JPH06506471A - 繊維症阻害法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 繊維症阻害法 本発明は国立衛生研究所からの許可１ｂ５Ｒ３７ＡＲ１７１２８及び５ＲＯＩ　 ＡＲ２８３０４の下で政府支援によりなされた。政府は本発明に対して特定の権 利を有する。

発明の分野 本発明は繊維症を阻害し治療か必要な患者の繊維異常と戦う方法及び組成物に関 する。

繊維芽細胞はコラーゲシ合成のための細胞の主な型である。

コラーゲンは皮膚の真皮及び他の結合組織中に見い出される細胞マトリックスの 完全な状態を維持するための本質的な繊維状タンパク質である。コラーゲンの生 成は精緻に規制された方法であり、その異常は組織繊維症の発生・＼と至り得る 。繊維状組織の形成は損傷後の治疹の正常な有益な工程の一部である。しかしな がら、ある場合には、繊維性材料の異常な蓄積が生じ、影響のある組織の正常な 機能を妨害する。繊維芽細胞の活性を刺激するのか自然的か誘発的かの繊維化条 件の発生か中心となる。肝臓の肝硬変及び肺の繊維症のような多くの一般的な衰 弱を伴う患者は繊維状組織の増殖を含み、強皮症、ケロイド及び肥厚性令痕のよ うな特定の皮膚疾患も同様である。

盛んな繊維芽細胞の増殖及び／又はコラーゲンの生成によりもたらされる細胞外 マトリックスのコラーゲンの過剰な蓄積は皮膚を含む多くの組織の繊維症におけ る主な生化学的異常である。コラーゲンの異常な蓄積を制画する試みは、コラー ゲン生合成の翻訳及び翻訳後反応の幾つかの阻害剤に対するものであるか、これ らの治療価値は特定の望ましくない特性により制限される。即ち、細胞膜を通る 透過性か低いこと、活性か非特異的なこと、又は毒性があることである。従って 、新しい抗繊維主剤に対する要請が引続き存在する。

発明の要約 我々はヒドラジン誘導体、即ち安息香酸ヒドラジドを同定した。これは従来の抗 繊維主剤における固有の制限かないと思われ、コラーゲンの生成量を更に減少さ せる培養においてコラーゲンの合成及び繊維芽細胞の増殖を抑える能力を有する 強力な抗繊維主剤となる可能性を提供する。従って、本発明は繊維化異常の患者 に繊維症阻害法を提供する。この方法は次の化学式（Ｉ）式で表わされる化合物 又は薬学上許容されるこれらの塩を繊維症阻害に有効な量、患者に服用すること を含んでなる。

（Ｒ）。−−Ｃ０ＮＨＮ　（Ｒ’）２（Ｉ　）式中、ｎは１又は２、好ましくは ！であり、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ヒドロキシ、アミン及びニトロから なる群から選択され、Ｒ′は水素及びＣ１−Ｃ４アルキル、好ましくは水素から なる群から選択される。

本発明の第２の知見は薬学的に許容なキャリヤ中に有効に繊維症と戦う量にて、 上記化学式（Ｉ）に対応した化合物、又は薬学的に許容されるそれらの塩を含む 薬学的な調合物である。

本発明の第３の知見は、繊維化異常と戦う医薬の製造のために、上記化学式（１ ）の化合物又は薬学的に許容されるそれらの塩を使用することである。

図面の簡単な説明 図１は安息香酸ヒドラジド（ＢＨ）のコラーゲン合成阻害の時間経過を表わす。

時（ＨＲ）でしめされた安息香酸ヒドラジド処理の期間を横軸に示し、コラーゲ ン合成のパーセントを縦軸に示す。

図２は安息香酸ヒドラジドのコラーゲン合成阻害の投与応答性を示す。ミリモル （ｍＭ）で示された安息香酸ヒドラジド濃度を横軸に示し、ｃｐｍの１０”倍で 示された取り込まれた［３Ｈ１プロリンの量を縦軸に示す。

