JPH06509070A - 抗ヒルジンポリクローナル抗体ならびにヒルジンの同定、免疫精製および定量的測定のためのその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ヒルジンポリクローナル抗体ならびにヒルジンの同定、免疫精製および定量的 測定のためのその用途本発明は、ヒルジンまたはヒルジン様タンパクに特異的な 抗体の製造方法に関する。

ヒルジンは、ヒル（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）のだ液腺から少量 単離され得るポリペプチドである（　Ｍａｒｋｗａｒｄｔ、　Ｆ、　：Ｕｎｔｅ ｒｓｕｃｈｕｎｇｅｒｎ　ｕｂｅｒ　Ｈｉｒｕｄｉｎ、　Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅ ｎｓｃｈａｆｔｅｎ　４１：５３７−５３８．１９５５　）　。

ヒルジンは、強力で特異的なトロンビン阻害剤である（Ｃｈａｎｇ。

Ｊ、　Ｙ、　：　トロンビン特異的阻害剤ヒルジンの機能的ドメイン、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、　１６４　：　３０７−３１３．１９８３）−ヒルジンはトロンビン に結合し、可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンへの転換を阻害し、■因 子、■因子および■因子のトロンビン媒介活性化を防ぐ（Ｍａｒｋｗａｒｄｔ、 　Ｆ、：ヒルジンの薬理学：医用ヒル中の抗凝血剤の最初の報告の１００年後、 Ｂｉａｓｅｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｃｔａ　４４　：　１００７−１０１３ ゜１９８５）　。

トロンビンは、ヒルジンに対して、血小板トロンビンレセプターに対するよりも 大きいアフィニティを有しくＦｅｎｔｏｎＩＩ　Ｊ、　Ｗ、　。

Ｌａｎｄｉｓ　Ｂ、　Ｈ，、Ｗａｌｚ　Ｄ、　Ａ、、　Ｂｉｎｇ　Ｄ、　Ｈ，、 Ｆｅｉｎｍａｎ　Ｒ，Ｄ、。

Ｚａｂｉｎｓｋｉ　Ｍ、　Ｐ、、　５ｏｎｄｅｒ　Ｓ、　Ａ、、　Ｂｅｒｌｉｎ ｅｒ　Ｌ、　Ｊ、、　ａｎｄ　ＦｉｎｌａｙｓｏｎＪ、　Ｓ、　：ヒトトロンビ ン：調製的評価、構造的特性および酵素的特異性、Ｄ、　Ｈ，Ｂｉｎｄ編［ヒト 血漿の化学と生理学（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｓｍａ）　Ｊ、　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ 、　ＮｅｗＹｏｒｋ中、ｐｐ、１５１−１８２．１９７９１　、そのためヒルジ ンはトロンビン−血小板レセプター複合体の解離を誘発することができ（ＴａＩ ＩＳ、　Ｌ。

Ｆｅｎｔｏｎ　Ｊ、　Ｌ　ａｎｄ　Ｄｅｔｗｉｌｅｒ　Ｔ、　Ｃ，：ヒルジンに よる血小板からのトロンビンの解離：レセプタープロセシングの証拠、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ。

Ｃｈｅｆｆｌ、、　２５４　：　８７２３−８７２５．１９７９）、それにより 放出反応および血小板凝集を阻害する（Ｈｏｆｆｍａｎｎ　Ａ、　ａｎｄ　Ｍａ ｒｋｗａｒｄｔ、　Ｆ、：ヒルジンによるトロンビン−血小板反応の阻害、Ｈｅ ｍｏｓｔａｓｉｓ、　１４　：　１６４−１６９゜１９８４　；　Ｒｅ１ｎｈｏ ｌｄ　Ｄ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｇｅｒｓｈｍａｎ　Ｈ，：ヒルジンはトロンビン刺 激による血小板放出を非感受性にする、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、、　３７　： ５１３−５２７．１９８５）。

同様の機序で、ヒルジンは、内皮細胞および繊維芽細胞上に存在するレセプター へのトロンビンの結合に干渉する（ＦｅｎｔｏｎＩＩ　Ｊ。

Ｌ、　Ｌａｎｄｉｓ　Ｂ、　Ｈ，、Ｗａｌｚ　Ｄ、＾、、　Ｂｉｎｇ　Ｄ、　Ｈ ，、Ｆｅｉｎｍａｎ　Ｒ，Ｄ、。

Ｚａｂｉｎｓｋｉ　Ｍ、　Ｐ、、　５ｏｎｄｅｒ　Ｓ、　Ａ、、　Ｂｅｒｌｉｎ ｅｒ　Ｌ、　Ｊ、、　ａｎｄ　ＦｉｎｌａｙｓｏｎＪ、　Ｓ、　：ヒトトロンビ ン：調製的評価、構造的特性および酵素的特異性、Ｄ、　Ｈ，Ｂｉｎｄ編、「ヒ ト血漿の化学と生理学Ｊ　、　ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ中、ｐｐ、１５１−１８２．１９７９）。

ヒルジンは、トロンビンとトロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ ）との間の相互作用をも阻害し、それは触媒部位とは異なるトロンビン上の共通 の部位に結合する（）Ｉｏｌｆｓｔｅｅｎｇｅ　Ｊ、、　Ｔａｇｕｅｃｈｉ　Ｈ 。

ａｎｄ　５ｔｏｎｅ　Ｓ、　Ｒ，：　トロンビンと基質および阻害剤との相互作 用の動態学に対するトロンボモジュリンの効果、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２ ３７゜２４３−２５１．１９８６）。

ヒルジンは、したがって、■因子および■因子を不活性化し得るセリンプロテア ーゼで、かつトロンビン自体の生成に必要であるプロティンＣが、トロンビンを 活性化する能力を減少させる。

