JPH06507433A - キサンタンを基礎材料とした多糖類ポリマーのアセチル化及びピルビル化の遺伝子制御 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キサンタンを基礎材料とした多糖類ポリマーのアセチル化及びピルビル化の遺伝 子制御 技術分野 本出願は、１９８９年７月２５日に出願した米国特許出願第０７／３８４．６２ １号の一部継続である（ここに、特に、引用により本明細書中に取り込まれる。

）。本出願は、１９８６年３月２６日に出願した米国特許出願第０６／８４４． ４３５号、の一部継続出願である１９８７年３月２３日に出願した米国特許出願 第０７１０２９．０９０号、の継続出願である１９９０年８月１３日に出願した 米国特許出願第０７１５６６、８７５号、の一部継続出願でもある（これらの全 てが、ここに、特に、引用により本明細書中に取り込まれる。）。

本発明は、多糖類のポリマーに関する。特に、それは、キサンタン・ガム（ｘａ ｎｔｈａｎ　ｇｕｍ）に構造的に類似するポリマーとして本明細書中で定義され 、そしてキサンタンの生合成経路の成分により製造された、キサンタンを基礎材 料とした多糖類のポリマーであって、その内側のマンノースがアセチル化され又 は未修飾であるように独立して制御されることを可能にしながら、その外側のマ ンノースが、特にアセチル化されることができるがピルビル化（ｐｙｒｕｖｙｌ ａｔｅｄ）されることができないように、ビルビル化されることができるがアセ チル化されることができないように修飾された、又は修飾されていないような、 キサンタンを基礎材料とした多糖類のポリマーを含むものに関する。

ｉｓ）の種の微生物により生産される。キサンタン・ガムは、その普通でない物 理的性質、すなわち、その極度に高い比粘度及びその疑似塑性により、広く使用 される製品である。それは、食品において、増粘剤として、２次又は３次の油回 収において、易動度制御及びｐｒｏｆｉｌｅ変更剤として、並びに石油掘削液中 で、一般的に使用される。

化学的には、キサンタン・ガムは、アニオンの複素多糖類である。

そのポリマーの反復単位は、５つの糖部分、特に２つのグルコース、１つのグル クロン酸及び２つのマンノース部分から成るペンタマーである。これらの糖は、 グルコース部分が、ポリマー鎖の骨格を形作り、そしてマンノース−グルクロン 酸−マンノース残基が一方のグルコース部分から一般的に延びているように配列 されている。

普通には、この基本構造は、例えば、ｊａｎｓｏｎ、　Ｐ、　Ｅ、　、　Ｋｅｎ ｎｅ、　Ｌ、　、　ａｎｄ　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、Ｂ、、ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄ ｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ、　４５：２７５−２８２（１９７５）　ａｎｄ　Ｍ ｅｔｔｏｎ、Ｌ、Ｄ、、Ｍｉｎｏｔ、Ｌ、、Ｒｅｅｓ、Ｄ、Ａ、、ａｎｄ　５ａ ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｇ、Ｒ，、ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ 、４６：２４５−２５７（１９７６にそれぞれが、特に、引用により本明細書中 に取り込まれる）により記載されるように、特にアセチル化及びピルビル化され ている。アセチル化及びピルビル化の程度は、変化することが知られている。キ サンタン・ガムの構造を、以下の式（Ｄに示す。

天然のキサンタン・ガムが広範に利用されるにも係わらず、その物理的性質が限 定的になるいくつかの状況が存在する。特に２次又は３次の油回収においては、 その油担持貯蔵槽の温度及びこの貯蔵槽ブラインの塩濃度がキサンタン溶液のた めに最適なものよりも高いことは、普通でないことではない。これらの条件が生 じたとき、キサンタンは、沈殿し、凝集し、そして／又はその粘度を失う。それ 故、油回収の間に遭遇する様々な条件、例えば、高い温度及び高い塩濃度で、よ く機能する新規の粘度付与製品が、必要とされるであろう。本発明は、天然のキ サンタン・ガムに比べて改良された性質をもつキサンタンを基礎材料とした多糖 類のファミリーを開示する。キサンタン・ガムの修飾は、以前にも記載されてい る。例えば、Ｂｒａｄｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ、（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｐ ｏｌｙｍｅｒｓ、　３：２３−３８（１９８３））は、脱アセチル化又は脱ピル ビル化された、化学修飾されたキサンタン・ガムの調製方法について記載してい る。キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓ ｔｒｉｓ）により生産されたキサンタン。

ガムを化学的に脱アセチル化する様々な手段も、米国特許番号第３゜０００、７ ９０号及び第３．０５４．６８９号の中に記載されている。今日まで、これらの 脱アセチル化工程のために使用される優れた方法は、正常にアセチル化されたキ サンタン・ガムからそのアセテート部分を化学的に除去することであった。キサ ンタン・ガムの脱アセチル化のための化学的工程が多数の不所望の副反応を生じ させることができ、そして、分子のコンフォメーションにおける不可逆変化及び 分子量低下を生じさせるグルコシドの骨格の加水分解を引き起こすことができる ことが、判明している。

水性媒質中の脱アセチル化キサンタンのレオロジーの性質のい（つかが知られて いる。例えば、Ｔａｋｏ　ａｎｄ　Ｎａｋａｍｕｒａ、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、　４８：２９８７−２９９３（１９８４）及び米国特許番号第３．０ ００．７９０号及び第３．０５４、６８９号を参照のこと。また、脱アセチル化 多糖類を使用した水溶液の粘度増加方法が、米国特許番号第３．０９６．２９３ 号の中に記載されている。従って、都合の悪い副反応引き起こさない非−アセチ ル化キサンタンを得るための方法がめられる。

キサンタン１ガム、Ｈｏｌｚｗａｒｔｈ　ａｎｄ　０ｇ１ｅｔｒｅｅ　ｉｎ　Ｃ ａｒｂｏ、ｒｅｓ、７６：２７７−２８０（１９７９）により記載されたように 、化学的に脱ピルビル化されることもできる。この脱ピルビル化の化学的方法も 、キサンタンの重合単位を変更し、そして／又はグルコシドの骨格の加水分解を 引き起こす。非ピルビル化キサンタン・ガムを生産するきキサントモナス・カン ペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の株が、米国特許番号第４゜２９６、 ２０３号に記載されているが、この非ピルビル化ガムは、化学的手段を使用して 、十分にアセチル化されているか又は脱アセチル化されたものであった。

さらに、キサンタン側鎖上の内側のマンノースのアセチル化の程度及び末端マン ノースのピルビル化の程度は、変化してもよい。本発明者は、全部がアセチル化 されたそして／又は全部がピルビル化されたキサンタンが、特定の油回収目的の ための改良されたレオロジーの性質をもつであろうということを信じている。

その上、本発明者は、ブロックを作っている正常なキサンタンのペンタマーを変 更することに基づく多糖類を同定した。これらのポリマーは、剪断速度、それら の塩度耐性能力及びそれらの粘度付与の性質に影響する温度へのそれらの応答性 に関して、正常なキサンタン・ガムを超える改良されたしオロジーの性質を示す 。これらの変更された多糖類は、以下に示すようなポリトリマー、及び非アセチ ル化ポリテトラマーを含む。

これらの多糖類は、１９８５年８月６日に出願された名称”Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈ ａｒｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｍａｄｅ　Ｂｙ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、”の 同時係属中の米国特許出願第７６２．８７８号（特に、引用により本明細書中に 取り込む）中に、Ｖａｎｄｅｒｓ　ｌ　ｉｃｅ他により記載されたアセチル化及 び非アセチル化ポリトリマーを含む。

本発明の目的は、天然のキサンタン・ガムよりも良好な水の増粘剤である多糖類 ポリマーのファミリーを提供することである。本発明の他の目的は、昇温にて、 そして／又は塩の存在中で、天然のキサンタン・ガムを超える改良されたレオロ ジーの性質をもつ多糖類のポリマーのファミリーであって、そしてこのメンバー が他の所望の性質を育しているものを提供することである。

本発明の目的は、外側のマンノースがアセチル化され、ピルビル化され又は未修 飾でありながら、内側のマンノースがアセチル化され又は未修飾であるような多 糖類のキサンタンのポリマーのファミリーを提供することである。

また、本発明の目的は、これらの製品並びにインビボにおいて多糖類のポリマー の上記ファミリーのメンバーを作る能力をもつ微生物を得るための、インビトロ における方法を提供することてもある。

本発明のさらなる目的は、上記の様々な多糖類のポリマーを作る能力をもつ微生 物を好気的に発酵することにより、多糖類の上記ファミリーのメンバーを調製す るための方法を提供することである。

また、本発明の目的は、微生物を好気的に発酵することにより、多糖類の上記フ ァミリーのメンバーを調製するための方法であって、これらの微生物に上記の様 々な多糖類のポリマーを作る能力を与える染色体の突然変異誘発を含むものを提 供することでもある。

本発明の追加の目的及び長所は、以降の説明の中に部分的に述べられるであろう し、そしてその説明から部分的に明らかになるであろうし、又は本発明の実施に より理解されることもできる。本目的及び利点は、添付した請求の範囲の中で特 に指摘された、道具の使用及び組合せにより理解及び達成されることができる。

発明の開示 上記の目的を達成するために、そして本発明の目的に従って、具体化された且つ 本明細書中に広範に記載されたものとして、約２：２：１の比のＤ−グルコース ：Ｄ−マンノース：叶グルクロン酸をもつ多糖類のポリマーを含んで成る組成物 であって、Ｄ−グルコース部分がベーター［１，４］コンフイギユレーシヨンで 結合され、内側のＤ−マンノース部分がアルファー［１，３］コンフイギユレー シヨンで、一般的に一方のグルコース部分に結合され、Ｄ−グルクロネート部分 がベーター［１゜２１コンフイギユレーシヨンで、上記のマンノース部分に結合 され、そして外側のマンノース部分が上記のＤ−グルクロネート部分に、ベータ ー［１，４）コンフィギユレーションで結合されているものが提供される。

上記の目的をさらに達成するために、そして本発明の目的に従って、上記の内側 のマンノース成分がその６−０位でアセチル化されているキサンタン・ガムを含 んで成る組成物が提供される。他の構造は、内側及び外側の両方のマンノース部 分がアセチル化されることをもくろまれている。４−６位でピルビル化された外 側のマンノース部分の部分及びアセチル化部分をもつさらなる構造が提供される 。

４−６位でビルビル化された外側のマンノース部分及び６−０位でアセチル化さ れた内側のマンノース部分をもつ他の構造が提供される。

２つの追加の構造が提供され、１つが、４−６位でピルビル化された外側のマン ノース部分をもち、他の１つが、アセチル化された外側のマンノース部分をもつ 。

上記の目的をさらに達成するために、そして本発明の目的に従って、具体化され た且つ本明細書中に広範に記載されたものとして、約２：２：１の比のＤ−グル コース：叶マンノース＝Ｄ−グルクロン酸をもつ多糖類のポリマーを含んで成る 組成物であって、Ｄ−グルコース部分がべ−９−［１，４］コンフイギユレーシ ヨンで結合され、内側のＤ−マンノース部分がアルファー［１，３１コンフイギ ユレーシヨンで、一般的に一方のグルコース部分に結合され、Ｄ−グルクロネー ト部分がベーター［１，２］コンフイギユレーシヨンで、上記のマンノース部分 に結合されているものが提供される。この多糖類のポリマーは、本明細書中で” ポリテトラマー”と命名される、なぜなら、それが、反復するテトラマ一単位ニ ゲルコース−グルコース−マンノース−グルクロン酸から構成されるからである 。先に記載されたようなポリテトラマー組成物であって、上記のマンノース部分 の少なくとも９０％、好ましくは９５％そして最も好ましくは１００％がその６ −０位でアセチル化されているもの、並びに非アセチル化されたポリテトラマー も提供される。

また、本発明は、本明細書中で、“十分にアセチル化されたキサンタン・ガム“ と称するキサンタン・ガム（上記の内側のマンノース部分の少なくとも９０％が アセチル化され、好ましくは９５％そして最も好ましくは１００％がアセチル化 されているもの）に関する。そしてまた、本発明は、上記末端のマンノース部分 の少なくとも９０％、好ましくは９５％そして最も好ましくは１００％がピルビ ル化された、本明細書中で、”十分にピルビル化されたキサンタン・ガム”と称 するキサンタン・ガムに関する。

本発明は、先に記載した多糖類のポリマーの製造方法もち（ろんでいる。本発明 の多糖類のポリマーは、一般的に、多糖類の製造を導く微生物の生合成経路の遺 伝子操作により作られることができる。

特に、キサンタン・ガムの製造のための微生物経路は、変更されたポリマーの単 位の製造のためのインビボ又はインビトロにおける系を創出するために操作され ることができる。従って、系は、様々な程度にアセチル化又はピルビル化された 多糖類を創出するために、突然変異誘発されたアセチラーゼ１１アセチラーゼ１ １及びケタラーゼ遺伝子の使用を通して創出されることができる。例えば、１０ ％、２０％、３０％、４０％、又は５０％がアセチル化されたキサンタン・ガム が合成されることができること、並びに１０％、２０％、３０％、４０％、５０ ％、６０％、７０％、又は８０％がピルビル化されたキサンタンが合成されるこ とができること、がもくろまれる。インビボにおいて本多糖類のポリマーを生産 する微生物及びこれらの多糖類のポリマーの使用方法も開示される。

