JPH0665296A - 免疫賦活物質およびその分画方法 - Google Patents

免疫賦活物質およびその分画方法

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JPH0665296A
JPH0665296A JP4220284A JP22028492A JPH0665296A JP H0665296 A JPH0665296 A JP H0665296A JP 4220284 A JP4220284 A JP 4220284A JP 22028492 A JP22028492 A JP 22028492A JP H0665296 A JPH0665296 A JP H0665296A
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water
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JP4220284A
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Inventor
Masao Kobayashi
正雄 小林
Shigeaki Ishizaka
重昭 石坂
Yoshio Furusawa
良雄 古澤
Kenji Tamaki
健二 玉木
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Aska Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Teikoku Hormone Manufacturing Co Ltd
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 現在までに唾液腺中に免疫活性を有する物質
が存在することが知られている、ウシやマウス以外の動
物から新規な免疫賦活物質を見い出し、単離する。 【構成】 ウサギの顎下腺から得られ、白色粉末状で、
SDS−10%ポリアクリルアミドのディスク電気泳動
法及びセファデックスG−100のゲル濾過法により測
定した分子量は、30〜60kD(キロダルトン)の範
囲内にあり、等電点が、pH4.5〜6.5の範囲内に
あり、水および生理食塩水に可溶、アセトンに不溶で、
ニンヒドリン反応、ビウレット反応、ミロン反応、坂口
反応、モリッシュ反応、アンスロン反応、エルソン・モ
ーガン反応は、全て陽性であり、分配係数(Kav値)
が、約0.25〜0.75の範囲内にあることを特徴と
する免疫賦活物質。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はウサギの顎下腺から得ら
れる新規な免疫賦活物質及びその分画方法に関する。
【0002】
【先行技術】哺乳動物の唾液腺、特に耳下腺には唾液腺
ホルモンが含まれ、この唾液腺ホルモンは間葉性組織に
作用し、特に硬組織の発育促進作用、血清カルシウム低
下作用、細網内皮系刺激作用、白血球増加作用等の生理
作用を有しており、医薬として広範に使用されている。
【0003】1974年に、青沼らは、ウシ耳下腺由来
の唾液腺ホルモン活性を有する分子量45,000の唾
液腺ホルモンサブユニットを単離した[Folio.E
ndocrinol.Jpn.,50,1468(19
74)参照]。引き続いて青沼らは、1977年に唾液
腺ホルモンサブユニットを酵素分解し、白血球増加作用
を示すFrAA−1およびヒトカルシウム低下作用を示
すFrH−1を分離し、その構造を決定した[Che
m.Pharm.Bull.,28,417(198
0)及び特公昭57−35958号公報参照]。
【0004】1983年に、石坂らは、ウシ耳下腺由来
の唾液腺ホルモンまたはそのサブユニットおよびFrA
A−1にマウスおよびヒトにおいてリンパ球を刺激して
非特異的に抗体産性を亢進させる作用があることを見い
出した[Immunopharmacology,
133(1983)]。
【0005】さらに,ヒトの唾液および唾液腺にも非特
異的に抗体産生を亢進させる物質が存在することが知ら
れている[特公平1−135799号公報]。
【0006】また、マウスの唾液腺中に遅延アレルギー
(delayed hypersensitivit
y)応答に影響を与える因子が存在することが知られて
