JPH06505913A - ゲルビーズ及び同様な材料においてリポソームを固定化する方法,このような方法によって調製された固定化リポソーム,及びそれらの使用 - Google Patents
ゲルビーズ及び同様な材料においてリポソームを固定化する方法,このような方法によって調製された固定化リポソーム,及びそれらの使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ゲルビーズ及び同様な材料においてリポソームを固定化する方法、このような方
法によって調製された固定化リポソーム、及びそれらの使用
本発明は、ゲルビーズのような材料中に、リポソーム、またはプロテオリポソー
ムを固定化する方法、このような方法によって調製されたリポソーム、またはプ
ロテオリポソームが固定化されている材料、及びリポソームが固定化されている
このようなゲルビーズまたは同様な材料のクロマトグラフィー的、医学的、及び
その他の目的における使用に関する。
円形の小胞の形で調製され、リポソームと呼ばれている脂質二重層は、実験的研
究において生体膜のモデルとして普通に使用されている。その脂質二重層に膜蛋
白質(単数/複数)が存在するリポソーム(プロテオリポソーム)は、二重層横
断蛋白質媒介輸送の研究のために使用されている。
リポソームを、イオン交換、アフィニティー、輸送の性質、ならびに触媒活性を
有するようにデザインすることができる。膜横断蛋白質、及び末梢膜蛋白質は、
疎水部分の相互作用により、脂質二重層に根を下すか挿入されることができる。
このような性質を使用することによる研究、分析、及び分離を簡便にするために
は、クロマトグラフィーの実験を遂行することができるように、リポソームを、
担体、例えばゲル中またはゲル上に固定化することが望ましい。
リポソームをゲルビーズに固定化する方法は、以前にM、Be1e冑と共に本発
明者らによって記述されている。
例えば、Bioc旧m1ca et Biophisica Acta 924
(1987)頁185−192. Elsevier及びBiochia+i
ca etBiophisica Acta 938 (1988)頁243−
256゜Elsevierを参照のこと。これらの方法は、特異的カップリング
剤を使用して、疎水性相互作用により、ゲルビーズ内及びゲルビーズ上にリポソ
ームの固定化ができるように、リガンドをゲルビーズの材料に共存結合によるカ
ップリングを行うことを内容としている。
遊離の疎水性リガンドの存在を避けるために、リポソームを固定化する別の方法
が、本発明者らによって開発された。旧ochimica et Biophi
sica Acta 982 (1989)頁47−52 r Elsevie
rを参照のこと。この方法は、疎水性リガンドまたは共有結合カップリングを含
まない。リポソームは、ゲルビーズ中に、ゲルビーズとともに、透析によって可
溶化された脂質によって捕獲される(立体的に固定化される)。捕獲されたリポ
ソームの量は、初期脂質濃度とともに非直線的に増加し、リポソームとゲルの孔
の相対的大きさに依存している。
リポソームを固定化する既知の方法にはいくつかの欠点があり、その中で最も重
大な欠点は、疎水性リガンドでの固定化した場合には望ましくない疎水性相互作
用のリスクであり、透析操作による立体的固定化の場合には、固定化容量が比較
的小さい。これらの方法では、本質的に少なからぬコストがかかり、時間もかか
り、労力を要し、または規模を拡大することが困難である。
したがって、ゲルビーズ中にリポソームを固定化する該欠点のない新しい方法を
提供すること、そして、該方法によって製造されたゲルビーズを提供することが
、本発明の目的であった。
これらの目的は、それぞれ、請求項1と14の特徴的部分にしたがって達成され
た。
本発明の新しい方法は、リポソームが融合するか、脂質材料(例えば、断片また
はミセル)がリポソーム中に含有するとき、新たに生じたリポソームは、立体的
に捕獲されるか、それらの相対的大きさのためにからみ合うか、さもなければ、
使用された材料の三次元ネットワーク中に捕獲されるか、からみ合うかするとい
う効果、または諸効果を利用する。より好ましい材料は、アガロース、デキスト
ラン、及びグルコマンナンのようなポリサッカライド;ポリアクリルアミド、N
、N’−メチレン−ビス−アクリルアミドで交差結合したアリルポリサッカライ
ド;及びシリカで出来たゲルビーズか粒子である。
ゲルビーズの材料は、交差結合があってもなくてもよく、親水性であっても疎水
性であってもよい。
本発明による方法のより好ましい態様は、さらに、以下の例とそれに伴う図を参
照として今記述される。
例中において、以下の溶液が使用される。
溶液A : 150mM NaC1,IOIM EDTA、10111M トリ
ス−HCl (pH7,4)
溶液B : 140mM NaC1,10mM カルセイン(pH7゜100m
M EYP (=卵黄ホスフォリピッド)溶液=100mM EYP、150m
M NaC1,1mM EDTA、10mM t−リス−MCI (pH7,4
) 125mM コーレート
290mM EYP溶液:290mM EYP、150mMNaC1,1mM
EDTA、10QIM トリス−HCI(pH7,4) 、580mM コーレ
ート例 !