また、本発明は、上記の突然変異された遺伝子が組み換えプラスミド内よりもむ しろその微生物の染色体内に取り込まれる場合の、変更されたポリマー単位の生 産のためのインビボにおける系についても記載する。このような染色体の欠損の 突然変異誘発が有利である。なぜなら、それは、プラスミドの維持を伴う潜在的 な問題を取り除くからであり、そしてまた、株の安定性に貢献するからである。

以上の概要説明及び以降の詳細な説明の両方が単に例示的及び説明的なものであ り、そして請求されたものとして、本発明を限定するものではないことが理解さ れよう。本明細書に取り込まれ、そしてその一部を構成する添付図は、本発明の 様々な態様を例示し、そして本説明と一緒になって、本発明の詳細な説明に役立 つものである。

図面の簡単な説明 図１ａは、キサンタンの生合成にために必要な１２の遺伝子のクラス旧制限マツ プに対し比較したこれらの１２の遺伝子の大体の位置も示している。

図１ｂは、遺伝子Ｆ及びＧの中及び付近の幾つかの制限部位並びに遺伝子Ｆ及び Ｇの接点でのＤＮＡ配列を示している。

図２は、ｇｕｍ遺伝子クラスターの遺伝子ｇｕｍ　Ｆ内の欠失突然変異（ｄｅｌ ｃｌａ）の構築を表している。

図３ａは、図中に示された大体の位置内でｐＲＫ２９０−８３３６のベクタ一部 分にトランスポゾンＴｎＫＩ２をインビボにおいて挿入することによりｐＲＫ２ ９０−Ｈ２Ｓｅから得られるプラスミドｐ１３ｄｅｌｃ１ａの構造、及びそ構造 としてｐ１３ｄｅｌｃｌａに類似するプラスミドＩＩＨ３３６ＫＢｍｌｄｅｌＣ １ａの構造を示す。このプラスミドは、遺伝子ｇｅｍ　Ｇ内のＢａｍ旧部位での 挿入突然変異（ＫＢｍｌ）を含む。そこの挿入されたＤＮＡフラグメントは、プ ラスミドｐＵｃ４−にのカナマイシン耐性遺伝子を担持するＢａｍ工Ｈ１制限フ ラグメントである。

図４は、キサンタン・ガムのポリテトラマー変異体の反復単位の化学構造、及び 模式図を表している。

含まず、そしてそれ故に遺伝子Ｂ及びＣを欠いているが遺伝子りから鯖までを含 んでいることを除いてｐＲＫ２９０−８３３６と同一なｐＲＫ２９０−ＨＡ３か ら得られたプラスミドｐＨＡ３ＫＢｍ２ｄｅ　Ｉｃ　ｌａの構造を示している。

ｐＨＤＮＡは、再び、カナマイシン耐性を与える遺伝子を担持するｐＵｃ４−に １０６中に存在する染色体欠失突然変異の程度を示し、ここで、遺伝子りからＭ までが欠失しており、一方Ｂ及びＣが無傷であり、そして染色体内で機能してい る。

図６は、野性型のキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉ　 ｓ）並びに遺伝子Ｆ、Ｇ、又はしの及び遺伝子Ｆ、Ｇ、又はし内の突然変異の可 能な全ての組合せの内で欠損がある突然変異体により生産された多糖類の反復単 位の模式図を表している。使用された略語は二Ｇ＝グルコース；Ｍ＝マンノース 、ＧＡ＝グルクロン酸；Ａｃ＝アセテート：Ｐｙｒ＝　ピルベートである。

失を示している。

図８は、例５の中で記載したような２段階の組み換え手順を示す。

図９は、野性型ガムと非ビルビル化ガムとの間の粘度の比較を表す。

図１０は、非アセチル化ガムと化学的に脱アセチル化したガムとの間の粘度の比 較を表す。

図１１は、組み換えプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６のクローン価ｇｕｍ遺伝 子りラスターＤＮＡ内の３つのＴｎＫ１２挿入突然変異の大体の物理的位置を表 している。この図は、ｐＲＫ２９０−Ｈ２Ｓｅ中のシュ制限エンドヌクレアーゼ 解裂部位の大体の位置も示している。

図１２は、キサンタン・ガム生合成の推定経路を表している。使用される略語は ：Ｇ１ｕ＝グルコース；ＧｌｕＡ＝グルクロン酸；Ｍａｎ＝マンノース；Ｇｌｕ −Ｇｌｕ＝セロビオース：Ｐ＝ニリン塩：ｐｐ＝ビロリン酸塩：Ｃ５５＝イブプ レノイド脂質担体：ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸塩：　ＡｃＣｏＡ＝アセ チルコエンザイムＡ；［−Ｖ＝グリコジルトランスフェラーゼ：ＵＤＰ＝ウリジ ン−５′−ジホスフェート：及びＧＤＰ＝グアノシン−５°−ジホスフェートで ある。

本発明を実施するための最適なやり方 以下の例と一緒に、本発明の詳細な説明するのに役立つ、本発明の現在好まれる 態様に対し、詳細に引用を行う。本明細書に言及された全ての引用は、ここに、 特に本明細書中に引用により取り込まれる。

本発明の多糖類ポリマーは、先に詳細に記載された。これらの多糖類ポリマーは 、細胞−フリー酵素系によりインビトロにおいて生産されることができ、又は適 切な突然変異株の増殖細胞によりインビボにおいて生産されることができる。ま た、この多糖類ポリマーを調製する他の方法を、以下に記載する。

インビトロにおける多糖類の合成 非−変異体キサンタン・ガムを作るための、細胞〜フリー系の使用に関しての基 本的な方法は、Ｉｅｌｐｉ、　Ｌ、　、　Ｃｏｕｓｏ、　Ｒ，０，、ａｎｄ　Ｄ ａｎｋｅｒｔ。

Ｍ、Ａ、　ｉｎ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１３０：２５３−２５６（１９８ １）により記載されている（特に引用により本明細書に取り込まれる）。拳法の 修正法を、本発明の変異体多糖類を創出するために使用できる。

上記の新たな、修正された方法のために、インビトロにおける細ｓ　ｃａｍｐｅ ｓｔｒｉｓ）の細胞を、好適なバッファー、好ましくはεＤＴＡを含むものの存 在中で、溶解することにより、そして外から添加された基質を引き続き加工する ことができる好適な生合成酵素を得ることにより、調製される。このインビトロ における系のための上記の一般的な方法は、Ｖａｎｄｅｒｓ　ｌ　ｉｃｅ他の米 国特許第４．７１３．４４９号の中に記載されている（特に引用により本明細書 に取り込まれる）。音波破砕、Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ細胞、界面活性 剤処理、酵素処理及びそれらの組合せを含むがこれに限定されない溶解の他の手 段も使用できる。

一般的に、本発明の変異体多糖類を作るためには、所望の多糖類を組み立てるた めに必要な酵素をプロセシングする微生物の溶解は、所望のガムに依存して、［ ＪＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノース、ＩＪＤＰ−グルクロン酸、アセチル −ＣｏＡ及びホスホエノールピルビン酸塩を含んでもよい好適な基質と共にイン キュベートされる。基質の選択は、生産されることを要求される多糖類に依存す る。例えば、非−アセチル化多糖類は、基質としてアセチル−ＣｏＡを除くこと により得られる。同様に、非−ビルビル化ガムは、基質としてホスホエノール− ピルビン酸塩を除くことにより得られる。外からの基質を消費するだめの細胞溶 解産物の化学的及び／又は酵素的処理は、当業者に明らかであろう。

さらに、細胞−フリー系は、キサンタン生合成経路（例えば、図１２に記載した 経路）の中の酵素の１以上を欠いた突然変異生物から創出されてもよい。このよ うな突然変異体から得られた細胞溶解産物は、全てその変異又は抑制基質と組み 合わされた突然変異のどちらかにより、本明細書中に記載した変異体ガムを製造 するであろう。

例えば、トランスフェラーゼＶを欠く突然変異体培養から作られた細胞−フリー 系は、ポリテトラマーを生産し、一方、これと同じ細胞−フリー系は、アセチル −ＣｏＡが存在しない時には、非アセチル化ポリテトラマーを生産する。

この生合成工程は、１つの態様においては、放射ラベルされた基質を重合単位に 取り込むことにより監視される。他の方法も、当業者に知られた生合成の中間体 を、分離及び同定するために開発されてきた。これらは、薄膜クロマトグラフィ ー及び高速液体クロマトグラフィーを含む。

キサンタンの細胞−フリーの生合成は、全部て３つの特異的ヌクレオチドの添加 に依存する時間に依存した、逐次的な工程でることが分かっている。ラベル基質 の非特異的取り込みの背景は、最小であり、そしてそのガム分画中のキサンタン 特異的ポリマーの検出を妨害しない。

脂質担体、特にイソプレノイド・ピロホスフェートを含むことは、幾つかの多糖 類生合成経路の中に示されている。さらに、キサンタン生合成中にピロホスホリ ル結合脂質担体が含まれることが証明された。従って、キサンタンの生合成の中 間体は、これらの担体脂質をもつ有機溶解分画中に回収されることがみつかった 。このように回収されたオリゴ糖類は、次に、温和な酸加水分解、例えば、ｐＨ ２２０分間９０℃によりこの脂質担体から遊離され、そして分析のためにアルカ リ性ホスファターゼにより脱リン酸化される。

中間体産物の回収のための上記の方法を使用しながら、インヒドロにおける条件 下で、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）突然変異 体の特定の溶解産物が、非変異体ガムの合成に必要な全ての基質の存在中でさえ 、非アセチル化又は非ビルビル化キサンタン・ガムを作ることが発見された。本 明細書中の教示の視点において、これらの方法は、当業者が他の変更された多糖 類を作る細胞溶解産物を同定することを可能にするインビボにおける多糖類の合 成 先に記載した多糖類のための細胞−フリー合成法の開発は、様々なキサントモナ ス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）細胞が 、アセチル化、ビルビル化又は未修飾のマンノース残基をもつキサンタンを基礎 材料としたポリマーを合成するのに必要な全ての酵素をもつことを証明している 。しかしながら、インビボにおいてポリテトラマーを合成するために全ての細胞 を使用するためには、反応Ｖ（図１２を参照のこと）でのキサンタン・ガムの合 成を妨害するための手段が必要とされる。さらに、全ての細胞が非アセチル化ポ リテトラマーを合成するようにするためには、アセチル化反応（図１２を参照の こと）並びに反応Ｖを妨害するための手段が必要とされるであろう。

さらに、全ての細胞が非アセチル化キサンタン・ガムを合成するために、キサン タン・ガム合成の間の内側又は外側のマンノースのいずれかのアセチル化を妨害 するための手段が必要とされるであろう。さらに、全ての細胞が非−アセチル化 、非−ビルビル化キサンタン・ガムを合成するために、アセチル化及びビルビル 化の段階の両方でキサンタン・ガム合成の両方を妨害することが必要であろう。

本発明の１つの態様においては、これらの各種の反応に責任を負う遺伝子の幾つ かを変更するために突然変異誘発を使用した。

ＴｎｌＯ１Ｔｎｋ１２（ＴｏＩＯｄｅｌ１６ｄｅｌ　１７ＫａｎＲ）　、及びＴ ｎ９０３を含むかこれに限定されないトランスポゾンを、キサントモナス・カン ペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）を突然変異誘発 するために使用することができる。これらのトランスポゾンは、１つの態様にお いて、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を与える。トランスポゾ ンは、それらがそのコード配列を妨害することにより突然変異を引き起こすとこ ろの遺伝子に、それらを挿入する能力をもっている。このトランスポゾンは、い わゆる、自殺ベクター、例えば、ｐＲＫ２０１３上を含む各種のベクター上で、 キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）に導入されることができる。Ｄｉｔｔａ、Ｇ１．　Ｃｏｒｂｉｎ、　Ｄ、 　ａｎｄ　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、　Ｄ、　Ｒ，ｉｎ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　 Ａｃａｄ、　ＳｃｉA　Ｌｌ、　Ｓ、　Ａ。

、Ｈ・７３４７−７３５１（１９８０）（特に引用により本明細書中に取り込ま れる）により記載されたようなベクターｐＲＫ２０１３は、それ自体を、非腸内 バクテリア、例えば、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）に転移する能力をもつが、その宿主内で複製するこ とはできない。従って、この自殺ベクターかキサントモナス・カンペストリス（ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）細胞の集団に導入され、そし てその集団が次にテトラマイシン又はカナマイシンのいずれかにより挑戦される 場合には、生存する個体は、そのトランスポゾンの１つがキサントモナス・カン ペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐ竺狂旦）のゲノムに挿入された ものである。上記のような挑戦の生存者は、キサンタン・ガムを作る能力を失っ ているものについてスクリーニングされることができる。このような突然変異体 は、菌糸本発明の他の態様においては、突然変異誘発の他の手段を、それらが生 産するガムをアセチル化そして／又はビルビル化しない突然変異体を作り出すた めに使用することができる。このような手段は、当業者に難なく思い浮かぶであ ろうし、そして照射、組み換えＤＮＡ技術（特に、１９８９年４月３日に出願さ れた、Ｃａｐａｇｅ他の”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＤＮＡ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ 　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｘａｎｔｈａｎ　Ｇｕｍ”と標題を付けられ、 そして引用により特に本明細書中に取り込まれた米国特許出願番号第０７／３３ ３．８６８中に、そして以下の例１の中に記載されたような）及び化学的突然変 異誘発処理を、限定することなく含んでいる。このような突然変異誘発手順の例 は、Ｍｉ　１ｌｅｒ、　Ｊ、　Ｈ，によりＥｘｐｅｒ　ｉｍｅｎ　ｔｓｉｎ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）の中に；Ｄａｖｉｓ、　Ｒ， Ｗ、　、　Ｂｏｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　ａｎｄＣｌｏｎｉｎｇ（１９８２）、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒの中に記載されている。