おり(M.Hiramatsu et al.,Imm
unology,1979,37,869)、近年、マ
ウスの顎下腺抽出物中の免疫抑制活性を有する物質に関
する研究が進められている[羽室ら,1990年臨床免
疫学会要旨集,D80;村上ら,第64回日本細菌学総
会要旨集,F−III −14;羽室ら,日本細菌学雑誌,
42(2),1992等]。
【0007】
【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、現在までに
唾液腺中に免疫活性を有する物質が存在することが知ら
れているウシやマウス以外の動物から、新規な免疫賦活
物質を見い出し、単離することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の報告
に基づき、ウシ、マウスとともにブタ、ラット、モルモ
ット、ウサギなどの各種動物の唾液腺中に免疫活性を有
する物質が存在するか否かについて検討を行った。
【0009】各種動物の唾液腺は、耳下腺と顎下腺とに
分けられ、それぞれの免疫活性を、PBA活性試験によ
り測定した。
【0010】PBA活性試験とは、ある物質(試料)の
ポリクロ−ナルB細胞に対する賦活活性を測定すること
により、その物質が免疫活性を有するか否かを知ること
ができる試験法でありである。脾臓中のB細胞は、ある
種の抗原の添加により非特異的にが活性化され、IgM
抗体の産生が誘発されるが、ここに免疫活性を有するか
否かを調べたい物質を加え、IgM坑他愛の産生が亢進
されたか否かを判定するものである。すなわち、摘出し
たマウスの脾臓細胞と試料溶液を混合して37℃で培養
した後、この培養細胞にプロテインA被覆ヒツジ赤血
球、モルモット補体および抗IgM血清を添加混合し、
さらに、0.5%寒天上にこの混合物を添加した後、3
7℃で培養し、形成された溶血斑(プラ−ク)の数を測
定する。このプラ−ク数と試料をてんかせずに同様に処
理した場合のプラ−ク数とを比較し、免疫活性(賦活お
よび抑制の両方を含む)の有無を判定する。
【0011】PBA活性試験は、それぞれの動物の耳下
腺及び顎下腺の水または塩を含む水による抽出物を遠心
分離(18000rpm,10分間)して得られた上清
を1N塩酸でpH4.5に調整し、生成した沈殿と上清
とを遠心分離(18000rpm、10分間)によって
分離し、沈澱を水または塩を含む水に溶解し、上清およ
び沈澱の溶液それぞれに0.1N水酸化ナトリウム溶液
を加えてpH7.0に調整した溶液を用いて実施した。
【0012】その結果を表1に示す。
【0013】
【表1】
【0014】一般に分類学的に近縁なラット、マウス、
モルモット、ウサギ等の唾液腺には、同等の性質の免疫
活性物質が存在するのではないかと推測されるが、上記
表1の結果から、この推測は成り立たないことが明らか
となった。
【0015】本発明者らは、各種の動物から得られた免
疫活性物質について個々に検討を行った。その結果、表
1より明らかなように、ウサギ顎下腺中に、非特異的に
抗体産生を賦活する作用をもつ物質が存在することを確
認し、その分離精製について鋭意研究を重ね、この物質
を分画できる方法を見い出し、その物理化学的性質を解
明し、本発明を完成するに至った。
【0016】本発明の免疫賦活物質(以下、「本発明物
質」と略す。)は以下に示す物理化学的性質を有するタ
ンパク質である。
【0017】(1)性状:白色粉末 (2)分子量:SDS−10%ポリアクリルアミドのデ
ィスク電気泳動法及びセファデックスG−100のゲル
濾過法により測定した分子量は30〜60kD(キロダ
ルトン)の範囲内にある。 (3)等電点:pH4.5〜6.5の範囲内にある。 (4)溶解性:水および生理食塩水に可溶、アセトンに
不溶。 (5)呈色反応:ニンヒドリン反応 陽性 ビウレット反応 陽性 ミロン反応 陽性 坂口反応 陽性 モリッシュ反応 陽性 アンスロン反応 陽性 エルソン・モーガン反応 陽性 (6)分配係数(Kav値):約0.25〜0.75の
範囲内にある。ここに、分配係数(Kav値)は、ゲル
濾過におけるゲル層と液層との間の分配係数であり、下
記式により算出される。 Kav=(Ve−Vo)/(Vt−Vo) Vt=ゲルベッドの総容積 Ve=溶出液量 Vo=ゲル粒子外部の溶媒量
【0018】なお、ゲル濾過材としてSephadex