リポソームと吸引−乾燥した湿潤ゲルビーズの混合物の凍結−解凍によるリポソ
ームの立体的固定化固定化リポソームの担体としての使用のためのゲルビーズを
、溶液AまたはBで3回すすいだ。次に、ゲルは、カラム上でウォータージェッ
トポンプ(アスピレータ−真空ポンプ)で吸引することによって、カラムから液
体が出なくなるまで、カラム上で乾燥した。この操作を、ここでは吸引−乾燥と
呼ぶ。0.7gの吸引−乾燥セファクリルS−1000、または、0.6gのセ
ファロース2B(両方の場合において、0.5ml充填ゲルに相当する)を5o
ilのプラスチック円錐−底のチューブに入れ、0゜55011のリポソーム懸
濁液をそのゲルに加えた。リポソーム懸濁液は、6−8.5mlの100O10
0OI溶液を、セファデックスG−50上に適用し、室温において、溶液Aで溶
出することによって調製された。その後は、リポソーム懸濁液は、例えば、Mi
nicon B (Aa+1conから)のような濃縮器を使用して濃縮させた
。異なる濃度のホスフォリビッドの懸濁液が使用された。ある場合には、カルセ
インがリポソーム中に包みこまれた。チューブは、窒素を充填し、封じた。ゲル
は、リポソームと共にヴオーテックスにかけることによってリポソームと混合し
、ゲルビーズをリポソームと平衡化させるために、窒素下で少くとも30分放置
した。高リポソーム濃度の混合物のためには、より長時間使用した。混合物は、
チューブをドライアイス/エタノール浴(約−75℃)、または液体窒素の中に
10分間浸すことによって凍結し、25°Cの水浴中で解凍した。チューブは、
10分間水浴中に保った。
固定化されていないリポソームは、3つの部分の溶液Aとともに、150Xgで
3×5分遠心分離することによって除去した。リポソームが固定化されたゲルは
カラムに充填され、さらに、少くとも10カラム容の溶液Aで洗浄された。G、
R,Bartlett、 J、 Biol、 Chew。
234 (1959)466の方法にしたがって、リンのアッセイを行うことに
よって、固定化容量(ゲル容量あたりの固定化ホスフォリピットの量)を測定す
るために、固定化されたリポソームを最終的に50mMのコーレート溶液で溶解
し、溶出した。
本例においては、リポソームの固定化は、濃縮されたリポソームの懸濁液を、吸
引−乾燥したビーズの代りに、凍結乾燥したゲルビーズと混合することにより達
成された。
使用されたゲルは、0.5mlの充填容量に相当する量のセファクリルS−10
00であった。10+olの丸底フラスコに入れたゲルをドライアイス/エタノ
ールに浸し、ゲル−ビード懸濁液を、フラスコをゆるやかに廻しながら薄い貝殻
状に凍結させた。その後は、ゲルは室温で一夜凍結乾燥させた。1.1−1.2
011の濃度のリポソーム懸濁物を乾燥した貝殻状のゲルビード(76mg)に
加えた。
混合物は、ヴオーテックスにかけることによって混合し、ゲルビーズを膨潤させ
、リポソームと平衡させるために、窒素下、室温で約3時間放置した。この混合
物は、例1に記述されたように、凍結−解凍した。洗浄の手順も例1に記述した
通りに行われた。
例1の最初のパラグラフに記述された操作手順が繰返された。但し、混合物は薄
い貝殻状に凍結され、解凍されなかった。その後は、それは、室温で一夜凍結乾
燥された。次に、薄い貝状の混合物は、1.1−1.2011の脱イオン水で再
加水させるか、または溶液Aに相当する最終組成まで希釈された。その後は、混
合物を窒素ガスでフラッシュし、再加水過程を完了するために、窒素下、室温で
少くとも3時間放置した。固定化されなかったリポソームは、例1において、上
述された洗浄の操作手順によって除去された。
加水された混合物は、固定化容量を増加させるために、随意に凍結−解凍させる
ことが出来る。
本例においては、操作手順は例3におけるのと同じであったが、但し、1−2m
