JPH06504679A - ｒａｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

ｒａｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害本発明は、自然に発 生し、腫瘍形成との関係が示唆される活性型に散発的に変換する遺伝子であるｒ ａｓ遺伝子の発現阻害のための組成物と方法に関する。本発明はまた、活性型ｒ ａｓ遺伝子の特異的な阻害に関する。さらに本発明は、細胞と組織中のｒａｓ遺 伝子の正常型と活性型の検出に関し、これは研究と診断のための研究試薬とキッ トのための基礎を形成する。さらに、本発明はｒａｓ遺伝子の活性化によって生 ずる状態の処置に関する。 発明の背景 細胞増殖と分化を直接的または間接的に調節する細胞遺伝子の変換は、癌の主要 な原因と考えられる。ヒトの腫瘍形成との関係が示唆される、癌遺伝子と呼ばれ る遺伝子は約３０フアミリーある。そのようなファミリーのメンバーであるｒａ Ｓ遺伝子ファミリーは、しばしば、ヒト腫瘍中で突然変異を起こしていることが 見いだされる。正常状態においては、ｒａｓ遺伝子によって産生されるタンパク 質は、正常な細胞増殖と成熟に寄与していると考えられる。産生されるタンパク 質中の３つの重要な部位の１つにおいてアミノ酸の変換を生ずるｒａｓ遺伝子の 突然変異は、腫瘍形成との関係が示唆される型への変換を起こす。そのような突 然変異を持つ遺伝子は、′活性型”と呼ばれる。そのようなｒａｓ活性化を引き 起こす点突然変異は、発癌性物質や他の環境因子によって引き起こされ得ると考 えられる。９０％以上の肺腺癌、およそ５０％の結腸腺腫と腺癌、およそ５０％ の肺腺癌と甲状腺腫、および、急性骨髄性白血病やを髄異形成症候群といった血 液の悪性腫瘍の大部分が活性化されたｒａｓ癌遺伝子を有することが見つかって いる。全体としておよそ１０から２０％のヒト腫瘍が３つのｒａｓ遺伝子（Ｈ− ｒａｓ、に−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ）の１つに突然変異を有している。 現在のところ、特定の腫瘍細胞中で活性化されている癌遺伝子の発現を抑制する ことにより、細胞をより正常な増殖状態に戻しつると信じられている。たとえば 、Ｆｅｒａｍｉｓｃｏら（Ｎａｔｕｒｅ、３１４：６３９−６４２．１９８５年 ）は、活性化ｒａｓ遺伝子により悪性腫瘍化した細胞に、ｒａｓ遺伝子によって 産生されるタンパク質に結合する抗体をマイクロインジェクションすると、細胞 は増殖速度を低下さ也より正常な形態に変化する。このことは、典型的な癌細胞 の制御されない増殖における、活性化ｒａｓ遺伝子産物の関与を支持するものと 説明されている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌遺伝子の抑制は、様々な癌遺伝子ファ ミリーの役割を理解するための有用な道具であるということが証明されている。 “アンチセンスオリゴヌクレオチド”とは、その遺伝子の「センス」、またはコ ーディング鎖に相補的な小さなオリゴヌクレオチドを意味し、これは結果として その遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対してもまた相補的であり、これに対しても特異 的にハイブリダイズしつる。Ｈｏ１ｔら（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、８． ９６３−９７３．１９８８年）は、癌遺伝子ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ転写物に特異 的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、培養されたＨＬ− ６０白血病細胞に添加すると、増殖が抑制され、分化が誘導されることを示した 。 Ａｎｆｏｓｓｉら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８６．３３７９ −３３８３．１９８９年）は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子のｍＲＮＡ転写物に特異的に ハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト骨髄性白血病細胞 株の増殖を抑制することを示した。Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　 １゜Ａｃａｄ、５ｃｉ−，８５，１０２８−１０３２，１９８８年）は、培養し たＨＬ６０白血病細胞の増殖と同様に、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子のタンパク質産物の 発現が、ｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリ ゴヌクレオチドによって抑制されることを示した。米国特許４８７１８３８　（ Ｂｏｓら）は、Ｎ−ｒａｓの第１３コドン中の突然変異を検出するための、その 変異に相補的なオリゴヌクレオチドを開示している。 これら全てのケースにおいて、修飾されていないオリゴヌクレオチドの不安定性 が主要な問題点である。これらは細胞内酵素により分解されるからである。ＰＣ Ｔ／ＵＳ８８１０１０２４　（Ｚｏｎら）は、ＨＬ−６０白血病細胞の増殖およ びこれらの細胞中のＤＮＡ合成を抑制するための、増幅されたｃ−ｍｙｃ癌遺伝 子の翻訳開始領域にハイブリダイズするフォスフォロチオエート誘導体オリゴヌ クレオチドの作用を開示した。Ｔｉｄｄら（Ａｎｔ　１−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕ ｇＤｅｓｉｇｎ、３，１１７−１２７．１９８８年）は、活性化されたＮ−ｒａ Ｓ癌遺伝子に特異的にハイブリダイズするメチルフォスフォネート誘導体アンチ センスオリゴヌクレオチドを検討し、これが生化学的分解に耐性であり、培養し たヒトＨＴ２９細胞に毒性を示さない一方で、これがＮ−ｒａｓ遺伝子の発現を 抑制せず、この細胞に影響を与えないことを見いだした。Ｃｈａｎｇら（Ａｎｔ ｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、４，２２１−２３２．１９８９年 ）は、Ｂａ１ｂ−ｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に特異的にハイブリダイズする 、メチルフォスフォネート誘導体およびフォスフォロチオエート誘導体オリゴヌ クレオチドの両方が、インビトロにおいてこの遺伝子のタンパク質産物の翻訳を 抑制しうることを示した。