G−100(PharmaciaFine Chem
icals製)を使用し且つ溶出液としてpH7.4の
0.2Mトリス緩衝液を用いた。
【0019】本発明物質は、ウサギの顎下腺の水または
塩を含む水による抽出物を遠心分離し、得られた上清液
をpH約4.5に調整し、生成した沈殿を集め、この沈
澱を水または塩を含む水に溶解した溶液を分子篩クラマ
トグラフィーに付し、分子量30〜60kDの画分を捕
集する工程を含むことを特徴とする分画方法により得ら
れる。
【0020】本発明物質は、分子量30〜60kDの画
分を、イオン交換体によるクロマトグラフィーに付し、
イオン交換体に吸着するもののうち、塩化ナトリウムを
含む緩衝液で溶出する画分を捕集する工程を含むことを
特徴とする分画方法により、更に分画される。
【0021】なお、イオン交換体に吸着し、塩化ナトリ
ウムを含む緩衝液で溶出されないものは免疫活性を有し
ない。
【0022】以下、本発明物質の分画方法について詳説
する。ウサギの顎下腺をホモジネートしたものを水また
は塩を含む水で抽出し、得られた抽出物を遠心分離(通
常5000〜20000rpm、5〜40分間、好まし
くは15000〜18000rpm、20〜30分間)
し、上清液を分離する。この上清液に塩酸、酢酸等の酸
を加えてpH約4.5に調整し、再度遠心分離(通常5
000〜20000rpm、5〜40分間、好ましくは
15000〜18000rpm、20〜30分間)して
生成した沈殿を回収する。回収した沈殿をアセトンで洗
浄し、脱脂および脱水する。得られた沈澱に水または塩
を含む水を加えて溶解し、この溶液を、分子篩クロマト
グラフィーに付し、分子量30〜60kDの画分を得
る。
【0023】ここで、塩を含む水としては、約0.1M
(約1.0重量%)の塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の水溶液が挙げら
れる。
【0024】分子篩クロマトグラフィーによる分子篩操
作は、デキストラン及びポリアクリルアミドなどのゲル
粒子をカラムに充填して実施する。本発明で用いること
ができるデキストランゲルとしては、例えばSepha
dex G−75、G−100、G−200およびSe
phacryl S−200(PharmaciaFi
ne Chemicals製)、ポリアクリルアミドゲ
ルとしては、例えばBio−Gel P−60およびP
−100(Bio−Rad Laboratories
製)が挙げられる。また、分子篩用充填カラムとして
は、例えばTSK gel G3000 SW、G20
00 SW(東ソー製)、Asahipak GS−3
10、GS−510(旭化成製)などが挙げられる。展
開に使用し得る緩衝液としては、ゲル粒子を平衡化させ
るのに用いた緩衝液が好ましく、例えば0.2Mトリス
緩衝液(pH7.0)、0.2Mリン酸緩衝液などが挙
げられる。分子篩操作はそれ自体公知の方法で行うこと
ができ、上記分子篩操作を単独、または、それらの操作
を相互に組み合わせて、目的とする分子量30〜60k
Dの画分を容易に得ることができる。
【0025】上記で得られた本発明物質である分子量3
0〜60kDの画分は溶液の形態で保存することが可能
であるが、凍結及び/又は乾燥して保存するのが好まし
い。乾燥は通常の方法例えば、減圧乾燥、凍結乾燥、ア
セトン乾燥等により行うことができる。
【0026】本発明物質である分子量30〜60kDの
画分は、次に示すイオン交換体によるクロマトグラフィ
ーに付すことにより更に分画することもできる。
【0027】前記の如く、分子篩操作によって得られた
分子量30〜60kDの本発明物質を、更にイオン交換
体カラムによるクロマトグラフィーに付し、イオン交換
体に吸着するもののうち、塩化ナトリウムを含む緩衝液
で溶出する画分を捕集する。クロマトグラフィ−に使用
するイオン交換体は、陰イオン交換体でも、陽イオン交
換体でもよい。陰イオン交換体としては、例えば、DE
AE−Sephadex(Pharmacia Fin
e Chemicals製)、DEAE−セルロ−ス
(Serva Eeinbiochemica Gmb
H.& Co.製)等が使用できる。陽イオン交換体と
しては、例えば、CM−Sephadex(Pharm
acia Fine Chemicals製)、CM−