図３は左から右に、コントロール、安息香酸ヒドラジド、アスコルビン酸塩、ア スコルビン酸塩プラス安息香酸ヒドラジドで処理した培養物中のプロコラーゲン 及びフィブロネクチンのｍＲＮＡレベルの安息香酸ヒドラジド効果を示す。ｍＲ ＮＡレベル（被処理／コントロール）を縦軸に示す。プロコラーゲンレベルを０ 柱で及びフィブロネクチンレベルを黒柱で示す。

図４は安息香酸ヒドラジドの繊維芽細胞阻害の投与応答性を示す。マイクロモル （８Ｍ）で示された安息香酸ヒドラジド濃度を横軸に示し、皿当り１０−”倍の 細胞数を縦軸に示す。

発明の詳細な説明 上記式（Ｉ）で説明した化合物は、限定はされないが、安息香酸ヒドラジド、２ −二トロ安息香酸ヒドラジド、２−アミノ安息香酸ヒドラジド、４−ニトロ安息 香酸ヒドラジド、４−アミノ安息香酸ヒドラジド、４−ヒドロキシ安息香酸ヒド ラジド、３−ニトロ安息香酸ヒドラジド、３−アミノ安息香酸ヒドラジド、３− ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド、３．５−ジヒドロキシ安息香酸ヒドラジド、　 ２．４−ジアミノ安息香酸ヒドラジド、３．４−ジアミノ安息香酸ヒドラジド、 及び３．４−ジニトロ安息香酸ヒドラジドを含む。普通は安息香酸ヒドラジド（ Ｃ＊ＨｉＣＯＮＨＮＨ２）が好ましい。このような化合物は当業者に既知の手順 で調製できる。「アルキル」の言葉は本明細書中では、メチル、エチル、プロピ ル、ブチルを意味する。化学式（Ｉ）の化合物の環上の互いに隣あったジヒドロ キシ置換体（例えば３位及び４位におけるヒドロキシ置換体のようなオルトジヒ ドロキシ）又はカルボニル基の隣のモノヒドロキシ置換体（例えば、２位におけ るヒドロキシ）は結果的に金属キレート化剤となり、従って余り好ましくない。

本発明の方法により処理される患者は、限定されないが、真皮繊維化異常を患っ ている患者、内部器官の繊維症を患っている患者、及び目の繊維化状態を患って いる患者を含む。

真皮繊維化異常は、限定されないが、強皮症、モルフエア（ｍｏｒｐｈｅａ）　 、ケロイド、肥厚性廠痕、家族性皮膚コラゲノーマ、及びコラーゲン型の結合組 織母斑を含む。このような異常は好ましくは化学式（Ｉ）の化合物を局部的に投 与することにより治療する。

内部器官（例えば、肝臓、肺、腎臓、心臓血管、胃腸）の繊維症は肺の繊維病、 肝硬変及び傷あと形成のような異常を起こす。このような異常は好ましくは注射 で又は経口で化学式（１）の化合物を投与して治療する。

目の繊維化状態は糖尿病性網膜症、手術後の傷あと（例えば、緑内障フィルタリ ング手術後及び斜視の手術後）、及び増殖性ガラス網膜症（ｖｉｔｒｅｏｒｅｔ ｉｎｏｐａｔｈｔｙ）のような条態を含み、これらは化学式（Ｉ）の化合物を含 む目の調合物を目に局部的に適用して治療できる。

本発明の方法により治療した患者は人及び動物（例えば、犬、猫、牛、馬）の患 者を含む。

化学式（Ｉ）の化合物は１日当り合計で、約５０■／ｋｇ体重以下、好ましくは 約２５■／ｋｇ以下及び最も好ましくは約ｌθ■／ｋｇ以下投与可能である。最 少投与量に関しては、化学式（１）の化合物は好ましくは１日当り合計で、少な くとも約０．０１■／ｋｇ、より好ましくは少なくとも約０．１■／　ｋｇ、最 も好ましくは少なくとも約１■／ｋｇ投与される。化合物は１日に１回又は数回 投与される。局部的投与のための調合物として調製した場合、形態は活性成分を 約０．１重量％〜約ｌＯ重量％含み得る。