ヒルジンは、ヘパリン−アンチトロンビン■複合体による阻害から保護されてい るクロット（血餅）結合トロンビンを阻害することもできる（Ｗｅｉｔｚ　ｎ、 、　Ｈｕｄｏｂａ　Ｍ、、　Ｍａｓｓｅｌ　Ｄｌ、　Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ　Ｊ 、　ａｎｄＨｉｒｓｈ　Ｊ、　：　クロット結合トロンビンはヘパリン−アンチ トロンビンｔｎによる阻害から保護されているがアンチトロンビン■非依存性阻 害剤による不活性化を受け得る、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８６　 ：３８５−３９１．１９９０）。

動物における実験研究では、ヒルジンは、静脈および動脈の血栓症＋　Ｍａｒｋ ｗａｒｄｔ、　Ｆ、　：抗血栓症剤としてのヒルジンの開発。

Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ ｉｓ、　１５（３）　：　２６９−２８２゜１９８９　；　）Ｉｅｒａｓ　Ｍ、 、　Ｃｈｅｓｅｂｒｏ　Ｊ、　Ｈ，、Ｗｅｂｓｔｅｒ　Ｍ、、　Ｍｒｕｋ　Ｊ、 　Ｓ、。

Ｇｒｉｌｌ　Ｄ、　Ｅ、、　Ｐｅｎｎｙ　Ｌ　Ｊ、、　Ｂｏｗｉｅｄ　Ｅ、　Ｊ 、　ＶＪ、、　Ｂａｄｉｍｏｎ　Ｌ、　ａｎｄＦｕｓｔｅｒ　Ｖ、：ブタの動脈 損傷におけるヒルジン、ヘパリンおよびブラセボ、血小板媒介血栓症におけるト ロンビンのインビボでの役割、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８２　：　１４７６− １４８４．１９９０）　、血管シャント閉塞（にｅＬｌｙ　Ａ、　Ｒ，、Ｍａｒ ｚ、ｅｋ　Ｌｌ、　Ｍ、、にｒｕｐｓｋｉ　Ｌ、、　Ｂａ５ｓ　Ａ、、　Ｃａｄ ｒｏｙ　Ｙ、。

Ｈａｕｓｏｎ　Ｓ、　Ｒ，、ａｎｄ　）Ｉａｒｋｅｒ　Ｌ、　Ａ、　：ヒヒにお けるヘパリン抵抗性動脈血栓形成のヒルジンによる妨害、Ｂｌｏｏｄ、　７７（ ５）・１００６−１０１２゜１９９１１およびトロンビン誘発散在住血管内凝血 ｆｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉ ｏｎｌ（Ｍａｒｋｗａｒｄｔ　Ｆ、、Ｎｏｗａｋ　Ｈ，ａｎｄＨｎｆｆｍａｎｎ 　Ｊ、　：散在住血管内凝血ＤＩＣに対する薬物の影響、天然および合成トロン ビン阻害剤の効果、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　１１　：　２７５−２８３゜１ ９７７）を防ぐのに効果的であることが証明された。

抗血栓症剤としてのヒルジンの臨床応用は数年前に提案されたが、これは、天然 のヒルジンが容易に入手可能ではないために厳しく制限されてきた。今日では、 遺伝子工学の方法学とポリペプチド精製の方法が利用でき、充分な量のヒルジン を前臨床研究および臨床研究のために製造することが可能である。この事実は、 天然のトロンビン阻害剤への関心を新たにさせた。

ヒルＨｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓからの異なるヒルジンの精製および 特性付けは詳細に研究され、これらの化合物の一次構造が決定された〔丁ｒｉｐ ｉｅｒ　Ｄ、　：イソタンパク（ｉｓｏ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のファミリー、ヒ ルジンの単離および新しいヒルジンの配列決定、Ｆｏｌｉａ　Ｈｅｍａｔｏｌ。

（Ｌｅｉｐｚ）　１１５　：　３０−３５．１９８８］　、特に、ＨＶＩと名付 けられたヒルジンの形態はヒルの全体から抽出され（Ｂｏｓｋｏｖａ　１．　Ｐ 、。

Ｃｈｅｒｋｅｓｏｖａ　Ｄ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ｍｏｓｏｌｏｗ　Ｖ、　Ｖ、　： 　ヒル頭部およびヒル全体からのヒルジンならびにヒル体部からの偽ヒルジン、 Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ。

３０　：　４５９−４６７、１９８３　；　Ｄｏｄｔ　Ｊ、　Ｐ、、　Ｍｕｌｌ ｅｒ　Ｈ，Ｐ、、　Ｓｅｅ＋＋＋ｕｌｌｅｒ　Ｖ。

ａｎｄ　Ｃｈａｎｇ　Ｊ、　Ｙ、　：　トロンビン特異的阻害剤ヒルジンの完全 アミノ酸配列、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１６５　：　１１１０−１８３．１９８ ４）　、一方、頭部からは少し異なるアミノ酸配列を有する別の形態のものが抽 出され、ＨＶ２と名付けられた（Ｈａｒｖｅｙ　Ｒ，Ｐ、、　Ｄｅｇｒｙｓｅ　 Ｅ、、　５ｔｅｆａｎｉ　Ｌ、。

Ｓｃｈａｍｂｅｒ　Ｆ、、　Ｃａｚｅｎａｖｅ　Ｊ、　Ｐ、、　Ｃｏｕｒｔｎｅ ｙ　Ｍ、、　Ｉａｌｓｔｏｓｈｅｖ　Ｐ、　ａｎｄＬｅｃｏｃｑ　Ｊ、　Ｐ、　 ：吸血ヒルＨｉｒｕｄｏ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓからの抗凝血剤ヒルジンをコ ードするｃＤＮＡのクローニングおよび発現、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３　：　１０８４−１０８８． １９８６）。ＨＶ３と名付けられた第３の変異体が記載された［Ｈａｒｖｅｙ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６）　１０８４−１０８８］　。