1の濃縮されたリポソーム懸濁液が凍結乾燥ゲルに加えられ、窒素下、室温で3
時間放置された。次に、混合物は、凍結乾燥し、1.1−1.21m1の脱イオ
ン水、希釈された溶液A、または溶液Aによりて再加水された。洗浄操作手順は
、上の例1において記述されたように行われた。
例 5
凍結乾燥ビーズについての逆相蒸発によるゲルビーズ中のリポソームの立体的固
定化
1、 ゲルビーズの凍結乾燥 0.7gの吸引−乾燥セファクリルS−1000
ゲルビーズを25m1の丸底フラスコに移した。ゲルを、例2において記述され
たように凍結乾燥した。
エマルジョン1. 200mgのEYPを、アルミニウムホイルで裏打ちしたス
クリューキャップを備えた10011の試験管中で2mlのジエチルエーテルに
溶解した。0.6 mlの溶液Aを、10m1の注射筒からの0.41+111
X20110+の針を通して脂質溶液に急速に注射した。溶液は、ヴオーテック
スミキサーを使用して30秒混合し、水浴ソニケーターで10分間超音波処理を
行った。
エマルジョン2. 200mgのEYPを、スクリューキャップがついた25m
1のバイアル中の15011のジエチルエーテル中に溶解した。1.5 mlの
溶液Aを、上述の如(急速に脂質溶液中に注射した。溶液を、ヴオーテックスミ
キサーを使用して30秒混合し、水浴ソニケーター中で20分間超音波処理した
。
3、 エマルジョンの凍結−乾燥ゲルビーズとの混合エマルジョンl、または2
を、76mgの凍結乾燥したゲルビーズを含む25m1のフラスコに直ちに移し
た。フラスコを栓で蓋をし、室温で1−3時間静かに振とうした。
4、 ロータリーエバポレーターによる有機溶媒の除去エマルジョンとゲルビー
ズの混合物を含むフラスコをロータリーエバポレーターに接続した。エマルジョ
ンlとゲルビーズの混合物については、ポンプに最大の水流を通して、アスピレ
ータ−による真空下、静かにフラスコを回転しつつ蒸発を行った。乾燥は、混合
物が乾燥するまで約10分間続けた。エマルジョン2とゲルビーズの混合物につ
いては、アスピレータ−の水流をはるかに弱くし、蒸発を行った。この乾燥は、
ゲル様の混合物が形成されるまで3−4時間続けた。
5、 リポソーム懸濁液の生成 最終乾燥材料を、ヴオーテックスミキサーを使
用して激しく混合した。そして、次に、必要ならば0.5−1.5mlの溶液A
を材料に加えた。
リポソームの若干はゲルビードの穴の内側に形成され、孔の大きさと比較して十
分な大きさがあり、このようにして固定化された。固定化されなかったEYPリ
ポソームを除去するために、例1におけるのと同じ洗浄操作手順が使用された。
例 6
溶媒で乾燥したゲルビーズについて逆相蒸発によるゲルビーズ中のリポソームの
立体的固定化1、 溶媒で乾燥したゲルビーズ 使用されたゲルは、0、5 m
lの充填容量に相当する量のセファクリルS−1000であった。ゲルを、それ
ぞれ50m1の20%、50%、及び98%エタノール、続いて50m1のジエ
チルエーテルで洗浄し、ゲルマトリックス中の水の大部分を除去した。溶媒で乾
燥したゲルビーズを、50m1の丸底フラスコに入れた。
2、EYPの有機溶媒溶液中への水溶液の超音波処理00mg)を、100m1
フラスコ中の5o1のジエチルエーテルに溶解した。適切な容量(通常0.6−
2 ml)の溶液A1または溶液Bを有機相中に加え、続いて、低温度(5℃)
中で、窒素ガスの保護下で、澄明なエマルジョンが得られるまで5−10分間、
水浴中で超音波処理を行った。このようなエマルジョンは、室温で30分間は2
相に分離しなかった。
3、 ロータリー蒸発 このエマルジョンを溶媒で乾燥したゲルビーズを含む5
0a+1のフラスコに移した。次に、そのフラスコを膜ポンプと真空制御装置が
ついたロータリーエバポレーターに接続した。混合物中のエーテルの大半を、フ
ラスコを200 rptrrで30−40分回転させながら、混合物がフラスコ