上記の通り、化学式（Ｉ）の化合物はそれ自体又は薬学的に許容される塩の形で 投与され得る。このように薬学的に許容される塩は、限定されないか、以下の酸 から調製される化合物を含む。塩酸、臭酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、 酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホ ン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸及びベンゼンス ルホン酸である。又、薬学的に許容される塩はナトリウム、カリウム、又はカル シウム塩のようなアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として調製され得る。

又、本発明は動物用及び人間用医薬の両方に薬学的な形態で提供され、化学式（ Ｉ）の化合物と共に１又はそれ以上の薬学的に許容されるキャリヤ（及び任意的 に他の治療的成分）を含む。キャリヤは調合物の他の成分と共存できる意味で薬 学的に許容できなければいけないし、それらの受取側に害かあってはいけない。

本発明の調合物は、局部的、眼科的、注射的（皮下、筋肉中、静脈中の注射を含 む）、経口的、鼻腔的、直腸的投与に適したものを含む、局部及び注射投与に適 した調合物が好ましい。

調合物は単位投薬の形態が便利であり、既知の調剤方法で調製できる。すべての 方法は、活性化合物をキャリヤに混合する段階を含み、キャリヤはｌ又はそれ以 上の付属の成分を組成する。一般に、調合物は活性化合物を液体キャリヤ、微細 化した固体キャリヤ又はその両方に一様に均質に溶解して調製し、必要なら生成 品を所望の形にする。

局部的調合物は局部的、薬学的調合物に使用される鉱油、石油、ポリヒドロキシ アルコール又は他の基剤のような１又はそれ以上の媒体中に溶解又は懸濁された 活性化合物を含む。又他の付属の成分の転化も望ましい。

注射投与に適した調合物は、好ましくは受取側の患者の血液と等張である、無菌 の発熱物質のない水又は塩分を含む溶液のような、活性化合物の無菌の水性の調 製を含む。

眼科の調合物は防腐剤及び等張剤を有する化学式（Ｉ）の化合物の純粋な水性溶 液を含む。好ましくは調合物のｐＨ及び浸透圧の因子を目の値に調整する。

経口投与に適した本発明の調合物はカプセル、カシェ−、タブレット又はドロッ プのような別々の単位として形成でき、各々は、シロップ、甘味の内用液（ｅｌ ｉｘｉｒ）、乳懸液又はつぎ出しくｄｒａｕｇｈｔ）のような水性アルコール又 は非水性液体中の懸濁、粉末又は顆粒として、化学式（Ｉ）の化合物の所定量を 含む。

タブレットは任意的に１又はそれ以上の付属の成分を含んで圧縮又は成型により 作られる。圧縮タブレットは任意に結合剤、錠剤分解物質、潤滑剤、不活性希釈 剤、表面活性剤又は分散剤と混合した粉末又は顆粒のような流動しない形態の活 性化合物を用いて、適当な機械中で圧縮して調製できる。成型タブレットは適当 なキャリヤと共に粉末化した活性化合物の混合物からなり、適当な機械中で成型 して作る。

シロップは、例えばスクロールのような糖の濃縮水性溶液に活性化合物を転化し て作られ、又これに付属の成分を添加してもよい。このような付属の成分は香料 、適当な防腐剤、糖の結晶化遅延剤、及び例えばグリセロール又はソルビトール 等の多価アルコールのような他の成分の溶解性を増加させる薬剤を含み得る。

鼻腔スプレー調合物は防腐剤及び等張剤を有する活性化合物の純粋な水性溶液か らなる。このような調合物は好ましくは鼻腔粘膜に合ったｐＨ及び浸透圧に調整 される。

直腸投与の調合物はココアバター、硬化脂肪、又は硬化脂肪酸のカルボン酸のよ うな適当なキャリヤで座薬として形成できる。

前述の成分に加えて、更に本発明の調合物は希釈剤、緩衝剤、香料、結合剤、錠 剤分解物質、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、防腐剤（酸化防止剤を含む）等から 選択したＩ又はそれ以上の付属の成分を含む。