セルロ−ス(Serva Eeinbiochemic
a GmbH.& Co.製)等が使用できる。クロマ
トグラフィ−の実施に先立ち、上記のイオン交換体を開
始緩衝液で平衡化させる。開始緩衝液またはイオン交換
体に吸着せず、カラムを素通りする画分を溶出する緩衝
液としては、従来より用いられている各種の緩衝液のう
ち、塩化ナトリウムを含有していないものであり、例え
ば、0.02Mトリス緩衝液等が挙げられる。本発明物
質のイオン交換体に吸着する画分を溶出するのに用いる
塩化ナトリウムを含む緩衝液としては、通常用いられる
各種の緩衝液のうち、塩化ナトリウムを含むものであ
り、例えば、0.02Mトリス緩衝液(pH8.0)、
0.05Mリン酸緩衝液(pH7.0)などが挙げられ
る。
【0028】平衡化した上記イオン交換体をカラムに充
填し、次いで前記の分子篩操作により得られた本発明物
質含有液をカラムに添加し、本発明物質のうち、塩化ナ
トリウムを含まない上記緩衝液を用いてイオン交換体に
吸着せず、カラムを素通りする画分を溶出させる。本発
明物質のイオン交換体に吸着する画分を、塩化ナトリウ
ムを含む上記緩衝液で溶出させる。本発明物質を含む画
分の溶出液を、透析等により脱塩したのち凍結乾燥する
ことにより本発明物質のうち、イオン交換体に吸着し、
塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出する画分を得ること
ができる。
【0029】かくして得られた本発明物質(分子篩クロ
マトグラフィーにより得られた物質および同物質をさら
にイオン交換クロマトグラフィーに付し、塩化ナトリウ
ムを含む緩衝液で溶出して得られた物質の両者を含む)
は、必要に応じて、それ自体公知の電気泳動による等電
点分画、陰イオン交換体による等電点分画、多孔質ガラ
スを用いるクロマトグラフィー、疎水性吸着体を用いる
クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー
などに付すことによりさらに精製することができる。
【0030】電気泳動による等電点分画による方法は、
通電によって自由溶液あるいは適当なゲル中にあらかじ
め安定なpH勾配を形成させ、そのpH勾配に対して、
本発明物質をその等電点と同一のpH層まで泳動させ、
そのpH層内に目的物を濃縮させたのち、該濃縮分画よ
り抽出する方法である。自由溶液又はゲルとしては、シ
ョ糖の密度勾配溶液またはポリアクリルアミドゲルを用
いることができ、本発明物質をpH層内に濃縮するため
には自由溶液の場合は約48時間、ゲルの場合は約6時
間通電する必要がある。尚、本発明物質はpH4.5〜
6.5層内から得ることができる。
【0031】多孔質ガラスを用いるクロマトグラフィー
による方法は、本発明物質を含む水溶液を酸性、好まし
くはpH4.5〜6.5としたのち、CPG−10(C
PG,INC.製)などの多孔質ガラスと接触させ、次
いでグリシンまたはプロリンなどのアミノ酸を加えてア
ルカリ性、好ましくはpH7.5以上とした水溶液を用
いて本発明物質を溶出させる方法である。
【0032】疎水性吸着体を用いるクロマトグラフィー
による方法は、例えば疎水性吸着体として、ブチル−セ
ファロースCL−6B、オクチル−セファロースCL−
6Bまたはフェニル−セファロースCL−6B(Pha
rmacia Fine Chemicals製)など
をカラムに充填し、硫酸アンモニウム、食塩などの無機
塩を約10〜20%含有する溶液に本発明物質を加え、
この混合液をカラムに流すことによって精製する方法で
ある。
【0033】陰イオン交換体による等電点分画による方
法としては、タンパク質の水溶液をタンパク質の等電点
の差を利用して分画するクロマトフォーカシングを用い
る方法が挙げられる。クロマトフォーカシングに用いる
イオン交換体としては、例えば、PBE94陰イオン交
換体(Pharmacia Fine Chemica
ls製)などが挙げられる。陰イオン交換体をカラムに
充填し、本発明物質含有液を添加し、溶出液を用いて本
発明物質を更に精製した形で溶出することができる。溶
出液としては例えばポリバッファー74(Pharma
cia Fine Chemicals製)などが用い
られる。
【0034】かくして得られた本発明の免疫賦活物質
は、免疫不全の治療剤、ワクチン効果増強剤、宿主防御
