図１(b) に示す
ようにアビジン１２が塗布される。なお、このアビジン
１２は被測定物質に対応する各種抗体を必要に応じて金
属螢光体１０に付けやすくするためである。

【００１１】次にアビジン１２により表面処理された金
属螢光体１０に対して各種被測定物質のうち測定目的と
する被測定物質に対応するそれぞれのビオチン化第１抗
体１３ａ、１３ｂ…が添加される。このようにアビジン
１２及びビオチン化第１抗体１３ａ、１３ｂ…を用いる
のは、必要に応じ使用直前に各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…ごとに
別の抗体を結合させるためであり、又、アビジン／ビオ
チン反応は特異的で迅速に行うことができるためであ
る。ここで、第１抗体１３ａ、１３ｂ…は、図１(c) に
示すように金属螢光体１０における各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…
のうち領域Ａには第１被測定物質の第１抗体１３ａ、領
域Ｂには第２被測定物質の第２抗体１３ｂのように各領
域Ａ、Ｂ、Ｃ…別に異なる各種被測定物質に対応する第
１抗体１３が添加される。なお、第１抗体１３は、予め
ビオチンで修飾されている。

【００１２】次にこの金属螢光体１０に対して被測定物
質を含んだサンプルが添加される。このサンプル添加に
より各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…では、一定時間例えば１分から
３０分で望ましくは１５分、一定条件例えば３０℃で暗
中の下で抗原抗体反応が起こり、図１(d) に示すように
各第１抗体１３ａ、１３ｂ…に対してそれぞれ対応する
各抗原、つまり各被測定物質１４ａ、１４ｂ…が付く。

【００１３】この第１段階の反応の後、必要に応じて洗
浄液、例えばＰＢＳ（燐酸緩衝生理食塩水）等で各チャ
ンネルＡ、Ｂ、Ｃ…は洗浄され、過剰の抗原や不純物を
含むサンプルは除去され、第１抗体に結合した抗原のみ
が螢光抗体上に残る。

【００１４】なお、洗浄法については、例えば円盤の金
属螢光体１０の場合、回転させることにより遠心力を応
用し、洗浄液を各チャンネルＡ、Ｂ、Ｃ…毎に中心部か
ら周辺部に向けて流すことができる。

【００１５】次に各被測定物質１４ａ、１４ｂ…に対応
しかつ螢光ブロック物質１５、例えばラテックス粒子
等、物理的光路妨害剤、又は螢光或いは発光のピーク波
長に吸収帯を持つ色素、特定励起波長を吸収する色素等
が付加された第２抗体１６ａ、１６ｂ…が金属螢光体１
０に対して添加される。そうすると、再び一定時間例え
ば１分から３０分で望ましくは１５分、一定条件例えば
３０℃で暗中の下で抗原抗体反応が起き、この反応によ
り図１(e) に示すように各第２抗体１６ａ、１６ｂがそ
れぞれ対応する各被測定物質１４ａ、１４ｂ…に付く。

【００１６】このとき、第２抗体に予め結合されている
螢光妨害物質としては、ラテックス粒子の他、波長４８
０ｎｍに吸収のピークを有するオレンジＧ等が挙げられ
る。又、ラテックス粒子に着色して螢光を吸収するよう
にしておくのも効果的である。

【００１７】この第２段階の反応の後、ＰＢＳ等で各チ
ャンネルＡ、Ｂ、Ｃ…は洗浄され、過剰の第２抗体が除
去される。この除去操作は必須であり、かつ充分に行わ
なければならない。この洗浄操作が不充分であると、測
定結果に誤差を生じる。

【００１８】次に金属螢光体１０の各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…
にそれぞれ対応して各光ディテクタ１７ａ、１７ｂ、１
７ｃ…が配置される。これとともに金属螢光体１０に対
して上方から光が照射される。このとき金属螢光体１０
は光を受光して螢光するが、この金属螢光体１０の表面
には螢光ブロック物質１５が付いているために、この螢
光ブロック物質１５の付着量に応じて螢光量は阻害され
る。しかるに、各光ディテクタ１７ａ、１７ｂ、１７ｃ
…はそれぞれ各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…ごとに螢光を受光して
その螢光量に応じた電気信号を出力する。この結果、光
ディテクタ１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…から出力される各
電気信号から各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…ごとに被測定物質１４
ａ、１４ｂ…の定量が行われる。

【００１９】なお、この被測定物質１４ａ、１４ｂ…の
定量の測定は、図４に示すような方法により行ってもよ
い。この場合、ガラス基板２０に対して螢光又は発光金
属物質２１が塗布されるか、螢光又は発光金属物質２１
の金属板が貼り合わされている。

【００２０】同図に示すように光源２２とフォトマルチ
プライヤ２３とをガラス基板２０を介して対向配置し、
この状態でガラス基板２０を回転移動、又はガラス基板
２０が平板であればスライド移動して各領域Ａ、Ｂ、Ｃ
…ごとに螢光量を検出するようにしてもよい。

【００２１】又、図５に示すように光源２４とフォトマ
ルチプライヤ２５とをガラス基板２０に対して斜め上方
に配置し、この状態でガラス基板２０を回転移動、又は
ガラス基板２０が平板であればスライド移動して各領域
Ａ、Ｂ、Ｃ…ごとに螢光量を検出するようにしてもよ
い。

【００２２】このように上記一実施例においては、金属
螢光体１０の表面に各種被測定物質１４ａ、１４ｂ…に
対応する各第１抗体１３ａ、１３ｂ…を添加し、次に金
属螢光体１０に対して被測定物質１４ａ、１４ｂ…を含
んだサンプルを添加し、次に各被測定物質１４ａ、１４
ｂ…に対応しかつ螢光ブロック物質１５が付加された各
第２抗体１６ａ、１６ｂ…を添加し、次に金属螢光体１
０に対して光を照射しこのときの螢光量を検出して各被
測定物質１４ａ、１４ｂ…の定量を行うようにしたの
で、各種の被測定物質１４ａ、１４ｂ…に対する定量測
定を短時間で行えるとともに複数種類の被測定物質１４
ａ、１４ｂ…に対する定量測定を同時にできる。

【００２３】さらに、例えば同一の被測定物質１４ａに
対する定量測定を各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…ごとに分けてでき
る。又、各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…ごとにランダムに被測定物
質１４ａ、１４ｂ…に対する定量測定ができる。そのう
え、各領域Ａ、Ｂ、Ｃ…ではサンプルなどを薄膜に形成
すればよいので、サンプルや第１抗体１３ａ、１３ｂ…
及び第２抗体１６ａ、１６ｂ…は微量でよい。

【００２４】又、金属螢光体１０は円形状に形成されて
いるので、回転することによって各種類の被測定物質１
４ａ、１４ｂ…に対する反応を随時モニタできるととも
に測定を短縮できる。

【００２５】なお、本発明は上記各実施例に限定される
ものでなくその要旨を変更しない範囲で変形してもよ
い。例えば、測定板は金属又は樹脂体に発光物質や螢光
物質を塗布したものでもよく、又隔壁で各領域を分ける
のでなく溝を形成して各領域を分けるようにしてもよ
い。又、測定板の形状は円形状に限らず四辺形でもよ
い。

【００２６】さらに、螢光のみならず、発光、吸光系で
も応用することが可能である。この場合、吸光系では、
螢光系と同様に光を照射してそのときの吸光を計測すれ
ばよく、又、発光系では物質自体が光を放射しているの
で、光源を別に容易する必要はないが、逆に物質以外の
光（外部光）を厳密に遮光して計測を行う。

【００２７】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、測
定感度を高めることができるとともに短時間で微量の被
測定物質を定量できる免疫測定法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わる免疫測定法の第１実施例を示す
測定流れ図。

【図２】同免疫測定法に用いられる金属螢光体の形状を
示す図。

【図３】同免疫測定法に用いられる金属螢光体の発光強
度と励起スペクトルを示す図。

【図４】同免疫測定法における被測定物質の定量測定の
説明するための図。

【図５】同免疫測定法における被測定物質の定量測定の
説明するための図。

【図６】従来における免疫測定法の測定流れ図。

【符号の説明】

１０…金属螢光体、１１，２１…隔壁、１２…アビジ
ン、１３ａ，１３ｂ…第１抗体、１４ａ，１４ｂ…被測
定物質、１５…螢光ブロック物質、１６ａ，１６ｂ…ビ
オチン化第２抗体、１７ａ，１７ｂ…光ディテクタ、２
０…測定板、２２…発光ブロック物質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者六川玖治栃木県大田原市下石上1385番の１株式会社東芝那須工場内 (72)発明者冨村真武栃木県大田原市下石上1385番の１株式会社東芝那須工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】螢光機能を有する測定板の表面に各種被
測定物質のうち測定目的とする被測定物質に対応する第
１抗体を添加し、次にこの第１抗体が添加された前記測
定板に対して前記被測定物質を含んだサンプルを添加
し、次に前記被測定物質に対応しかつ螢光ブロック物質
が付加された第２抗体を前記測定板に対して添加し、次
に前記測定板に対して光を照射しこのときの螢光量を検
出して前記被測定物質の定量を行うことを特徴とする免
疫測定法。
【請求項２】測定板には各種被測定物質に対応する複
数の第１抗体がそれぞれ各領域別に添加されることを特
徴とする請求項(1) 記載の免疫測定法。
【請求項３】測定板は金属螢光体であることを特徴と
する請求項(1) 記載の免疫測定法。
【請求項４】測定板は金属板又は樹脂体の表面に螢光
物質が塗布されたものであることを特徴とする請求項
(1) 記載の免疫測定法。
【請求項５】発光機能を有する測定板の表面に各種被
測定物質のうち測定目的とする被測定物質に対応する第
１抗体を添加し、次にこの抗体が添加された前記測定板
に対して前記被測定物質を含んだサンプルを添加し、次
に前記被測定物質に対応しかつ発光ブロック物質が付加
された第２抗体を前記測定板に対して添加し、このとき
の前記測定板における発光量を検出して前記被測定物質
の定量を行うことを特徴とする免疫測定法。
【請求項６】測定板には各種被測定物質に対応する複
数の第１抗体がそれぞれ各領域別に添加されることを特
徴とする請求項(5) 記載の免疫測定法。
【請求項７】測定板は金属板又は樹脂体の表面に発光
物質が塗布されたものであることを特徴とする請求項
(5) 記載の免疫測定法。