野性型の生物、すなわち、幾つかの多糖類を作る能力を一般的に保持するように 要求されたものよりも、少ない粘液状を呈する突然変異体を、最初に選ぶことが できる。それぞれのキサンタン突然変異体の細胞−フリー抽出物を、基質の異な る組合せの添加及びその結果物である生成物の分析により、先に記したように調 製し、そしてテストすることができる。

あるいは、適切な突然変異体を、それぞれの突然変異体の培養培地を所望の多糖 類、例えば、内側のマンノースがアセチル化されているか又は修飾されていない ようにしながら、アセチル化されているがピルビル化されていない、ピルビル化 されているがアセチル化されていない、ピルビル化及びアセチル化の両方がされ ている、又は修飾されていない外側のマンノースをもっキサンタン・ガムの存在 について分析することにより検出することができる。従って、キサンタン・ガム 経路の様々な位置で妨害されるような突然変異体を見つけることができる。キサ ンタン・ガムを生産するキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ ａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の突然変異体であって、内側のマンノースでアセ チル化されそして外側のマンノースでアセチル化されたもの（Ｘ１３９７）　、 内側のマンノースでアセチル化されそして外側のマンノースでピルビル化された もの（Ｘ１３９８）　、内側のマンノースでアセチル化されそして外側のマンノ ースで修飾されていないもの（Ｘ１３９９）　、内側のマンノースで修飾されて なくそして外側のマンノース部分の一部がピルビル化されそして一部がアセチル 化されているもの（Ｘ１４００）　、内側のマンノースで修飾されてなくそして 外側のマンノースでアセチル化されているもの（Ｘ１４０１）、そして内側のマ ンノースで修飾されてなくそして外側のマンノースでピルビル化されているもの （Ｘ１４０２）　、そして内側のマンノースで修飾されてなくそして外側のマン ノース修飾されていないもの（Ｘ１４０３）が、それぞれ、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに、それぞれ６８０３３．６８０３４．６８０３５．６ ８０３６　、６８０３７．６８０３８及び６８０３９の寄託番号の下で、寄託さ れている。

キサントモナス°カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）の突然変異体であって、アセチル化キサンタン・ガムを作るもの（ＸＩ　 ００６）、非ビルビル化キサンタン・ガムを作るもの（Ｘ９２１）、低レベルの ピルビル化を含むキサンタン・ガムを作るもの（末端マンノースの５％未満、Ｘ ９３４）　、及び非アセチル化、非ビルビル化キサンタン・ガムを作るもの［Ｘ １２３１（ｐ４１に３２２月が、それぞれ、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌ ａｎｄに、それぞれ５３４７２．５３４７３．５３４７４　、及び６７３４４の 寄託番号の下で、寄託されている。

キサンタン・ガムの変異体を作りそして染色体の突然変異を含む然変異体も、例 の方法によってのみ作られ、内側のマンノースで修飾されていなくそして外側の マンノースでピルビル化されているポリマーを作るＸ１９１０は、例５の中で記 載されている。

上記と同じ生成物に到達するために、アセチラーゼ！、アセチラーゼＩＩ、トラ ンスフェラーゼＶ、及びケタラーゼの酵素阻害剤を使用することは、本発明の範 囲を超えることはない。上記の多糖類のファミリーを製造するための、天然のキ サンタン・ガムの酵素的及び化学的分解を含む、他の変更も、考慮に入れられて いる。

上記の突然変異体は、野性型キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍ ｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の増殖のための当業者に一般的に知られた条 件下で増殖されることができる。例えば、それらは、好適な同化できる炭素源、 例えば、グルコース、シュクロース、マルトース、澱粉、複雑な炭化水素、例え ば、糖蜜又はコーンシロップ、様々な有機酸等の上で増殖されることができる。

炭素源の混合物も使用されることができる。供給される炭素源の濃度は、しばし ば、ｌリッター当たり１０と６０グラムとの間である。また、増殖のために必要 なものは、一般的には１リツター当たり約０．１と１Ｏ９０グラムとの間の同化 できる有機又は無機窒素源、及び無機物であり、その選択は当該技術分野内にお いて容易である。好適な窒素源の例は、アンモニウム塩、硝酸、尿素、酵母エキ ス、ペプトン、又は他の加水分解蛋白質物質あるいはそれらの混合物である。好 適な無機物の例は、燐、硫黄、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムを含み ：それらはしばしばキレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ又はクエン酸を添加される 。

キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）の増殖のための最適温度は、一般的に１８℃と３５°Ｃとの間に、好まし くは約２７°Ｃと３０°Ｃとの間にある。キサントモナス・カンペストリス（ば 、飽和の約ｌＯ％を超える値を維持するように、空気又は酸素を提供することに より好気的に増殖される。好ましくは、このレベルは、約２０％を超える値に保 たれる。そのｐＨは、しばしば、約６．０〜８．０で、好ましくは約６．５〜７ ．５で維持される。

本発明の多糖類は、好適な手段により、発酵培地から回収されることができる。

イソプロパツール、エタノール、又は他の好適なアルコールによる沈殿は、本発 明の多糖類を難なく産生ずる。一般的に、アルコールは、約５０〜７５容量％の 濃度まで、好ましくは塩化カリウム、塩化ナトリウム又は他の塩の存在中で、添 加される。あるいは、上記のポリマーは、限外濾過により上記培地から回収され ることができる。

強化された油回収における使用のための易動度調節溶液も、本明細書の中で開示 した変異体の多糖類ポリマーから調製されることができる。約５０から約３００ ０ｐｐｍまでの濃度の上記多糖類のポリマーの溶液は、このような易動度調節溶 液にとって適切である。他の知られた添加物も、これらの溶液と組み合わせて、 油回収をさらに強化するために使用されることができる。このような添加物は、 例えば、界面活性剤、アルカリ化剤又は金属若しくは有機の架橋化剤を含む。

また、キサンタン・ガムのような多糖類のポリマーは、食品、化粧品、医薬の形 成、紙のサイジング、泥の掘削、印刷用インキ他における増粘剤として、そして ゲル化剤として使用されることもできる。さらに、それらは、パイプ内の液体の 流れの摩擦抵抗を減少させるために使用されることができる。

例 以下の例は、本発明の特定の好ましい聾様を例示する。これらの例の中に引用さ れる全ての米国特許出願及び他の引用は、特に、本明細書中に引用により取り込 まれる。

例１ 本例は、キサンタン・ガムのアセチル化を触媒する酵素をコードしている２つの キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）遺伝子の存在 について説明する。

Ｃａｐａｇｅ他の、米国特許出願番号第０７／３３３．８６８号は、キサンタン ・ガムの生合成のために必要な遺伝子クラスターを含むキサントモナス・カンペ ストリス（Ｘ、　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の１６ｋｂセグメントのヌクレオチド 配列について記載している。そのＤＮＡ配列により同定されるそれぞれの遺伝子 を不活性化する突然変異を単離する。これらの突然変異を担持する突然変異体株 の表現型を決定した。トランスポゾン挿入により引き起こされる遺伝子ｇｕｍ　 Ｐ内の突然変異（図１ａ参照のこと）は、検出できるアセテートを全く含まない キサンタン・ガムの生産を生じさせる。遺伝子ｇｕｍ　Ｇ内の挿入突然変異は、 キサンタン・ガム生合成におけるいかなる明白な欠損をも生じなかった。遺伝子 ｇｕｍ　Ｇ欠損をもつ突然変異体は、高いレベルのキサンタン・ガムを生産し、 そしてこのガムは、殆ど正常なモル比で、キサンタンの正常な構成成分の全てを 含んでいた。これらの最初の結果に基づ蛋白の活性は、未知のまま残った。

しかしながら、そのＤＮＡ配列が、遺伝子Ｆ及びＧの生成物（ｇｐＦ及びｇｐＧ ）のアミノ酸配列を予言するために使用されたとき、これらの蛋白は、互いに広 範囲の相同性をもっていることが見つかった。この発見は、ｇｐＦ及びｇｐＧの 機能が同じではないかということを示唆している。遺伝子ｇｕｍ　Ｇ内に欠損が ある突然変異体の表現型を、次に再検査し、そしてこれらの突然変異体により作 られたキサンタンの組成を正確に定量した。これらのデータは、野性型キサント モナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）に比べて、Ｇ−突然変異 体により生産されたガムのアセテート含有量における少量（５％〜１０％）では あるが有意な減少を示した。それ故、キサンタンのアセチル化においてｇｐＧが どんな役割をもつかを決定するために、さらに実験を実施した。

ｇｐＧが正常にはキサンタン・ガムの１０％のアセチル化に向けられているとい う仮説は、遺伝子ｇｕｍ　Ｆ内のトランスポゾン挿入突然変異がアセチル化の排 除を生じるという観察により否定されるようである。明らかに、これらの突然変 異体のガムは、１０％の正常のアセテート含有量を保持していなかった。しかし ながら、それは、遺伝より報告されるように、その挿入部位から、転写の言葉で 下流に位置する遺伝子の発現を、一般的に減少させる。さらに、この減少は、Ｏ ｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｄ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ，、ｉｎ　Ｇｅｎ ｅｔ、９５ニア８５−７９５（１９８０）により報告されるように、その下流の 遺伝子がその挿入突然変異を含む遺伝子へ”翻訳的に結合している（ｔｒａｎｓ ｌａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｕｐｌｅｄ）”場合においては、非常に大きいなものと なることができる。翻訳的結合は、１つの遺伝子の翻訳終止シグナルが隣接する 下流の遺伝子の翻訳開始シグナルと重複しているという現象である。このような 結合が生じた幾つかの場合においては、その下流の遺伝子の翻訳の開始は、その カプラー（ｃｏｕｐｌｅｒ）で生じた上流遺伝子の翻訳の終止に、広く又は完全 に依存している。従って、その結合された遺伝子の上流のメンバーへの挿入は、 その下流の遺伝子の発現を、劇的に減少させ、又は除去さえする。なぜなら、こ れらの挿入は、上流遺伝子の翻訳のフレームシフト及び未成熟な終止を、必ず引 き起こすからである。

上記のｇｕｍ遺伝子クラスターのＤＮＡ配列は、遺伝子ｇｕｍ　Ｆの翻訳終止が 遺伝子ｇｕｍ　Ｇの翻訳開始と重複すること、すなわち、この２つが”結合した “ものであること（図１ｂを参照のこと）を明らかにした。さらに、遺伝子ｇｕ ｍ　Ｇのための翻訳開始シグナルの配列は特に強いものではなく、このことは、 この翻訳的結合が遺伝子ｇｕｍ　Ｇ発現における重大な役割を演じるのであろう ことを示唆している。

この仮説をテストするために、欠失突然変異（図２の中に示すような）を、遺伝 子ｇｕｍ　Ｆのコード配列内で構築した。この欠失は、遺伝子ｇｕｍ　Ｆ内のＣ １ａユ１部位間の６６０塩基対を取り除いた。この欠失ＤＮＡは、遺伝子ｇｕｍ 　Ｆのコード配列内で完全に抜は落ち、そして外来遺伝子は全く挿入されていな い。従って、この欠失は、その遺伝子の大部分（約６０％）を除去するが、欠失 した塩基対の数が３により整数に割りことができるのでその読み取り枠を変更し ない。この欠失突然変異により生産された突然変異体のｇｐＦ（ｇｐＦｄｅｌ） は、全部で３６４の中から２２０のアミノ酸を消失しているが、遺伝子ｇｕｍ　 Ｇの最初に結合された、遺伝子ｇｕｍ　Ｆの翻訳開始及び遺伝子Ｈｕｍ　Ｆの翻 訳終止は、未変更のまま残っている。ｇｐＦのアミノ酸の３分の２除去は、全て の蛋白活性の除去を生じることと、全く同じではないか、非常に近い。従って、 この突然変異体からのいずれの残存アセチラーゼ活性は、ｇｐＧの活性に、最も 原因があるよってある。

上記のＣ１ａ　［欠失突然変異を、他の野性型ｇｕ［ｎ遺伝子クラスターるもの を担持するプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，１３（図３ａ）上で構築した。