以下の例により本発明を説明するか、これらに限定されるものではない。実施例 中、ｍｍはミリメートル、ＳＰは標準偏差を、μＭはマイクロモルを、ｃｐｍは カウント７分を、Ｍはモルを表わし、温度は摂氏で示した。

実施例１ ３５ｍｍ皿中の集密な成長した培養物を７２時間、０．５％の透析した牛血溝を 補充した培地中で培養した。培養物は７２時間の全期間中に１ｍＭの供試化合物 を受容した。培養物を最後の６時間に、１ｍｌの培地中に２０μｃｉのＬ−［２ ，３−″Ｈ１プロリンでラベル化した。培地と結合した細胞中のコラーゲンに取 り入れられた放射能量を、細菌コラゲナーゼて消化後に測定し、コラーゲン中の 相対的なプロリンの量に対して補正して、全コラーゲンと非コラーゲンタンパク 質に取り込まれた放射能の％として表わした。データを下記の表１に示す。他の 供試化合物に比べて安息香酸ヒドラジドか特別に高活性を示すことに注目すべき コラーゲン合成における安息香酸ヒドラジドを含む種々の化合物の効果 ａニア２時間、１ｍＭ ｂ１重複して分析した２つの培養物中、ＳＤは１４０６以内てあった。

実施例２ 安息香酸ヒドラジドのコラーゲン合成阻害の時間経過本実施例は、培養物か、培 養の全７２時間、最後の４８時間、２４時間、６時間又は０時間に、１ｍＭ安息 香酸ヒドラジドの固定投与量を受容した以外は、上記実施例１と本質的に同様に 実施した。データは図１に示す。コラーゲン合成における安息香酸ヒトランドに よる効果は時間に依存することに注目すべき安息香酸ヒドラジドのコラーゲン合 成阻害に対する投与応答性 本実施例は、培養物を固定した７２時間、安息香酸ヒドラジドの濃度を０．００ 〜１．００ｍＭの範囲て変えて培養した以外は、上記実施例１と本質的に同様に して実施した。データを図２に示す。

非コラーゲンタンパク質における効果かなくコラーゲン合成における安息香酸ヒ ドラジドによる効果は投与量に依存していることに注目すべきである。

実施例４ プロコラーゲン分泌における安息香酸ヒドラジドの効果本実施例は、細胞を１ｍ Ｍの安息香酸ヒ１〜ラジド、１００μＭのアスコンビン酸塩を用いて、共に７２ 時間培養した以外は上記実施例１と本質的に同様に実施された。データを下記の 表２に示す。プロコラーゲンの分泌か安息香酸ヒドラジドにより減少することに 注目すべきである。

表２ プロコラーゲン分泌における安息香酸ヒドラジドの効果ａニア２時間 ｂ：１ｍＭ ｃ　：　１００μＭ ｄ：培地中のコラーゲン中の放射能対培地及び細胞層中のコラーゲン中の放射能 の比の１００倍として表示実施例５ プロリル　ヒドロキシル化における安息香酸ヒドラジドの効果集密な培養物を７ ２時間、１ｍＭの安息香酸ヒドラジドで処理し、最後の２４時間に培地１ｍｌ当 り１２．５μＣｉのＬ−［２，３−’Ｈ１−プロリンでラベル化した。培地及び 細胞からコラーゲンのタンノくり質を分離して抽出し、ジチオトレイトール（Ｄ ＴＴ）で還元し、４〜１５％のナトリウムドデシルスルホン酸−ポリアクリルア ミドゲルで電気泳動的に分析した。２つの分画からのｐｒｏα１（Ｉ）及びｐｒ ｏα２（Ｉ）鎖に対応したバンドをプールして６ＭのＨＣＩで２４時間１１０℃ で加水分解した。ヒドロリサート（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）中のプロリン及び ヒドロキシプロリンを高性能液体クロマトグラフィで分離して液体シンチレーシ ョンカウンターで定量した。

