JP2726754B2 - ｒａｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害 - Google Patents
ｒａｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害Info
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Description
発明の分野 本発明は、自然に発生し、腫瘍形成との関係が示唆さ
れる活性型に散発的に変換する遺伝子であるras遺伝子
の発現阻害のための組成物と方法に関する。本発明はま
た、活性型ras遺伝子の特異的な阻害に関する。さらに
本発明は、細胞と組織中のras遺伝子の正常型と活性型
の検出に関し、これは研究と診断のための研究試薬とキ
ットのための基礎を形成する。さらに、本発明はras遺
伝子の活性化によって生ずる状態の処置に関する。 発明の背景 細胞増殖と分化を直接的または間接的に調節する細胞
遺伝子の変換は、癌の主要な原因と考えられる。ヒトの
腫瘍形成との関係が示唆される、癌遺伝子と呼ばれる遺
伝子は約30ファミリーある。そのようなファミリーのメ
ンバーであるras遺伝子ファミリーは、しばしば、ヒト
腫瘍中で突然変異を起こしていることが見いだされる。
正常状態においては、ras遺伝子によって産生されるタ
ンパク質は、正常な細胞増殖と成熟に寄与していると考
えられる。産生されるタンパク質中の３つの重要な部位
の１つにおいてアミノ酸の変換を生ずるras遺伝子の突
然変異は、腫瘍形成との関係が示唆される型への変換を
起こす。そのような突然変異を持つ遺伝子は、“活性
型”と呼ばれる。そのようなras活性化を引き起こす点
突然変異は、発癌性物質や他の環境因子によって引き起
こされ得ると考えられる。90％以上の膵腺癌、およそ50
％の結腸腺腫と腺癌、およそ50％の肺腺癌と甲状腺腫、
および、急性骨髄性白血病や脊髄異形成症候群といった
血液の悪性腫瘍の大部分が活性化されたras癌遺伝子を
有することが見つかっている。全体としておよそ10から
20％のヒト腫瘍が３つのras遺伝子（H-ras,K-ras,N-ra
s）の１つに突然変異を有している。 現在のところ、特定の腫瘍細胞中で活性化されている
癌遺伝子の発現を抑制することにより、細胞をより正常
な増殖状態を戻しうると信じられている。たとえば、Fe
ramiscoら（Nature,314:639-642、1985年）は、活性化r
as遺伝子により悪性腫瘍化した細胞に、ras遺伝子によ
って産生されるタンパク質に結合する抗体をマイクロイ
ンジェクションすると、細胞は増殖速度を低下させ、よ
り正常な形態に変化する。このことは、典型的な癌細胞
の制御されない増殖における、活性化ras遺伝子産物の
関与を支持するものと説明されている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌遺伝子の抑
制は、様々な癌遺伝子ファミリーの役割を理解するため
の有用な道具であるということが証明されている。“ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド”とは、その遺伝子の
「センス」、またはコーディング鎖に相補的な小さなオ
リゴヌクレオチドを意味し、これは結果としてその遺伝
子のmRNA転写物に対してもまた相補的であり、これに対
しても特異的にハイブリダイズしうる。Holtら（Mol.Ce
ll Biol.、８、963-973、1988年）は、癌遺伝子c-mycの
mRNA転写物に特異的にハイブリダイズするアンチセンス
オリゴヌクレオチドを、培養されたHL-60白血病細胞に
添加すると、増殖が抑制され、分化が誘導されることを
示した。Anfossiら（Proc.Natl.Acad.Sci.,86,3379-338
3、1989年）は、c-myb癌遺伝子のmRNA転写物に特異的に
ハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド
が、ヒト骨髄性白血病細胞株の増殖を抑制することを示
した。Wickstromら（Proc.Natl.Acad.Sci.,85,1028-103
2,1988年）は、培養したHL60白血病細胞の増殖と同様
に、c-myc癌遺伝子のタンパク質産物の発現が、c-myc m