このＴｎＫ１２挿入物は、プラスミド伝達の選択のための便利な薬剤耐性を提供 する。ｐ１３ｄｅｌｃｌａと名付けられた欠失プラスミドを、遺ｅｌｃｌａ）に より作られた多糖類を分析した。このガムは、少ないが有意な量のアセテートを 含んだ；大体（１０−１５％）であって、野性型キサンタン内で正常にある量で ある。この結果は、ｇｐＦ及びｇｐＧの両方がアセチラーゼであること、そして アセチル化キサンタンのバルクがｇｐＦにより触媒され、アセチル化キサンタン 小成分がｇｐＧにより触媒されることを示唆した。しかしながら、上記の突然変 異体ｘ１２３１（ｐ１３ｄｅｌｃ１ａ）内で観察された低級レベルのアセチル化 がｇｐＧの活性からは生じないが、ｇｐＦｄｅ　ｌの残りの活性から生じたとい う可能性も残った。この問題に取りかかるために、プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ ３３６の２重突然変異体の誘導体を構築した。図３ｂの中に示すように、この２ 重突然変異体は、遺伝子ｇｕｍ　Ｆ　Ｃ１ａｌ欠失突然変異と遺伝子ｇｕｍ　Ｇ 内の挿入突然変異（ＫＢｍｌ）とを−緒にしている。この２重突然変異体プラス ミドｐＨ３３６ＫＢ１ｄｅｌｃ１ａを、株Ｘ１２３１に移転し、そして作られた 多糖類を分析した。Ｘ１２３１（ｐ１３ｄｅｌｃＩａ）により作られたガム中で 観察された低レベルのアセチル化がｇｐＧの活性から生じる場合には、この２重 突然変異体Ｘ１２３１（ｐＨ３３６ＫＢｍｌｄｅｌｃｌａ）は、遺伝子ｇｕｍ　 Ｇ内の挿入突然変異によりｇｐＧの活性を除去するはずであり、そしてアセチル 化は全く観察されないはずである。しかしながら、Ｘ１２３１（ｐ１３ｄｅｌＣ １ａ）内のアセチル化活性の真の源が突然変異体のｇｐＦｄｅｌである場合には 、遺伝子ｇｕｍ工Ｇ工人挿入物加は、アセチル化に影響を与えないはずであり、 そしてＸ１２３１（ｐ１３ｄｅｌｃ１ａ）中で観察された同様の１０％のレベル がこの２重突然変異体株により作られたガム中に見られるはずである。株Ｘ１２ ３１（ｐＨ３３６ＫＢｍｌｄｅｌｃｌａ）により作られた多糖類が全（アセテー トを含んでいないことがみつかった。このことは、ｇｐＧがキサンタンのアセチ ル化を触媒すること、そして野性型株内、ｇｐＧが、観察される全アセチル化の 大体ｌＯ％について責任を負っていることを証明した。

例２ 本例は、ｇｐＧ（ｇｐＦではない）によるアセチル化のための標的残基がキサン タンの反復単位の外側のマンノースであること、そしてこのアセチル化が外側の マンノースのビルビル化が妨害されたときに増大されることを例示する。

キサンタンの生合成遺伝子クラスターの遺伝子ｇｕｍ　Ｌ（図１ａ）内の突然変 異が外側のマンノースのビルビル化を触媒するケタラーゼ酵素を不活性化するこ とは、以前に示されていた。ｇｐＬ活性を欠く突然変異体は、ピルベートを欠く キサンタン・ガムを生産する。しかしながら、このような突然変異体の初期の研 究は、これらの非ビルビル化ポリマーが普通ではない高いレベルのアセテート、 一般的には〉０．８アセテート／マンノースを含んだことを明らかにした。従っ て、外側のマンノースは、ビルビル化が遺伝子により妨害されたときに効果的に アセチル化されることができ、そしてさらなる研究は、このアセチル化がｇｐＧ により触媒されそしてｇｐＦによっては触媒されないことを示した。

２つのアセチラーゼ遺伝子とケタラーゼ遺伝子とのそしてそれぞゼ１）、遺伝子 銃町Ｇ（アセチラーゼ１１）、及び遺伝子ｇｕｍ　Ｌ（ケタラーゼ）内の全ての 組合せを含んで成る８つの突然変異体株のセットを構築した。突然変異体の各種 の組合せを、完全なｇｕｍ遺伝子クラスターを含むプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ ３３６上で構築した。

これらの構築物内で使用された遺伝子ｇｕｍ　Ｆ突然変異は、この遺伝子内のフ レーム内欠失である。先に記載したように、この欠失は、け落ち、そして外来Ｄ ＮＡは全く挿入されない。従って、この欠失は、この遺伝子の大部分（約６６％ ）を除去するが、その読み取り枠を変更しない。なぜなら、欠失された塩基対の 数は３により整数で割りきれるからである。この欠失突然変異により作られた突 然変異体のｇｐＦ（ｇＰＦｄｅｌ）は、全部で３６４の中から２２０アミノ酸を 欠いているが、Ｆの翻訳開始部、及びＧの開始部に結合されたその翻訳終止部は 未変更のまま残っている。ｇｐＦのアミノ酸残基の３分の２の除去は、先のよう にｇｐＦ活性を除去することを示された。

Ｇ内の挿入体（ＫＢｍｌ）である。この挿入されたＤＮＡは、Ｖｉｅｉｒａ、　 Ｊ、　ａｎｄＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、ｉｎ　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８（ １９８２）により記載されたようなプラスミドｐＵｃ４−にの１．３　ｋｂ　Ｋ ａｎ’　ＤＮＡセグメントを含む制限フラグメントであり、最終的には、トラン スポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子から得られるものである。

ある。２番目のタイプは、カナマイシン及びストレプトマイシンに１フラグメン トの欠失により、上記の挿入から得られる。このＴｎＫ１２欠失突然変異におい ては、ＴｎＫ１２　ＤＮＡのｌｋｂの挿入物は、遺伝子これらの突然変異の各種 の組合せを、インビトロにおける組み換えＤＮＡ技術を使用してプラスミドｐＲ Ｋ２９０−Ｈ３３６上で構築した。得られた８つの突然変異体プラスミドを、次 に、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から、染色体から全てのｇｕｍ遺伝子クラスター を除去する欠失突然変異を含むキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐ ｅｓｔｒｉｓ）に接合的ニ伝達した。この８つの得られた株Ｘ１３９６−Ｘ１４ ０３（表１）を、次にポリマー生産について分析した。

表１ 遺伝子型 株　アセチラーゼ！　アセチラーゼ１１　ケタラーゼＸ１４０３　−　” １　野性型であって、プラスミドのｐＲＫ２９０部分内のＴｎＫ１２挿入物を担 持するもの。

ゝ　ＴｎＫ１２挿入突然変異 ’Ｋａｎ’フラグメント挿入突然変異 ’　ＴｎＫ１２欠失誘導体挿入突然変異°　フレーム内、非極性欠失突然変異 全ての株を、３００ｍ１のバッフル付き振とうフラスコ内に、３．２　ｇ／Ｉ　 Ｎ−Ｚ−アミンＡＳ ｉ、７　ｇ／ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ３００，７ｇ／ｌ　ＫＨｚ　ＰＯａ ４０　ｇ／ｌ　グルコース １９．５　ｇ／ｌ　（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタン・スルホン酸）５−１０ 　ｍｇ／ｌ　カナマイシン １　ｍｇ／ｌ　テトラサイクリン（使用できる場合）を含むｐＨ７，０のＦＸＣ −ＲＡＨ−１培地のそれぞれ５０ｍ１中で増殖させた。

温度を、３０°Ｃに維持した。接種の約６０時間後、この培養液を、蒸留Ｈ，Ｏ の４容量に対して２で希釈し、そしてその細胞を、１４．０００−１８．０００ 　ｘ　ｇで３０分間１０℃での遠心分離により、取り除いた。ガムを、２−３容 量の２−プロパツールの添加によりその上澄液から沈殿させ、そして先に記載し た条件を使用して遠心分離により集めた。この沈殿物を、次に、１００−３００ ｍｌの２０ｍＭ　ＮａＣｌ内で再水和させ、そして上記沈殿を繰り返した。最後 にこのガムを、１００［１１１の蒸留Ｈ２Ｏ内でそれぞれ再水和させた。それぞ れのサンプルを、次に、１２．０００−１４゜０００　ＭＷ　遮断セルロース・ チューブ内で毎日Ｈ２０を交換しながら、４日間、４１の蒸留８．０に対して透 析した。

それぞれの精製ガムの３連サンプルを、次に、真空乾燥により３−４倍に濃縮し 、そして２−１重２時間、１２０°Ｃて２Ｍトリフルオロ酢酸中で加水分解した 。１．２Ｍ　Ｎａ　２　ＣＯｉにより中和した後、この加水分解産物を、０．４ ５ｍｍフィルターを通して濾過し、そして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）による分析のために準備をした。

上記の分析を、Ａｍ１ｎｅｘ　ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｘ　７ ．８ｍｍ）を装備したＢｅｃｋｍａｎ　ＨＰＬＣを使用して実施した。有機酸を 、２１４ｎｍでの紫外線吸収により検出した。屈折率を、中性糖を検出するため に使用した。上記カラムを、移動相として０．０１ＮのＨｚ　ＳＯ，と平等に、 ４５℃で０．６ｍｌ／分の流速で操作した。

それぞれの加水分解産物中の成分のモル比を、それぞれの糖及び有機酸について のピーク面積に基づ（一連の換算曲線を使用して計算した。

マンノースに対するアセテート及びピルベートのモル比を表２に示す。

表２ マンノースに対するアセテート及びピルベートのモル比株　アセチラーゼ１　ア セチラーゼ［ｌ　ケタラーゼ　アセテート／　ピルベートＸ１３９６　＋　＋　 ＋　０．６６　０．４３Ｘ１３９７　＋　＋　１．０１　０．００Ｘ１３９８　 ＋　＋　０．６３　０．３６Ｘ１３９９　＋　０．５１　０．００ Ｘ＋４００　＋　＋　０．１０　０．３９Ｘ１４０１　＋　０．４７　０．００ ＸＩ４０２　＋　０．００　０．３７ Ｘ１４０３　０．００　０．００ 表２の中に表されたデータについて、以下の主要な観察を行うことができた。

１、遺伝子ｇｕｍ　Ｆ内の６６０塩基対の欠失は、遺伝子Ｆ蛋白（アセチラーゼ １）を不活性化した。Ｘ１４０２対Ｘ１３９８を参照のこと。

２、遺伝子ｇｕｍ　Ｇ蛋白（アセチラーゼＩＩ）は、ケタラーゼが活性のとき、 キサンタンをアセチル化し、そしてそれは野性型と比へて非常に減少されたレベ ルであった。例４におけるＸ１４００対Ｘ１３９６を参照のこと。

３、ケタラーゼが不活性化された場合、アセチラーゼ！１によるアセチル化は、 劇的に減少する（例４に記載された、Ｘ１４００対Ｘ１４０１）。

４、アセチラーゼＩによるアセチル化の程度は、ケタラーゼの不活性化に応じて 増加しない。例４に記載された、Ｘ１３９８対Ｘ１３９９を参照のこと。

５、ピルビル化は、アセチル化の程度には関係なく、有意にはバラつかない。例 ４に記載された、Ｘ１３９６　、Ｘ１３９８　、Ｘ１４００及びＸ１４０２を参 照のこと。

これらのデータは、遺伝子ｇｕｍ　Ｇ蛋白（アセチラーゼｍがキサンタンの外側 のマンノースのアセチル化を触媒することを示している。これは、ケタラーゼが 活性であるとき限定された程度で生ずるよってあるが、ケタラーゼ−突然変異対 においては劇的に増加する。

これらのデータは、ピルビル化がアセチル化を妨害するが、アセチル化のレベル とは関係なくピルビル化が有意に変更されないということから、その反対は正し くないということを示している。遺伝子ｇｕｍ　Ｆ蛋白（アセチラーゼｌ）は、 内側のマンノースのみのアセチル化を触媒し、そしてキサンタンのポリトリマー 及びポリテトラマー変異体についての以前のデータ、すなわち、米国特許第４． ７１３．４４９号及び米国特許出願第８８４．３３５号は、ケタラーゼが外側の マンノースのみのピルビル化を触媒することを示している。

本例は、ｇｐＧ（アセチラーゼｍがキサンタン反復単位の内側のマンノースのア セチル化を触媒しないことを証明する。

ガム遺伝子クラスターの遺伝子ｌは、トランスフェラーゼＶ（図１）、すなわち 、キサンタン生合成において脂質−結合４糖類の中間体にマンノースを追加する 酵素をコードしている。この機構は、米国特許第４．７１３，４４９号の中に記 載されている。遺伝子ｇｕｍ　Ｉを不活性化する突然変異は、脂質−結合４糖類 の合成を導く。この４糖類の反復単位は重合し、ポリテトラマー・ガムであって 、その正常結合中に内側のマンノースを含むがキサンタン・ガム上に正常みられ る外側のマンノースを欠いているもの（図４）を産生ずる。遺伝子ｇｕｍ　Ｉ内 の挿入突然変異を、そして遺伝子ｇｕｍ　Ｆ内の旦と！欠失突然変異（図５参照 のこと）を含む、２重突然変異体プラスミド、ｐＫＢｍ２ｄｅｌＣ１ａを、構築 した。この２重突然変異体プラスミド、ｐＫＢｍ２ｄｅ　Ｉｃ　ｌａを、その染 色体中にｇｕｍ遺伝子Ｂ及びＣのみを含むキサントモナス・カンペストリス（Ｘ 、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）欠失株Ｘ１１０６に伝達した。ｐＲＫ２９０−ＨＡ３ から得られた突然変異体プラスミドがＢ及びＣを担持しないがガム遺伝子の残り の全て、ＤからＭまでを含むので、上記染色体により、遺伝子Ｂ及びＣは提供さ れる。得られた株、Ｘ１１０６（ｐＫＢＸｌ１０６（ｐＫＢ又はＸ１４０９を、 ポリマー組成について２回分析した。この結果は、アセチラーゼ［１が有意な程 度では上記ポリテトラマーの内側のマンノースをアセチル化できないことを示し ている。この突然変異体株においては、アセチラーゼ１１は活性である、なぜな らば、遺伝子ｇｕｍ　Ｇは突然変異体ではなく、そして遺伝子ｇｕｍ　Ｆ突然変 異が、遺伝子ｇｕｍ　Ｇの発現に影響を及ぼさないことが先に示されている本例 は、キサンタン・ガムのペンタ糖類反復単位のアセチル化及びビルビル化の遺伝 子制御により作られることができる多糖類ファミリーを含んで成る、反復単位に ついて記載する。これらの反復単位の構造を、図６の中の模式図において示す。