Ｃｈａｎｇらが使用したアンチセンスオリゴヌクレオ チドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、ｒａｓ遺伝子の翻訳開始領域に特異的 にハイブリダイズするため、これらオリゴヌクレオチドの、ｒａｓ遺伝子の正常 型（野生型）と変異型（活性化型）に対する結合能力の比較は行われなかった。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、即座に治療が施されない場合には突然の死をしばしば引き 起こす遺伝病であるｌｏｎｇＱ−Ｔ症候群と呼ばれる重篤な心不整脈との関係が 示唆されている。乱れた鼓動の始まりには前兆がないことがしばしばである。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子が正確にＩｏｎｇＱ−Ｔ症候群の原因であるかはどうかははっ きりしない。しかし、この症候群の遺伝と第１１染色体上のＨ−ｒ　ａ　ｓ遺伝 子周辺領域の特定の変異の存在との間には、非常に高い相関がある。このため、 Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、１ｏｎｇＱ−Ｔ症候群による心臓突然死の高リスクの優れ た指標となる。 ｒａｓ遺伝子の発現を調節しうる構成物の提供と、そして特に活性化型ｒａｓ遺 伝子の発現を特異的に調節する構成物の提供が強く望まれている。動物における ｒａｓ遺伝子の検出と診断の方法の提供が強く望まれている。また、ｒａｓ遺伝 子活性化から生ずる病態の診断と治療の方法を提供することが望まれている。 加えて、ｒａｓ遺伝子の検出と研究のための、改良された研究キットと試薬が望 まれている。 本発明は、哺乳類ｒａｓ遺伝子に由来するＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハイブ リダイズしつるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を提供する ことを目的とする。 また本発明は、アンチセンスとｒａｓ遺伝子から産生ずるｍＲＮＡとの相互作用 によりｒａｓ遺伝子の発現を調節しつるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ オチド誘導体を提供することを目的とする。 また本発明は、ｒａｓ遺伝子の活性化された変異型のｍＲＮＡに選択的にハイブ リダイズしつるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を提供する ことを目的とする。 また本発明は、ｒａｓ　ｍＲＮＡの変異した第１２コドン領域とオリゴヌクオチ ドまたはオリゴヌクレオチド誘導体とのハイブリダイズによって、ｒａｓ遺伝子 の活性型の発現を特異的に抑制することを目的とする。 また本発明は、ｒａｓ遺伝子の正常型（野生型）から活性型への変異を検出する ことを目的とする。 また本発明は、活性化したｒａｓ遺伝子の存在に起因する、形態的に類似した腫 瘍を区別する診断および高リスク状態の同定を目的とする。 また本発明は、ｒａｓ遺伝子の野生型から変異型（すなわち活性型）への変異に 起因する病態の診断と治療の方法の提供を目的とする。 発明の要約 本発明にしたがって、ヒトｒａｓ遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的 にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体が提 供される。このオリゴヌクレオチドは、そのような特異的なハイブリダイゼーシ ョンを果たすために充分な同一性と数のヌクレオチド単位から構成される。好ま しくは、このオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体は、遺伝子の 転写開始コドンと特異的にハイブリダイズし、また好ましくはこのオリゴヌクレ オチドはＣＡＴの配列を含む。他の好ましい態様によれば、活性化Ｈ−ｒａｓ遺 伝子の第１２コドンと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびオ リゴヌクレオチド誘導体が提供され、これらは好ましくはＧＡＣの配列を含む。 他の好ましい態様においては、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子の変異した第１２コドン と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘 導体が提供される。この態様においては、そのようなオリゴヌクレオチドまたは オリゴヌクレオチド誘導体は好ましくはＧＡＣの配列を含む。そのようなオリゴ ヌクレオチドは、薬学的に受容しうる担体中に含まれることが都合よくそして望 ましい。 他の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド誘導体は 、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少な（ともいくつかの結合基が、 フォスフォロチオエート部分等の硫黄含有化学種を含むように形成される。 他の態様によれば、本発明は、細胞または組織中のヒトｒａｓ遺伝子の発現を調 節する方法、および、活性化を誘導する変異を有していると疑われる細胞または 組織中において、活性化されたｒａｓ遺伝子の発現を特異的に調節する方法に関 する。また本発明は、細胞または組織中のｒａｓ遺伝子を検出する方法、および 、前述の変異を起こした遺伝子を有していると疑われる細胞または組織中の活性 化ｒａｓ遺伝子を特異的に検出する方法に関する。この方法は、前述の遺伝子の 作用を阻害し、または検出するために、本発明にしたがうオリゴヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチド誘導体と、ヒトｒａｓ遺伝子を含むと疑われる細胞また は組織とを接触させることを含む。 さらに別の態様によれば、本発明は、ｒａｓ遺伝子の活性化を誘導する変異を有 すると疑われる動物の診断法と治療法に関する。この方法は、この遺伝子の発現 を調節し、この遺伝子の活性化によって生ずる状態を治療し、またはその診断を 行うために、動物、細胞、組織または体液と本発明にしたがうオリゴヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチド誘導体とを接触させることを含む。 図面の簡単な説明 図１は、Ｈ−ｒａｓ転写開始コドン（ＡＵＧ）を標的としたオリゴヌクレオチド を使用したｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑制の用量依存性を示 す棒グラフである。発現は、ルシフェリンを添加した時に発する光の量によって アッセイされたルシフェラーゼ活性の測定によって定量される。 図２は、活性化Ｈ−ｒａｓの変異した第１２コドン領域を標的としたオリゴヌク レオチドを使用したｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑制の用量依 存性を示す棒グラフである。