ＨＶｌ、ＨＶ２およびＨＶ３のアミノ酸配列は、配列番号（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ 、）　１．２および３である。ＨＶＩおよびＨＶ２は６５アミノ酸の単一ポリペ プチド鎖からなり、そのＮＨ，末端の無極コアおよび強酸性Ｃ末端テールはトロ ンビンの無極結合部位および陰イオン結合性部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）に結合し、 それ故トロンビンを基質（フィブリノーゲン）との相互作用から防ぐ（Ｒｙｄｅ ｌ　Ｔ、　Ｊ、。

Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ　Ｋ、　Ｇ、、　Ｔｕｌｉｎｓｋｙ　Ａ、、　Ｂｏｄ ｅ　ＶＪ、、　Ｈｕｂｅｒ　Ｒ，、ＲｏｉｔｓｃｈＣ，ａｎｄ　Ｆｅｎｔｏｎ　 Ｕ　Ｊ、　Ｗ、　：組換えヒルジンとヒトα−トロンビンの複合体の構造、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４９　：　２７７−２８０．１９９０）。さらに、位置６３に硫 酸化チロシンが存在する。この翻訳後修飾は、抗トロンビン活性に必須であるよ うには見えない（Ｓｔｏｎｅ　Ｓ、　Ｒ，ａｎｄＨｏｆｓｔｅｅｎｇｅ　Ｊ、・ ヒルジンによるトロンビンの阻害の動態学、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２５　：　４６ ２２−４６２８．１９８６１゜ＨＶ　３は位置１から３２までＨＶ　２と同一で あり、次いで、以下の点においてＨＶＩと異なる二位置３３でＡｓｐの代わりに Ｇｌｕ、位１３５でＧｌｕの代わりにＬｙｓ、位置３６でＬｙｓの代わりにＡｓ ｐ、位置５３でＡｓｐの代わりにＧｉｎ、位置５８でＧ１１］の代わりにＰｒｏ 、位置６２でＧｌｕの代わりにＡｓｐ、位置６３でＴｙｒ　（ＳＯｓ　Ｈ）の代 わりにＡｌａ、位置６４でＬｅｕの代わりにＡｓｐ、そして位置６５でＧｉｎの 代わりにＧｌｕ。

ヒルジンのＮ末端ドメイン（残基１〜３９）は、コンホメーション全体を安定化 する３つのジスルフィド結合によって特徴付けられる（Ｃｈａｎｇ　Ｊ、　Ｙ、 　：　ヒルジンアミノ末端コアフラグメントの産生、特性およびトロンビン阻害 機序、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６５　（３６）　：２２１５９−２ ２１６６、１９９０）。

最近、ヒルジンはヒルの他の種においても検出されてきた。特に、ヒルジンＨＶ Ｉと同様の抗トロンビン特性があり、配列番号４および５に示すアミノ酸配列を 有する２つのポリペプチド（本明細書中において、以下Ｐ１およびＰ２と呼ぶ） がヒルＨｉｒｕｄｉｎａｒｉａｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓから単離され、特性化さ れ、遺伝子工学によって製造された（ヨーロッパ特許出願筒９２３０１７２１． ４号）、ＰｌはヒルジンＨＶＩと６０％の相同性を示し、硫酸化されたアミノ酸 を有さない。

天然供給源または組換え生物物質からのヒルジンの単離および精製は、一般的に は、イオン交換クロマトグラフィーと、それに続く逆相カラムおよびイオン交換 カラム上での高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を通した一連の分離によ って実施される（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　Ｍ、、　Ｌｏｉｓｏｎ　Ｇ、、　Ｌｅｍｏ ｉｎｅ　Ｙ、、　Ｒｉｅｈｌ−Ｂｅｌｌｏｎ　Ｎ、。

Ｄｅｇｒｙｓｅ　Ｅ、、　Ｂｒｏｗｎ　Ｓ、　Ｌ、　Ｃａｚｅｎａｖｅ　Ｊ、　 Ｐ、、　Ｄｅｆｒｅｙｎ　Ｇ、。

Ｄｅｌｅｂａｓｓｅｅ　Ｄ、、　Ｂｅｒｎａｔ　Ａ、、　Ｍａｆｆｒａｎｄ　Ｊ 、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｒｏｉｔｓｃｈｌ、　：Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏ ｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　１５　（３）　：　：）８ ｇ−２９２゜１９８９）。

ヒルジンをコードする天然および合成遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ並晶（ 大腸菌）および酵母において発現された（）Ｉａｒｖｅｙ　Ｒ，Ｐ、。

Ｄｅｇｒｙｓｅ　Ｅ、、　５ｔｅｆａｎｉ　Ｌ、、　Ｓｃｈａｍｂｅｒ　Ｆ、、 　Ｃａｚｅｎａｖｅ　Ｊ、　Ｐ、。

Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　Ｍ、、　Ｉａｌｓｔｏｓｈｅｖ　Ｐ、　ａｎｄ　Ｌｅｃｏｃ ｑ　Ｊ、　Ｐ、　：吸血ヒルＨｉｒｕｄ。

ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓからの抗凝血剤ヒルジンをコードするｃＤＮＡのクロー ニングおよび発現、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８３　：１０８４−１０８８．１９８６　；　Ｂｅｒｇｍａｎｎ　Ｃ，、Ｄｏｄ ｔ、、にｏｈｌｅｒ　Ｓ、、　Ｆｉｎｋ　Ｅ、　ａｎｄＣｊａｓｓｅｎ　Ｈ，Ｊ 、　：ヒルＨｉｒｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓからのトロンビン特異的阻害剤 ヒルジンをコードする遺伝子の化学合成および発現、Ｂｉｏｌ、−Ｃｈｅｌｌ、 　）！ｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ、　３６７　：　７３１−７４０．１９８６　； 　Ｆｏｒｔｋａｍｐ　Ｅ、。