能を増大させる治療剤として有用である。
【0035】即ち、免疫不全疾患の患者は、免疫担当細
胞であるT−リンパ球およびB−リンパ球の機能低下の
ため、細菌および微生物の侵入による感染症にかかりや
すい状態にある。免疫不全疾患の患者に本発明物質を投
与すれば、免疫機能の改善、さらには細菌等の感染に対
する防御が期待される。
【0036】さらに、ワクチン(例えば、インフルエン
ザワクチン,B型肝炎ワクチン等)投与時に本発明物質
を用いれば抗体価の上昇、さらには投与したワクチンの
効果の増強作用が期待できる。
【0037】本発明物質は、かかる治療剤等として、経
口投与及び非経口投与のいずれの方法によっても投与す
ることができる。本発明物質は各種投与形態に調剤する
ことができ、例えば、経口剤(錠剤、顆粒剤、散剤、カ
プセル剤など)、経粘膜剤(坐剤、経鼻剤など)、注射
剤(溶剤、凍結乾燥剤など)とすることができる。調剤
の際に使用しうる補助剤としては例えば、塩化ナトリウ
ム、グリシン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、シ
ョ糖、でんぷん、デキストラン、ゼラチンなどが挙げら
れる。
【0038】本発明物質を臨床治療剤として使用する際
の有効投与量は、疾病の種類、投与経路、症状の軽重、
患者の年令等により適宜変動させるべきであるが、一般
に1日につき約0.01〜10mg/kgで用いること
ができる。
【0039】
【実施例】以下、実施例により、本発明を更に説明す
る。
【0040】実施例1(本発明物質の分画例) 成熟正常雄性ウサギ(体重2.5〜3.0Kg)の顎下
腺100gをホモジネートし、水400mlで抽出し
た。得られた水抽出物を18000rpm、10分間遠
心分離し、上清液を分離した。上清液に1.0N塩酸を
加えて上清液のpHを4.5に調整し、沈殿を形成さ
せ、更に18000rpm、10分間遠心分離し、沈澱
を回収した。回収した沈澱にアセトン800mlを加え
て洗浄し、脱水して本発明物質を含む乾燥末を得た。
【0041】得られた本発明物質を含む乾燥末を0.2
Mトリス緩衝液(pH7.4)250mlに溶解し、同
緩衝液で平衡化したSephadex G−100カラ
ム(Pharmacia Fine Chemical
s製)に添加した。同緩衝液で溶出を行い、分子量30
〜60kDの本発明物質を含む画分の溶液を回収した。
回収した画分溶液を透析により脱塩した後、凍結乾燥し
て免疫賦活活性を有する本発明物質の画分(A)0.8
g(収率:0.8%)を得た。
【0042】得られた免疫賦活活性を有する画分(A)
の物理化学的性質を測定した結果を以下に示す。
【0043】(1)性状:白色粉末 (2)分子量:30〜60kD (3)等電点:pH4.5〜6.5 (4)溶解性:水および生理食塩水に可溶、アセトンに
不溶。 (5)呈色反応:ニンヒドリン反応、ビウレット反応、
ミロン反応、坂口反応、モリッシュ反応、アンスロン反
応、エルソン・モーガン反応は、いずれも陽性である。 (6)分配係数(Kav値):約0.25〜0.75 (なお上記物理化学的性質(1)〜(6)の測定方法の
うち、測定方法が本明細書に記載のあるものはこの記載
方法により、また記載のないものは常法による。)
【0044】次に、上記工程で得られた画分(A)を
0.2Mリン酸緩衝液(pH6.8)150mlに溶解
し、同緩衝液で平衡化したTSK gel G3000
SWカラム(東ソー製)に添加した。同緩衝液で溶出
を行い、免疫賦活活性を有する画分を捕集した。なお、
免疫賦活活性は、PBA活性試験法により判定した。
(以下、同様である。)
【0045】捕集した画分を限外濾過膜YM−2(Am
icon製)を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、再
度0.02Mリン酸緩衝液(pH6.8)で平衡化した
TSK gel G3000 SWカラムに添加し、同
緩衝液で溶出し、,免疫賦活活性を有する画分を捕集し
た。さらに、捕集した画分を限外濾過膜YM−2によっ
て脱塩後、凍結乾燥し、免疫賦活活性を有する本発明物
質の画分(B)150mg(収率:0.15%)を得
た。
【0046】得られた画分(B)の物理化学的性質を測
定した結果、画分(B)は画分(A)と同様の物理化学
的性質を有していた。