（ａ）野性型（Ｘ１３９６）　；アセチラーゼｌ　＋、アセチラーゼｌＩ＋、ケ タラーゼ◆ 正常キサンタンは、内側のマンノース残基で広くアセチル化されており、そして 外側のマンノースでしばしばピルビル化されている。

一般的な所信に反し、正常キサンタンの外側のマンノース残基の有意なパーセン テージ（１０−２０）は、アセチル化されている。従って、正常キサンタン反復 単位は、ピルベート又はアセテートのどちらかを含む、外側のマンノースの修飾 に関して不均一である。

（ｂ）Ｌ−（Ｘ１３９７）；７−ｔ＝チラーゼ［”、７セチラーゼ［［”　、ケ タラーゼ一 本ポリマーは、ピルベートを含んでいない、そして結果として、外側のマンノー ス残基で広くアセチル化されている。内側のマンノース残基は、野性型における ものと同じように高くアセチル化されている。

（ｃ）Ｇ−（Ｘ１３９８）；アセチラーゼ［＋、アセチラーゼ［［−、ケタラー ゼ４ 本ポリマーは、野性型におけるものと同じように内側のマンノース上で高くアセ チル化されており、そして外側のマンノースは、野性型にようにピルビル化され ている。しかしながら、外側のマンノースのアセチル化はない。

（ｄ）Ｇ−、Ｌ−（Ｘ１３９９）：アセチラーゼｌ　＋、アセチラーゼ［［−、 ケタラーゼ一 本ポリマーは、内側のマンノースの高いレベルの野性型のアセチル化をもってい るが、外側のマンノースは未修飾である。

（ｅ）Ｆ−（Ｘ１４００）；アセチラーゼ［−、アセチラーゼＩド、ケタラーゼ １ 本ポリマーの内側のマンノースは、未修飾であ、一方、外側のマンノースは野性 型におけるものと同じように修飾されている。すなわち、外側のマンノースは一 般的にピルビル化されているが、外側のマンノース残基の有意な部分がその代わ りにアセチル化されている。

（ｆ）Ｆ−、Ｌ−（Ｘ１４０１）；アセチラーゼ１−、アセチラーゼＩＩ＋、ケ タラーゼ一 本ポリマーは、未修飾の内側のマンノースを含む。外側のマンノースは、ピルビ ル化されていないが、重くアセチル化されている。

（ｇ）Ｆ−、Ｇ−（Ｘ１４０２）：アセチラーゼ］−、アセチラーゼｒｒ−、ケ タラーゼ◆ 本ポリマーは、内側又は外側のマンノース残基のどちらでもアセチル化されてい ない。外側のマンノースのピルビル化は、野性型におけるものと同じように正常 に生じる。

（ｈ）Ｆ−、Ｇ−ルー（Ｘ１４０３）：アセチラーゼ１−、アセチラーゼＩｌ− 、ケタラーゼ一 本ポリマーは、アセテート又はピルベートを全く含まない。内側又は外側のマン ノース残基のどちらも全く修飾されていない。

ある、染色体の欠失突然変異の構築について記載する。

例４の中に記載した変異体キサンタンを、ガム遺伝子クラスターがその染色体か ら欠失しており、且つその細胞内に組み換えプラスの突然変異体株により、生産 する。幾つかの場合には、このキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐ ｅｓｔｒｉｓ）の染色体内に位置するガム遺伝子クラスターをもつことが要求さ れる。なせなら、このことがプラスミド維持のための必要性を取り除き、そして それ故に株の安定性を改善するはずであるからでる。それぞれアセチラーゼｌ及 び１１をコードする、遺伝子ｇｕｍ　Ｆ及びｇｕｍ　Ｇに欠損のある、染色体の 欠失突然変異を、以下に記載するように構築した。この突然変異体は、非アセチ ル化キサンタン・ガムを生産した。

図７ａは、ｇｕｍ　Ｐ及びｇｕｍ　Ｇ遺伝子を含むガム遺伝子クラスターの４、 ３ｋｂのｂｇｌ　Ｉ［フラグメントのマツプを示している。このｂｇｌ　１１フ ラグメントを、ｐｓＩＢｇｌと名付ける組み換えプラスミドを作るために、プラ スミド・ベクターｐＳｌのｂｇｌ　１１部位にクローニングする。このｐＳｌベ クターは、増殖性の、接合性でないＤＮＡ複製起点がｐＢＲ３２２の複製起点に より置き換えられているｐＲＫ２９０の誘導体である。このＰＳｇｌは、”自殺 ”プラスミドであり、すなわち、それらは、キサントは複製できない。

欠失を、図２ｂの中に示されたｐｓＩＢｇｌΔＣ１ａを作るために、例１の中で 記載したように（Ｃ１ａ　［によりｐｓＩＢｇｌを処理し、そして低いＤＮＡ濃 度で再連結することにより）達成した。これらの実験においてはれなかった。

しかしながら、Ｃ１ａ　［による処理は、この認識配列の最初のアデニン（Ａ） 残基のメチル化に感受性があることが知られている。その残基がメチル化された 場合、この酵素は、上記配列を解裂しないであろう。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ ）内では、配列ＧＡＴＣが、このテトラヌクレオチド配列のＡ残基をメチル化す るｄａｍメチラーゼのための基質である。遺伝子ｇｕｍ　Ｇ内のＣ１ａ工■認識 部位は、Ｇ残基により先行されている。従って、その配列、ＧＡ　ＴＣＧＡＴに おいては、下線を付けたＡがメチル化される。なぜなら、それが、上記ＧＡＴＣ テトラヌクレオチド配列内で生しており；そしてそれ故、上記Ｃ１ａ　１部位が Ｃ１ａ　［処理に対し不応であるからである。

遺伝子ｇｕｍ　Ｇ内のＣ１ａユ１部位を処理するために、関係するメチラーゼ活 性について欠損のある大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｄａｍ株内でｐｓｌＢｇｌΔＣ １ａを増幅することにより、非メチル化ＤＮＡを作ることが必要であった。非メ チル化ｐｓｌＢｇｌΔＣ１ａ　ＤＮＡを調製したとき、遺伝子ｇｕｍ　Ｇての牡 虹１処理が難なく観察された。基質としてこのプラスミドＤＮＡを使用して、図 ７ｃ内に示したｐｓＩＢｇｌΔＣ１ａ２を作るために、第二のＣ１ａ　Ｉフラグ メントを、（レエ］によりｐｓＩＢｇｌΔＣ１ａを処理することにより欠失させ 、そして低いＤＮＡ濃度で再連結した。両方のＣ１ａ　！フラグメントの欠失生 成体は、ｇｕｍ　Ｆ遺伝子の近い部分とｇｕｍ　Ｇ遺伝子の遠い部分とのフレー ム内融合を創出した。それ故、この領域にわたる、そして遠くに位置する遺伝子 Ｈから屓まで（図１）の転写及び翻訳は、正常に進行するはずである。

上記の欠失突然変異を含むプラスミドｐｓＩＢｇｌΔＣ１ａ２を、遺伝子交換を 介してキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の染色体 に伝達させた。この２段階の組み換え手順を、図８内の一般的なやり方で図解す る。一般的に、第一段階においては、プラスミドと染色体との相同的組み換えが 、プラスミド全体の染色体への統合を生じさせる。この事件は、プラスミドのベ クタ一部分内に担持されている抗生物質耐性マーカーの維持についての選択によ り、選択される。第二段階においては、次の組み換えは、プラスミドの損失及び 構築された欠失突然変異の保持を作り出す。この事件は、染色体ＤＮＡ構造物の 、抗生物質耐性決定基の損失についてのスクリーニング並びにサザン・プロット ・ハイブリダイゼーション分析により検出される。

本例においては、ｐｓＩＢｇｌΔＣ１，ａ２を、標準的な３世代にわたる接合に より野性型キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株Ｘ ７７に、接合伝達し、そしてテトラサイクリン耐性のトランス接合体（ｔｒａｎ ｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を選択した。これらのテトラサイクリン耐性コロニーは 、外見上、明黄色又は暗黄色のどちらかであった。ＤＮＡを気泳動により分離し 、そしてサザン・プロット・ハイブリダイゼーションを実施した。ラベルされた ガム遺伝子クラスターＤＮＡによるプローブ形成は、上記明黄色単離物からのＤ ＮＡ中に野性型のパターンを示した。暗黄色単離物からのＤＮＡについてのハイ ブリダイゼーション・パターンは、これらの単離物内で、ｐｓＩＢｇｌΔＣ１ａ ２がその染色体に組み換えられていることを示した。

本物のｐｓｌＢｇｌΔＣ１ａ２挿入単離物の２つを、次に、テトラサイクリンの 非存在中で増殖させ、遺伝子交換過程の上記第二段階における次の組み換えにつ いてスクリーニングした。これらの実験においては、液体培養をテトラサイクリ ンの非存在中で飽和まで行い、新しい生育培地中で１＝５０希釈し、そして再び 飽和まで増殖させた。本タイプの幾つかの実験において、継代培養段階の数は、 ２から６までにばらついた。

上記の液体継代培養段階の後、この細胞を、テトラサイクリンの非存在中で、希 釈及びブレーティングし、単離コロニーを産生じた。

これらのコロニーをテトラサイクリン耐性についてテストした。異なる実験にお いて、テトラサイクリン感受性コロニーの頻度は、広く、〜０．５％から〉５０ ％まで、ばらついた。テトラサイクリン感受性単離物の頻度は、テトラサイクリ ンの非存在中で、増殖の世代数（すなわち、継代培養段階）と共に、増加した。

個々のテトラサイクリン感受性単離物を増殖させ、そしてそれらの染色体ＤＮＡ を、その染色体中に上記欠失突然変異を含んでおりそして相同的組み換えの結果 として上記プラスミドの配列を失っているそれらの単離物を同定するために、サ ザン・プロット・ハイブリダイゼーションにより分析した。Ｘ１９１０と名付け た、このような１つの単離物は、例２に中で詳述した手順によるインビボにおけ る多糖類ポリマーの生産について特徴付けされた。Ｘ１９１０により生産された 多糖類ポリマーの組成は、グルコース、マンノース、グルクロン酸及びピルベー トに関して、野性型キサンタンから区別できないことが見つけられた：しかしな がら、反対に、Ｘ１９１０により作られたガム中には、アセテートは全く検出さ れなかった。従って、この突然変異体は、Ｘ１４０２（例４）により作られたも のと等価な組成をもつ非アセチル化キサンタンを生産するが、上記の染色体の欠 失突然変異の結果としてそのようになっている。組み換えプラスミド又はいかな る外来ＤＮＡは、本株中に全く存在しない。

先に記載したような一般的なアプローチ及び戦略は、本明細書中に又はＶａｎｄ ｅｒｓｌｉｃｅ　ａｎｄ　５ｈａｎｎｏｎの米国特許第４．７１３．４４９号中 に記載されている変異体キサンタンのいずれかを作るであろう染色体欠失突然変 異体アナログを創出するために容易に利用されることができるであろう。

気［ 本例は、アセチラーゼ又はケタラーゼ活性における欠損をもつキサントモナス・ カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）突然変異体株を作り出すために使 用された突然変異誘発及びスクリーニングの方法を示す。

キサンタン・ガム生合成の酵素類をコードしている遺伝子は、キサントモナス・ カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の染色体上の一連のクラスター遺 伝子を含んで成ることが示されている。二〇″ガム遺伝子クラスター″は、Ｃａ ｐａｇｅ他により詳細に記載されている。ガム遺伝子ＤＮＡのセグメントは、Ｃ ａｐａｇｅ他により詳述されたように、プラスミド・ベクター例えば、ｐＭＷ７ ９上でクローニングされた。

部位特異的突然変異誘発を、プラスミドｐＭＷ７９内に担持された上記ガムＤＮ Ａのサブクローニング部分の上で行った。これらのクローン化ＤＮＡセグメント は、上記のクローン化キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）ＤＮＡ内で挿入、欠失、及び置換の突然変異を生じさせるために組み換え ＤＮＡ技術を使用することにより、トランス接合体と共にインビトロにおいて、 そしてインビボにおいて、突然変異誘発された。これらの突然変異により与えら れた表現型を研究するために、この突然変異を担持するプラスミドを、キサント モナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）に戻し伝達し、そして次 に、プラスミドにより生まれ、突然変異された遺伝子が相同的組み換えを介して その染色体内に挿入されている組み換え体を同定した。

ＴｎｌＯによりコードされているテトラマイシン耐性は、プラスミドからその染 色体への突然変異の移動についての便利な選択系を与える。

このような１つの突然変異体株（Ｘ１００６）は、上記のアセチラーゼ活性の不 活性化を引き起こすことが見っがったＴｎｌＯ挿入物を担持する。この突然変異 体株は、例７及び８中に記載されたように特徴付けされ、そして非アセチル化さ れた多糖類を作ることが見つけられた。２番目の突然変異体株は、釦ｌＯのテト ラサイクリン耐性遺伝子遺伝子を含むＤＮＡのフラグメントを上記ガム遺伝子ク ラスター内の制限部位にインビトロにおいて挿入することにより構築された。こ の突然変異体株（Ｘ９２１）は、上記ケタラーゼ活性における欠損があることが 見つかった。例７及び８の方法により見つけられたように、この突然変異体株は 、非ピルビル化されたキサンタンを生産する。

３番目の突然変異体株（Ｘ９３４）も、上記のケタラーゼ活性を太き（減少させ ることが見つかった。この突然変異体株は、非常に低レベルのピルビル化をもつ キサンタン・ガムを生産する：正常キサンタンにおいて、１−５％のレベルのピ ルビル化が見つかった。

上記の突然変異体株は、先に記載されたように見つけられた。予備試験として、 プラスミドにより作られたキサントモナス・カンベこのＴｎｌＯの挿入は、Ｃａ ｐａｇｅ他及びＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ他により記載されたように、突然変異誘 発Ｘ６５５内にＧｕｍ−欠損を引き起こした。本実験は、ブレスミドｐＲＫ２０ １３によりＰＴＸ６５５を８動化し、そしてそれをについての選択により、伝達 するとであった。本接合の最初の結果は、異常であり、そしてＴｎｌＯが上記の プラスミド上で担持されたとき、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍ ｐｅｓｔｒｉｓ）内で効果的にテトラサイクリン耐性を発現しないが、キサント モナス・カンベストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の染色体内でＴｎｌＯが 担持されたとき、その薬剤耐性がより効果的に発現されるいうことを示唆した。

この現象は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）内のＴｎｌＯについても記載された。そ こで、上記の染色体内に挿入されたＴｎｌＯの１つのコピーを担持する株が、マ ルチコピー・プラスミド上でＴｎｌＯを担持する株よりも、存意に高い濃度のテ トラサイタリンに耐性であることが示された。上記の接合さく、水のようなコロ ニー）増殖する高い頻度（受容体当たり０．５）の子孫を作り出した。延長した インキュベーションの後、そのコロニーの多くの両分（２５％）が、より活発に 増殖する細胞のセクターを作った。これらのセクターの５０％より多くのものが 、形態においてＧｕｍ−のようであった。これらは、たぶん、上記のＴｎｌＯｔ ｌ入物を含むプラスミドより生まれたＤＮＡと上記染色体野性型ＤＮＡとの間の 組み換えから生じている。このＴｎｌＯが上記染色体に組み換えられたとき、高 いレベルのＴｅｔ　’が得られ、そして上記の活発に増殖するセクターが観察さ れる。これらのＧｕｍ　−、Ｔｅｔ　’セクターが拾い上げられ、そしてテトラ サイクリン上で再び線接種されたとき、それらは、よく増殖し、そして特徴的な Ｇｕｍ−の形態を呈した。

Ｇｕｍ　”　、　Ｔｅｔ　’単離物も特徴付けられた。これらの株のいくつか（ 特にＸ９３４）は、相同的組み換えを介してキサントモナス・カンペストリス（ Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の染色体に挿入された完全なプラスミドｐＴＸ６５ ５を含むことが見つかった。このＸ９３４株の染色体構造を、その染色体ＤＮＡ のサザン・プロット・ハイブリダイゼーションにより決定し、それは、そのプラ スミド配列が染色体に統合された形態で存在することを示している。

本例は、本発明の変更された多糖類がインビトロにおいてとのように調製される かを示す。例えば、非アセチル化及び／又は非ビルビル化のキサンタン・ガムが インビトロにおいてとのように調製されるかを示す。

溶解物の調製 例６及び例１０の中で記載されたキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍ ｐｅｓｔｒｉｓ）　Ｂ１４５９５４−Ｌ又は５４−Ｌ突然変異体を、Ｊｅａｎｅ ｓ、　Ａ、他により、ｔｌ、ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌ ｔｕｒｅ、ＡＲ３−ＮＣ−５１，ｐｐ、１４（１９７６）（特に引用により本明 細書中に取り込む）中に記載されたように、２（ｗ／ｖ）％グルコースを補われ たＹ＆Ｉ（酵母−マルト培地）中で増殖させた。培養液を３０°Ｃで対数期の終 わりまで増殖させた。この細胞を遠心分離により収穫し、そして１０ｍＭ　ＥＤ ＴＡを含む冷Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ、７０ｍＭ、ｐＨ８，２で洗浄し、そしてＥｕｒ ｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：９３−１ ０５（１９７４）（特に引用により本明細書中に取り込む）の中に記載された、 Ｇａｒｃｉａ、　Ｒ，Ｃ，と同様の手順により、３回、凍結−解凍を行った。

この懸濁液の増加した粘度により、そしてこの処理後の細胞生育能力の完全な損 失（１／１０　＠生存体）により証明されたように、この手順は、上記細胞を破 壊した。この凍結−解凍溶解物を部分として一８０°Ｃで凍結した。蛋白質濃度 は、８１０　ＲＡＤ検定（ＢＩＯＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃ ｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）により測定され、そして１＋ｎｌの溶解 物当たり５〜７ｍｇ細胞蛋白であることが見つかった。

生合成検定手順 ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１３０：２５３−２５６（１９８１）（引用により 本明細書中に特に取り込む）中にＩｅｌｐｉ、　Ｌ、　Ｃｏｕｓｏ、　Ｒ，０， 、ａｎｄ　Ｄａｎｋｅｒｔ、　Ｍ、　Ａ、により記載されたように、凍結−解凍 溶解物の部分（３ｏＯ〜４００μｇ蛋白に等価）　、ＤＮＡａｓｅ　Ｉ（１０μ ｇ／ｍｌ）　、及びＭｇＣＭｇＣ１２（８を、２０°Ｃで２０分間前インキュベ ートした。等容量の７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，２を、所望の放 射ラベルした糖ヌクレオチド（ＬＩＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノース及び ＵＤＰ−グルクロン酸）と共に、添加し、そして２０℃でインキュベートした。

放射レベルしたホスホエノール・ピルベート及びアセチル・コエンザイムＡを、 Ｉｅｌｐｉ　ｅｔ　ａｌ、、前記、ａｎｄ　Ｉｅｌｐｉ、Ｌ、Ｃｏｕｓｏ。

ｎｔｅｒｎ、　６：３２３−３３３（１９８３Ｘこの両方を引用により本明細書 中に特に取り込む）中に記載されたように、必要なときに添加した。各種時間に 、４°Ｃバッファーによる希釈によりこの反応を停止させた。このサンプルを遠 心分離し、そしてこのペレットをバッファーにより２回洗浄した。この上澄を結 合させ、担体キサンタンｃｉｏｏμｇ）を添加し、そしてキサンタンと合成ポリ マーをエタノール（６０％）−ＫＣＩ（０，８％）により沈殿させた。この沈殿 ポリマーを水に再懸濁し、そして未取り込みラベルを除去するために２回より多 く再沈殿させた。この沈殿物（ガム画分と名付けた）に取り込まれた放射能を、 液体シンチレーション・カウンター内で測定し、そしてそのデータを、その放射 ラベル成分のピコモル換算での取り込み量を得るために加工した。

Ｘ１００６の細胞溶解物は、［”Ｃ］アセチルＣｏＡから上記インビトロ系のガ ム画分に炭素−１４アセテートを取り込まなかった。５４−Ｌの細胞溶解物は、 インビトロにおいて、［”ＣＩアセテートにより放射ラベルされたガムを生産し た。同様に、Ｘ９２１の細胞溶解物は、そのガム画分に［１４Ｃ］ピルベートを 取り込まず、一方、５４−Ｌ細胞溶解物は、ホスホエノール［”Ｃ］ピルベート から上記インビトロ系のガム画分に放射レベルされたピルベートを取り込んだ。

従って、Ｘ１００６は、アセチラーゼのための遺伝子内に欠損をもつ突然変異体 株として同定され、そしてＸ９２１は、ケタラーゼのための遺伝子内に欠損をも つ突然変異体株として同定された。これらの株の溶解物は、インビトロにおいて 、それぞれ、非アセチル化キサンタン及び非ビルビル化キサンタンを生産した。

基質を限定することにより、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅ ｓｔｒｉｓ）　Ｂ１４５９５４−Ｌの溶解物は、インビトロにおいて、変更され た多糖類を生産する。例えば、Ｓ４−シの細胞溶解物は、内在のアセチル−Ｃｏ Ａ及びホスホエノールピルベートが消費し尽されたとき、インビトロにおいて、 非アセチル化、非ビルビル化のキサンタン・ガムを生産する。

トランスフェラーゼ■のための遺伝子内の突然変異は、ポリテトラマーの生産を 生ずるであろう。この表現型は、先に記載されたようなインビトロにおける方法 により証明されるであろう。このガム画分は、２：ｌ・１のモル比で、グルコー ス、マンノース及びグルクロン酸から成る多糖類を表すであろう。上記の脂質担 体から加水分解されたテトラマーの中間体も、そのＴＬＣ上の移動及びその糖の モル比により検出されるであろう。

例８ 本例は、インビボにおいて非アセチル化ガムを作るための、上記のアセチラーゼ 欠損株、Ｘ１００６の使用を説明する。本例は、上記のケタラーゼ陰性株、Ｘ９ ２１からの非ビルビル化ガム、並びに上記株Ｘ９３４からの減少されたレベルの ビルビル化をもつキサンタン・ガムのインビボにおける生産も説明する。

先に記載した３つの突然変異株及び５４−Ｌを、３０°Ｃで２パーセントのグル コースを含む培養液の中で一夜、培養した。このガムを、遠心分離による細胞の 除去により、０．５〜１％塩化カリウムを含む２−プロパツール又はエタノール の添加による上澄からこのガムを沈殿させることにより、このガムを収穫した。

このガム沈殿物を、遠心分離により回収し、そして再懸濁させた。この手順を繰 り返した。この沈殿ガムを、水に対して透析した。それぞれの多糖類のサンプル を、酸加水分解し、８１０　ＲＡＤ　ＨＰＸ−８７Ｈカラムを使用したＨＰＬＣ ニより分析した。キサンタン成分を、既知濃度の標準のインジェクションにより 定量した。

上記の加水分解ガムのＨＰＬＣ分析は、Ｘ９２１がピルベートをもたないキサン タン・ガムを生産することを示した。株Ｘ１００６は、アセテートを全くもたな いキサンタン・ガムを生産した。株ｘ９３４は、５４−Ｌガムのピルベートの１ −５％のレベルで、ピルベートを含むガムを生産した。

例９ 本例は、非アセチル化及び非ビルビル化の両方がされているキサンタンを生産す るであろうキサントモナス・カンペストリス（飄９ｍｐｅｓｔｒｉｓ）の突然変 異体を構築するために使用されることができる方法及び戦略について記載する。

ケタラーゼ活性を（Ｘ９２１）又はアセチラーゼ活性を（Ｘ１００６）欠いてい るキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の突然変異体 株については記載した。キサントモナス・カンペストリス（Ｌ９ｍｐｅｓｔｒｉ ｓ）の単一株にケタラーゼ欠損及びアセチラーゼ欠損を導入するために、Ｖａｎ ｄｅｒｓ　ｌ　ｉｃｅ他及びＣａｐｅｇｅ他により記載されたような、微生物の 遺伝子のそして組み換えＤＮＡの方法を使用することができた。この２重突然変 異体株は、非アセチル化及び非ピルビル化の両方がされているキサンタン・ガム を生産するであろう。

プラスミド・ベクター上に担持されているクローン化ガム遺伝子ＤＮＡへの挿入 突然変異の製造方法は、Ｃａｐｅｇｅ他により記載されている。インビボ又はイ ンビトロにおける第二ラウンドの突然変異誘発のための基質として、突然変異体 株Ｘ９２１を生じさせる上記の挿入突然変異を担持するプラスミドを使用するこ とを、思い浮かべることができた。この第二ラウンドの突然変異誘発は、当業者 に容易に思いつくであろう多数のトランスポゾン性の要素のいずれか、又は等し く明らかな数の選択マーカーを含むＤＮＡ制限フラグメントいずれかを使用する ことができる。２つの挿入突然変異を担持しているｌするために、Ｃａｐｅｇｅ 他の遺伝子交換技術の中で、使用されることができた。得られた株の表現型を、 例７中に、前記のＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ他及びＣａｐｅｇｅ他により記載され たインビボ又はインビトロにおける技術により分析することができる。これらの 分析は、ケタラーゼ及びアセチラーゼ活性の両方において妨害されている２重突 然変異体株を現すであろう。これらの２重突然変異体株は、同時に非ピルビル化 及び非アセチル化されているキサンタンを生産するであろう。

例１０ 本例は、ポリテトラマーを生産するキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａ ｍｐｅｓｔｒｉｓ）突然変異体を得るための手順について記載する。先に記載し たように、そして前記のＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ他の中では、切断された側鎖を もつキサンタン関連多糖類、すなわち、ポリテトラマーは、既に得られている。