データを下記の表３に示す。安息香酸ヒドラジド処理した繊維芽細胞によるプロ コラーゲン合或はブロリ、ンに比べてヒドロキシプロリン中で少ないことに注目 ずべきである。

表　３ プロコラーゲン中のプロリン残基のヒドロキシル化における安息香酸ヒドラジド の効果 ａニア２時間 ｂ：ＩｍＭ ｃ　：　１００μＭ ｄ：ヒドロキシプロリン対ツドロシキブロリン及びプロリン中の放射能の比の１ ００倍として表示実施例６ プロコラーゲン及びフィブロネクチンのｍＲＮＡレベルの安息香酸ヒドラジドの 効果 上記のようにして処理された培養物がら単離した全ＲＮＡをノザン　プロット　 ハイプリダイセーションにより［”ＰＩ−ラベル化フィブロネクチン及びｐｒｏ α１（［）コラーゲンｃＤＮＡに対して分析した。フィブロネクチン及びｐｒｏ α１（１）コラーゲンｍＲＮＡに対応し、たプロットをオートラジオグラフィで 可視化し、デンシトメータ走査で定量した。データを図３に示す。安息香酸ヒド ラジドによるコラーゲン合成阻害がプロコラーゲンのｍＲＮＡレベルにおいて特 異的な還元と関連していることに注目すべきである。

ヒトの皮膚の繊維芽細胞（１００，０００細胞）の培養物を２０％牛血清で補充 したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良イーグル培地を含む６０ｍｍの皿に入れた。培養物を ３７°Ｃ，５％ＣＯ□／９５％空気の湿った大気中にて培養した。ブレーティン グ後１日で培養物を０．００〜１００μＭ安息香酸ヒドラジドて処理した。ブレ ーティング後７日で、細胞をトリプシン処理によりハーベストし、細胞懸濁液の アリコートをクールターカウンターで計数し、細胞数を決定した。データを図４ に示す。安息香酸ヒドラジドによる繊維芽細胞増殖における投与量依存効果に注 目すべきである。

前述の例は本発明を説明するが、これに制限されるものではない。本発明は以下 の請求の範囲により明確にされる。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年ｌＯ月１　日

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．化学式（Ｉ） （Ｒ）■■ｎＣＯＮＨＮ（Ｒ′）２（Ｉ）（式中、ｎは１又は２を示し、Ｒは水 素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ヒドロキシ、アミノ及びニトロからなる群から選択さ れ、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルからなる群から選択されてなる。） で表わされる化合物又はそれらの薬学上許容される塩を繊維症阻害に有効な量、 患者に投与することを含んでなる、繊維化異常を患う患者における繊維症阻害法 。
2. ２．ｎは１である請求項１記載の方法。
3. ３．Ｒ′は水素である請求項１記載の方法。
4. ４．前記化合物が、２−ニトロ安息香酸ヒドラジド、４−ニトロ安息香酸ヒドラ ジド、４−アミノ安息香酸ヒドラジド、４−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド及び 安息香酸ヒドラジドからなる群より選択される請求項１記載の方法。
5. ５．前記患者が真皮繊維化異常を患っている請求項１記載の方法。
6. ６．前記患者か内部器官の繊維症を患っている請求項１記載の方法。
7. ７．前記患者が目の繊維状態を患っている請求項１記載の方法。
8. ８．前記化合物を局部的に投与する請求項１記載の方法。
9. ９．前記化合物を注射で投与する請求項１記載の方法。
10. １０．安息香酸ヒドラジドを戦記症阻害に有効な量、患者に投与することを含ん でなる、繊維化異常を患う患者における繊維症阻害法。
11. １１．前記患者が真皮繊維化異常を患っている請求項１０記載の方法。
12. １２．前記患者が内部器官の繊維症を患っている請求項１０記載の方法。
13. １３．前記患者が目の繊維状態を患っている請求項１０記載の方法。
14. １４．前記化合物を局部的に投与する請求項１０記載の方法。
15. １５．前記化合物を注射で投与する請求項１０記載の方法。