JPH06505563A - 毛管電気泳動におけるサンプル濃縮の改良のためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 毛管電気泳動におけるサンプル濃縮の改良のためのシステム及び方法発明の分野 本発明は分離カラム内部でのサンプル成分の分離及び検出のための毛管電気泳動 システム及び方法に関し、特に毛管電気泳動のサンプルスタッキング技術を用い て検出能力を高めるための改良されたシステム及び方法に関するものである。

発明の背景 毛管ゾーン電気泳動（ＣＺ　Ｅ）は、電場内でサンプル成分の異なる移動度を利 用し、これにより毛管カラム内でサンプル成分がゾーン内部に編成される効果的 な分析的分離技術である。

実際に、広範に使用されて来た従来のＣＺＥ装置は、二つのリザーバ内に配置さ れた入口及び出口端を有するバッファが充填された毛管カラムと、分析されるサ ンプルを注入するためのサンプル導入手段と、検出器を通過するサンプルゾーン を検知するためのオンカラム検出器手段と、カラム内のサンプル成分の移動及び 分離を生じさせる毛管カラムに電圧を印加するための高電圧手段から成る。（参 照：　Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ、　Ｊ、ｊ　ａｎｄ　Ｌｕｋａｃｓ、　Ｋ、Ｄ、　５ ｃｉｅｎｃｅ、　１９８３．　ｖ２２２．　ｐ、２６６−２V２） 非常に少ない量のサンプルの分析にＣＺＥを使用すると、従来の検出器ではその 検出限界に伴う重大な問題が生じる。検出装置の改良を通して、分析されるサン プル成分の検出感度を向上させる従来の技術の路線に沿って、毛管カラム内の狭 いゾーンにサンプル成分を濃縮させることにより感度を向上させるひとつの異な るアプローチが開発された。（参照：　Ｍｉｋｋｅｒｓ、　Ｆ、　Ｅ、　Ｐ、、 　Ｅｖｅｒａｅｒｔ、　Ｆ、Ｍ、　；　Ｗｅｒｈｅｇｇｅｎ、　Ｔｈ　Ｐ、Ｅ」 、、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　１９７９．１６９．１１）このオン カラム濃縮技術は時々サンプルスタッキングと呼ばれ、希薄化されたバッファ内 及びサンプルプラグより非常に高い導電性を有するバッファの周囲に、サンプル のプラグで充填された分離カラムを横切って高電圧を印加することにより得られ る。

希薄化されたバッファ内のサンプルのプラグと、隣接する補助バッファとの間の 境界で、サンプルイオンのオンカラム濃縮を使用する多（の技術はサンプル成分 の検出能力を強化する。（参照：　Ｍｏｒｉｎｇ、　Ｓ、　Ｅ、　；　Ｃｏ１ｂ ｕｒｎ、　Ｔ、Ｃ，；　Ｇｒｏｓｓａ＋ａｎ、　Ｐ。

５４２、１７３） 従来技術の短所 オンカラムでサンプル濃縮を伴う従来のＣＺＥ技術において、注入サンプル量を 増加する試みは分析の低下につながる。ニーしン（Ｎｉｅｌｅｎ）は濃縮感度の 改良のためサンプル体積を１５ｎｌまで注入した。全毛管カラム量の２％まで注 入した良好な結果が、モリング（Ｍｏｒｉｎｇ）らによって得られた。

上で説明した方法の検出能力の向上の限界は、毛管カラムの内部で層流の生成に よって生じるピークの広がりのメカニズムにある。（参照：　Ｂｕｒｇｉ、　Ｄ 、Ｓ、　；　ａｎｄＣｈｉｅｎ、　Ｒ，Ｌ、　；　ＡｎａＬＣｈｅｍ、　１９９ １．６３．２０４２）この層流はサンプル量（・ソファと補助バッファの間での 部分的電気浸透移動度及び電場強度の不整合から生じる。カラムに導入されるサ ンプル量が増えれば増えるほど、サンプルピークは広がる。一般に、層流による 広がりのために分析に損失が生じなければ、注入されたサンプル量の１０倍の増 加を得ることができる。サンプルイオンの分離プロセスの達成のためのもう一つ の障害は、長いサンプル溶剤プラグを覆うツク・ソファ内の電場強度が非常に低 いことであり、サンプルプラグに比ベノ（・ソファの導電性力（非常１こ高いと いうことである。はとんどすべての電場が、長いサンプルプラグを横切って低下 しその結果電気泳動速度が減少するため、覆っている］＜・ソファ内の電場：ま 弱い。さらにこれが、カラム内に注入されるサンプル溶液の量を制限する。