Ｒｉｅｇｅｒ　Ｍ、、　Ｈｅｉｓｔｅｒｂｅｒｇ−Ｍｏｕｔｓｅｓ　Ｇ、、　Ｓ ｃｈｗｅｉｚｅｒ　Ｓ、　ａｎｄ　ＳｏｎｎｍｅｒＲｌ：　ヒルの血液凝固阻害 剤ヒルジンの合成りＮＡのクローニング結果として生じる硫酸化されていないタ ンパク質は、天然のタンパク質と非常に類似の生化学的および生物学的特性を示 す（ＴａｌｂｏｔＭ　：組換えヒルジンの生物学（ＣＧＰ３９３９３）：血栓症 治療の新しい展望、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏａ＋ｂｏｓｉｓ　ａｎｄ 　Ｈａｅ＋＋＋ｏｓｔａｓｉｓ。

１５　（３）　：　２９３−３０１．１９８９　；　Ｃｏｕｒｎｅｙ　Ｍ、、　 Ｌｏｉｓｏｎ　Ｇ、、　Ｌｅｍｏｉｎｅ　Ｙ、。

Ｒｉｅｈｌ−Ｂｅｌｌｏｎ　Ｎ、、　Ｄｅｇｒｙｓｅ　Ｅ、、　Ｂｒｏｗｎ　Ｓ 、　＋！、、　Ｃａｚｅｎａｖｅ　Ｊ、　Ｐ、。

Ｄｅｆｒｅｙｎ　Ｇ、、　Ｄｅｌｅｂａｓｓｅｅ　Ｄ、、　Ｂｅｒｎａｔ　Ａ、 、　Ｍａｆｆｒａｎｄ　Ｊ、　Ｐ、　ａｎｄＲｏｉｔｓｃｈｌ、：　Ｓｅｍ１ｎ ａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ。

１５　（３）　＋　２８８−２９２．１９８９　］。

組換えタンパクを用いて、より広範な前臨床研究および臨床研究を実施すること が可能であり、そのタンパク質の低い毒性および免疫原性が示された。

ヒルジンのインビボ抗凝血効率は、主に血液中での適正レベルの維持および調節 に依存する。そのため、その薬物動態学の知識は、ヒトにおける抗血栓症剤とし てのその利用のための必須の前提条件である。予備的研究の過程において、Ｍａ ｒｋｗａｒｄｔらは、凝血試験で評価した抗トロンビン活性のみに基づいて（Ｍ ａｒｋｗａｒｄｔ　Ｆ、、　ＮｏｗａｋＧ、、　５ｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ　Ｊ 、、　Ｇｒｉｅｓｓｂａｃｈ　Ｖ、、　Ｗａｌｓｍａｎｎ　Ｐ、　ａｎｄ　Ｖｏ ｇｅｌ　Ｇ。

・ヒトにおけるヒルジンの薬物動態学および抗凝血効果、Ｔｈｒｏ＠。

Ｈｅｍｏｓｔ、　５２　：　１６０−１６３．１９８４）、またはトロンビン特 異的色原性基質を用いて（Ｇｒｉｅｓｓｂａｃｈ　Ｖ、、　５ｔｕｒｚｅｂｅｃ ｈｅｒ　Ｊ、　ａｎｄ　ＭａｒｋｗａｒｄｔＦ、：色原性トロンビン基質を用い る血漿中のヒルジンのアッセイ、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　３７　：　３４７ −３５０．１９８５）、生物学的試料中のヒルジンを測定することができた。

ヒルジンの免疫原性は非常に低いので、実験動物において沈降抗体を産生させる ことは極めて困難である（Ｂｉｃｈｅｒ　Ｊ、、　ＧｅｒｍｍｅｒｌｉＲ，ａｎ ｄ　Ｆｒ１ｔｚ　Ｈ，：ヒトにおける反復静脈注射の後のヒルジンに対する感作 の可能性を明らかにするための研究、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　６１　：３９ −５１．１９９１）。

種々の試みの後、５ｐｉｎｎｅｒら［５ｐｉｎｎｅｒ　Ｓ、、　５ｔｏｆｆｌｅ ｒ　Ｇ、　ａｎｄＦｉｎｋ　Ｅ、　：　ヒルジンの定量的酵素免疫アッセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）、ＪＩｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８７　：　７９−８３． １９８６　）は、天然のヒルジンを用いて、免疫した１１匹のヤギのうちの２匹 において抗体を得ることができた。これらの抗体は、天然および組換えヒルジン の測定のためのＥＬＩ　ＳＡ法の開発を可能にした。

最近、組換えヒルジン（ＨＶＩ変種）に対する、およびＨＶＩのＣ末端配列を示 す合成ペプチドに対するモノクローナル抗体が得られた（Ｓｃｈｌａｅｐｐｉ　 Ｊ、　Ｍ、、　Ｖｅｋｅｍａｎｓ　Ｊ、、　Ｒｉｎｋ　Ｈ，ａｎｄ　Ｃｈａｎｇ 　Ｊ。

Ｙ、：　ヒルジンおよびヒルジンペプチドに対するモノクローナル抗体の調製、 Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１８８　：　４６３−４７０．１９９０ 　；　Ｍａｏ　Ｓ、　Ｊ。

Ｔ、、　Ｙａｔｅｓ　Ｍ、　Ｔ、、　Ｏｗｅｎ　Ｔ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｋｒ５ｔ ｅｎａｎｓｋｙ　Ｊ、　Ｌ、　：ヒルジンの合成Ｃ末端に対する抗体の調製およ び抗原性部位の同定、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２０　：　４５−５０．１９８９）。こ れらの抗体は、トロンビンとの相互作用に関与するヒルジンの領域を同定するた めに特に用いられた。しかしながら、天然または組換えヒルジンに対するそれら の、低い、または欠如した反応性は、薬物動態学研究におけるそれらの用途を制 限し得る。