の壁土に貝殻状になるまで、25℃で真空吸引により650−700 mbar
において除去した。簡潔にするために、本ステージにおける混合物を“貝殻状混
合物”と呼ぶ。真空圧が450−500mbarであったことを除き、同じ実験
条件下で蒸発を15−30分間続けた。比較的多量の水溶液(≧1.0 ml)
を含んでいたエマルジョンの場合には、この蒸発を継続中に、貝殻状混合物は、
リポソームが形成されるにつれて、粘稠な懸濁液に変換された。水溶液が1.O
a+1未満のエマルジョンについては、貝殻状混合物から懸濁液への変換は、貝
殻状混合物がヴオーテックスミキサーを使用して激しく振とうされたとき、また
は余分な水溶液が貝殻状混合物に加えられたとき、リポソームの形成と同時に起
った。変換の過程を通じて、溶媒で乾燥したゲルビーズは、エマルジョンから放
出された水で加水されたとき、ある程度膨潤した。ビードの孔の内側に形成され
たリポソームの若干は、孔の大きさに較べて十分な大きさを有しており、このよ
うにして固定化された。
4、 固定化されなかったリポソームの除去 固定化されなかったリポソームは
、上記の例1において記述されたように、遠心分離とカラム洗浄によって除去さ
れた。
上記の操作手順1−4は、約2時間で行うことができた。
吸引−乾燥(大きな孔がある)ゲルビーズ図1において、例1を参照として、凍
結と解凍の際の固定化容量に対するリポソーム(ホスフォリビッド)の濃度の効
果が図解されている。曲線は、セファクリルS−1000(+と・)及びセファ
ロース2B(ム)における固定化を表している。凍結と解凍は、10mMのカル
セイン(+)を含む溶液Bを使用することによって、及び溶液A(・、Q、ム、
△と★)を使用することによって行われた。対照実験は、凍結−解凍固定化につ
いては、同じ実験条件下で、しかし、リボゾームとゲルビーズ(○と△)の混合
物を、凍結及び解凍することなく行われた。(★)は、凍結解凍によるセファク
リルs−i。
00におけるプロテオリポソーム(赤血球膜蛋白質とともに)の固定化容量を示
す。(■)は、上に引用した以前の技術にしたがった透析技術の後のセファロー
ス2B中の固定化容量を示している。
図に見られるように、固定化容量は、それぞれセファクリルS−1000に対し
て、及びセファロース2Bゲルに対して、ゲルのmlあたり6.5から80μm
ol 、及び3.5から40μmolのホスフォリピットまでほとんど直線的に
増加し、リポソーム濃度は、30011IMのホスフォリピット(それぞれ、図
における・とム)まで上昇した。
赤血球膜プロティンとともにプロテオリポソームを固定化する容量は、蛋白質な
しく★1図1)のリポソームについてより僅かに低かった。凍結と解凍を行った
際固定化されたリポソームの量は、セファロース2Bゲル(ム。
図1)におけるように、セファクリルS−1000(・。
図1)の約2倍高かった。N、N−メチレン−ビス−アクリル−アミドで交差結
合されたアリルデキストランのセファクリル5−toooゲルビーズは大きな孔
を有し、凍結−解凍によって形成された大きなリポソームに対して、より近付き
つると考えられる。一方、セファクリルs−i o o oのより高い固定化容
量は、水流ポンプによってセファローズ2BゲルからよりもセファクリルS−1
000から水を引抜くことが容易であるという事実のためであるかもしれない。
このことは、セファローズ2Bに比較して、セファクリルS−1000のビード
の孔により多くのリポソームが取込まれる結果となるかもしれない。対照実験は
、リポソームが引続いて凍結−解凍を行うことな(ビーズと混合されたとき、そ
れぞれ1.3及び0.7μmo1未満のホスフオリピツドがセファクリルs−t
o o oとセファロース2Bゲル(Oと61図1)に吸着されることを示し
た。
溶液Aの1011Mトリスが、10mMのカルセインによって置換えられている