加えて、上の方法を実施するためのシステムは、毛管カラム内に導入されるサン プルの素早い充填を保証するサンプル量の検出手段を備えておらず、その点力嘴 この技術の再生のために大変重要である。

発明の概要 毛管ゾーン電気泳動を実現するための従来技術であるサンプル濃縮方法及びシス テムの欠点は本発明により解決された。発明によると、水また１よ希薄イヒされ たバッファは、サンプル成分が補助バッファ中にスタ・ツクする間、電気浸透流 を使ってカラムから外へ追い出される。その際、サンプル成分の分離が最少量の 層流とともにカラム内で達成される。本発明は高分解能を維持する間、注入され たサンプルの量を増加させる。

高性能電気泳動のためのシステム及び方法は、連続的に、補助バッファ及び補助 バッファより非常に低い濃度を有する希薄化されたサンプルバッファ内に備えら れたサンプルの大きいプラグを分離カラム内に導入することと、 サンプル溶液及び補助バッファの間の境界でサンプルイオンをスタックし、一方 で分離カラムに沿って反対の極性の高電圧を印加するために生じた電気浸透を使 用して分離カラムからサンプルバッファを同時に抽出することと、サンプルバッ ファの除去の後、標準極性の高電圧を分離カラムに沿って印加することによりサ ンプルイオンをそれらの相対的電気泳動移動度に従って分離することを含む。

上で説明した方法の達成のための装置であって、補助バッファを含む二つのバッ ファリザーバ内にそれぞれ配置された入口及び出口端を有する分離カラムと、補 助バッファより非常に低い濃度を有するサンプルバッファ内に備えられたサンプ ルを分離カラム内に注入するためのサンプル導入手段と、注入されたサンプル溶 液の量を検出するための注入検出器手段と、分離カラムの出口端でサンプル成分 を検出するための分離検出器手段と、分離カラムに沿って傾斜した電場を印加す るために及び分離カラム内からサンプルバッファを抽出すべく、電気浸透流の方 向を逆転するために印加された電圧極性を反転させるようにバッファ内に配置さ れた電極を有する電源手段とを含む装置。

毛管カラムからサンプルバッファを押し出す電気浸透流の方向は毛管カラム壁の 電荷に依存するため、この技術は負または正の荷電粒子のいずれの分離に対して も適用され得る。