ヒルジンの異なる形態の免疫精製および特性付けは、特異的抗体が充分な量で利 用可能でないために、実施されたことがなかった。

ヒルジンおよびヒルジン様タンパクの同定、精製および定量的測定のための免疫 学的方法の開発は、これらの化合物の極めて低い免疫原性によって今まで妨げら れてきた。

したがって、本発明は、実験動物においてヒルジンまたはヒルジン様タンパクに 対する抗体を確かに生成させることができる効果的な免疫原を提供することを目 的とする。本発明は、さらに、ヒルジンまたはヒルジン様タンパクに特異的な抗 体を製造する再現性のある方法を提供することを目的とする。

したがって、本発明は、免疫原を製造する方法であって、ヒルジンおよび／また はヒルジン様タンパクを重合させることを特徴とする方法を提供する。本発明は また、重合したヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを含む免疫原をも提 供する。本発明は、さらに、ヒルジンまたはヒルジン様タンパクに結合すること ができる抗体を製造する方法であって、そのような免疫原に対する抗体を生成さ せることを特徴とする方法を提供する。

本明細書中において用いられる用語「ヒルジン」は、ＨＶＩ、ＨＶ２、ＨＶ３、 ＰｌまたはＰ２のような天然ヒルジンイソフオームの配列を有するいかなるタン パクをも含む。用語「ヒルジン様タンパク」は、例えばアミノ酸の置換、欠失、 挿入、伸長、官能化または化学修飾による、抗トロンビン活性を有するヒルジン のいかなる誘導体をも含む。用語「ヒルジン様タンパク」は、１つを越えるヒル ジンのハイブリッドをも含み、それは遺伝子工学によって製造されてもよい。例 えば、ＷＯ−Ａ−９１／ｌ　７２５０には、ＨＶＩの最初の４６残基とそれに続 ＜ＨＶ２のアミノ酸４７〜６５から構成されるヒルジン様タンパクが記載されて いる。

ヒルジン様タンパクは、アミノ酸の置換、欠失、挿入、伸長、官能化または化学 修飾によるＨＶＩ、ＨＶ２、ＨＶ３、ＰｌまたはＰ２の誘導体であって、抗トロ ンビン活性を有するものであってよい。置換、欠失、挿入または伸長は、１つ以 上のアミノ酸を含んでイテモヨイ。典型的には、ＨＶＩ、ＨＶ２、ＨＶ３、Ｐｌ またはＰ２のアミノ酸配列と、その誘導体のアミノ酸配列との間には、６０％以 上の程度の相同性がある。相同性の程度は、７５％以上、８５％以上、または９ ５％以上であってよい。

元来の配列の物理化学的特徴、すなわち電荷の密度、疎水性／親水性、サイズお よび形状（コンフィギユレーション）に関しては、保存され得る。１文字コード に基づ（と、可能性のある置換は（Ｅｕｒ、、１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３８： 　９−３７．　１９８４）　：ＧのかわりにＡ、およびその逆； Ａ、ＬまたはＧによるＡ； Ｒによるに： ＴによるＳ、およびその逆； ＤのかわりにＥ、およびその逆；そしてＮによるＱ、およびその逆 である。

伸長に関する限り、５０アミノ酸残基までの短い配列が、各末端に、またはその どちらかに与えられていてもよい。配列は３ｏまで、例えば２０までまたは１０ までのアミノ酸残基を有していてもよい。

ヒルジンまたはヒルジン様タンパクは、グリコジル化、硫酸化（ｓｕｌｐｈａｔ ｉｏｎ）　、　ＣＯＯＨ−アミド化またはアシル化のような１つ以下の化学修飾 （例えば翻訳後修飾によるもの）を受けていてもよい。例えば、位置６３のＴｙ ｒ残基は硫酸化されていてもよい。

組換えヒルジンまたはヒルジン様ポリペプチドは、通常この位置においては硫酸 化されていないであろう。さらに、本発明は、ＨＶＩ、ＨＶ２、ＨＶ　３、Ｐｌ またはＰ　２（７）Ｎ末端またはＣ末端部分を有さない低分子量誘導体に適用し てもよい。

本発明の免疫原は、ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクのポリマーであ る。したがって、免疫原は、ヒルジンのホモポリマー、ヒルジン様タンパクのホ モポリマー、またはヒルジンとヒルジン様タンパクのコポリマーであってよい。

免疫原は、ｌを越えるヒルジンイソフオームまたはｌを越えるヒルジン様タンパ クのコポリマーであってもよい。

ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクは、ゲルタールアルデヒドまたはカ ルボジイミドで好適に重合させられる０モル過剰のゲルタールアルデヒドまたは カルボジイミドが好適に用いられる。

１．１〜５倍モル過剰を用いることができる。

重合化反応は、水性溶媒の存在下で実施する。好適な溶媒としては、リン酸緩衝 生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。反応の時間は、好適には５時間〜３０時間 であり、好ましくは１５時間〜２０時間である。反応の温度は、好適には１５℃ 〜３５℃であり、例えば周囲温度〜３０℃である。簡便性の観点から、周囲温度 が好ましい。

ヒルジンおよび／またはヒルジン様出発物質を得る方法は公知である。これらの 方法としては、ヒルからのヒルジンの抽出、および遺伝子工学による組換えヒル ジンおよびヒルジン様タンパクの製造が挙げられる。ヒルジンおよびヒルジン様 タンパク、特にＨＶＩ、ＨＶ　２、ＨＶ３およびその誘導体は、ＷＯ−Ａ−９１ ／１７２５０に従って得てもよい。ＷＯ−Ａ−９１／１７２５０の方法は、ヒル ジンまたはヒルジン様ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の化学合成、 および組換え生物における該ポリペプチドの発現に基づいている。ＰｌおよびＰ ２は、ＷＯ−Ａ−９０１０５１４３に従って調製物を得、その調製物を高圧液体 クロマトグラフィーにかけることにより、ヒルＨｉｒｕｄｏ　ｍａｎｉｌｌｅｎ ｓｉｓの組織から単離してもよい（ヨーロッパ特許出願第９２３０１７２１．４ 号）。