この突然変異体は、本明細書中に記載したインビボ又はインビトロにおける方法 により特徴付けされた。

本明細書中で、そして引用された特許出願の中で記載された方法を使用して、当 該技術分野における熟練者は、先に記載したようなポこれらの突然変異体株の同 定は、本明細書中で、モしてＣａｐｅｇｅ他の中で記載されたように、インビト ロにおける方法を使用して、又はインビボにおいて製造された多糖類の分析によ り達成されることができる。

一旦、ポリテトラマー生産突然変異体が得られると、追加の突然変異段階、例え ば、例６及び１０の中で記載され、そして当該技術分野における熟練者に一般的 に知られている段階は、非アセチル化ポリテトラマーを生産する突然変異体を作 り出すために、行われるこ本例は、本明細書中に記載された多糖類が、十分にア セチル化、十分にビルビル化、又は両方がされているかどうかを確認するための 、ベクター上でのアセチラーゼ遺伝子及びケタラーゼ遺伝子のクローンニングに ついて討議する。

上記のキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の株Ｘｌ ００６及びＸ９２１は、例６及び７の中で記載したように、それぞれ、アセチラ ーゼ及びケタラーゼのための遺伝子内の突然変異をもっている。当業者は、アセ チラーゼ又はケタラーゼ遺伝子を含む生来のＤＮＡ制限フラグメントを回復する ために、Ｂｅｔｌａｃｈ他、前記の中に記載された方法を使用することができる 。すねわち、薬剤耐性マーカーにより邪魔されたアセチラーゼ又はケタラーゼ遺 伝子を含むＤＮＡ制限フラグメントをもつプラスミドを、アセチラーゼ又はケタ ラーゼ遺伝子のための生来のＤＮＡ制限フラグメントを得るためのラムダ・ゲノ ム・ライブラリーを探るために使用することができる。他の態様においては、ア セチラーゼ又はケタラーゼ酵素のための遺伝子は、前記のＣａｐａｇｅ他により 記載されたようなプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６、ＡＴＣＣ第６７０４９号 の上で、そしてそこに記載された他のプラスミドの上で、既にクローン化されて いる。当業者にとって、これらのプラスミドからアセチラーゼ又はケタラーゼの 遺伝子自体をサブクローニングすることは簡単なことである。

次に、いずれかの方法により得た生来のＤＮＡ配列を、Ｂｅｔｌａｃｈ他の中で 現された方法を使用して、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓ ｔｒｉｓ）内で複製可能なプラスミド、例えば、ｐＭＷ７９上に挿入することが できる。アセチラーゼ及び／又はケタラーゼ遺伝子の発現は、その現存ＤＮＡ配 列を修飾することにより、又はその遺伝子の上流に調節可能なプロモーターを挿 入することにより、調節することができる。これらの技術は、分子生物学及び遺 伝子工学の分野における熟練者によく知られている。同様に、上記遺伝子が挿入 されているプラスミドは、高いコピー数のプラスミドであることができる。Ｃａ ｐａｇｅ他の中で明らかにされたように、上記のキサンタンミドから生まれた遺 伝子の発現のために好適な条件下での培養液の増殖は、その他のキサンタン生合 成酵素よりも非常に多数のアセチラーゼ及び／又はケタラーゼ酵素を作り出すで あろう。このアセチラーゼの過剰発現は、上記のキサンタン多糖類が十分にアセ チル化されること、すなわち、全ての内側のマンノース残基のアセチル化を引き 起こすはずである。同様に上記ケタラーゼの過剰発現は、その末端マンノース上 で、キサンタン多糖類が十分にビルビル化されるこを引き起こすはずである。

当業者にとって、キサンタンの十分なアセチル化及び十分なビルビル化が先に記 載した方法により達成されることができることは明らかであろう。さらに、ポリ テトラマーの十分なアセチル化、そしてポリトリマーの十分なアセチル化（前記 のＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ他の中に記載されている）は、本明細書中に記載され た方法を使用して達成されることができる。

醪 本例は、高温で水の粘度を増加させるための、遺伝子を修飾されたキサントモナ ス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）にいよ り生産される非ビルビル化多糖類の経済的及び技術的の利点について証明する。

キサンタン・ガム、すなわち、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏ ｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の天然製品は、例えば、増強された、石油 回収における使用のための水の効果的な増粘剤である。これらの粘度の利用は、 しばしば、キサンタン・ガムが高温で、そして塩水ブライン中で使用されること を要求する。キサンタン・ガムは、高温（例えば、７５°Ｃ−１００″Ｃ）でも 効果的な増粘剤である。但し、それらの粘度は、低温（例えば、２５°Ｃ〜６０ ″Ｃ）での粘度よりも実質的に減少される。

本発明者は、上記の３４−Ｌ親株（株Ｘ２３７）から作られた野性型のキサンタ ン・ガムの粘度に等しい、高温での粘度を作り出す、キサントモナス・カンペス トリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の遺伝子修飾された 株により作られた新たなそして新規の多糖類を発見した。

このキサンタン・ガムは、正常なペンタマーのキサンタン構造をもっているが、 その遺伝子修飾のために、その末端マンノース上にピルベート部分を全く含んで いない。この新規の多糖類は、実質的な費用の削減及び工程の利便性を作り出す であろう３０″Ｃ付近の発酵温度にて低い粘度をもっている。ビルビル化キサン タン・ガムを作るためのコストは、本来高い。なぜなら、このポリマーの高い粘 度が攪拌、通気及び冷却について大きなエネルギー流入量を要求するからである 。

図９は、新規のビルビル化キサンタン・ガムと、未修飾の親により作られた野性 型キサンタン・ガムとの粘度比較を示している。野性型ガムは、低温で高い粘度 を示すが、その粘度は温度増加に伴い速やかに減少する。上記の非ビルビル化ガ ムは、一方では、低温でより低い粘度をもっているが、上記野性型キサンタン・ ガムに本質的に等価な、高温での粘度を保持する。図９の中で報告された粘度を 、同心円筒粘度計内で、５０００ｐｐｍ　ＮａＣｌブライン中に１１０００ｐｐ 活性ポリマー固形物を含む溶液上で、８ｓ−Ｉの剪断速度で記録した。

乳す 本例は、水溶液のための増粘剤としての使用のための、遺伝子修飾されたキサン トモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒ印）に より生産された非アセチル化キサンタンの利点を説明する。

図１Ｏは、化学的に脱アセチル化された商業的キサンタン及びその親化合物の粘 度と、遺伝子操作されたキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ ａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）　（株Ｘ１００６）から作られた非アセチル化キ サンタン多糖類の及び野性型キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅ ｓｔｒｉｓ）の親（株Ｘ２３７）から作られたキサンタンの粘度とを比較してい る。この粘度を、５０．０００ｐｐｍ　ＮａＣｌブライン中の１１０００ｐｐの ポリマー濃度について８ｓ−１の剪断速度で得た。粘度を２５°Ｃ〜約８０℃の 温度範囲にわたり測定した。

図１０は、キサンタンの化学的脱アセチル化が前温度範囲にわたり増粘力の減少 を生じさせることを示した。しがしながら、遺伝子手段によるアセチル化の取り 除きは、その野性型のキサンタン・ガムと比べて、実質的に増加した粘度を作り 出している。従って、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）の突然変異体株により生産された非アセチル化キサンタン・ガムは、キサ ンタン・ガムそれ自体に比較して、そして化学的方法により作られた脱アセチル 化キサンタン・ガムに比較して、改良された多糖類である。

例１４ 本例は、非アセチル化、非ビルビル化キサンタンを生産するキサントモナス・カ ンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の２重突然変異体株を構築するため に使用した方法について記載する。

Ｃａｐａｇｅ他は、キサンタン・ガムの生合成に向けられている遺伝子を含む、 キサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）からの遺伝子ク ラスターのクローニングについて記載している。それらは、この遺伝子クラスタ ー〇全体又は様々な部分を取り除かれた、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ 、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）内の染色体の欠失突然変異についても記載している。

このような１つの欠失突然変異体株２１２３１は、組み替えプラスミドｐＲＫ２ ９０−Ｈ３３６上で担持されたキサントモナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐ ｅｓｔｒｉｓ）　ＤＮＡの全てを欠いている。従って、株Ｘ１２３１は、キサン タンを合成しない。ｐＲＫ２９０−Ｈ２ＳＯが株ＸＩ２３１に伝達されたとき、 キサンタンを合成する能力が回復する。Ｃａｐａｇｅ他は、単離の方法及びｐＲ Ｋ２９０−８３３６上に担持されたクローン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポ ゾンＴｎＫＩ２の挿入突然変異の特徴付けについても記載している。２つのこの ような突然変異体プラスミドは、ｐＲＫ２９０−Ｈ２ＳＯ，２２及びｐＲＫ２９ ０−８３３６．４１である。これらのプラスミドのそれぞれの上の上記Ｔｎ１２ 挿入物の大体の位置を、図１１の中に示す。ｐＲＫ２９０−Ｈ２ＳＯ，２２がＸ １２３１に伝達されたとき、得られた株は、非アセチル化キサンタンを生産する 。ｐＲＫ２９０−Ｈ２ＳＯ，４１がＸＩ２３１に伝達されたとき、非ピルビル化 キサンタンが生産される。これらの２つのプラスミドの突然変異体は、上記欠失 株Ｘ１２３１内で担持されたとき非アセチル化、非ピルビル化キサンタンの合成 に向けられる２重突然変異体プラスミドを、インビトロにおける組み替え上の手 段により、構築するために使用されてきた。

非アセチル化、非ビルビル化２重突然変異体プラスミドを作るためのインビトロ における戦略は以下のようなものである。ｐＲＫ２９０−Ｈ２ＳＯ、４１のカナ マイシン感受性（Ｋａｎ’　）誘導体を、そのプラスミドの部分的Ｈｉｎｄｌｌ ｌ処理を行うことにより作り、非常に低いＤＮＡ濃度でこの処理生成物を連結し く分子間連結を促進するため）、そして次に、カナマイシン感受性についてテト ラサイクリン耐性（Ｔｅｔ’　）組み替え細胞をスクリーニングする。次に、プ ラスミドＤＮＡを、Ｔｅｔ’、Ｋａｎ“単離物から調製し、そして制限エンドヌ クレアーゼ処理及びアガロースゲル電気泳動により分析する。ｐＲＫ２９０−Ｈ ２ＳＯ，４１内にはただ３つのみのＨｉｎｄｌｌ［部位があり、そしてそれたの ２つは、ＴｎＫ１２内に生じており、そして上記Ｋａｎ遺伝子を括っている。従 って、この部分的処理内で作られた高い割合の欠失は、上記にａｎ遺伝子につい て欠失てあり、一方、上記プラスミドの残りは無傷で保持されている。上記のＫ ａｎ“プラスミドは、上記のケタシーセ遺伝子内に挿入物（ｌｋｂ）をまだ担持 しており、そしてそれ故、非ビルビル化ガムを産生ずることが期待される。この プラスミドは、ｐ４１Ｋｓと名付けられた。この次の段階は、上記の非アセチル 化突然変異体プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ２ＳＯ，２２（７）大８すＳｐｅ　［ ７ラグメントをｐ４１Ｋｓ　ｉ、：　クローニングすることである。図１１中に 示すように、それぞれのプラスミドは、Ｃａｐａｇｅ他のＤＮＡ配列内の位置７ ５８．７７１　、及び比７１６に３つのＳｐｅ　［部位を含む。この１０．９ｋ ｂのＳｐｅ　［フラグメントは、ｐＲＫ２９０虹］フラグメントは、キサントモ ナス・カンペストリス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の増殖及びキサンタンの生 産のために必須でないｔＲＮＡ遺伝子内に完全に横たわっている。従って、上記 の２重突然変異体の構築の過程におけるこの小さなＳｐｅ　Ｉセグメントの欠失 は、キサンタンの生合成に影響を及ぼすべきではない。プラスミドｐ４１Ｋｓ及 びｐＲＫ２■により、１０ｘモル過剰で、連結した。従って、Ｈ２Ｓｅ、　２２ のＫａｎ　’Ｓｐｅ　Ｉフラグメントを含む組み替え細胞ガ選択されたとき、そ れらは、ｐ４１ＫｓのＳｐｅ　Ｉベクター・フラグメントと最も頻繁に一緒にな るはずである。我々は、これらの連結による組み替えを行い、そしてＫａｎ　’ 組み替え細胞を得た。これらの組み替え細胞により担持されたプラスミドを、問 題の組み替え細胞を同定するために分析した。

所望の組み替え細胞プラスミドは、Ｋａｎ　’組み替え細胞の中から容易に同定 された。ｐ４１ＫＳ２２と名付けられた、この組み替えプラスミドは、そのケタ ラーゼ遺伝子内に９４１Ｋｓから生じた挿入物を含み、そしてそのアセチラーゼ 遺伝子内に８３３６．２２から生じたＴｎＫ１２挿入物を含む。好適な制限酵素 処理分析は、両方の挿入突然変異の存在を確認させ、そしてさらに、ＴｎＫ１２ 突然変異を含むＳｐｅ　Ｉフラグメントが正しい方向で挿入されたことを示した 。