【0047】実施例2 実施例1と同様にして得た本発明物質の画分(A)の凍
結乾燥物200mgを、0.02Mトリス緩衝液(pH
7.5)200mlに溶解した。得られた溶液を、同緩
衝液で平衡化したDEAE−Sephadexカラム
(Pharmacia Fine Chemicals
製、A−25)に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄し、
カラムに吸着しない画分を除去した後、1.0M塩化ナ
トリウムを含む0.02Mトリス緩衝液(pH7.5)
で溶出を行い、免疫賦活活性を有する画分を含む溶液を
捕集した。得られた免疫賦活活性を有する画分の溶液を
限外濾過膜YM−2(Amicon製)により脱塩した
後、実施例1と同様の方法でTSK gel G300
0 SWカラム(東ソー製)に添加し、0.2Mリン酸
緩衝液(pH6.8)で溶出した。免疫賦活活性を有す
る画分の溶液を捕集し、限外濾過膜YM−2(Amic
on製)により脱塩した後、凍結乾燥し、免疫賦活活性
を有する本発明物質の画分(C)3.7mg(収率:
0.02%)を得た。
【0048】得られた画分(C)の物理化学的性質を測
定した結果、画分(C)は画分(A)と同様の物理化学
的性質を有していた。
【0049】実施例3 実施例1と同様にして得た本発明物質の画分(A)の凍
結乾燥物200mgを、1.0M硫酸アンモニウムを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)1
00mlに溶解した。この溶液を同緩衝液で平衡化した
オクチル−セファロースCL−6Bカラム(Pharm
acia Fine Chemicals製ゲル,径
2.6cm、高さ20cm)に添加し、同緩衝液でカラ
ムを洗浄し、カラムに吸着しない画分を素通りさせた。
カラムに吸着しない本発明物質を含む溶液を限外濾過膜
YM−2(Amicon製)により脱塩した後、濃縮し
た。得られた濃縮液を2%両性担体(バイオライト、p
H3〜10、Bio−RadLaboratories
製)を含む4%ポリアクリルアミドゲルによる等電点電
気泳動に付し、精製を行った。等電点電気泳動ゲル上の
免疫賦活活性を有する部分を水で抽出し、限外濾過膜Y
M−2(Amicon製)によって脱塩した後実施例1
と同様の方法でTSK gel G3000 SWカラ
ムによって精製し、免疫賦活活性を有する本発明物質の
画分(D)の凍結乾燥物4.1mg(収率:0.01
%)を得た。
【0050】得られた画分(D)の物理化学的性質を測
定した結果、画分(D)は画分(A)と同様の物理化学
的性質を有していた。
【0051】実施例4(本発明物質の免疫賦活活性試験
例) 上記実施例2で得られた免疫賦活活性を有する本発明物
質の画分(C)を用いて、本実施例において免疫賦活活
性試験を実施した。
【0052】本発明物質の免疫賦活活性の測定は次の方
法でIgMの抗体産生細胞数を測定することにより行っ
た。
【0053】即ち、生後6〜8週令のDBA/2マウス
を脱臼殺し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から調製し
た脾臓細胞懸濁液と上記実施例 に示す方法で得られた
本発明物質(画分(C))との混合物を37℃で3〜5
日間培養した。培養した脾臓細胞懸濁液中の抗体産生細
胞数の測定は、E.Gronowieg、A.Cout
inho、Eur.J.Immunol.,,588
(1976)に記載された方法によった。即ち、培養し
た脾臓細胞懸濁液をプロティンA被覆ヒツジ赤血球、モ
ルモット補体及び抗Igサブクラス抗血清と共に37
℃、4時間培養した。さらに、0.5%寒天上にこの混
合物を添加した後、37℃で培養し、出現する溶血斑の
数を測定し、106 個の脾臓生細胞数当りの溶血斑形成
細胞数(PFC)を計算した。測定結果を表2に示し
た。
【0054】
【表2】
【0055】表2の結果から、本発明物質が免疫賦活活
性を有することは明らかである。
【0056】
【発明の効果】本発明により、ウサギ顎下腺中に、新規
な免疫賦活物質が存在することを見出し、この免疫賦活
活性物質を分画することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成5年8月20日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0004
【補正方法】変更
【補正内容】
【0004】1983年に、石坂らは、ウシ耳下腺由来
の唾液腺ホルモンまたはそのサブユニットおよびFrA
A−1にマウスおよびヒトにおいてリンパ球を刺激して
非特異的に抗体産を亢進させる作用があることを見い
出した[Immunopharmacology,6,
133(1983)]。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0010
【補正方法】変更
【補正内容】
【0010】PBA活性試験とは、ある物質(試料)の
ポリクロ−ナルB細胞に対する賦活活性を測定すること
により、その物質が免疫活性を有するか否かを知ること
ができる試験法である。脾臓中のB細胞は、ある種の抗
原の添加により非特異的に活性化され、IgM抗体の産
生が誘発されるが、ここに免疫活性を有するか否かを調
べたい物質を加え、IgM坑体の産生が亢進されたか否
により免疫活性の有無を判定する方法である。すなわ
ち、摘出したマウスの脾臓細胞と試料溶液を混合して3
7℃で培養した後、この培養細胞にプロテインA被覆ヒ
ツジ赤血球、モルモット補体および抗IgM血清を添加
混合し、さらに、0.5%寒天上にこの混合物を添加し
た後、37℃で培養し、形成された溶血斑(プラ−ク)
の数を測定する。このプラ−ク数と試料を添加せずに同
様に処理した寒天上のプラ−ク数とを比較し、その試料
免疫活性(賦活および抑制の両方を含む)の有無を判
定する。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0011
【補正方法】変更
【補正内容】
【0011】PBA活性試験は、それぞれの動物の耳下
腺及び顎下腺の水または塩を含む水による抽出物を遠心
分離(18000rpm,10分間)して得られた上清
をそれぞれに0.1N水酸化ナトリウム溶液を加えてp
H7.0に調整した溶液を用いて実施した。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0013
【補正方法】変更
【補正内容】
【0013】
【表1】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0019
【補正方法】変更
【補正内容】
【0019】本発明物質は、ウサギの顎下腺の水または
塩を含む水による抽出物を遠心分離し、得られた上清液
をpH約4.5に調整し、生成した沈殿を集め、この沈
澱をpH7.4の0.2Mトリス緩衝液に溶解した溶液
を分子篩クラマトグラフィーに付し、分子量30〜60
kDの画分を捕集する工程を含むことを特徴とする分画
方法により得られる。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0022
【補正方法】変更
【補正内容】
【0022】以下、本発明物質の分画方法について詳説
する。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0023
【補正方法】変更
【補正内容】
【0023】ここで、塩を含む水としては、約0.1M
(約0.6重量%)の塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の水溶液が挙げら
れる。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0032
【補正方法】変更
【補正内容】
【0032】疎水性吸着体を用いるクロマトグラフィー
による方法は、例えば疎水性吸着体として、ブチル−セ
ファロース4B、オクチル−セファロースCL−4B
たはフェニル−セファロースCL−4B(Pharma
cia Fine Chemicals製)などをカラ
ムに充填し、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどの
無機塩を約10〜20%含有する溶液に本発明物質を加
え、この混合液をカラムに流すことによって精製する方
法である。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0049
【補正方法】変更
【補正内容】
【0049】実施例3 実施例1と同様にして得た本発明物質の画分(A)の凍
結乾燥物200mgを、1.0M硫酸アンモニウムを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)1
00mlに溶解した。この溶液を同緩衝液で平衡化した
オクチル−セファロースCL−4Bカラム(Pharm
acia Fine Chemicals製ゲル,径
2.6cm、高さ20cm)に添加し、同緩衝液でカラ
ムを洗浄し、カラムに吸着した本発明物質を10%硫酸
アンモニウムから水へのグラジエント溶出し、捕集し、
限外濾過膜YM−2(Amicon製)により脱塩した
後、濃縮した。得られた濃縮液を2%両性担体(バイオ
ライト、pH3〜10、Bio−Rad Labora
tories製)を含む4%ポリアクリルアミドゲルに
よる等電点電気泳動に付し、精製を行った。等電点電気
泳動ゲル上の免疫賦活活性を有する部分を水で抽出し、
限外濾過膜YM−2(Amicon製)によって脱塩し
た後実施例1と同様の方法でTSK gel G300
0 SWカラムによって精製し、免疫賦活活性を有する
本発明物質の画分(D)の凍結乾燥物4.1mg(収
率:0.01%)を得た。
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0053
【補正方法】変更
【補正内容】
【0053】即ち、生後6〜8週令のDBA/2マウス
を脱臼殺し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓から調製し
た脾臓細胞懸濁液と上記実施例 に示す方法で得られた
本発明物質(画分(C))との混合物を37℃で3〜5
日間培養した。培養した脾臓細胞懸濁液中の抗体産生細
胞数の測定は、E.Gronowieg、A.Cout
inho、Eur.J.Immunol.,6,588
(1976)に記載された方法によった。即ち、培養し
た脾臓細胞懸濁液をプロティンA被覆ヒツジ赤血球、モ
ルモット補体及び抗Igクラス抗血清と共に0.5%寒
天上に添加した後、37℃で4時間培養し、出現する溶
血斑の数を測定し、106個の脾臓生細胞数当りの溶血
斑形成細胞数(PFC)を計算した。測定結果を表2に
示した。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ウサギの顎下腺から得られ、下記の物理
    化学的性質を有することを特徴とする免疫賦活物質。 (1)性状:白色粉末 (2)分子量:SDS−10%ポリアクリルアミドのデ
    ィスク電気泳動法及びセファデックスG−100のゲル
    濾過法により測定した分子量は、30〜60kD(キロ
    ダルトン)の範囲内にある。 (3)等電点:pH4.5〜6.5の範囲内にある。 (4)溶解性:水および生理食塩水に可溶、アセトンに
    不溶。 (5)呈色反応:ニンヒドリン反応 陽性 ビウレット反応 陽性 ミロン反応 陽性 坂口反応 陽性 モリッシュ反応 陽性 アンスロン反応 陽性 エルソン・モーガン反応 陽性 (6)分配係数(Kav値):約0.25〜0.75の
    範囲内にある。ここに、分配係数(Kav値)は、ゲル
    濾過におけるゲル層と液層との間の分配係数であり、下
    記式により算出される。 Kav=(Ve−Vo)/(Vt−Vo) Vt=ゲルベッドの総容積 Ve=溶出液量 Vo=ゲル粒子外部の溶媒量
  2. 【請求項2】 ウサギの顎下腺の水または塩を含む水に
    よる抽出物を遠心分離し、得られた上清液をpH約4.
    5に調整し、生成した沈殿を集め、沈澱を水または塩を
    含む水に溶解した溶液を分子篩クラマトグラフィーに付
    し、分子量30〜60kDの画分を捕集する工程を含む
    ことを特徴とする免疫賦活物質の分画方法。
  3. 【請求項3】 分子量30〜60kDの画分を、イオン
    交換体によるクロマトグラフィーに付し、イオン交換体
    に吸着するもののうち塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶
    出する画分を捕集する工程を含むことを特徴とする請求
    項2に記載の方法。
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