溶液Bを使用することによって、リポソームの濃度を80mMから190mMの
ホスフオリビツドへ増加したとき、固定化容量は、この濃度範囲における溶液A
(・2図1)を使用したときの容量と較べ、30%の増加に相当するmlのゲル
当り(★9図1)の20μmolから80μ0101へと鋭く上昇した。我々は
、濃縮されたリポソーム溶液の粘度が、溶液Bの存在において有意に減少したこ
とを観察した。これが、ゲルの孔の中へのリポソームの拡散速度を増加したこと
は明らかであった。
吸引−乾燥した(小さい孔)ゲルビーズ下の表1において示されているように、
例1にしたがって、リポソームをまた比較的小さい孔をもったあるゲル中に凍結
−解凍によって固定化することができた。
表 1
凍結−解凍操作手順を行ったとき小さい孔のゲルビーズ中のEYPリポソームの
固定化容量66 0.7 295 54
CL−660,6630061
8吸引−乾燥ゲルの量は、すべての使用された実験的条件下で、0.5 mlの
充填容量に相当する。
これらのゲルの固定化容量は、300I!1Mの脂質濃度において、セファロー
ス2B(ム2図1)の35μmol /mlの容量より大きいが、セファクリル
S−1000(・。
図1)の相当する78μmol/mlの容量より小さかった。
凍結乾燥ゲルビーズ
例2においては、ゲルビーズが凍結乾燥されてから、リポソーム懸濁液と混合さ
れたとき、例1におけるより、さらに大きな容量が得られた。したがって、大き
な固定化容量のために必要となるリポソーム懸濁液におけるホスフオリビッドの
濃度は、吸引乾燥湿潤ゲルビーズの場合よりも低かった。結果は、下記の表2に
示されている。
表 2
凍結乾燥したビーズとEYPリポソームの混合物を凍結−解凍したときセファク
リルS−1000ゲルビーズの固定化容量
76 93 26、2 52
76 200 68、5 137
76 252 56.4 113
76 270 56、1 112
a、76mgの凍結乾燥ゲルは、使用された実験的条件下における0、 5 m
lの充填ゲル容量に相当する。
b、 北向部容量は、カプセルにつつみこまれた10mMカルセインの使用によ
って決定された。それは、ホスフオリビッドのμmolあたり0.88μlであ
った。
例1 (図1.・を参照)の相当する濃度に比較して、容量は、270mMのリ
ポソーム濃度で約50%だけ、そして93及び200mMの濃度で約120%だ
け増加した。
このように、比較的低いリポソームの濃度で、より高い容量が得られた。
凍結−乾燥と再加水による立体的固定化吸引−乾燥ゲルビーズ
凍結乾燥と再加水を行ったとき、セファクリルS−1000ゲルビーズにおける
固定化容量に対するホスフォリビッドの全量の効果が、例3を参照して図2に示
されている。凍結乾燥の前に吸引−乾燥したゲルビーズと混合された11.YP
リポソーム懸濁液の脂質濃度は、39.165及び255mMであり、懸濁液の
容量は、それぞれ、2、■及び0.55m1であった。相当する脂質の量は、X
−軸上に与えられている。
図2は、165μmolのホスフォリビッドを含むリポソーム懸濁液の凍結乾燥
と再加水の後、比較的高容量、mlゲルあたり62μmolを示している。様々
な濃度と容量を有する上記のリポソームの懸濁液中のホスフォリビッドの量を増
加することによって、固定化容量が増加することが認められた。例1による凍結
−解凍操作手順に比較して、凍結乾燥と再加水の後の固定化の利点は、リポソー
ムのより低い濃度を用いることによって固定化の高容量が得られることであるよ
うに思われる。
凍結−乾燥ゲルビーズ
表3に示されているように、例4においても高用量が得られた。
表 3
凍結乾燥したビーズとEYPリポソームの混合物を凍結乾燥及び再加水したとき
のセファクリルS−1000′ゲルにおける固定化容量
76 153 52.3 104
76 252 56.3 113 ’