図面の簡単な説明 図１は、本発明による高性能毛管電気泳動のための装置である。

図２は、サンプルバッファ（Ｈ！　Ｏ）内で希薄化されたサンプルの毛管カラム 中への注入の略図である。

図３は、毛管カラムから外へのサンプルバッファ（Ｈ２Ｏ）の抽出の略図である 。

図４は、５分間の注入でサンプルバッファの抽出の有無による電気泳動図の比較 を示したプロットである。

図５は、長さ３５ｃｍのサンプルプラグに対して、サンプルバッファの抽出の有 無による電気泳動図の比較を示したプロットである。

図６は、分離カラムを充填したサンプルプラグの電気泳動図である。

図７は、正電荷イオン分離の電気泳動図である。

図８は、サンプルバッファの抽出を伴う重力注入に対する異なる持続時間の比較 を示すプロットである。

好適実施例 ＣＺＥの改良されたサンプル濃縮方法が、本発明のＣＺＥシステムを使用して行 われ、図１に図示されている。図１を参照すると、ＣＺＥシステムは入口端１２ 及び出口端１３を有する毛管カラム１１から成り、入口端１２及び出口端１３は 補助バッファを含むバッファリザーバ１４及び１５に少しだけ浸されており、サ ンプル導入手段１６は入口端１２を通じて毛管カラム１１内にサンプル溶液を導 入し、電源手段１７はそれぞれリザーバ１４及び１５内に配された電極手段１８ 及び１９を有し、注入検出手段２０は毛管カラム１１内に入口端１２を通じてサ ンプル導入手段１６によって導入されるサンプル溶液の体積を検出し、分離検出 手段２１は毛管カラム１１の出口端１３でサンプル成分を検出し、電流計２２は 電源手段１７と電極手段１８または１９との間に接続され毛管カラム１１内の電 解液を通じる電流をモニターする。

補助バッファは、リザーバ１４から動水内的にカラム（ポリミクロ・テクノロジ ー社、フェニックス、ＡＺ）の一端から３５ｃｍのところに検出窓を有する毛管 が融合された長さ１００ｃｍ、入口径５０μｍ１出ロ径３６５μｍの毛管カラム １１へ供給される。毛管カラム１１のどちらか一方の端が、入口端から３５ｃｍ 或いは５５ｃｍのところで検出窓を与える注入（入口）側として使用され得る。

この検出窓は、１ｍｍの外側のポリアミドコーティング部分を熱して除くことに よって成形された。

毛管カラム１１の出口端１３のリザーバ１５は、カラムの充填後に補助バッファ を収集する。電流計２２によって補助バッファを通じる電流の大きさを計測する ために、好適にプラチナ線である電極手段１８及び１９を介して毛管カラムの入 口端１２と出口端１３との間に電力手段１７によって高電圧が印加される。

サンプル導入手段１６は注入器であり、注入検出手段２０が毛管カラム１１の窓 を通過するサンプル溶液に応答するまでサンプル溶液が毛管カラム内にこの注入 によって注入される。この方法は、毛管カラムの入口端に対しての検出窓の位置 に従ってカラムの１／３または２／３を直ちに充填し得る。毛管カラムの出口端 で注入検出を行い、カラムを完全に充填することができる。

サンプル溶液導入の他の方法は、バッファリザーバ１４の底面の上方１５ｃｍに サンプル溶液バイアルを配置することである。毛管カラム１１の入口端１２は、 バイアル内に挿入され、プラグの長さ１ｍｍ及び１２ｃｍに対応してそれぞれ１ ０秒から２０分の間そこに置かれる。注入後、毛管カラム１１の入口端１２は、 バッファリザーバ１４へ戻される。導入されたサンプル溶液の体積は、注入検出 手段２０によって検出され、注入検出手段２０はＵＶ吸光度検出器、例えば一部 変更が為されたミクロセル・ホールグーの１００μｍスリットを有するヴアリア ン２５５０　（ウォルナット・クリーク、ＣＡ）である。解析における波長は２ ６５ｎｍである。

サンプルスタックが行われている間、サンプルバッファが、電極手段１８及び１ ９を通じて毛管カラム１１の入口１２と出口１３との間の電源手段１７によって 逆の極性高電圧を印加することによってバッファリザーバ１４へ押し出される。

サンプル溶液および補助バッファを通じる電流レベルは、その大きさが補助バッ ファの電流値の１％内に達するまで電流計２２によってモニターされる。

その構成成分内へのサンプルの分離のため、電極手段１８及び１９の極性は、標 準極性に切り替えられ、高電圧が毛管カラム１１に電源手段１７によって印加さ れる。毛管１１の出口端１３でのサンプル構成成分の検出は、注入検出手段とし てのＵＶ吸光度検出器と同じタイプの分離検出手段２１によって与えられる。

サンプル濃縮手順 鋭いバンド内で濃縮されたサンプルを維持する構成は、サンプルが補助バッファ 内に運ばれた後に電気浸透流を使用して毛管カラムからサンプルバッファを抽出 する方法から成る。

負に帯電したシリカ製毛管壁でもって、負のサンプルイオンがサンプルバッファ のプラグの端にスタックされ、印加された電場でカラムを通じて移動するときに プラグの後に続く。正のサンプルイオンの分離において、シリカ製毛管壁の電荷 は、電気浸透流の方向を変えるためにテトラデシルトリメチルアンモニウム臭化 物（ＴＴＡＢ）をバッファに加えることによって正にされる。