発現は、ルシフェリンを添加した時に発する光の　 量によってアッセイされたルシフェラーゼ活性の測定によって定量される。 図３は、アンチセンスフォスフォチオエート化合物によるｒａｓ−ルシフェラー ゼ融合タンパク質の発現の単一用量による抑制を示す棒グラフである。発現は、 ルシフェリンを添加した時に発する光の量によってアッセイされたルシフェラー ゼ活性の測定によって定量される。 図４は、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子と特異的にハイブリダイズしうる１３のアンチ センスヌクレオチドのデータを要約した表および棒グラフである。それぞれのオ リゴヌクレオチドについて、その長さ、特異的にハイブリダイズする活性化ｒａ Ｓ遺伝子の領域、ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑制活性を示す 。 発明の詳細な記述 悪性腫瘍は、癌細胞に特徴的な制御された増殖の喪失、すなわち連続的な制御不 能の増殖、周辺組織への侵入能力、および他の臓器への転移能力を誘導する、一 連の段階的で進行性の変化を通して発達する。厳密に制御されたインビトロの研 究によって、正常細胞と癌細胞の増殖を性格付ける因子が定義され、細胞増殖と 分化を制御する特定のタンパク質が同定されてきた。さらに、厳密に制御された 定量的なインビトロアッセイで細胞の形質転換を研究することが可能であること によって、形質転換した細胞の表現型を誘導しつる特定の遺伝子が同定されてき た。そのような癌の原因遺伝子または癌遺伝子は、それらが産生ずるタンパク質 の発現調節の変化を誘導する突然変異によって形質転換誘導能を獲得すると信じ られている。ある場合には、そのような変化はプロモーターやエンハンサ−とい った非コード調節領域のＤＮＡ中において起こり、癌遺伝子の転写活性の変化を 誘導し、その遺伝子産物の過剰または過小産生を引き起こす。他の場合には、遺 伝子変異は癌遺伝子のコード領域内において起こり、非活性、過剰な活性または 正常型（野生型）の遺伝子産物とは異なった活性を示す遺伝子産物の産生を誘導 する。 今日までに３０以上の細胞性癌遺伝子ファミリーが同定されている。これらの遺 伝子は、それらの細胞内局在とそれらのタンパク質産物の推定上の作用機構によ って分類することができる。ｒａｓ癌遺伝子は、細胞膜の内側に存在する類縁タ ンパク質をコードする遺伝子ファミリーのメンバーである。ｒａｓタンパク質群 はアミノ酸レベルで高度に保存され、ＧＴＰに対して高親和性かつ特異的に結合 し、そしてＧＴＰａｓｅ活性を有している。細胞内におけるｒａｓ遺伝子産物の 機能は明らかでないが、ＧＴＰ結合タンパク質、またはＧタンパク質として知ら れている信号伝達タンパク質群とかなりの配列ホモロジーを有するという生化学 的性質は、ｒａｓ遺伝子産物が細胞膜を介しての細胞外信号の伝達に関係して、 基本的な細胞調節機能において基礎的な役割を果たしていることを示唆する。 Ｈ−ｒａｓ、に−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓと呼ばれる３つのｒａｓ遺伝子は、 哺乳類のゲノム中で同定されている。哺乳類ｒａｓ遺伝子は、それらのコード配 列内の単一の点突然変異により形質転換を誘導する性質を獲得する。自然に発生 するｒａｓ癌遺伝子中の突然変異は、第１２番、第１３番、第６１番のコドンに 存在する。ヒト腫瘍中で見つかる活性型ｒａｓ変異で最もよ（検出されるのは、 Ｈ−ｒａｓ遺伝子の第１２コドン中の変異であり、これはＧＧＣからＧＴＣへの 塩基の変化によりｒａｓタンパク質産物のＱＴＰａｓｅ調節領域中のグリシンか らバリンへの変化をもたらす。この単一アミノ酸の変化はｒａｓタンパク質機能 の正常な調節を喪失させると考えられ、それにより正常に制御された細胞タンパ ク質を常に活性なタンパク質に変換する。そのような正常ｒａｓタンパク質機能 の膜制御が、正常から悪性の増殖への形質転換の原因であると信じられている。 本発明は、ヒトｒａｓ癌遺伝子発現抑制のためのオリゴヌクレオチドおよびオリ ゴヌクレオチド誘導体を提供する。本発明はまた、ｒａｓの変異型発現を選択的 に抑制するのためのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を提供 する。 本発明においては、「オリゴヌクレオチド」との用語は、天然に生ずる塩基と天 然のフォスフオシエステル結合によって結合したフラノシル基から形成される複 数の結合したヌクレオチド単位を意味する。この用語は、天然に生ずる化学種ま たは天然に生ずるサブユニットから構成される合成された化学種について用いら れる。 本発明において使用される「オリゴヌクレオチド誘導体」との用語は、オリゴヌ クレオチドと同様に機能するが、天然には生じない部分を有しているものを意味 する。したがって、オリゴヌクレオチド誘導体は変換された糖部分または糖体結 合を有していてもよい。これらのうちで典型的なものは、フォスフォロチオエー トおよび当該技術分野で使用されることが知られている他の硫黄含有化学種であ る。これらは変換された塩基単位または本発明の精神と一致した他の修飾を含む 。 特定の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドの少な（ともいくつかのフォ スフオシエステル結合は、活性を調節すべきＲＮＡが存在する細胞内領域に侵入 するための組成物の能力を増強し、かつ、細胞内酵素による分解に対する組成物 の耐性をより高めるように機能する構造によって置換される。そのような結合に は硫黄を含むことが好ましい。現時点では、そのような置換はフォスフォロチオ 工−ト結合を含むことが好ましい。他の結合、たとえばアルキルフォスフォチオ 工−ト結合、　Ｎ−アルキルフォスフォアミデート、フォスフォロジチオエート 、アルキルフォスフォネート、および短鎖のアルキルまたはシクロアルキル構造 もまた有用である。他の好ましい態様によれば、フォスフオシエステル結合は、 実質的には同時に非イオン性かつ非キラルである構造、あるいは、配列特異的で ありかつ実質的にキラルである構造と置換される。当業者は、本発明の実施にお いて使用するための他の結合を選択し得るであろう。 オリゴヌクレオチド誘導体はまた、少なくともいくつかの修飾した塩基の形を含 有する化学種を含んでいてもよい。したがって、自然界において通常観察される もの以外のプリンおよびピリミジンを使用してもよい。そのような一つの態様に よれば、一つまたは複数の塩基は２−（アミノ）アデニンを含む。他のそのよう な態様では、一つまたは複数の塩基は、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（ アルキルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（ア ミノアルキルアミノ）アデニン、または他のへテロ置換アルキルアデニンを含む 。