”地内部容量は、つつみ込まれたlQmMのカルセインの使用によって決定され
た。それはホスフオリビッドのμ1dolあたり0.54μlであった。しかし
、リポソームの地内部容量は例2における操作手順によらて得られたそれよりも
38%低かった。
逆相蒸発による立体的固定化
■、 凍結乾燥ゲルビーズ
リポソームはまた、例5による立体的固定化によりでも、セファクリル5−io
ooゲルビーズにおいて固定化することができた。エマルジョン1を使用するこ
とによって、結果として生じた固定化容量は、μlゲルあたり128μmolの
ホスフォリビッドであった。
内部容量
図3には、種々の濃度における固定化EYPリポソームの全内部容量と地内部容
量が示しである。10mMのカルセインが包み込まれたEYPリポソームが、例
1にしたがって、凍結−解凍によってセファクリルS−1000において固定化
された。記号(・)は、μ■01ホスフォリビッドあたりのμmとして表現され
固定化されたリポソームの地内部容量を意味している。記号(0)は、mlゲル
あたりのμlにおける全容量を意味し、地内部容量(・)を固定化容量(図1か
らのデータ★)に乗することによって計算される。
ホスフォリビッドのμa+olあたりのμlとして表現された固定化リポソーム
の地内部容量は、リポソーム濃度(・2図3)の増加とともに徐々に減少した。
このようにして、リポソーム濃度は、凍結−解凍融合過程に影響する。固定化リ
ポソームの平均の大きさは、リポソーム濃度の増加とともに減すると考えられる
が、しかし、リポソームが比較的大きな程度まで、多層形または多小胞形になる
ことも可能である。超音波処理によって調整された小さい単一層小胞は、凍結及
び解凍を行ったとき、そして凍結乾燥及び再加水を行ったとき、平均の大きさ及
び捕獲された容量が著しく増加することが知られている。また、捕獲容量は、C
a”のような2価の金属イオンの存在において減少することも報告されている。
同様に、捕獲容量(図3の・)は、溶液Bが10mMのカルセインを含み、それ
は、正味−3の負の電荷をもっているので、低下されたかもしれない。固定化容
量(図1の◆を参照)の増加は、地内部容量の減少より大きかったので、aIt
のゲルあたりのμmとして表現される全内部容量は増加した。それぞれ、190
mMと29301Mのリポソーム濃度について得られた011のゲルあたり14
4と150μmの全内部容量は、従来の技術にしたがったオクチルサルファイド
−セファクリルS−1000上の疎水性の相互作用によって固定化された中程度
の小胞(平均直径がlQOnm)について算定されたmlのゲルに対する74μ
mの値よりも50%高かった。
Il、操作手順を改変した溶媒−乾燥
内部容量の決定のために、カルセインを含んでいる水溶液Bを加えた有機相中の
100BのEYPの乳化の場合について、図4に図解されているような例6にし
たがって、リポソームは、セファクリルS−1000ゲルビーズに固定化するこ
とができた。地内部容量は、充填ゲルmlあたり60μmolから12μmol
のホスフオリビツドの減少を伴って、ホスフォリビッドμmolあたり1.1か
ら6.1μlの水へと増加した。そのとき、図4Aにおいて示されているように
、乳化のために加えられた水溶液の容量は、0.8 mlから2.0 mlに増
加した。地内部容量が4.9−6.1μmの大きなリポソームが固定化され、相
対的に高い容量が維持された。0.8から1.6m1(図4B)への水溶液の添
加の増加の際、固定化リポソームの全内部容量は、充填ゲルallあたり55μ
mから88μlの水へと徐々に増加した。しかし、この容量をさらに増加させる
ことによって、全内部容量が僅かに減少した。
ゲルallあたり約10μmolホスフオリビッドにおいて固定化されたプロテ
オリポソームは、低濃度のオクチルグルコシドであらかじめ平衡化され固定化さ