濃縮技術の第１工程は、図２に示されるサンプルバッファ内で希薄化されたサン プルの注入である。この場合のサンプルバッファは純水である。試験は、ＨＰＬ Ｃグレードの蒸留水（オードリッチ、Ｗｌ）で用意されそれぞれ３．４ｘｌＯ− ｓＭと４．６ｘｌＯ−’Ｍに希薄化される１、７ｘｌＯ−’ＭのＰＴＨ−Ａｓｐ 酸および２．３Ｘ１０−’ＭのＰＴＨ−Ｇｌｕ酸の原液で行われた。その２つの 陽性の材料は１．５ｘｌＯ−’ＭのＰＴＨ−Ａｒｇおよび５．０ｘｌＯ−’Ｍの ＰＴＨ−Ｈｉｓであった。補助バッファは、ｐＨ６，６に調整された１００ｍＭ のリン酸ナトリウムか又はｐＨ５，１に調整された１００ｍＭのＭＥＳ／ＨＩＳ であった。

全ての薬品は、シグマ社（セント・ルイス、ＭＯ）から得た。トリプシン消化剤 は、水１０ｍ１に０．０２ｇのチタクロームＣ（ホース・ヒート）および０．０ ０１ｇのトリプシンを混ぜて為された。この消化剤は、２８時間３７°Ｃに保た れ、次に蒸留水と共に５．０ｘｌＯ−’Ｍまで希薄化された。水で調製されたサ ンプルは、重力注入によって毛管カラムに積め込まれた。

ウォータプラグ内のイオンの電気泳動速度がバルク電気浸透速度よりも非常に速 いことから、サンプルを積め込んだ直後に逆転された極性を有する高電圧の適用 が、図３に示されるように、毛管カラムから（のみ）ウォータプラグの抽出を起 こさせる。負イオンは、サンプルプラグの背後の狭い領域内にスタックされる。

毛管カラムからのウォータプラグの除去は、カラム内のサンプル溶液及び補助バ ッファを通る電流の大きさをモニターし、カラム内にサンプル溶液を注入する以 前に補助バッファを通る電流の大きさと比較しながら、毛管カラムに逆極性を有 する高電圧を印加することによって制御される。

電流が均一なシステムの電流の９５％から９９％に達するとき、電圧が切られる 。スタックされたサンプルイオンの成分への更なる分離にため、電極の極性を標 準極性に切り替え、サンプル溶液注入前に毛管カラムに印加されていた高電圧に 匹敵する値を有する高電圧を印加することが必要である。

サンプルバッファ（水）の除去によって得られたサンプルの分離においての改善 結果が、図４に示されている。試験は、以下の条件の下で行われた。毛管カラム に印加した高電圧は２５ｋＶのオーダーであり、カラム内の補助バッファを通る 電流は、リン酸に対し２２５μＡでり、ＭＥＳ／ＨＩＳバッファに対し８μＡの オーダーである。カラム内に残留している水および除去された水を有する長いサ ンプルプラグ（１０ミリインチの注入器）の電気泳動図が、それぞれ電気泳動図 ム（ａ）及び（ｂ）に示されている。これら２つの分析の解像度は、カラム内の 水量が大きいため、電気泳動図（ａ）にあるように非常に低い。電気泳動図（ａ ）の理論的径プレートの数は、ＰＴＨ−Ａｓｐに対し２．５ｘｌＯ’、ＰＴＨ− Ｇｌｕに対し２．３ｘｌＯ’である。サンプルのピークは、サンプルバッファの 長いプラグによって生成される層流によって広げられる。サンプルの分離は、バ ルク電気浸透流が増大してカラムのバッファ部分の電場が水量が大きくなること によって減少することから良好な解像度が得られない。対照的に、電気泳動図（ ｂ）の理論的径プレートの数は、はとんどの水が除去されたところで、ＰＴＨ− Ａｓｐの分離に対し４．２ｘｌＯ’でありＰＴＨ−Ｇｌｕの分離に対し４．　５ ｘ１０４である。サンプルプラグの成分全ては、基線分解され、ピークの高さは 一層大きく、ピーク幅は一層狭（なっている。したがって、サンプルが濃縮され た後に超過する水を除去することによって、サンプルの解像度及び検出能を改善 することが可能である。

図５は、カラムから除去されたサンプルバッファを有するサンプル溶液と有さな いサンプル溶液の３５ｃｍの注入の比較である。上方の電気泳動図を見ると、負 のイオンは、サンプルプラグに対してスタックし、全ての電場がサンプルプラグ を横切りで降下することから、これらイオンは離散したサンプル領域内にそれら 自身で分離することができない。下方の電気泳動図ムサンプル溶液除去およびイ オン分離の全プロセスを示している。このプロセスの最初の３分間でサンプルバ ッファが除去される。電流が補助バッファ電流の９９％に達した後、電極が切り 替えられる。知ってのとおり、残留サンプルバッファは最初に分離検出器を通過 し、次に濃縮サンプルイオンが高解像度で検出される。

図６は注入の電気泳動図であり、全てのカラムはサンプル溶液と共に充填される 。最初の７分間は、サンプルバッファの除去である。電流がサンプルバッファの ９９％に達した後、電極が切り替えられる。サンプルバッファのピークは１３分 で現れ、サンプルイオンは遅れて高解像度で現れる。言い換えると、全カラムの サンプルイオンは、非常に鋭い領域内で濃縮されている。

図７は、２つの陽性の材料の電気泳動図である。これら２つのサンプルイオンは 、それぞれＰＴＨ−ＨｉｓとＰＴＨ−Ａｒｇである。補助バッファはその中に１ ｍＭのＴＴＡＢを有し、カラムの電気浸透流を反転させる。

１分の注入期間および１０分間の注入期間のチタクロームのトリプシン消化剤と 除水との比較が図８に示されている。トリプシン消化剤分析においての濃縮方法 を使用すると、一層多くのピークと一層大きいピークの高さが見られる。しかし 、これら２つの型の注入の間ではピークの１対１の対応が無く、これは濃縮効果 によるものである可能性がある。

試験データは、重力注入例においてのサンプルスタックの濃縮効果の改善を示し ている。サンプルスタック技術での解像度の喪失を起こすサンプルノくツファは 、分離カラムからの電気浸透流によって抽出され、更に、濃縮されたサンプルの 領域の分離は、在来の電気泳動条件の下で続けて行う。

＋ （」ン珈　°８ｘｖ）　ｌン　葦　コンロ（＊＠　Ｅ８ｖ　）　ｌし　７ｋ　（ ンロ手続補正書く方式） 平成６年１月、→７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．毛管電気泳動システムであって、 入口端および出口端を有する分離カラムと、該分離カラム内の補助バッファと、 前記分離カラム内に、サンプルバッファで希薄化されるサンプルであるサンプル 溶液のプラグを充填するためのサンプル導入手段と、前記入口端で前記分離カラ ムに導入される前記サンプルバッファで希薄化される前記サンプルの体積を検出 するための、注入検出器手段と、前記分離カラムの出口端でサンプルの成分を検 出するための分離検出器手段と、 前記分離カラムにそって電場を印加するための、電極手段を有する電源手段であ って、前記分離カラム内で、前記補助バッファと前記サンプル溶液との間の境界 でサンプルイオンを濃縮し、前記電極手段の電場の極性を切り替えることにより 前記カラムから前記サンプルバッファを抽出し、これにより前記サンプルをその 成分に分離するために前記電極手段の前記電場の極性を再度逆転することで前記 カラムにそって前記サンプルを移動させる、電源手段と、か成る毛管電気泳動シ ステム。 ２．前記分離カラムが毛管である、ところの請求の範囲第１項に記載の毛管電気 泳動システム。 ３．前記補助バッファを含むための第１および第２のバッファリザーバを更に有 し、 前記電源手段の前記電極手段を前記毛管にそって電場を印加するために配置され 、前記第１および第２のバッファリザーバが前記毛管の前記入口端および前記出 口端にそれぞれ配置されている、ところの請求の範囲第２項に記載の毛管電気泳 動システム。 ４．前記分離カラム内の前記サンプルバッファで希薄化される前記サンプルおよ び前記補助バッファを通過する電流の大きさを測定する測定手段をさらに有する 、ところの請求の範囲第１項に記載の毛管電気泳動システム。 ５．前記測定手段が、前記電源手段と前記電極手段との間で接続されている、と ころの請求項４項に記載の毛管電気泳動システム。 ６．前記注入検出器が、注入された前記サンプル溶液の体積を検出するため、前 記分離カラムの前記入口端から選択された距離に配置される、ところの請求の範 囲第１項に記載の毛管電気泳動システム。 ７．毛管電気泳動でサンプルの濃度を改良する方法であって、分離カラムを第１ のバッファで実質的に充填する工程と、前記分離カラム内で前記第１のバッファ を通過する電流の大きさを、前記分離カラムに第１の電圧を、前記第１の電流を 測定し、第１の電流値を決定するのに必要な時間の間印加することにより、測定 する工程と、サンプルを、前記第１のバッファよりも低い濃度を有する第２のバ ッファに用意することによりサンプル溶液を得る工程と、前記サンプル溶液のプ ラグを前記第１のバッファに近接した前記分離カラムに導入する工程と、 前記サンプルのイオンを前記第１のバッファと前記サンプル溶液との間の境界で 濃縮し、前記分離カラムに、第１の電圧とは反対の極性をもつ第２の電圧を印加 することにより前記第２のバッファを前記分離カラムから実質的に抽出し、前記 分離カラム内の前記サンプル溶液および第１のバッファを通る電流の大きさを同 時にモニターする工程と、 前記サンプルをその成分に分離するために、前記分離カラムに前記第２の電圧と 反対の極性をもつ第３の電圧を印加し、各成分が検出されるときに信号を与える ところの工程と、 から成る方法。 ８．前記第１のバッファが前記第２のバッファと同じ組成物である、ところの請 求項７項に記載の方法。 ９．前記第２のバッファが純水である、ところの請求の範囲第７項に記載の方法 。 １０．前記サンプル溶液の前記プラグが前記分離カラムに動水力的に導入される 、ところの請求の範囲第７項に記載の方法。 １１．前記サンプル溶液の前記プラグが前記注入検出器からの応答があるまで前 記分離カラムに導入される、ところの請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．前記サンプルの溶液の前記プラグの長さが前記分離カラムの長さの２％よ りも長い、ところの請求の範囲第１０項に記載の方法。 １３．前記サンプル溶液の前記プラグは、前記サンプル溶液の前記プラグの長さ が前記分離カラムの長さに匹敵するまで、前記分離カラムに導入される、ところ の請求の範囲第１０項に記載の方法。 １４．前記第１の電圧および前記第３の電圧が匹敵する値をもつ、ところの請求 の範囲第７項に記載の方法。 １５．前記分離カラムから前記第２のバッファを実質的に充填する工程が、前記 第１の電流とは反対の方向を有する第２の電流を達成するために第２の電圧を印 加し、そして前記第２の電流が増加し前記第１の電流値以下の選択された値に至 るまで前記第２の電圧を維持する工程から成るところの請求の範囲第７項に記載 の方法。 １６．前記第２の電流が前記第１の電流の実質的に９９％である、ところの請求 の範囲第１５項に記載の方法。 １７．正に帯電したサンプルのイオンの濃度を増加させることにより毛管電気泳 動を高性能に行う方法であって、 分離カラムを第１のバッファで実質的に充填する工程と、前記分離カラム内で前 記第１のバッファを通過する電流の大きさを、前記分離カラムにそって第１の電 圧を、前記第１の電流を測定し、第１の電流値を決定するのに必要な時間の間印 加することにより、測定する工程と、サンプルを、前記第１のバッファよりも低 い濃度を有する第２のバッファ内に用意することによりサンプル溶液を得る工程 と、前記サンプル溶液のプラグを前記第１のバッファに近接した前記分離カラム に心入する工程と、 正に帯電したサンプルのイオンを前記第１のバッファと前記サンプル溶液との間 の境界で濃縮し、前記分離カラムにそって、第１の電圧とは反対の極性をもつ第 ２の電圧を印加することにより前記第２のバッファを前記分離カラムから実質的 に抽出し、前記分離カラム内の前記サンプル溶液および第１のバッファを通る電 流の大きさを同時にモニターする工程と、前記サンプルをその成分に分離するた めに、前記分離カラムにそって前記第２の電圧と逆の極性をもつ第３の電圧を印 加し、各成分が検出されるときに信号を与えるところの工程と、 から成る方法。 １８．前記分離カラムがシリカ製壁を有する毛管である、ところの請求の範囲第 １７項に記載の方法。 １９．前記バッファが、前記毛管の前記シリカ製壁を正に帯電するために変性剤 を有する、ところの請求の範囲第方法。 ２０．前記変性剤がセチルトリメチルアンモニウム臭化物である、ところの請求 の範囲第第１９項項に記載の方法。 ２１．前記第１のバッファが前記第２のバッファと同じ組成物である、ところの 請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２２．前記第２のバッファが純水である、ところの請求の範囲第１７項に記載の 方法。 ２３．前記サンプル溶液の前記プラグが前記分離カラムに動水力的に導入される 、ところの請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２４．前記第１の電圧および前記第３の電圧が匹敵する値をもつ、ところの請求 の範囲第１７項に記載の方法。 ２５．前記分離カラムから前記第２のバッファを実質的に充填する工程が、前記 第１の電流とは反対の方向を有する第２の電流を達成するために第２の電圧を印 加し、そして前記第２の電流が増加し前記第１の電流値以下の選択された値に至 るまで前記第２の電圧を維持する工程から成るところの請求の範囲第１７項に記 載の方法。 ２６．前記第２の電流が実質的に前記第１の電流の実質的に９９％である、とこ ろの請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７．負に帯電したサンプルのイオンの濃度を増加させることにより毛管電気泳 動を高性能に行う方法であって、 分離カラムを第１のバッファで実質的に充填する工程と、前記分離カラム内で前 記第１のバッファを通過する電流の大きさを、前記分離カラムにそって第１の電 圧を、前記第１の電流を測定し第１の電流値を決定するのに必要な時間の間印加 することにより、測定する工程と、サンプルを、前記第１のバッファよりも低い 濃度を有する第２のバッファ内に用意することによりサンプル溶液を得る工程と 、前記サンプル溶液のプラグを前記第１のバッファに近接した前記分離カラムに 注入する工程と、 負に帯電したサンプルのイオンを前記第１のバッファと前記サンプル溶液との間 の境界で濃縮し、前記分離カラムにそって、第１の電圧とは反対の極性をもつ第 ２の電圧を印加することにより前記第２のバッファを前記分離カラムから実質的 に抽出し、前記分離カラム内の前記サンプル溶液および第１のバッファを通る電 流の大きさを同時にモニターする工程と、前記サンプルをその成分に分離するた めに、前記分離カラムにそって前記第２の電圧と逆の極性をもつ第３の電圧を印 加し、各成分が検出されるときに信号を与えるところの工程と、 から成る方法。 ２８．前記分離カラムがシリカ製壁を有する毛管である、ところの請求の範囲第 ２７項に記載の方法。 ２９．前記第１のバッファが前記第２のバッファと同じ組成物である、ところの 請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３０．前記第２のバッファが純水である、ところの請求の範囲第２７項に記載の 方法。 ３１．前記サンプル溶液の前記プラグが前記分離カラムに動水力的に導入される 、ところの請求の範囲第２７項に記載の方法。 ３２．前記第１の電圧および前記第３の電圧か匹敵する値をもつ、ところの請求 の範囲第２７項に記載の方法。 ３４．前記第２の電流が実質的に前記第１の電流の９９％である、ところの請求 の範囲第３３項に記載の方法。