同様に、本発明の本質的な教示にしたがう限り、ヌクレオチド単位のフラノー ス部分の修飾もまた起こりうる。 そのような誘導体は、天然のオリゴヌクレオチド（または天然のラインに沿った 合成オリゴヌクレオチド）と機能的に交換可能であることについて最もよく記述 されるが、天然の構造と一つまたは複数の違いを有している。全てのそのような 誘導体は、ｒａｓ遺伝子またはこれに由来するｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｒ ａｓ遺伝子の機能または発現を抑制するために効果的に機能する限り、本発明に 包含される。 本発明にしたがうオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、好ま しくは約１０から約３０のサブユニットを含む。より好ましくは、そのようなオ リゴヌクレオチドおよび誘導体は約１５から約２５のサブユニットを含む。当業 者には理解されるように、サブユニットとは、フォスフオシエステルまたは他の 結合により隣合うサブユニットに適当に結合する一つの塩基と糖の組み合わせで ある。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、Ｈ−ｒ　ａ　 ｓ遺伝子に由来するメツセンジャーＲＮＡとハイブリダイズしつるように設計さ れる。そのようなハイブリダイゼーションは、それが達成される際には、そのメ ツセンジャーＲＮＡの正常な役割を抑制し、細胞中におけるその機能の喪失を生 ずる。抑制されるべきメツセンジャーＲＮＡの機能は、タンパク質への翻訳場所 へのＲＮＡの移動、ＲＮＡからタンパク質への実際の翻訳、一つまたは複数のｍ ＲＮＡ種の生成のためのＲＮＡのスプライシング、および、恐らくはＲＮＡ自身 によって行われるかも知れない独立の異化活性等の、生体に重要な全ての機能を 含む。ＲＮＡ機能のそのような抑制の全体としての効果は、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の 発現の抑制である。Ｎ−ｒａｓ、に−ｒａｓといった他の哺乳類のｒａｓ遺伝子 のタンパク質産物は、最初の８５アミノ酸に渡ってＨ−ｒａｓと同一である。３ つのｒａｓ遺伝子の塩基配列は、同一ではないが、周知であり、当業者はＮ−ｒ ａＳおよびに−ｒａｓ遺伝子と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチ ドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を調製する指針として本発明を使用し得るで あろう。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、診断、治療、 および研究試薬とキットとして利用し得る。本発明のオリゴヌクレオチドおよび オリゴヌクレオチド誘導体は、ｒａｓ遺伝子とハイブリダイズするため、この事 実を利用するサンドイツチ法または他のアッセイ法が容易に構築可能である。さ らに、本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体はｒａｓ遺 伝子の変異型（活性化型）に特異的にハイブリダイズするため、細胞もしくは組 織の野生型のｒａｓから活性型のｒａｓへの変換をスクリーニングするためのア ッセイを工夫し得る。そのようなアッセイは、形態的に類似の腫瘍を区別する診 断や、ｒａｓ遺伝子の活性化に由来して高まる癌のリスクの検出に利用し得る。 オリゴヌクレオチドまたは誘導体のｒａｓ遺伝子とのハイブリダイゼーションを 検出するための手段のための準備は、日常的に成し得る。そのような準備は、酵 素コンジュゲーション、放射活性ラベルまたは他の適当な検出システムを含み得 る。 ｒａｓ遺伝子または活性化ｒａｓ遺伝子の存在または不在を検出するキットもま た製造しつる。 以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではな い。 修飾されていないオリゴヌクレオチドは、標準のヨードによる酸化およびフォス フォアミデート化学を用いて、自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。 ｓｙｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ）で合成した。フォスフォチオネートオ リゴヌクレオチドのためには、亜リン酸結合の段階的なチオ化（ｔｈｉａｔｉ。 ｎ）のために、標準酸化ボトルを、０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール −３−オン　１．１−ジオキサイド溶液を含むアセトニトリルに交換した。チオ 化の待ち段階は６８秒に延ばし、続いてキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラ ムからの分離および濃縮水酸化アンモニウム中での脱ブロック（５５℃、１８時 間）の後、オリゴヌクレオチドを２．５倍体積のエタノールと０．５Ｍ塩化ナト リウムで２回沈澱させて精製した。分析ゲル電気泳動は、２０％アクリルアミド 、８Ｍ尿素、４５４ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ＝７．０で行った。オリゴ ヌクレオチドとフォスフォロチオエートは、完全長物質が８０％以上であること をポリアクリルアミドゲル電気泳動から判断した。 実施例２　ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築この研究において記述 されるｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ＰＣＲ技術を用いて構築さ れた。変異型（第１２コドン）と非変異型（野生型）ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子のエ クソン１の５′領域のＰＣＲによるクローニングのプライマーとして使用するた めに、オリゴヌクレオチドブライマーを合成した。Ｈ−ｒａｓ遺伝子の鋳型は、 ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から購入した（ＡＴＣＣ番号４１０００．４１ ００１）、、ｔｌＪゴヌクレオチドＰｃＲプライマー５’　−ＡＣＡ−ＴＴＡ− ＴＧＣ−ＴＡＧ−ＣＴＴ−ＴＴＴ−ＧＡＧ−ＴＡＡ−ＡＣＴ−ＴＧＴ−ＧＧＧ− ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＡＣ−ＣＣＴ|ＧＴ−３゜ （センス、配列ＩＤ番号ニア）、および５°−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ −ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＡＴＧ−ＧＴＣ−ＡＧＣ−ＧＣ−３’　（７ンチセンス、配 列ＩＤ番号同第）を、変異型と非変異型Ｈ−ｒａｓ遺伝子を鋳型として用いる標 準ＰＣＲ反応において使用した。これらのプライマーは、ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩ ［ｒ制限酵素部位に接した、正常および変異Ｈ−ｒａｓの配列−５３から＋６５ （転写開始部位に対して）に相当する１４５塩基対のＤＮＡ産物を作ることが期 待される。ＰｃＲ産物は、標準的な方法によりゲル精製し、沈澱し、洗浄し、そ して水に再懸濁した。 Ｐ、ｐｙｒａｌｉｓ　（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのため のＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物がアミノ末端のメチオニン残基を除いて完全 長のルシフェラーゼタンパク質をコードするように設計された。このメチオニン 残基はアミノ末端がリジン、続いてロイシンという２つのアミノ酸で置き変わら れるようにした。ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのために使用されたオリ ゴヌクレオチドブライマーは、 ５°−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴＧ−＾ＡＧ−ＡＣＧ−ＣＣＡ−Ａ ＡＡ−ＡＣＡ−ＴＡＡ−ＡＧ−３’　（センス、配列ＩＤ番号＝９）および ５’−ＡＣＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＧＣＧ−ＣＧＣ−ＣＧＡＡ−ＴＡＣ−ＣＧＴ− ＣＧＡ−ＣＣＴ−ＣＧＡ−３’　（７ンチセンス、配列■Ｄ番号＝１０）であり 、これらを使用してルシフェラーゼレポーター遺伝子を鋳型として含む商業的に 入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃ１゜ｎｔｅｃｈ社）を用い る標準的なＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓ ５ＨＩＩ制限酵素部位に接した約１．９ｋｂのルシフェラーゼ遺伝子に相当する 産物を与えることが期待された。この断片は、標準的な方法にょリゲル精製し、 沈殿し、洗浄し、そして水に再懸濁した。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の構築を行うために、ｒａｓおよ びルシフェラーゼのＰＣＲ産物を適当な制限酵素により切断し、制限酵素Ｎｈｅ Ｉ、ＨｉｎｄＩ［［、およびＢｓ５Ｈ］Ｉを用いて、３部分のライゲーションに よって、ステロイドで誘導されるマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）のプロモータ ーを含む発現ベクター中にクローン化した。この結果、ホタルのルシフェラーゼ 遺伝子にフレームがあった形で融合されたＨ−ｒａｓの配列（−５３から＋６５ ）の挿入を含むクローンが得られた。このようにして得られた発現ベクターは、 ステロイド誘導性のＭＭＴＶプロモーターによって発現が調節されるｒａｓ−ル シフェラーゼ融合産物をコードする。 実施例３　プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクショントランスフェク ションは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ。 Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｒ，Ｂｒｅｎｔ 。 Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、Ｊ、Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｊ、 Ｇ。 Ｓｅｉｄｍａｎ、に、５ｔｒａｈ１編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎ ｓ、ＮＹ）中のＭ、Ｅ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによる記載を以下のように変更して 行った。Ｈｅ１ａ細胞を、５Ｘ１０’細胞／デイツシユになるように６０ｍｍの ディツシュに播種した。全部で１０μｇのＤＮＡを各ディツシュに添加したが、 このうち９μｇはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミドであり、１Ｍｇ は、恒常的に発現するラウス肉腫ウィルス（Ｒ８Ｖ）プロモーターにより調節さ れるラットグルココルチコイド受容体を発現するベクターであった。１６から２ ０時間後に、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物を、３ｍＭ　ＥＧＴＡを含むトリ ス緩衝生理食塩液（５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７，５）　、１５０ｍＭ　塩化 ナトリウム）で洗浄して除去した。次に、１０％牛脂児血清を含む新鮮な培地を 細胞に添加した。この時点において、レポーター遺伝子発現をデキサメタシンで 活性化する前に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理した。 −ＭＥＭ　（ギブコ社）で細胞を３回洗浄した。１０μｇ／ｍｌのＮ−［１−（ ２゜３−ジオレイルオキシ）プロピル〕〜Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−トリメチルアンモニ ウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）を含む２ｍｌのＯｐｔ　ｉ−ＭＥＭを、各 ディツシュに添加し、オリゴヌクレオチドを直接添加して、３７℃で４時間イン キュベートした。次に、Ｏｐｔ　ｉ−ＭＥＭを除去し、オリゴヌクレオチドを含 む適当な増殖培地で置き換えた。この時点において、最終濃度０．２μＭのデキ サメタシンで細胞を処理することにより、レポーター遺伝子の発現を活性化させ た。ステロイド処理から１２〜１６時間後に細胞を回収した。 実施例５　ルシフェラーゼのアッセイ ルシフェラーゼは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅ１．Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ 。 Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、ＭｏｏｒｅＳＪ、Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｊ、Ｇ、Ｓｅ ｉｄｍａｎ、に、５ｔｒａｈｌ＆Ｉ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　Ｉｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎ ｓ、ＮＹ）中のＭ、Ｅ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによる記載にしたがって、界面活性 剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００による細胞溶解物から抽出した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ　 ＭＬ１０００ルミノメータ−を用いて、６２５μＭのルシフェリン（シグマ社） の添加により発生する蛍光のピークを測定した。アッセイの直線域にデータが確 かに集まるように、各抽出物毎に抽出物の量を変えて、ルシフェラーゼアッセイ を複数回行った。 実施例６　ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチ ドによる阻害 前述の実施例中に記載されたｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子システム を使用して、Ｈ−ｒａｓの翻訳開始コドン、または活性化Ｈ−ｒａｓの第１２コ ドン点突然変異部を標的とした一連のアンチセンスフォスフォロチオエート誘導 体をスクリーニングした。この最初のシリーズのうち、６つのオリゴヌクレオチ ドが、有意にそして再現性をもってｒａｓ−ルシフェラーゼ活性を阻害すること が同定された。これらオリゴヌクレオチド（全てフォスフォロチオエート誘導体 ）の塩基配列、配列参照番号および配列ＩＤ番号を表１に示す。 嚢１ オリゴヌクレオ チド　参照番号　配列　配列ＩＤ番号 ２５０２　ＣＴｒ　ＡＴＡ　ＴＴＣＣＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＣＴＣ１２５０３ＴＣ ＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＧＧ　２　’２５７０　ＣＣＡ　ＣＡ ＣＣＧＡ　ＣＧＧ　ＣＧＣＣＣ３２５７１ＣＣＣＡＣＡ　ＣＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣ Ｇ　ＣＣＣＡ　４２５６６　ＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣ５２ ５６０ＴＧＣＣＣＡ　ＣＡＣＣＧＡ　ＣＧＧ　ＣＧＣＣＣＡ　ＣＣ６図４は、正 常なｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子または変異型ｒａｓ−ルシフェラ ーゼレポーター遺伝子を発現する細胞を、フォスフォロチオエートオリゴヌクレ オチド誘導体２５０３　（配列ＩＤ番号：２）の濃度を増加させて処理した用量 依存性試験を示す。この化合物は、Ｈ−ｒａｓのＲＮＡ転写物の翻訳開始コドン を標的としている。図１に示すように、このオリゴヌクレオチドによる細胞の処 理はｒａｓ−ルシフェラーゼ活性の阻害をもたらし、正常型および変異型の標的 ｒａｓのいずれも約５０ｎＭのＩＣ５０値を示した。対照オリゴヌクレオチドは ２０塩基対のランダムなフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体であ る。結果は、オリゴヌクレオチドで処理していないトランスフェクトした細胞の ルシフェラーゼ活性に対するパーセンテージで表現される。ｒａｓ翻訳開始コド ンを標的としたオリゴヌクレオチドが変異型、正常型ｒａｓの両方の発現を同程 度減少させるという観察は、２つの標的がＡＵＧ翻訳開始部位を囲む領域中で同 一の配列組成を有していることがら予期される。 図２は、変異型（活性型）Ｈ−ｒａｓ　ＲＮＡの第１２コドン点突然変異を標的 とした化合物である、フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体２５７ ０（配列ＩＤ番号＝３）で細胞を処理した用量依存性試験を示す。対照オリゴヌ クレオチドは２０塩基対のランダムなフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチ ド誘導体である。結果は、オリゴヌクレオチドで処理していないトランスフェク トした細胞のルシフェラーゼ活性に対するパーセンテージで表現される。図に示 すように、このオリゴヌクレオチドの濃度を増加させて細胞を処理した結果、変 異型または正常型のｒａｓ−ルシフェラーゼを発現する細胞中のｒａｓ−ルシフ ェラーゼ活性はいずれも用量依存的に阻害された。しかし、データをよく検証す ると、低濃度においてオリゴヌクレオチド２５７０は、正常型に比較して変異型 のｒａｓ−ルシフェラーゼに対し約３倍の選択性を示すことが示されている。 事実、オリゴヌクレオチド２５７０は、変異型ｒａｓ−ルシフェラーゼでは約１ １００ｎというＩＣ５０値を示したのに対し、非変異型に対しては約２５０ｎＭ というＩＣ５０値を示した。 図３は、正常型または変異型のｒａｓ−ルシフェラーゼを発現する細胞を、Ｈ− ｒａｓの翻訳開始コドンまたは第１２コドン点突然変異を標的としたオリゴヌク レオチドにより単一用量（領　５μＭ）で処理した典型的な試験結果を示す。 試験されたアンチセンスフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体は表 １に示される。対照オリゴヌクレオチド（２５０４）は、２０塩基対のランダム なフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体である。結果は、オリゴヌ クレオチドで処理していないトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性に 対するパーセンテージで表現される。図３に示すように、ｒａｓ−翻訳開始コド ンを標的とした化合物２５０３　（配列ＩＤ番号＝２）は、最もｒａｓ−ルシフ ェラーゼ活性の阻害作用が強かった。活性化ｒａｓの第１２コドン点突然変異を 標的としたこれらの３つの化合物の中で、１７ｍａｒのオリゴヌクレオチド２５ ７０（配列ｒＤ番号：３）のみが正常型に対する場合と比較して変異型ｒａｓ− ルシフェラーゼに対して選択的であることが示された。このことはまた、活性化 Ｈ−ｒａｓ遺伝子に相補的な１３のアンチセンスオリゴヌクレオチドの全て、不 規則な対照オリゴヌクレオチド（１９６６）、および野生型ｒａｓの第１２コド ンに相補的な対照オリゴヌクレオチド（２９０７）について得られたデータを要 約した図４にも示されている。各オリゴヌクレオチドについて、その長さ、相補 的な領域、およびｒａｓ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現抑制活性が示さ れている。第１２コドン点突然変異を標的としたより長いフォフフォロチオエー トは、ｒａＳ−ルシフェラーゼ発現に対する実質的なアンチセンス活性を示すの に対し、変異型のｒａｓ−ルシフェラーゼ発現の選択的な阻害を示さなかった。 １７ヌクレオチド長以下の、第１２コドン点突然変異を標的としたフォスフォロ チオエートオリゴヌクレオチドは、いずれの型のｒａｓ−ルシフェラーゼに対し ても活性を示さなかりた。これらの結果は、ｒａｓ−配列を標的としたフォスフ ォロチオエートオリゴヌクレオチドの効果的なアンチセンス活性を示す。 実施例７２−（アミノ）アデニン−置換オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレ オチドおよびフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体は、以下の例外 を除いて実施例１にしたがって合成される。すなわち、２−（アミノ）アデニン が好ましい部位においては、標準フォスフォアミダイトを商業的に入手可能な２ −アミノデオキシアデノシン　フォスフォアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）で 置き換える。 実施例８　ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現の２−（アミノ）アデニン−修飾 型アンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害活性化ｒａｓの第１２コドン点突 然変異に相補的な一連のアンチセンスフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチ ド誘導体は、実施例７に記載されているように合成され、変異した第１２コドン のウラシルに相補的な部位に２−（アミノ）アデニンを有する。アデニンの２位 のアミノ基はウラシルの２位の酸素と水素結合しつるため、通常の２つの水素結 合と異なり３つの水素結合が形成される。このことは、この部位における修飾さ れたＡ−Ｇミスマツチのために野生型コドンに対する二〇オリゴの安定性を非安 定化するか、または影響を与えないにもかかわらず、活性化ｒａｓ遺伝子に対す る２−（アミノ）アデニン修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダ イゼーションを大きく安定化するのに寄与する。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ＝２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ ハイポセティカル配列二ＮＯ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＣＴｒＡＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣ２０配列番号：２ 配列の長さ＝２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ ハイボセティカル配列＝ＮＯ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧ　ＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ　２０配列番号：３ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ ハイポセティカル配列二ＮＯ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ１７配列番号＝４ 配列の長さ＝１９塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ ハイポセティカル配列二ＮＯ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡ　ＣＧＧＣＧＣＣＣＡ　１９配列番号：５ 配列の長さ：２１塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ ハイポセティカル配列二Ｎ。 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 ＧＣＣＣＡＣＡＣＣＧ　ＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡ　Ｃ２１補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる、１０から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチド誘導体。
2. ２．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コドンと特異的にハイブ リダイズしうる、請求項１記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド 誘導体。
3. ３．薬学的に受容しうる担体中の請求項１記載のオリゴヌクレオチドまたはオリ ゴヌクレオチド誘導体。
4. ４．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド単位間結合基が硫 黄含有化学種を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド誘導体。
5. ５．前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエートを含む請求項４記載のオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体。
6. ６．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的に ハイブリダイズしうる、次のいずれかの配列：５′−−−−−−−−−−−−− ３′ 【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号： ２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番 号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列Ｉ Ｄ番号：６）を含む、オリゴヌクレオチまたはオリゴヌクレオチド誘導体。
7. ７．薬学的に受容しうる担体中の請求項６記載のオリゴヌクレオチドまたはオリ ゴヌクレオチド誘導体。
8. ８．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド単位間結合基が硫 黄含有化学種を含む、請求項６記載のオリゴヌクレオチまたはオリゴヌクレオチ ド誘導体。
9. ９．前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエートを含む請求項８記載のオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体。
10. １０．ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子の発現を調節する方法であって、該遺伝子を含む組 織または細胞を、ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮ Ａと特異的にハイブリダイズしうる１０から３０ヌクレオチド単位を含むオリゴ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体と接触させることを含む方法。
11. １１．前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が、ヒトＨ−ｒ ａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コドンと特異的にハイブリダイズしうる 、請求項１０記載の方法。
12. １２．前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が、次のいずれ かの配列： ５′−−−−−−−−−−−−−３′ 【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号： ２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番 号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列Ｉ Ｄ番号：６）を含む、請求項１０記載の方法。
13. １３．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド単位間結合基が 硫黄含有化学種を含む、請求項１０記載の方法。
14. １４．前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエートを含む、請求項１３記載の 方法。
15. １５．細胞または組織中のＨ−ｒａｓ遺伝子の存在を検出する方法であって、該 細胞または組織を、ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲ ＮＡと特異的にハイブリダイズしうる１０から３０ヌクレオチド単位からなるオ リゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体と接触させることを含む方法 。
16. １６．前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が、ヒトＨ−ｒ ａｓ遺伝子の翻訳開始部位または第１２コドンと特異的にハイブリダイズしうる 、請求項１５記載の方法。
17. １７．前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が、次のいずれ かの配列： ５′−−−−−−−−−−−−−３′ 【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号： ２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番 号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列Ｉ Ｄ番号：６）を含む、請求項１５記載の方法。
18. １８．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド単位間結合基が 硫黄含有化学種を含む、請求項１５記載の方法。
19. １９．前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエートを含む、請求項１８記載の 方法。
20. ２０．特定のオリゴヌクレオチドが活性化されたＨ−ｒａｓと野生型のＨ−ｒａ ｓに対して異なる親和性を有することに基づいて、活性化されたＨ−ｒａｓを検 出する方法であって、活性化Ｈ−ｒａｓを含むと疑われる細胞または組織をオリ ゴヌクレオチド： ５′−【配列があります】−３′（配列ＩＤ番号：３）と接触させ、かつ、細胞 または組織の同一のサンプルを次のいずれかのオリゴヌクレオチド： ５′−−−−−−−−−−−−−３′ 【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号： ２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番 号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列Ｉ Ｄ番号：６）と接触させることを含む方法。
21. ２１．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド単位間結合基が 硫黄含有化学種を含む、請求項２０記載の方法。
22. ２２．前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエートを含む、請求項２１記載の 方法。
23. ２３．Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化により生ずる状態を処置する方法であって、 動物を、ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異 的にハイブリダイズしうる１０から３０ヌクレオチド単位からなるオリゴヌクレ オチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体と接触させることからなる方法。
24. ２４．前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が次の配列：５ ′−【配列があります】−３′（配列ＩＤ番号：３）の少なくとも一部分を含む 、請求項２３記載の方法。
25. ２５．オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかのヌクレオチド単位間結合基が 硫黄含有化学種を含む、請求項２３記載の方法。
26. ２６．前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエートを含む、請求項２５記載の 方法。