RNAと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドによって抑制されることを示した。米国特
許4871838（Bosら）は、N-rasの第13コドン中の突然変
異を検出するための、その変異に相補的なオリゴヌクレ
オチドを開示している。 これら全てのケースにおいて、修飾されていないオリ
ゴヌクレオチドの不安定性が主要な問題点である。これ
らは細胞内酵素により分解されるからである。PCT/US38
/01024（Zonら）は、HL-60白血病細胞の増殖およびこれ
らの細胞中のDNA合成を抑制するための、増幅されたc-m
yc癌遺伝子の翻訳開始領域にハイブリダイズするフォス
フォロチオエート誘導体オリゴヌクレオチドの作用を開
示した。Tiddら（Anti-Cancer Drug Design,3,117-127,
1988年）は、活性化されたN-ras癌遺伝子に特異的にハ
イブリダイズするメチルフォスフォネート誘導体アンチ
センスオリゴヌクレオチドを検討し、これが生化学的分
解に耐性であり、培養したヒトHT29細胞に毒性を示さな
い一方で、これがN-ras遺伝子の発現を抑制せず、この
細胞に影響を与えないことを見いだした。Changら（Ant
i-Cancer Drug Design,4,221-232,1989年）は、Balb-ra
s遺伝子のmRNA転写物に特異的にハイブリダイズする、
メチルフォスフォネート誘導体およびフォスフォロチオ
エート誘導体オリゴヌクレオチドの両方が、インビトロ
においてこの遺伝子のタンパク質産物の翻訳を抑制しう
ることを示した。Changらが使用したアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、ra
s遺伝子の翻訳開始領域に特異的にハイブリダイズする
ため、これらオリゴヌクレオチドの、ras遺伝子の正常
型（野生型）と変異型（活性化型）に対する結合能力の
比較は行われなかった。 H-ras遺伝子は、即座に治療が施されない場合には突
然の死をしばしば引き起こす遺伝病であるlong Q−Ｔ症
候群と呼ばれる重篤な心不整脈との関係が示唆されてい
る。乱れた鼓動の始まりには前兆がないことがしばしば
である。H-ras遺伝子が正確にlong Q−Ｔ症候群の原因
であるかはどうかははっきりしない。しかし、この症候
群の遺伝と第11染色体上のH-ras遺伝子周辺領域の特定
の変異の存在との間には、非常に高い相関がある。この
ため、H-ras遺伝子は、long Q−Ｔ症候群による心臓突
然死の高リスクの優れた指標となる。 ras遺伝子の発現を調節しうる構成物の提供と、そし
て特に活性化型ras遺伝子の発現を特異的に調節する構
成物の提供が強く望まれている。動物におけるras遺伝
子の検出と診断の方法の提供が強く望まれている。ま
た、ras遺伝子活性化から生ずる病態の診断と治療の方
法を提供することが望まれている。加えて、ras遺伝子
の検出と研究のための、改良された研究キットと試薬が
望まれている。 発明の目的 本発明は、哺乳類ras遺伝子に由来するRNAまたはDNA
と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドお
よびオリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的と
する。 また本発明は、アンチセンスとras遺伝子から産生す
るmRNAとの相互作用によりras遺伝子の発現を調節しう
るオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体
を提供することを目的とする。 また本発明は、ras遺伝子の活性化された変異型のmRN
Aに選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的
とする。 また本発明は、ras mRNAの変異した第12コドン領域と
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体と
のハイブリダイズによって、ras遺伝子の活性型の発現
を特異的に抑制することを目的とする。 また本発明は、ras遺伝子の正常型（野生型）から活
性型への変異を検出することを目的とする。 また本発明は、活性化したras遺伝子の存在に起因す
る、形態的に類似した腫瘍を区別する診断および高リス
ク状態の同定を目的とする。 また本発明は、ras遺伝子の野生型から変異型（すな
わち活性型）への変異に起因する病態の診断と治療の方
法の提供を目的とする。 発明の要約 本発明にしたがって、ヒトras遺伝子に由来するDNAま
たはRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドおよびオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。こ
のオリゴヌクレオチドは、そのような特異的なハイブリ
ダイゼーションを果たすために充分な同一性と数のヌク
レオチド単位から構成される。好ましくは、このオリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体は、遺伝
子の転写開始コドンと特異的にハイブリダイズし、また
好ましくはこのオリゴヌクレオチドはCATの配列を含
む。他の好ましい態様によれば、活性化H-ras遺伝子の
第12コドンと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体が提供され、こ
れらは好ましくはGACの配列を含む。他の好ましい態様
においては、活性化H-ras遺伝子の変異した第12コドン
と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。この態様に
おいては、そのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド誘導体は好ましくはGACの配列を含む。そ
のようなオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容しうる担
体中に含まれることが都合よくそして望ましい。 他の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドとオ
リゴヌクレオチド誘導体は、オリゴヌクレオチドのヌク
レオチド単位間の少なくともいくつかの結合基が、フォ
スフォロチオエート部分等の硫黄含有化学種を含むよう
に形成される。 他の態様によれば、本発明は、細胞または組織中のヒ
トras遺伝子の発現を調節する方法、および、活性化を
誘導する変異を有していると疑われる細胞または組織中
において、活性化されたras遺伝子の発現を特異的に調
節する方法に関する。また本発明は、細胞または組織中
のras遺伝子を検出する方法、および、前述の変異を起
こした遺伝子を有していると疑われる細胞または組織中
の活性化ras遺伝子を特異的に検出する方法に関する。
この方法は、前述の遺伝子の作用を阻害し、または検出
するために、本発明にしたがうオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド誘導体と、ヒトras遺伝子を含む
と疑われる細胞または組織とを接触させることを含む。 さらに別の態様によれば、本発明は、ras遺伝子の活
性化を誘導する変異を有すると疑われる動物の診断法と
治療法に関する。この方法は、この遺伝子の発現を調節
し、この遺伝子の活性化によって生ずる状態を治療し、
またはその診断を行うために、動物、細胞、組織または
体液と本発明にしたがうオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド誘導体とを接触させることを含む。 図面の簡単な説明 図１は、H-ras転写開始コドン（AUG）を標的としたオ
リゴヌクレオチドを使用したras−ルシフェラーゼ融合
タンパク質の発現抑制の用量依存性を示す棒グラフであ
る。発現は、ルシフェリンを添加した時に発する光の量
によってアッセイされたルシフェラーゼ活性の測定によ
って定量される。 図２は、活性化H-rasの変異した第12コドン領域を標
的としたオリゴヌクレオチドを使用したras−ルシフェ
ラーゼ融合タンパク質の発現抑制の用量依存性を示す棒
グラフである。発現は、ルシフェリンを添加した時に発
する光の量によってアッセイされたルシフェラーゼ活性
の測定によって定量される。 図３は、アンチセンスフォスフォチオエート化合物に
よるras−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現の単一
用量による抑制を示す棒グラフである。発現は、ルシフ
ェリンを添加した時に発する光の量によってアッセイさ
れたルシフェラーゼ活性の測定によって定量される。 図４は、活性化H-ras遺伝子と特異的にハイブリダイ
ズしうる13のアンチセンスヌクレオチドのデータを要約
した表および棒グラフである。それぞれのオリゴヌクレ
オチドについて、その長さ、特異的にハイブリダイズす
る活性化ras遺伝子の領域、ras−ルシフェラーゼ融合タ
ンパク質の発現抑制活性を示す。 発明の詳細な記述 悪性腫瘍は、癌細胞に特徴的な制御された増殖の喪
失、すなわち連続的な制御不能の増殖、周辺組織への侵
入能力、および他の臓器への転移能力を誘導する、一連
の段階的で進行性の変化を通して発達する。厳密に制御
されたインビトロの研究によって、正常細胞と癌細胞の
増殖を性格付ける因子が定義され、細胞増殖と分化を制
御する特定のタンパク質が同定されてきた。さらに、厳
密に制御された定量的なインビトロアッセイで細胞の形
質転換を研究することが可能であることによって、形質
転換した細胞の表現型を誘導しうる特定の遺伝子が同定
されてきた。そのような癌の原因遺伝子または癌遺伝子
は、それらが産生するタンパク質の発現調節の変化を誘
導する突然変異によって形質転換誘導能を獲得すると信
じられている。ある場合には、そのような変化はプロモ
ーターやエンハンサーといった非コード調節領域のDNA
中において起こり、癌遺伝子の転写活性の変化を誘導
し、その遺伝子産物の過剰または過小産生を引き起こ
す。他の場合には、遺伝子変異は癌遺伝子のコード領域
内において起こり、非活性、過剰な活性または正常型
（野生型）の遺伝子産物とは異なった活性を示す遺伝子
産物の産生を誘導する。 今日までに30以上の細胞性癌遺伝子ファミリーが同定
されている。これらの遺伝子は、それらの細胞内局在と
それらのタンパク質産物の推定上の作用機構によって分
類することができる。ras癌遺伝子は、細胞膜の内側に
存在する類縁タンパク質をコードする遺伝子ファミリー
のメンバーである。rasタンパク質群はアミノ酸レベル
で高度に保存され、GTPに対して高親和性かつ特異的に
結合し、そしてGTPase活性を有している。細胞内におけ
るras遺伝子産物の機能は明らかでないが、GTP結合タン
パク質、またはＧタンパク質として知られている信号伝
達タンパク質群とかなりの配列ホモロジーを有するとい
う生化学的性質は、ras遺伝子産物が細胞膜を介しての
細胞外信号の伝達に関係して、基本的な細胞調節機能に
おいて基礎的な役割を果たしていることを示唆する。 H-ras,K-ras,およびN-rasと呼ばれる３つのras遺伝子
は、哺乳類のゲノム中で同定されている。哺乳類ras遺
伝子は、それらのコード配列内の単一の点突然変異によ
り形質転換を誘導する性質を獲得する。自然に発生する
ras癌遺伝子中の突然変異は、第12番、第13番、第61番
のコドンに存在する。ヒト腫瘍中で見つかる活性型ras
変異で最もよく検出されるのは、H-ras遺伝子の第12コ
ドン中の変異であり、これはGGCからGTCへの塩基の変化
によりrasタンパク質産物のGTPase調節領域中のグリシ
ンからバリンへの変化をもたらす。この単一アミノ酸の
変化はrasタンパク質機能の正常な調節を喪失させると
考えられ、それにより正常な制御された細胞タンパク質
を常に活性なタンパク質に変換する。そのような正常ra
sタンパク質機能の脱制御が、正常から悪性の増殖への
形質転換の原因であると信じられている。 本発明は、ヒトras癌遺伝子発現抑制のためのオリゴ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を提供す
る。本発明はまた、rasの変異型発現を選択的に抑制す
るためのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
誘導体を提供する。 本発明においては、「オリゴヌクレオチド」との用語
は、天然に生ずる塩基と天然のフォスフォジエステル結
合によって結合したフラノシル基から形成される複数の
結合したヌクレオチド単位を意味する。この用語は、天
然に生ずる化学種または天然に生ずるサブユニットから
構成される合成された化学種について用いられる。 本発明において使用される「オリゴヌクレオチド誘導
体」との用語は、オリゴヌクレオチドと同様に機能する
が、天然には生じない部分を有しているものを意味す
る。したがって、オリゴヌクレオチド誘導体は変換され
た糖部分または糖間結合を有していてもよい。これらの
うちで典型的なものは、フォスフォロチオエートおよび
当該技術分野で使用されることが知られている他の硫黄
含有化学種である。これらは変換された塩基単位または
本発明の精神と一致した他の修飾を含む。 特定の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドの
少なくともいくつかのフォスフォジエステル結合は、活
性を調節すべきRNAな存在する細胞内領域に侵入するた
めの組成物の能力を増強し、かつ、細胞内酵素による分
解に対する組成物の耐性をより高めるように機能する構
造によって置換される。そのような結合には硫黄を含む
ことが好ましい。現時点では、そのような置換はフォス
フォロチオエート結合を含むことが好ましい。他の結
合、たとえばアルキルフォスフォチオエート結合、Ｎ−
アルキルフォスフォアミデート、フォスフォロジチオエ
ート、アルキルフォスフォネート、および短鎖のアルキ
ルまたはシクロアルキル構造もまた有用である。他の好
ましい態様によれば、フォスフォジエステル結合は、実
質的には同時に非イオン性かつ非キラルである構造、あ
るいは、配列特異的でありかつ実質的にキラルである構
造と置換される。当業者は、本発明の実施において使用
するための他の結合を選択し得るであろう。 オリゴヌクレオチド誘導体はまた、少なくともいくつ
かの修飾した塩基の形を含有する化学種を含んでいても
よい。したがって、自然界において通常観察されるもの
以外のプリンおよびピリミジンを使用してもよい。その
ような一つの態様によれば、一つまたは複数の塩基は２
−（アミノ）アデニンを含む。他のそのような態様で
は、一つまたは複数の塩基は、２−（メチルアミノ）ア
デニン,2−（アルキルアミノ）アデニン、２−（イミダ
ゾリルアルキル）アデニン,2−（アミノアルキルアミ
ノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン
を含む。同様に、本発明の本質的な教示にしたがう限
り、ヌクレオチド単位のフラノース部分の修飾もまた起
こりうる。 そのような誘導体は、天然のオリゴヌクレオチド（ま
たは天然のラインに沿った合成オリゴヌクレオチド）と
機能的に交換可能であることについて最もよく記述され
るが、天然の構造と一つまたは複数の違いを有してい
る。全てのそのような誘導体は、ras遺伝子またはこれ
に由来するmRNAとハイブリダイズし、ras遺伝子の機能
または発現を抑制するために効果的に機能する限り、本
発明に包含される。 本発明にしたがうオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド誘導体は、好ましくは約10から約30のサブユ
ニットを含む。より好ましくは、そのようなオリゴヌク
レオチドおよび誘導体は約15から約25のサブユニットを
含む。当業者には理解されるように、サブユニットと
は、フォスフォジエステルまたは他の結合により隣合う
サブユニットに適当に結合する一つの塩基と糖の組み合
わせである。 本発明のオリオヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、H-ras遺伝子に由来するメッセンジャーRNA
とハイブリダイズしうるように設計される。そのような
ハイブリダイゼーションは、それが達成される際には、
そのメッセンジャーRNAの正常な役割を抑制し、細胞中
におけるその機能の喪失を生ずる。抑制されるべきメッ
センジャーRNAの機能は、タンパク質への翻訳場所へのR
NAの移動、RNAからタンパク質への実際の翻訳、一つま
たは複数のmRNA種の生成のためのRNAのスプライシン
グ、および、恐らくはRNA自身によって行われるかも知
れない独立の異化活性等の、生体に重要な全ての機能を
含む。RNA機能のそのような抑制の全体としての効果
は、H-ras遺伝子の発現の抑制である。N-ras,K-rasとい
った他の哺乳類のras遺伝子のタンパク質産物は、最初
の85アミノ酸に渡ってH-rasと同一である。３つのras遺
伝子の塩基配列は、同一ではないが、周知であり、当業
者はN-rasおよびK-ras遺伝子と特異的にハイブリダイズ
しうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘
導体を調製する指針として本発明を使用し得るであろ
う。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、診断、治療、および研究試薬とキットとし
て利用し得る。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチド誘導体は、ras遺伝子とハイブリダイズ
するため、この事実を利用するサンドイッチ法または他
のアッセイ法が容易に構築可能である。さらに、本発明
のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体
はras遺伝子の変異型（活性化型）に特異的にハイブリ
ダイズするため、細胞もしくは組織の野生型のrasから
活性型のrasへの変換をスクリーニングするためのアッ
セイを工夫し得る。そのようなアッセイは、形態的に類
似の腫瘍を区別する診断や、ras遺伝子の活性化に由来
して高まる癌のリスクの検出に利用し得る。オリゴヌク
レオチドまたは誘導体のras遺伝子とのハイブリダイゼ
ーションを検出するための手段のための準備は、日常的
に成し得る。そのような準備は、酵素コンジュゲーショ
ン、放射活性ラベルまたは他の適当な検出システムを含
み得る。ras遺伝子または活性化ras遺伝子の存在または
不在を検出するキットもまた製造しうる。 以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。 実施例 実施例１ オリゴヌクレオチド合成 修飾されていないオリゴヌクレオチドは、標準のヨー
ドによる酸化およびフォスフォアミデート化学を用い
て、自動DNA合成装置（Applied Biosystems model 380
B）で合成した。フォスフォチオネートオリゴヌクレオ
チドのためには、亜リン酸結合の段階的なチオ化（thia
tion）のために、標準酸化ボトルを、0.2Mの3H−1,2−
ベンゾジオール−３−オン 1,1−ジオキサイド溶液を
含むアセトニトリルに交換した。チオ化の待ち段階は68
秒に延ばし、続いてキャッピング段階を行った。CPGカ
ラムからの分離および濃縮水酸化アンモニウム中での脱
ブロック（55℃、18時間）の後、オリゴヌクレオチドを
2.5倍体積のエタノールと0.5M塩化ナトリウムで２回沈
殿させて精製した。分析ゲル電気泳動は、20％アクリル
アミド、8M尿素、454mMトリスーホウ酸緩衝液,pH＝7.0
で行った。オリゴヌクレオチドとフォスフォロチオエー
トは、完全長物質が80％以上であることをポリアクリル
アミドゲル電気泳動から判断した。 実施例２ ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築 この研究において記述されるras−ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子は、PCR技術を用いて構築された。変異
型（第12コドン）と非変異型（野生型）ヒトH-ras遺伝
子のエクソン１の５′領域のPCRによるクローニングの
プライマーとして使用するために、オリゴヌクレオチド
プライマーを合成した。H-ras遺伝子の鋳型は、ATCC（A
merican Type Culture Collection,Bethesda,MD）から
購入した（ATCC番号41000、41001）。オリゴヌクレオチ
ドPCRプライマー５′−ACA−TTA−TGC−TAG−CTT−TTT
−GAG−TAA−ACT−TGT−GGG−GCA−GGA−GAC−CCT−GT
−３′（センス、配列ID番号:7）、および ５′−GAG−ATC−TGA−AGC−TTC−TGG−ATG−GTC−AGC
−GC−３′（アンチセンス、配列ID番号:8）を、変異型
と非変異型H-ras遺伝子を鋳型として用いる標準PCR反応
において使用した。これらのプライマーは、NheIとHind
III制限酵素部位に接した、正常および変異H-rasの配
列−53から＋65（転写開始部位に対して）に相当する14
5塩基対のDNA産物を作ることが期待される。PCR産物
は、標準的な方法によりゲル精製し、沈殿し、洗浄し、
そして水に再懸濁した。 P.pyralis（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクロ
ーニングのためのPCRプライマーは、PCR産物がアミノ末
端のメチオニン残基を除いて完全長のルシフェラーゼタ
ンパク質をコードするように設計された。このメチオニ
ン残基はアミノ末端がリジン、続いてロイシンという２
つのアミノ酸で置き変わられるようにした。ルシフェラ
ーