JPH0665296A - 免疫賦活物質およびその分画方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 現在までに唾液腺中に免疫活性を有する物質
が存在することが知られている、ウシやマウス以外の動
物から新規な免疫賦活物質を見い出し、単離する。 【構成】 ウサギの顎下腺から得られ、白色粉末状で、
ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドのディスク電気泳動
法及びセファデックスＧ−１００のゲル濾過法により測
定した分子量は、３０〜６０ｋＤ（キロダルトン）の範
囲内にあり、等電点が、ｐＨ４．５〜６．５の範囲内に
あり、水および生理食塩水に可溶、アセトンに不溶で、
ニンヒドリン反応、ビウレット反応、ミロン反応、坂口
反応、モリッシュ反応、アンスロン反応、エルソン・モ
ーガン反応は、全て陽性であり、分配係数（Ｋａｖ値）
が、約０．２５〜０．７５の範囲内にあることを特徴と
する免疫賦活物質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はウサギの顎下腺から得ら
れる新規な免疫賦活物質及びその分画方法に関する。

【０００２】

【先行技術】哺乳動物の唾液腺、特に耳下腺には唾液腺
ホルモンが含まれ、この唾液腺ホルモンは間葉性組織に
作用し、特に硬組織の発育促進作用、血清カルシウム低
下作用、細網内皮系刺激作用、白血球増加作用等の生理
作用を有しており、医薬として広範に使用されている。

【０００３】１９７４年に、青沼らは、ウシ耳下腺由来
の唾液腺ホルモン活性を有する分子量４５，０００の唾
液腺ホルモンサブユニットを単離した［Ｆｏｌｉｏ．Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊｐｎ．，５０，１４６８（１９
７４）参照］。引き続いて青沼らは、１９７７年に唾液
腺ホルモンサブユニットを酵素分解し、白血球増加作用
を示すＦｒＡＡ−１およびヒトカルシウム低下作用を示
すＦｒＨ−１を分離し、その構造を決定した［Ｃｈｅ
ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２８，４１７（１９８
０）及び特公昭５７−３５９５８号公報参照］。

【０００４】１９８３年に、石坂らは、ウシ耳下腺由来
の唾液腺ホルモンまたはそのサブユニットおよびＦｒＡ
Ａ−１にマウスおよびヒトにおいてリンパ球を刺激して
非特異的に抗体産性を亢進させる作用があることを見い
出した［Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６，
１３３（１９８３）］。

【０００５】さらに，ヒトの唾液および唾液腺にも非特
異的に抗体産生を亢進させる物質が存在することが知ら
れている［特公平１−１３５７９９号公報］。

【０００６】また、マウスの唾液腺中に遅延アレルギー
（ｄｅｌａｙｅｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ
ｙ）応答に影響を与える因子が存在することが知られて
おり（Ｍ．Ｈｉｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，１９７９，３７，８６９）、近年、マ
ウスの顎下腺抽出物中の免疫抑制活性を有する物質に関
する研究が進められている［羽室ら，１９９０年臨床免
疫学会要旨集，Ｄ８０；村上ら，第６４回日本細菌学総
会要旨集，Ｆ−III −１４；羽室ら，日本細菌学雑誌，
４２（２），１９９２等］。

【０００７】

【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、現在までに
唾液腺中に免疫活性を有する物質が存在することが知ら
れているウシやマウス以外の動物から、新規な免疫賦活
物質を見い出し、単離することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の報告
に基づき、ウシ、マウスとともにブタ、ラット、モルモ
ット、ウサギなどの各種動物の唾液腺中に免疫活性を有
する物質が存在するか否かについて検討を行った。

【０００９】各種動物の唾液腺は、耳下腺と顎下腺とに
分けられ、それぞれの免疫活性を、ＰＢＡ活性試験によ
り測定した。

【００１０】ＰＢＡ活性試験とは、ある物質（試料）の
ポリクロ−ナルＢ細胞に対する賦活活性を測定すること
により、その物質が免疫活性を有するか否かを知ること
ができる試験法でありである。脾臓中のＢ細胞は、ある
種の抗原の添加により非特異的にが活性化され、ＩｇＭ
抗体の産生が誘発されるが、ここに免疫活性を有するか
否かを調べたい物質を加え、ＩｇＭ坑他愛の産生が亢進
されたか否かを判定するものである。すなわち、摘出し
たマウスの脾臓細胞と試料溶液を混合して３７℃で培養
した後、この培養細胞にプロテインＡ被覆ヒツジ赤血
球、モルモット補体および抗ＩｇＭ血清を添加混合し、
さらに、０．５％寒天上にこの混合物を添加した後、３
７℃で培養し、形成された溶血斑（プラ−ク）の数を測
定する。このプラ−ク数と試料をてんかせずに同様に処
理した場合のプラ−ク数とを比較し、免疫活性（賦活お
よび抑制の両方を含む）の有無を判定する。

【００１１】ＰＢＡ活性試験は、それぞれの動物の耳下
腺及び顎下腺の水または塩を含む水による抽出物を遠心
分離（１８０００ｒｐｍ，１０分間）して得られた上清
を１Ｎ塩酸でｐＨ４．５に調整し、生成した沈殿と上清
とを遠心分離（１８０００ｒｐｍ、１０分間）によって
分離し、沈澱を水または塩を含む水に溶解し、上清およ
び沈澱の溶液それぞれに０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液
を加えてｐＨ７．０に調整した溶液を用いて実施した。

【００１２】その結果を表１に示す。

【００１３】

【表１】

【００１４】一般に分類学的に近縁なラット、マウス、
モルモット、ウサギ等の唾液腺には、同等の性質の免疫
活性物質が存在するのではないかと推測されるが、上記
表１の結果から、この推測は成り立たないことが明らか
となった。

【００１５】本発明者らは、各種の動物から得られた免
疫活性物質について個々に検討を行った。その結果、表
１より明らかなように、ウサギ顎下腺中に、非特異的に
抗体産生を賦活する作用をもつ物質が存在することを確
認し、その分離精製について鋭意研究を重ね、この物質
を分画できる方法を見い出し、その物理化学的性質を解
明し、本発明を完成するに至った。

【００１６】本発明の免疫賦活物質（以下、「本発明物
質」と略す。）は以下に示す物理化学的性質を有するタ
ンパク質である。

【００１７】（１）性状：白色粉末 （２）分子量：ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドのデ
ィスク電気泳動法及びセファデックスＧ−１００のゲル
濾過法により測定した分子量は３０〜６０ｋＤ（キロダ
ルトン）の範囲内にある。 （３）等電点：ｐＨ４．５〜６．５の範囲内にある。 （４）溶解性：水および生理食塩水に可溶、アセトンに
不溶。 （５）呈色反応：ニンヒドリン反応 陽性 ビウレット反応 陽性 ミロン反応 陽性 坂口反応 陽性 モリッシュ反応 陽性 アンスロン反応 陽性 エルソン・モーガン反応 陽性 （６）分配係数（Ｋａｖ値）：約０．２５〜０．７５の
範囲内にある。ここに、分配係数（Ｋａｖ値）は、ゲル
濾過におけるゲル層と液層との間の分配係数であり、下
記式により算出される。 Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｔ−Ｖｏ） Ｖｔ＝ゲルベッドの総容積 Ｖｅ＝溶出液量 Ｖｏ＝ゲル粒子外部の溶媒量

【００１８】なお、ゲル濾過材としてＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−１００（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ製）を使用し且つ溶出液としてｐＨ７．４の
０．２Ｍトリス緩衝液を用いた。

【００１９】本発明物質は、ウサギの顎下腺の水または
塩を含む水による抽出物を遠心分離し、得られた上清液
をｐＨ約４．５に調整し、生成した沈殿を集め、この沈
澱を水または塩を含む水に溶解した溶液を分子篩クラマ
トグラフィーに付し、分子量３０〜６０ｋＤの画分を捕
集する工程を含むことを特徴とする分画方法により得ら
れる。

【００２０】本発明物質は、分子量３０〜６０ｋＤの画
分を、イオン交換体によるクロマトグラフィーに付し、
イオン交換体に吸着するもののうち、塩化ナトリウムを
含む緩衝液で溶出する画分を捕集する工程を含むことを
特徴とする分画方法により、更に分画される。

【００２１】なお、イオン交換体に吸着し、塩化ナトリ
ウムを含む緩衝液で溶出されないものは免疫活性を有し
ない。

【００２２】以下、本発明物質の分画方法について詳説
する。ウサギの顎下腺をホモジネートしたものを水また
は塩を含む水で抽出し、得られた抽出物を遠心分離（通
常５０００〜２００００ｒｐｍ、５〜４０分間、好まし
くは１５０００〜１８０００ｒｐｍ、２０〜３０分間）
し、上清液を分離する。この上清液に塩酸、酢酸等の酸
を加えてｐＨ約４．５に調整し、再度遠心分離（通常５
０００〜２００００ｒｐｍ、５〜４０分間、好ましくは
１５０００〜１８０００ｒｐｍ、２０〜３０分間）して
生成した沈殿を回収する。回収した沈殿をアセトンで洗
浄し、脱脂および脱水する。得られた沈澱に水または塩
を含む水を加えて溶解し、この溶液を、分子篩クロマト
グラフィーに付し、分子量３０〜６０ｋＤの画分を得
る。

【００２３】ここで、塩を含む水としては、約０．１Ｍ
（約１．０重量％）の塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の水溶液が挙げら
れる。

【００２４】分子篩クロマトグラフィーによる分子篩操
作は、デキストラン及びポリアクリルアミドなどのゲル
粒子をカラムに充填して実施する。本発明で用いること
ができるデキストランゲルとしては、例えばＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−７５、Ｇ−１００、Ｇ−２００およびＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、ポリアクリルアミドゲ
ルとしては、例えばＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６０およびＰ
−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
製）が挙げられる。また、分子篩用充填カラムとして
は、例えばＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ、Ｇ２０
００ ＳＷ（東ソー製）、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３
１０、ＧＳ−５１０（旭化成製）などが挙げられる。展
開に使用し得る緩衝液としては、ゲル粒子を平衡化させ
るのに用いた緩衝液が好ましく、例えば０．２Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２Ｍリン酸緩衝液などが挙
げられる。分子篩操作はそれ自体公知の方法で行うこと
ができ、上記分子篩操作を単独、または、それらの操作
を相互に組み合わせて、目的とする分子量３０〜６０ｋ
Ｄの画分を容易に得ることができる。

【００２５】上記で得られた本発明物質である分子量３
０〜６０ｋＤの画分は溶液の形態で保存することが可能
であるが、凍結及び／又は乾燥して保存するのが好まし
い。乾燥は通常の方法例えば、減圧乾燥、凍結乾燥、ア
セトン乾燥等により行うことができる。

【００２６】本発明物質である分子量３０〜６０ｋＤの
画分は、次に示すイオン交換体によるクロマトグラフィ
ーに付すことにより更に分画することもできる。

【００２７】前記の如く、分子篩操作によって得られた
分子量３０〜６０ｋＤの本発明物質を、更にイオン交換
体カラムによるクロマトグラフィーに付し、イオン交換
体に吸着するもののうち、塩化ナトリウムを含む緩衝液
で溶出する画分を捕集する。クロマトグラフィ−に使用
するイオン交換体は、陰イオン交換体でも、陽イオン交
換体でもよい。陰イオン交換体としては、例えば、ＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、ＤＥＡＥ−セルロ−ス
（Ｓｅｒｖａ Ｅｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ｇｍｂ
Ｈ．＆ Ｃｏ．製）等が使用できる。陽イオン交換体と
しては、例えば、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）、ＣＭ−
セルロ−ス（Ｓｅｒｖａ Ｅｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ ＧｍｂＨ．＆ Ｃｏ．製）等が使用できる。クロマ
トグラフィ−の実施に先立ち、上記のイオン交換体を開
始緩衝液で平衡化させる。開始緩衝液またはイオン交換
体に吸着せず、カラムを素通りする画分を溶出する緩衝
液としては、従来より用いられている各種の緩衝液のう
ち、塩化ナトリウムを含有していないものであり、例え
ば、０．０２Ｍトリス緩衝液等が挙げられる。本発明物
質のイオン交換体に吸着する画分を溶出するのに用いる
塩化ナトリウムを含む緩衝液としては、通常用いられる
各種の緩衝液のうち、塩化ナトリウムを含むものであ
り、例えば、０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）などが挙げられ
る。

【００２８】平衡化した上記イオン交換体をカラムに充
填し、次いで前記の分子篩操作により得られた本発明物
質含有液をカラムに添加し、本発明物質のうち、塩化ナ
トリウムを含まない上記緩衝液を用いてイオン交換体に
吸着せず、カラムを素通りする画分を溶出させる。本発
明物質のイオン交換体に吸着する画分を、塩化ナトリウ
ムを含む上記緩衝液で溶出させる。本発明物質を含む画
分の溶出液を、透析等により脱塩したのち凍結乾燥する
ことにより本発明物質のうち、イオン交換体に吸着し、
塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出する画分を得ること
ができる。

【００２９】かくして得られた本発明物質（分子篩クロ
マトグラフィーにより得られた物質および同物質をさら
にイオン交換クロマトグラフィーに付し、塩化ナトリウ
ムを含む緩衝液で溶出して得られた物質の両者を含む）
は、必要に応じて、それ自体公知の電気泳動による等電
点分画、陰イオン交換体による等電点分画、多孔質ガラ
スを用いるクロマトグラフィー、疎水性吸着体を用いる
クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー
などに付すことによりさらに精製することができる。

【００３０】電気泳動による等電点分画による方法は、
通電によって自由溶液あるいは適当なゲル中にあらかじ
め安定なｐＨ勾配を形成させ、そのｐＨ勾配に対して、
本発明物質をその等電点と同一のｐＨ層まで泳動させ、
そのｐＨ層内に目的物を濃縮させたのち、該濃縮分画よ
り抽出する方法である。自由溶液又はゲルとしては、シ
ョ糖の密度勾配溶液またはポリアクリルアミドゲルを用
いることができ、本発明物質をｐＨ層内に濃縮するため
には自由溶液の場合は約４８時間、ゲルの場合は約６時
間通電する必要がある。尚、本発明物質はｐＨ４．５〜
６．５層内から得ることができる。

【００３１】多孔質ガラスを用いるクロマトグラフィー
による方法は、本発明物質を含む水溶液を酸性、好まし
くはｐＨ４．５〜６．５としたのち、ＣＰＧ−１０（Ｃ
ＰＧ，ＩＮＣ．製）などの多孔質ガラスと接触させ、次
いでグリシンまたはプロリンなどのアミノ酸を加えてア
ルカリ性、好ましくはｐＨ７．５以上とした水溶液を用
いて本発明物質を溶出させる方法である。

【００３２】疎水性吸着体を用いるクロマトグラフィー
による方法は、例えば疎水性吸着体として、ブチル−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ、オクチル−セファロースＣＬ−
６Ｂまたはフェニル−セファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）など
をカラムに充填し、硫酸アンモニウム、食塩などの無機
塩を約１０〜２０％含有する溶液に本発明物質を加え、
この混合液をカラムに流すことによって精製する方法で
ある。

【００３３】陰イオン交換体による等電点分画による方
法としては、タンパク質の水溶液をタンパク質の等電点
の差を利用して分画するクロマトフォーカシングを用い
る方法が挙げられる。クロマトフォーカシングに用いる
イオン交換体としては、例えば、ＰＢＥ９４陰イオン交
換体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ製）などが挙げられる。陰イオン交換体をカラムに
充填し、本発明物質含有液を添加し、溶出液を用いて本
発明物質を更に精製した形で溶出することができる。溶
出液としては例えばポリバッファー７４（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）などが用い
られる。

【００３４】かくして得られた本発明の免疫賦活物質
は、免疫不全の治療剤、ワクチン効果増強剤、宿主防御
能を増大させる治療剤として有用である。

【００３５】即ち、免疫不全疾患の患者は、免疫担当細
胞であるＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球の機能低下の
ため、細菌および微生物の侵入による感染症にかかりや
すい状態にある。免疫不全疾患の患者に本発明物質を投
与すれば、免疫機能の改善、さらには細菌等の感染に対
する防御が期待される。

【００３６】さらに、ワクチン（例えば、インフルエン
ザワクチン，Ｂ型肝炎ワクチン等）投与時に本発明物質
を用いれば抗体価の上昇、さらには投与したワクチンの
効果の増強作用が期待できる。

【００３７】本発明物質は、かかる治療剤等として、経
口投与及び非経口投与のいずれの方法によっても投与す
ることができる。本発明物質は各種投与形態に調剤する
ことができ、例えば、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カ
プセル剤など）、経粘膜剤（坐剤、経鼻剤など）、注射
剤（溶剤、凍結乾燥剤など）とすることができる。調剤
の際に使用しうる補助剤としては例えば、塩化ナトリウ
ム、グリシン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、シ
ョ糖、でんぷん、デキストラン、ゼラチンなどが挙げら
れる。

【００３８】本発明物質を臨床治療剤として使用する際
の有効投与量は、疾病の種類、投与経路、症状の軽重、
患者の年令等により適宜変動させるべきであるが、一般
に１日につき約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇで用いること
ができる。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により、本発明を更に説明す
る。

【００４０】実施例１（本発明物質の分画例） 成熟正常雄性ウサギ（体重２．５〜３．０Ｋｇ）の顎下
腺１００ｇをホモジネートし、水４００ｍｌで抽出し
た。得られた水抽出物を１８０００ｒｐｍ、１０分間遠
心分離し、上清液を分離した。上清液に１．０Ｎ塩酸を
加えて上清液のｐＨを４．５に調整し、沈殿を形成さ
せ、更に１８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈澱
を回収した。回収した沈澱にアセトン８００ｍｌを加え
て洗浄し、脱水して本発明物質を含む乾燥末を得た。

【００４１】得られた本発明物質を含む乾燥末を０．２
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）２５０ｍｌに溶解し、同
緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ製）に添加した。同緩衝液で溶出を行い、分子量３０
〜６０ｋＤの本発明物質を含む画分の溶液を回収した。
回収した画分溶液を透析により脱塩した後、凍結乾燥し
て免疫賦活活性を有する本発明物質の画分（Ａ）０．８
ｇ（収率：０．８％）を得た。

【００４２】得られた免疫賦活活性を有する画分（Ａ）
の物理化学的性質を測定した結果を以下に示す。

【００４３】（１）性状：白色粉末 （２）分子量：３０〜６０ｋＤ （３）等電点：ｐＨ４．５〜６．５ （４）溶解性：水および生理食塩水に可溶、アセトンに
不溶。 （５）呈色反応：ニンヒドリン反応、ビウレット反応、
ミロン反応、坂口反応、モリッシュ反応、アンスロン反
応、エルソン・モーガン反応は、いずれも陽性である。 （６）分配係数（Ｋａｖ値）：約０．２５〜０．７５ （なお上記物理化学的性質（１）〜（６）の測定方法の
うち、測定方法が本明細書に記載のあるものはこの記載
方法により、また記載のないものは常法による。）

【００４４】次に、上記工程で得られた画分（Ａ）を
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１５０ｍｌに溶解
し、同緩衝液で平衡化したＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＳＷカラム（東ソー製）に添加した。同緩衝液で溶出
を行い、免疫賦活活性を有する画分を捕集した。なお、
免疫賦活活性は、ＰＢＡ活性試験法により判定した。
（以下、同様である。）

【００４５】捕集した画分を限外濾過膜ＹＭ−２（Ａｍ
ｉｃｏｎ製）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、再
度０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した
ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷカラムに添加し、同
緩衝液で溶出し、，免疫賦活活性を有する画分を捕集し
た。さらに、捕集した画分を限外濾過膜ＹＭ−２によっ
て脱塩後、凍結乾燥し、免疫賦活活性を有する本発明物
質の画分（Ｂ）１５０ｍｇ（収率：０．１５％）を得
た。

【００４６】得られた画分（Ｂ）の物理化学的性質を測
定した結果、画分（Ｂ）は画分（Ａ）と同様の物理化学
的性質を有していた。

【００４７】実施例２ 実施例１と同様にして得た本発明物質の画分（Ａ）の凍
結乾燥物２００ｍｇを、０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）２００ｍｌに溶解した。得られた溶液を、同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
製、Ａ−２５）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄し、
カラムに吸着しない画分を除去した後、１．０Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）
で溶出を行い、免疫賦活活性を有する画分を含む溶液を
捕集した。得られた免疫賦活活性を有する画分の溶液を
限外濾過膜ＹＭ−２（Ａｍｉｃｏｎ製）により脱塩した
後、実施例１と同様の方法でＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３００
０ ＳＷカラム（東ソー製）に添加し、０．２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。免疫賦活活性を有す
る画分の溶液を捕集し、限外濾過膜ＹＭ−２（Ａｍｉｃ
ｏｎ製）により脱塩した後、凍結乾燥し、免疫賦活活性
を有する本発明物質の画分（Ｃ）３．７ｍｇ（収率：
０．０２％）を得た。

【００４８】得られた画分（Ｃ）の物理化学的性質を測
定した結果、画分（Ｃ）は画分（Ａ）と同様の物理化学
的性質を有していた。

【００４９】実施例３ 実施例１と同様にして得た本発明物質の画分（Ａ）の凍
結乾燥物２００ｍｇを、１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含
む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１
００ｍｌに溶解した。この溶液を同緩衝液で平衡化した
オクチル−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製ゲル，径
２．６ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に添加し、同緩衝液でカラ
ムを洗浄し、カラムに吸着しない画分を素通りさせた。
カラムに吸着しない本発明物質を含む溶液を限外濾過膜
ＹＭ−２（Ａｍｉｃｏｎ製）により脱塩した後、濃縮し
た。得られた濃縮液を２％両性担体（バイオライト、ｐ
Ｈ３〜１０、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
製）を含む４％ポリアクリルアミドゲルによる等電点電
気泳動に付し、精製を行った。等電点電気泳動ゲル上の
免疫賦活活性を有する部分を水で抽出し、限外濾過膜Ｙ
Ｍ−２（Ａｍｉｃｏｎ製）によって脱塩した後実施例１
と同様の方法でＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷカラ
ムによって精製し、免疫賦活活性を有する本発明物質の
画分（Ｄ）の凍結乾燥物４．１ｍｇ（収率：０．０１
％）を得た。

【００５０】得られた画分（Ｄ）の物理化学的性質を測
定した結果、画分（Ｄ）は画分（Ａ）と同様の物理化学
的性質を有していた。

【００５１】実施例４（本発明物質の免疫賦活活性試験
例） 上記実施例２で得られた免疫賦活活性を有する本発明物
質の画分（Ｃ）を用いて、本実施例において免疫賦活活
性試験を実施した。

【００５２】本発明物質の免疫賦活活性の測定は次の方
法でＩｇＭの抗体産生細胞数を測定することにより行っ
た。

【００５３】即ち、生後６〜８週令のＤＢＡ／２マウス
を脱臼殺し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から調製し
た脾臓細胞懸濁液と上記実施例 に示す方法で得られた
本発明物質（画分（Ｃ））との混合物を３７℃で３〜５
日間培養した。培養した脾臓細胞懸濁液中の抗体産生細
胞数の測定は、Ｅ．Ｇｒｏｎｏｗｉｅｇ、Ａ．Ｃｏｕｔ
ｉｎｈｏ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５８８
（１９７６）に記載された方法によった。即ち、培養し
た脾臓細胞懸濁液をプロティンＡ被覆ヒツジ赤血球、モ
ルモット補体及び抗Ｉｇサブクラス抗血清と共に３７
℃、４時間培養した。さらに、０．５％寒天上にこの混
合物を添加した後、３７℃で培養し、出現する溶血斑の
数を測定し、１０⁶ 個の脾臓生細胞数当りの溶血斑形成
細胞数（ＰＦＣ）を計算した。測定結果を表２に示し
た。

【００５４】

【表２】

【００５５】表２の結果から、本発明物質が免疫賦活活
性を有することは明らかである。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、ウサギ顎下腺中に、新規
な免疫賦活物質が存在することを見出し、この免疫賦活
活性物質を分画することができる。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年８月２０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】１９８３年に、石坂らは、ウシ耳下腺由来
の唾液腺ホルモンまたはそのサブユニットおよびＦｒＡ
Ａ−１にマウスおよびヒトにおいてリンパ球を刺激して
非特異的に抗体産生を亢進させる作用があることを見い
出した［Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６，
１３３（１９８３）］。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】ＰＢＡ活性試験とは、ある物質（試料）の
ポリクロ−ナルＢ細胞に対する賦活活性を測定すること
により、その物質が免疫活性を有するか否かを知ること
ができる試験法である。脾臓中のＢ細胞は、ある種の抗
原の添加により非特異的に活性化され、ＩｇＭ抗体の産
生が誘発されるが、ここに免疫活性を有するか否かを調
べたい物質を加え、ＩｇＭ坑体の産生が亢進されたか否
かにより免疫活性の有無を判定する方法である。すなわ
ち、摘出したマウスの脾臓細胞と試料溶液を混合して３
７℃で培養した後、この培養細胞にプロテインＡ被覆ヒ
ツジ赤血球、モルモット補体および抗ＩｇＭ血清を添加
混合し、さらに、０．５％寒天上にこの混合物を添加し
た後、３７℃で培養し、形成された溶血斑（プラ−ク）
の数を測定する。このプラ−ク数と試料を添加せずに同
様に処理した寒天上のプラ−ク数とを比較し、その試料
の免疫活性（賦活および抑制の両方を含む）の有無を判
定する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】ＰＢＡ活性試験は、それぞれの動物の耳下
腺及び顎下腺の水または塩を含む水による抽出物を遠心
分離（１８０００ｒｐｍ，１０分間）して得られた上清
をそれぞれに０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐ
Ｈ７．０に調整した溶液を用いて実施した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１３】

【表１】

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１９】本発明物質は、ウサギの顎下腺の水または
塩を含む水による抽出物を遠心分離し、得られた上清液
をｐＨ約４．５に調整し、生成した沈殿を集め、この沈
澱をｐＨ７．４の０．２Ｍトリス緩衝液に溶解した溶液
を分子篩クラマトグラフィーに付し、分子量３０〜６０
ｋＤの画分を捕集する工程を含むことを特徴とする分画
方法により得られる。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】以下、本発明物質の分画方法について詳説
する。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】ここで、塩を含む水としては、約０．１Ｍ
（約０．６重量％）の塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の水溶液が挙げら
れる。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】疎水性吸着体を用いるクロマトグラフィー
による方法は、例えば疎水性吸着体として、ブチル−セ
ファロース４Ｂ、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂま
たはフェニル−セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）などをカラ
ムに充填し、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどの
無機塩を約１０〜２０％含有する溶液に本発明物質を加
え、この混合液をカラムに流すことによって精製する方
法である。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４９】実施例３ 実施例１と同様にして得た本発明物質の画分（Ａ）の凍
結乾燥物２００ｍｇを、１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含
む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１
００ｍｌに溶解した。この溶液を同緩衝液で平衡化した
オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製ゲル，径
２．６ｃｍ、高さ２０ｃｍ）に添加し、同緩衝液でカラ
ムを洗浄し、カラムに吸着した本発明物質を１０％硫酸
アンモニウムから水へのグラジエント溶出し、捕集し、
限外濾過膜ＹＭ−２（Ａｍｉｃｏｎ製）により脱塩した
後、濃縮した。得られた濃縮液を２％両性担体（バイオ
ライト、ｐＨ３〜１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ製）を含む４％ポリアクリルアミドゲルに
よる等電点電気泳動に付し、精製を行った。等電点電気
泳動ゲル上の免疫賦活活性を有する部分を水で抽出し、
限外濾過膜ＹＭ−２（Ａｍｉｃｏｎ製）によって脱塩し
た後実施例１と同様の方法でＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３００
０ ＳＷカラムによって精製し、免疫賦活活性を有する
本発明物質の画分（Ｄ）の凍結乾燥物４．１ｍｇ（収
率：０．０１％）を得た。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５３】即ち、生後６〜８週令のＤＢＡ／２マウス
を脱臼殺し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から調製し
た脾臓細胞懸濁液と上記実施例 に示す方法で得られた
本発明物質（画分（Ｃ））との混合物を３７℃で３〜５
日間培養した。培養した脾臓細胞懸濁液中の抗体産生細
胞数の測定は、Ｅ．Ｇｒｏｎｏｗｉｅｇ、Ａ．Ｃｏｕｔ
ｉｎｈｏ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５８８
（１９７６）に記載された方法によった。即ち、培養し
た脾臓細胞懸濁液をプロティンＡ被覆ヒツジ赤血球、モ
ルモット補体及び抗Ｉｇクラス抗血清と共に０．５％寒
天上に添加した後、３７℃で４時間培養し、出現する溶
血斑の数を測定し、１０⁶個の脾臓生細胞数当りの溶血
斑形成細胞数（ＰＦＣ）を計算した。測定結果を表２に
示した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウサギの顎下腺から得られ、下記の物理
   化学的性質を有することを特徴とする免疫賦活物質。 （１）性状：白色粉末 （２）分子量：ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドのデ
   ィスク電気泳動法及びセファデックスＧ−１００のゲル
   濾過法により測定した分子量は、３０〜６０ｋＤ（キロ
   ダルトン）の範囲内にある。 （３）等電点：ｐＨ４．５〜６．５の範囲内にある。 （４）溶解性：水および生理食塩水に可溶、アセトンに
   不溶。 （５）呈色反応：ニンヒドリン反応 陽性 ビウレット反応 陽性 ミロン反応 陽性 坂口反応 陽性 モリッシュ反応 陽性 アンスロン反応 陽性 エルソン・モーガン反応 陽性 （６）分配係数（Ｋａｖ値）：約０．２５〜０．７５の
   範囲内にある。ここに、分配係数（Ｋａｖ値）は、ゲル
   濾過におけるゲル層と液層との間の分配係数であり、下
   記式により算出される。 Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｔ−Ｖｏ） Ｖｔ＝ゲルベッドの総容積 Ｖｅ＝溶出液量 Ｖｏ＝ゲル粒子外部の溶媒量
2. 【請求項２】 ウサギの顎下腺の水または塩を含む水に
   よる抽出物を遠心分離し、得られた上清液をｐＨ約４．
   ５に調整し、生成した沈殿を集め、沈澱を水または塩を
   含む水に溶解した溶液を分子篩クラマトグラフィーに付
   し、分子量３０〜６０ｋＤの画分を捕集する工程を含む
   ことを特徴とする免疫賦活物質の分画方法。
3. 【請求項３】 分子量３０〜６０ｋＤの画分を、イオン
   交換体によるクロマトグラフィーに付し、イオン交換体
   に吸着するもののうち塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶
   出する画分を捕集する工程を含むことを特徴とする請求
   項２に記載の方法。