れたリポソームに対して、オクチルグルコシド中に可溶化されたヒト赤血球から
の必須な膜蛋白質の添加によって調製することができた。
発明の応用
本発明の方法によって生産されたゲルビーズ、または同様な材料は、この分野の
技術に熟達した人にとって明らかであるように、様々な応用のために意図された
クロマトグラフィーの媒体として使用することができる。最近の総説は、蛋白質
、核酸、酵素35(1990)頁1983−1998、共立出版、東京;及び、
J。
Chromatogr、リポソームクロマトグラフィーニゲルビーズ中に固定化
されたリポソームを固定相とした水性カラムクロマトグラフィー、Per Lu
ndahl とQing Yang−印刷中にある。応用には、バイオテクノロ
ジーの目的、化学合成、及び化学分析を含むことが可能である。化学合成につい
ては、触媒活性物質または巨大分子をリポソームまたはその2重層中に組み込む
。包含された、挿入された、もしくは吸着された物質、または巨大分子があるか
ないかのいずれかのビーズ、または粒子が化学分析に使用される。
ゲルビーズまたは同様な材料において、固定化に先立って、または固定化を行う
ときに、1つ以上の薬理学的に薬剤を組込むことが考えられる。これは、固定化
の際、または固定化に先立って、薬剤(単数または複数)にリポソームが脂質の
材料を混合することによって容易に行うことができる。次に、得られたゲルビー
ズ、または脂質の材料を、in vivoにおける徐放性の薬物配送システムと
して役立つように、ヒトまたは動物の体に移植または注射することができる。さ
もなければ、それらは、いずれの便利な形においても、皮膚上、または身体の部
分に適用し、薬物の拡散によってそれらの意図された作用を及ぼすことができる
。同様に、組込まれた、または包み込まれた薬剤が、ある場合もない場合も、固
定化リポソームは、化粧の目的に使用することができる。リポソームは、いくつ
かの化粧品の成分としてよく知られており、それらの作用は固定化によって調節
することができる。
浄書(内容に変更なし)
第1図
第2図
50 too 150 200
第3図
第4A図
第4B図
0.8 1.0 +、2 1.4 1.6 +、8 2.0水溶液の容量(mL
)
平成5年7月14日
Claims (26)
- 1.以下のステップを含むリポソーム及び/またはプロテオリポソームを、内部 孔、または間隙を形成する三次元のネットワークを有する交差−結合、または非 交差結合の材料中に固定する方法: a)リポソーム、そして/またはプロテオリポソームの懸濁液、または脂質のエ マルジョン、または脂質と蛋白質(単数と複数)、そして有機溶媒中の水を調製 する;b)材料と懸濁液またはエマルジョンを混合すること;c)材料に入った りポソーム、そして/または、プロテオリポソームの平均の大きさを増加させる こと、または、エマルジョンになった脂質(及び蛋白質)の材料中への取込みと 会合を、有機溶媒を蒸発させることによって行わせ、その際、リポソーム、そし て/またはプロテオリポソームを形成させ;その結果リポソーム、そして/また はプロテオリポソームを該三次元ネットワーク内に捕獲するか封じ込めること; そして、 d)固定化されなかったリポソーム、そして/またはプロテオリポソームを除去 すること。
- 2.リポソーム(プロテオリポソーム)の平均の大きさを、リポソーム(プロテ オリポソーム)の融合、そして/またはリポソーム(プロテオリポソーム)の断 片のより大きなリポソーム(プロテオリポソーム)への会合によって増加させて いる請求項1による方法。
- 3.リポソームの懸濁液が、50−350mMの脂質の濃度をもつように調製さ れる請求項1と2の1つか、または両方による方法。
- 4.三次元のネットワークをもつ材料が、クロマトグラフィー用の充填剤として 、または細胞培養における細胞の担体として使用するために、あらかじめ作られ ているゲルビーズ、またはゲル粒子、または同様なビーズ、または粒子から成立 ち、リポソーム、またはエマルジョンからの脂質が、拡散、そして/または、吸 引、そして/または材料の膨潤の際に材料に入る請求項1−3のうちの1つ以上 による方法。
- 5.材料が、ステップb)の前に凍結乾燥される請求項4による方法。
- 6.材料が、ステップb)の前に吸引−乾燥され、そして、ステップc)が、材 料とリポソーム、そして/または、プロテオリポソーム間の混合物の凍結と解凍 によって遂行される請求項4による方法。
- 7.材料を、ステップb)の前に、有機溶剤で洗浄することによって水が除去さ れる請求項4による方法。
- 8.ステップc)が、材料とリポソーム、そして/または、プロテオリポソーム の間の混合物の凍結と解凍によって遂行される請求項5による方法。
- 9.ステップc)が、材料とリポソーム、そして/またはプロテオリポソームの 間の混合物の凍結乾燥によって遂行される請求項1−4のうち、1つ以上による 方法。
- 10.リポソーム(プロテオリポソーム)と材料の間の混合物の凍結に続く解凍 が、ステップd)の前に遂行される請求項9による方法。
- 11.ステップb)における材料が吸引乾燥される請求項9または10による方 法。
- 12.ステップb)における材料が凍結乾燥される請求項9または10による方 法。
- 13.リポソームが、固定化に先立って、または固定化に際して、1つ以上の薬 理学的に活性な薬剤とともに提供される請求項1−12のうちの1つ以上による 方法。
- 14.請求項1−13の1つ以上による材料の三次元のネットワークの孔、ある いは間隙内に固定化されているリポソームを含む非交差結合、または交差結合ゲ ルのビーズ、または粒子、または他の同様なビーズ、または粒子。
- 15.固定化リポソーム、そして/または固定化プロテオリポソームの量が、ゲ ルのmlあたり20μmol以上に相当する請求項14によるビーズまたは粒子 。
- 16.固定化リポソーム、そして/または固定化プロテオリポソームの全内部容 量が、ゲルのmlあたり50μl以上である請求項14、または15によるゲル ビーズ。
- 17.ゲルが、以下の成分またはこれらの誘導体のうち1つ以上からなる請求項 14、15、または16によるゲルビーズ、またはゲル粒子:アガロース:N, N′−メチレン−ビス−アクリルアミドで交差結合したアリルポリサッカライド ;セルローズ;デキストラン;ゼラチン;グルコマンナン;ポリアクリルアミド ;及びシリカ。
- 18.材料が、セラミック材料であるか、ガラスである請求項14、15、また は16によるビーズまたは粒子。
- 19.1つ以上の天然、または人工的膜蛋白質(単数または複数)が、脂質2重 層に組込まれている請求項14−18のうちの1つ以上によるビーズまたは粒子 。
- 20.触媒的に活性な物質、または巨大分子が、リポソーム、またはそれらの2 重層に組込まれている請求項14−19のうちの1つ以上によるビーズまたは粒 子。
- 21.1つ以上の薬理学的に活性な薬物(単数と複数)がリポソーム中に組込ま れている請求項14−19のうち、1つ以上によるビーズまたは粒子。
- 22.請求項14−20のうち1つ以上によるビーズ、または粒子のバイオテク ノロジーの目的のための使用。
- 23.請求項22によるビーズ、または粒子のクロマトグラフィーのための使用 。
- 24.包含された、挿入された、または吸着された物質、または巨大分子の存在 、または非存在下における請求項22によるビーズまたは粒子の化学分析のため の使用。
- 25.請求項21によるビーズ、または粒子の医学または獸医学の目的のための 使用。
- 26.請求項14−21のうち、1つ以上によるビーズまたは粒子の化粧の目的 のための使用。
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