本発明は、ヒルジンまたはヒルジン様タンパクに結合することができる抗体の製 造方法であって、本発明の免疫原に対する抗体を生成さゼることを特徴とする方 法を提供する。製造される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであっ てよい。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を製造する方法はよく知られてい る。ポリクローナル抗体を製造する方法は、好適な宿主動物、例えば実験動物を 本発明の免疫原で免疫し、その血清から免疫グロブリンを単離することを含む。

したがって、動物に免疫原を接挿し、続いてその動物から血液を採ってＩｇＧ画 分を精製してもよい。モノク［］−ナル抗体を製造する方法は、望ましい抗体を 産生する細胞を不死化することを含む。ハイブリドーマ細胞を、接種を受けた実 験動物の稗臓細胞と腫瘍細胞を融合させることによって製造してもよい（にｏｈ ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７ ゜１９７５１゜ 望ましい抗体を産生ずる不死化した細胞は、従来の手順で選択してもよい。ハイ ブリドーマは、培養において生育させてもよく、あるいは、腹水を形成させるた めに腹腔中に、または同種（アロジェニック）宿主もしくは免疫相容性（ｉｎｕ ＋＋ｕｎｏｃｏｍｐｒｏｎ＋１ｓｅｄ）宿主の血流中に、注射してもよい。ヒト 抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫とそれに続くエプスタイン−バーウィル スによる該リンパ球の形質転換によ−）で製造し得る。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の製造のためには、実験動 物は好適にはヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスである。望ましい場合には、本 発明の免疫原は、例えばアミノ酸残基のうちのひとつの側鎖を介して、好適な担 体にカップリングさせたコンジュゲートとして投与してもよい。担体分子は、典 型的には生理学的に許容可能な担体である。得られる抗体は単離してもよく、望 ましい場合には精製してもよい。

本発明は、ヒルジンまたはヒルジン様タンパクの定量的測定、精製または同定の 方法であって、本発明の免疫原に対する抗体を生成させ、それにより得られた抗 体を該定量的測定、精製または同定の方法において用いることを特徴とする方法 を含む。

抗体を用いる試料中の抗原の定置的測定のための従来の方法を用いてもよい。例 えば、本発明に従って製造した抗体を、非競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッ セイ）のようなＥＬＩＳＡ法において用いてもよい。

典型的には、ＥＬＩＳＡ法は以下の工程を含む：（１）本発明に従って製造した 非標識抗体を固体支持体上に固定し、 （ｉｉ　）測定すべきヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを含有する試 料を、該ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクが該非標識抗体によって捕 獲されるように添加し、（ｉ）本発明に従って製造した標識抗体を添加し、そし て（１ｖ）結合した標識抗体の量を測定する。

好適な抗体の標識の例としては、ビオチン（ペルオキシダーゼに結合させたアビ ジンによって検出され得る）およびアルカリホスファターゼが挙げられる。ヒル ジンおよび／またはヒルジン様タンパクを含有する試料は、生物学的液体（例え ばヒル抽出物）、形質転換した、またはしない細胞の培養からの組織培養培地、 または組換えＤＮＡ手順により製造した試料であってよい。

抗体を用いる抗原の精製の従来法を用いてもよい。このような方法としては、免 疫沈降およびイムノアフィニティ力うム法が挙げられる。イムノアフィニティカ ラム法においては、本発明に従って製造した抗体を、カラムの不活性マトリック スにカップリングさゼ、精製すべきヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパク を含有する試料を、該ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクが保持される ようにカラムに通す。次いで、ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを溶 出する。

ヒルジンまたはヒルジン様タンパクを含有する試料は、生物学的液体（例えばヒ ル抽出物）、形質転換した、またはしない細胞の培養からの組織培養培地、また は組換えＤＮＡ手順により製造した試料であってよい。

抗体を用いて抗原を同定する従来の方法を用いてもよい。例えば、ウェスタン・ プロッティング法を用いてもよい。このような方法は以下の工程を含むことがで きる： （１）ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを含有する試料をゲル電気泳 動にかけ、 （１１）ゲル中の分離したタンパク質を、プロッティングによって同体支持体（ 例えば、ニトロセルロース支持体）上に移し、 （―）本発明に従って製造し、標識した抗体を、該ヒルジンおよび／またはヒル ジン様タンパクに結合させる。

ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを含有する試料は、生物学的液体（ 例ぶばヒル抽出物）、形質転換した、またはしない細胞の培養からの組織培養培 地、または組換えＤＮＡ手順により製造した試料であってよい。

以下の例は、本発明を説明するものであるが、いかなる方法でもそれを制限する ものではない。添付した図面において：図１は、ＨＶＩとゲルタールアルデヒド の反応後に得られたヒルジンＨＶ　１ポリマーのドデシル硫酸すトリウムポリア クリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを示す。レーンＡにはヒルジン （２０ｕｇ）をロードし、レーンＢにはＨＶ１ポリマー（２０μｇ）をロードし た。ゲルの左側の数字は分子量（ｋＤ）である。

図２は、オフタロニー法による免疫拡散アガロースゲルを示す。

ウェルＡは１；１６希釈した免疫血清を含有し、ウェルＢは緩衝液を含有し、そ してウェルＣ，ＤおよびＥはそれぞれ２．５．５および１０μｇのヒルジンを含 有した。ゲルは、接種を受けたウサギから得た血液中の沈降抗体の存在を明らか にしている。

図３は、緩衝液（−ロー）、血！！（−◆−）および尿（−一一）中のヒルジン の濃度（ｎｇ／ｍｌ）　（Ｙ軸）に対するＨＶＩヒルジンの４９０ｎｍでの吸光 度（Ｘ１００Ｏ）（Ｘ軸）に関する標準曲線を示す。曲線上の各点は、４９０止 での吸光度の５回の測定の平均を表し、バーは標準偏差を表す。

図４は、例２で得られた抗ヒルジン抗体の、天然ＨＶＩ（−ロー）および組換え ＨＶ２　（−−−○−−−）に対する、しかしＰｌ（−一一一一一一）に対して はない特異性を表す。Ｘ軸はヒルジンの濃度（ｎｇ／＋ｌ）であり、Ｙ軸は４９ ０止での吸光度である。

凱１ ２、　、−′の　爪 組換えＤＮＡ技術によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ％Ｉｊ、において得られたＨＶ Ｉヒルジンを、１，２５％ゲルタールアルデヒドを含有するｐ）１７．３のＰＢ Ｓ中に、６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし、室温で１８時間インキュベートした。０ ．９％ＮａＣｌ２に対して透析した後、ヒルジンポリマーの形成を、１５％ポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により検査した。

図１は、反応後に形成されたポリマーを示す。ヒルジンに相当するバンド（Ａ） は見久なくなるが、一方、始めのヒルジンの分子量の複数倍に相当する分子量を 有する７つの化合物（Ｂ）が現れる。

同様の手順を用いて、他の形態のヒルジン、例えばＨＶ２およびＰＩの免疫原性 ポリマーを製造することが可能である。

耐ス の舌゛および ５匹のニュージ−ラントポワイド（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｗｈｉｔｅ）の雄 ウサギに、２ｍｌのフロイントの完全アジュバント中に再懸濁させたＨＶＩヒル ジンポリマー２５０μｇを皮下接種した。フロイントの不完全アジュバントを用 いた追加注射（ブースター）を、４，６．８および１０週後に与えた。第１２週 に、各動物から３０ｍ１の血液を採取し、オフタロニーによるアガロースゲル中 での二重拡散技術により沈降抗体の存在を測定した（Ｏｕｔｃｈｅｒｌｏｎｙ　 ｏ、　：免疫学的分析のだめのゲル中での拡散法、Ｐｒｏｇｒ、　Ａｌｌｅｒｇ ｙ、　５．１．１９５８）、図２に示すように、０．１５ＭＰＢＳ中の１％アガ ロースゲルから、５つのウェルが得られた。

ＰＢＳ中、１：１６希釈した免疫血清３５μｌをウェルＡにロードし、一方、ウ ェルＢ、Ｃ，Ｄ、Ｅには、緩衝液、２．５．５および１０μｇのＨＶＩヒルジン をそれぞれロードした。

湿潤容器内で、室温で４８時間インキュベートした後、通常の生理食塩水および 蒸留水で２４時間ゲルを洗浄し、４０℃で乾燥して、５０％トリクロロ酢酸中の ０．２％クマシーブルーで染色した。

図２は、中央のウェルＡと、ヒルジンが置かれたウェルＣ，Ｄ、Ｅとの間にはっ きりした沈降バンドを示す。

免疫していないウサギ血清なウェルＡに置いた平行実験では、沈降バンドは観察 されなかったが、この実験では、免疫した５匹のウサギのうちの４匹が沈降抗体 の存在を示した。

ＩｇＧ画分を、プロティンＡ−セファロースクロマトグラフィーにより調製した 。ｐＨ７，４のＰＢＳ中、１：２希釈した血清を、ＰＢＳ、ｐＨ７，４で平衡化 したプロティンＡ−セファロースカラムにかけた。続いて、ＩｇＧを０．１Ｍク エン酸緩衝液、ｐｉ（３で溶出した。同様の手順を用いて、他の形態のヒルジン 、例えばＨＶ２およびＰｌに対するポリクローナル抗体を製造することが可能で ある。

阿１ ＥＬＩＳＡ去を　いる　、の　１ 例２で単離した抗ＨＶＩＩｇＧの一部を、Ｇｕｅｓｄｏｎらの方法に従ってビオ チニル化した（Ｇｕｅｓｄｏｎ　Ｊ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、：酵素免疫技術にお けるアビジン−ビオチン相互作用の利用、Ｊ、　ＨＬｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　２７：　１１３１−１１３９．１９７５）　。

ＥＬＩＳＡ試験には、以下の概略を用いた。ウサギ抗ＨＶＩポリクローナルＩｇ Ｇを、固相に固定化して試料中に含まれる抗原（ＨＶＩ）を捕獲させ、次いでそ れにビオチニル化したウサギの抗ＨＶＩポリクローナルＩｇＧを付着させた。検 出は、ペルオキシダーゼに結合させたアビジンを用いて実施した。より正確には ＝０．１Ｍ　Ｎａ−ＣＱｓ　、ｐＨ９，６中、１０ｕｌ／ｍｌのポリクローナル ＩｇＧ　１５０μｌをマイクロプレートのウェルに入れ、４℃で１６時間インキ ュベートした。ＩｇＧの濃度は、ＥＬＩＳＡを最適化し、高感度および低バツク グラウンドを得るように選択した。

プレートを洗浄し、残りの結合部位を、３％ウシアルブミンを含有するＰＢＳ、 ｐＨ７，４を用いて１時間インキュベートすることによりブロッキングした。洗 浄後、プレートを、次第に増加する量の榎準ヒルジンを、または未知濃度で試料 を含有する血漿もしくは尿またはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７，４を用いて、３ ７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ｐ）１７．４で洗浄 した後、プレートを、５μｇ／ｍｌビオチニル化ＩｇＧを用いて３７℃で６０分 間インキュベートし、再び洗浄し、１５８　ｎｇ／ｍｌアビジン−ペルオキシダ ーゼを用いて３７℃で６０分間インキュベートした。

プレートを、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７，４で３回洗浄し、２回蒸留水 で１回洗浄した。ペルオキシダーゼを、室温で１５分間、Ｏ，１Ｍクエン酸緩衝 液、ｐＨ５中のＯ，１％０−フェニレンジアミン、０．０１５％Ｈ２０，と反応 させた０反応を、４．５ＭＨ，ＳＯ２を添加することにより停止し、マイクロプ レートリーダーにより４９Ｃ１ｎｍの吸光度を測定した。