次に、プラスミドｐ４１Ｋｓ２２を、接合を介してキサントモナス・カンペスト リス（Ｘ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株に伝達した。大きなＧｕｍ−欠失株Ｘ１２ ３１は、上記の受容体の中にあった。この欠失は、ｐ４１Ｋｓ２２上で担持され た全てのガム遺伝子ＤＮＡを欠いており：それ故、Ｘ１２３１担持ｐ４１Ｋｓ２ ２は、非アセチル化、非ビルビル化キサンタンを生産するはずである。このプラ スミドは、効率良＜　Ｘ１２３１に伝達し、そして得られた表現型は、明らかに 粘液上軸ｕｃｏｉｄ）であるが１、野性型対照よりも有意に少なかった。Ｘ１２ ３１担持ｐ４１ＫＳ２２により生産された多糖類を、調製し、そして分析した。

このポリマーは、グルコース、マンノース、そしてグルクロン酸を含んだが、検 出できるアセテート又はピルベートは全く含んでおらず、これにより、Ｘ１２３ １（ｐ４１Ｋｓ２２）が期待された非アセチル化、非ビルビル化ガムを生産する ことが証明された。

例１５ 本例は、アセチラーゼ突然変異とトランスフェラーゼＩ■突然変異とを組合わせ る２重突然変異体プラスミドの構築及び性質について記載する。

Ｃａｐａｇｅ他は、プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６により担持されたクロー ン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎに１２挿入物の単離方法及び特徴 付けについて記載した。このような挿入物を担持する１つの突然変異体プラスミ ドは、ｐＲＫ２９０−Ｈ２Ｓｅ、　６である。このプラスミド内のＴｎＫ１２挿 入物の好適な位置を、図１１中に示す。上記の欠失株Ｘ１２３１内に存在すると き、このプラスミドは、トランスフェラーゼＩｖの上記挿入の不活性化の結果と してのポリトリマー・ガムの合成に向けられる。例１４中に記載したものと類似 の手順を使用して、プラスミドｐＲに２９０−Ｈ２Ｓｅ、　２２内で担持された 、このトランスフェラーゼＩｖ欠損突然変異と上記アセチラーゼ突然変異とを組 合わせる２重突然変異体プラスミドを、構築した。ｐＲＫ２９０−８３３６．６ のカナマイシン感受性誘導体を、ＴｎＫ１２の旧ｎｄ［Ｉｒフラグメントの欠失 により得た。このプラスミド、９６ＫＳは、Ｋａｎ　’　プラスミド４１ＫＳに 似ており、そして未だ、そのトランスフェラーゼ１■遺伝子内にｌｋｂのＴｎＫ １２挿入物をミドＤＮＡに連結し、そして２重突然変異体プラスミド９６ＫＳ２ ２を得た。

このプラスミドは、トランスフェラーゼＩＶ及び上記アセチラーゼ内に挿入突然 変異を担持している。欠失株Ｘ１２３１に伝達されたとき、それは、非アセチル 化ポリトリマー上の合成に向けられるべきである。しかしながら、いくつかの独 立したプラスミド伝達実験において、９６ＫＳ２２の株Ｘ１２３１への伝達は全 く検出されなかった。但し、このプラスミドは、Ｇｕｍ−及びＧｕｍ＋株を含む 、他の受容体に高い頻度で首尾よく伝達された。この結果は、株Ｘ１２３１内の ｐ６ＫＳ２２の存在が、おそらく、非アセチル化ポリトリマー・ガムの生産の直 接的な結果として致死的であることを示唆している。Ｃａｐａｇｅ他は、上記ガ ム遺伝子クラスター内の３つの他の致死突然変異について記載しており、そして これらの致死突然変異がキサンタン生合成における毒性中間体の蓄積を引き起こ すと結論付けた。非アセチル化ポリトリマーの蓄積は、この多糖類が、正常にキ サンタンを分泌するその輸送系により分泌されることができない場合に、潜在的 に毒性であり得るであろう。

当業者にとって、本発明の方法及び製品において、様々な変更及び変化を行い得 ることは明らかであろう。従って、本発明が、添付した請求項の範囲及びそれら の等価な範囲の中で行われる、本発明の変更及び変化を覆っていることが意図さ れている。

図の標題： 図９　粘度の比較　野性型ガム及び非ビルビル化ガム図１Ｏ粘度の比較　非アセ チル化ガム対脱アセチル化ガムＦＩＧ、　６ａ ＦＩＧ、　６ｅ ＦＩＧ、　６ｇ　ＦＩＧ、　６ｈ ＦＩＧ、　８ ０　Ｑ）　Ｃｏ　ＷへＣ）　（Ｃ１＋５　？　（’Ｊ　０　Ｑ）　Ｃｏ　？　Ｃ ％Ｊ　Ｃ１Ωへ〜〜〜〜−一一一一 国際調査報告　。１エフ、Ｋ　Ｑ２／ｎ１ＡＡＩフロントページの続き （７２）発明者　マーレリ、ジョン　ディー。

アメリカ合衆国、テキサス　７７００９．ヒユーストン、リーガン　３７０９ （７２）発明者　バンダースライス、レベッカ　ダブリュ。

アメリカ合衆国、コロラド　８０３０３．ボールダー、タントラ　パーク　サー クル （７２）発明者　ハスシー、ランダール　ニー。

アメリカ合衆国、コロラド　８００２６．ラフエイエツト、ミロ　サークル　１ ０２０−ピー

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．約２：２：１の、Ｄ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比 をもつ反復ペンタマー単位を含んで成る水溶性多糖類ポリマーであって、そのＤ −グルコース部分がベータ−［１，４］配置で結合されており、内側のマンノー ス部分がアルファ−［１，３］配置で主に一方のグルコース部分に結合されてお り、そのＤ−グルクロン酸部分がベータ−［１，２］配置で上記の内側のマンノ ース部分に結合されており、そして外側のマンノース部分が上記のグルクロン酸 部分にベータ−［１，４］配置で結合されているもの。
2. ２．上記の内側のマンノース部分がアセチル化されている、請求項１の多糖類ポ リマー。
3. ３．上記の外側のマンノース部分がアセチル化されている、請求項２の多糖類ポ リマー。
4. ４．上記の外側のマンノース部分の一部がピルビル化されており、そしてその残 りの部分がアセチル化されている、請求項１の多糖類ポリマー。
5. ５．上記の外側のマンノース部分の実質的に全てがピルビル化されている、請求 項２の多糖類ポリマー。
6. ６．上記の外側のマンノース部分の一部がピルビル化されている、請求項１の多 糖類ポリマー。
7. ７．上記の外側のマンノース部分がアセチル化されている、請求項１の多糖類ポ リマー。
8. ８．約２：１：１の、Ｄ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比 をもつ反復テトラマー単位を含んで成る水溶性多糖類ポリマーであって、（１） そのＤ−グルコース部分がベータ−［１，４］配置で結合されており、（２）そ の６−０位でアセチル化されているか又はアセチル化されていないマンノース部 分がアルファ−［１，３］配置で主に一方のグルコース部分に結合されており、 そして（３）そのＤ−グルクロン酸部分がベータ−［１，３］配置で上記マンノ ース部分に結合されているもの。
9. ９．上記の多糖類ポリマーのマンノース部分がその６−０位でアセチル化されて いる、請求項８の多糖類ポリマー。
10. １０．上記の多糖類ポリマーのマンノース部分がその６−０位でアセチル化され ていない、請求項８の多糖類ポリマー。
11. １１．上記の多糖類ポリマーのマンノース部分少なくとも９０％がその６−０位 でアセチル化されている、請求項８の多糖類ポリマー。
12. １２．内側のマンノースにおいて非アセチル化されており、そして外側のマンノ ースにおいて非アセチル化且つ非ピルビル化されている、請求項１の多糖類ポリ マーを合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微 生物を、好適な生育培地に接種し、そして請求項１の多糖類ポリマーを生産する のに十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の接種さ れた生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項１の多糖類ポリマ ーの製造方法。
13. １３．内側のマンノースにおいてアセチル化されており、そして外側のマンノー スにおいて非アセチル化且つ非ピルビル化されている、請求項２の多糖類ポリマ ーを合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生 物を、好適な生育培地に接種し、そして請求項２の多糖類ポリマーを生産するの に十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の接種され た生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項２の多糖類ポリマー の製造方法。
14. １４．内側のマンノースにおいてアセチル化されており、そして外側のマンノー スにおいてアセチル化且つ非ピルビル化されている、請求項３の多糖類ポリマー を合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物 を、好適な生育培地に接種し、そして請求項３の多糖類ポリマーを生産するのに 十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の接種された 生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項３の多糖類ポリマーの 製造方法。
15. １５．内側のマンノースにおいて非アセチル化されており、そして外側のマンノ ースにおいてアセチル化且つピルビル化されている、請求項４の多糖類ポリマー を合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物 を、好適な生育培地に接種し、そして請求項４の多糖類ポリマーを生産するのに 十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の接種された 生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項４の多糖類ポリマーの 製造方法。
16. １６．内側のマンノースにおいてアセチル化されており、そして外側のマンノー スにおいてピルビル化されているがアセチル化されていない、請求項５の多糖類 ポリマーを合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属 の微生物を、好適な生育培地に接種し、そして請求項５の多糖類ポリマーを生産 するのに十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の接 種された生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項５の多糖類ポ リマーの製造方法。
17. １７．内側のマンノースにおいて非アセチル化されており、そして外側のマンノ ースにおいてピルビル化されているがアセチル化されていない、請求項６の多糖 類ポリマーを合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ） 属の微生物を、好適な生育培地に接種し、そして請求項６の多糖類ポリマーを生 産するのに十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の 接種された生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項６の多糖類 ポリマーの製造方法。
18. １８．内側のマンノースにおいて非アセチル化されており、そして外側のマンノ ースにおいてアセチル化されているがピルピル化されていない、請求項７の多糖 類ポリマーを合成することができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ） 属の微生物を、好適な生育培地に接種し、そして請求項７の多糖類ポリマーを生 産するのに十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の 接種された生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項７の多糖類 ポリマーの製造方法。
19. １９．請求項８のポリテトラマー・ガムを合成することができるキサントモナス （Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物を、好適な生育培地に接種し、そして約 ２：１：１の、Ｄ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比をもつ 多糖類ポリマーを生産するために、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記 の接種された生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項８の多糖 類ポリマーの製造方法。
20. ２０．上記の多糖類ポリマーが上記の生育培地から、沈殿又は限外濾過により、 回収される、請求項１９の方法。
21. ２１．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の種である、請求項１９の方法。
22. ２２．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓｃａｍｐｅｓｔｒｌｓ）のトラノスフェラーゼＶの欠損突然変異体である、請 求項１９の方法。
23. ２３．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓｃａｍｐｅｓｔｎｓ）のトラノスフェラーゼＶ及びアセチラーゼの欠損突然変 異体である、請求項１９の方法。
24. ２４．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のトランスフェラーゼＶ及びアセチル・コエンザイ ムＡの欠損突然変異体である、請求項１９の方法。
25. ２５．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉＳ）のホスホエノールピルベートの欠損突然変異体であ る、請求項１９の方法。
26. ２６．請求項１１のポリテトラマー・ガムを合成することができるキサントモナ ス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物により、好適な生育培地を接種し、そ して約２：１：１の、Ｄ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比 をもつ多糖類ポリマーであって、アセチル化されていないものを生産するために 、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で、上記の接種された生育培地をインキュ ベートすることを含んで成る、請求項１１の多糖類ポリマーの製造方法。
27. ２７．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｐｅｓｔｒｉＳ）のカタラーゼ、アセチラーゼＩ、及びアセチラーゼＩ Ｉの欠損突然変異体である、請求項１２の方法。
28. ２８．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉＳ）のケタラーゼ及びアセチラーゼＩＩの欠損突然変異 体である、請求項１３の方法。
29. ２９．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のケタラーゼの欠損突然変異体である、請求項１４ の方法。
30. ３０．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉＳ）のアセチラーゼＩの欠損突然変異体である、請求項 １５の方法。
31. ３１．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のアセチラーゼＩＩの欠損突然変異体である、請求 項１６の方法。
32. ３２．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のアセチラーゼＩ及びアセチラーゼＩＩの欠損突然 変異体である、請求項１７の方法。
33. ３３．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉＳ）のアセチラーゼＩ及びカタラーゼの欠損突然変異体 である、請求項１８の方法。
34. ３４．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉＳ）のアセチラーゼの欠損突然変異体である、請求項２ ６の方法。
35. ３５．上記の徴生物がＡＴｃｃ番号５３４７３、すなわち、キサントモナス・カ ンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のアセチラー ゼの欠損突然変異体（Ｘ１００６）である、請求項２６の方法。
36. ３６．染色体の欠失突然変異を含み、そして内側のマンノースにおいて非アセチ ル化されており且つ外側のマンノースにおいて非アセチル化されている請求項１ の多糖類ポリマーを合成することができる、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏ ｎａｓ）属の微生物を、好適な生育培地に接種し、そして請求項１の多糖類ポリ マーを生産するのに十分な時間にわたり、好適な温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度で 、上記の接種された生育培地をインキュベートすることを含んで成る、請求項１ の多糖類ポリマーの製造方法。
37. ３７．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の種である、請求項３６の方法。
38. ３８．上記の微生物がアセチラーゼＩ及びＩＩの染色体の欠失突然変異を含む、 請求項３６の方法。
39. ３９．上記の微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のアセチラーゼＩ及びＩＩの染色体の欠失突然変異 体（Ｘ１９１０）である、請求項３６の方法。