用量依存性の直線的関係が、０　、６１　ｎｇ／＋ｍｌとＬｏｎｇ／■ｌの間で 得られ、検出限界は０　、３　ｎｇ／ｍｌであった（図３）、用量間の変動係数 は、７つの異なる用量に基づいて確立し、３．８９％と６．２８％の間にわたっ た。

例２で単離した抗ＨＶＩ抗体の特異性を、天然ＨＶＩヒルジン、組換えＨＶ２ヒ ルジンおよびＰｌに対して、ＥＬＩＳＡにより試験した（図４）。

これらの抗体は、天然ＨＶＩヒルジンおよびＨＶ２変種を認識するが、ＨＶＩヒ ルジンと６０％の相同性を示すＰｌを認識しない。

既に述べたように、ヒルジン類、特にＰｌを認識することができる抗体は、例２ に記載したのと同様の手順で得ることができ、例えば例３に記載したのと同様の ＥＬＩＳＡ法において、ヒルジン類、特にＰｌの測定のために用ることができる 。

配列表 （２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１に関する情報：（ｉ）　配列の 特徴： （Ａ）　長さ：６５アミノ酸 （Ｂ）　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉｌ　分子タイプ；ペプチド （ｘｉ）　配列の記載：配列番号１ Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｇｌｕ　Ｇ］、ｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ、　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　５■■ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕｉｎ （２）配列番号２に関する情報： （１）　配列の特徴： （Ａｌ　長さ：６５アミノ酸 ＣＢ１　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）　分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）　配列の記載：配列番号２ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｕｓ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　（：ｙｓ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＰｒB Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕｌｎ （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝６５アミノ酸 ｆＢｌ　タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）　分子タイプ：ペプチド （ｘｉ）　配列の記載：配列番号３ Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｐｌｕ （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：６４アミノ酸 ｆＢｌ　タイプ；アミノ酸 （Ｃ）　＃貴：単一 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｔ）　分子タイプ：ペプチド （ｖｉｌ　元の供給源： （Ａ）　生物：　Ｈｉｒｕｄｕｎａｒｉａ　ｎｍｎ１ｌｌｅｎｓｉｓ（ｘｉ）　 配列の記載：配列番号４ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　５ｅｒＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｔ ｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａ ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　ＧｌｙＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ａ ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　５ｅｒＧｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈ ｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｌｅ ｕ　Ａｓｎ（２）配列番号５に関する情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝６４アミノ酸 ＣＢ１　タイプ：アミノ酸 （Ｃ）　鎖：単一 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｆ）　分子タイプ：ペプチド （ｖｉ）　元の供給源： （Ａ）　生物：　）ｌｉｒｕｄＬｎａｒｉｓ　ＬｋＩｎｉｌｌｅｎｓｉｓ（ｘｉ ）　配列の記載：配列番号５ Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　 Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｌｎ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｌ　８３１０−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１５ （７２）発明者　ギョルゲッチ、カルライタリア国、２７０４９　ストラデーラ （パヴイア）、ヴイア・モンテマルチ一二、４Ｉ （７２）発明者　ランセン、ジャクニリンイタリア国、２００２８　サン・ヴイ ットーレ・オロナ（ミラノ）、ヴイア・ギ・ウンガレッチ、１７ （７２）発明者　ロンクッチ、ロメオ イタリア国、１２−２０１５９　ミラノ、ヴイア・ツァオン・ディ・レベル（番 地ない

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．免疫原の製造方法であって、ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを 重合させることを特徴とする方法。 ２．ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを、グルタールアルデヒドを用 いて重合させる、請求項１記載の方法。 ３．ヒルジンが、ＨＶ１（配列番号１）、ＨＶ２（配列番号２）、ＨＶ３（配列 番号３）、Ｐ１（配列番号４）またはＰ２（配列番号５）である、請求項１また は２記載の方法。 ４、ヒルジン様タンパクが、アミノ酸の置換、欠失、挿入、伸長、官能化または 化学修飾による、ＨＶ１（配列番号１）、ＨＶ２（配列番号２）、ＨＶ３（配列 番号３）、Ｐ１（配列番号４）またはＰ２（配列番号５）の誘導体であって、該 誘導体が抗トロンビン活性を有する、請求項１または２記載の方法。 ５．重合したヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを含む免疫原。 ６．ヒルジンが、ＨＶ１（配列番号１）、ＨＶ２（配列番号２）、ＨＶ３（配列 番号３）、Ｐ１（配列番号４）またはＰ２（配列番号５）である、請求項５記載 の免疫原。 ７．ヒルジン様タンパクが、アミノ酸の置換、欠失、挿入、伸長、官能化または 化学修飾による、ＨＶ１（配列番号１）、ＨＶ２（配列番号２）、ＨＶ３（配列 番号３）、Ｐ１（配列番号４）またはＰ２（配列番号５）の誘導体であって、該 誘導体が抗トロンビン活性を有する、請求項５記載の免疫原。 ８．ヒルジンおよび／またはヒルジン様タンパクを、グルタールアルデヒドを用 いて重合させて得られる、請求項５、６または７のいずれか１項記載の免疫原。 ９．ヒルジンまたはヒルジン様タンパクと結合し得る抗体の製造方法であって、 請求項５〜８のいずれか１項記載の免疫原に対する抗体を生成させることを特徴 とする方法。 １０．該抗体が、ポリクローナル抗体である請求項９記載の方法。 １１．該抗体が、モノクローナル抗体である請求項９記載の方法。 １２．ヒルジンまたはヒルジン様タンパクの定量的測定、精製または同定のため の方法であって、請求項５〜８のいずれか１項記載の免疫原に対する抗体を生成 させ、それにより得られた抗体を該定量的測定、精製または同定において用いる ことを特徴とする方法。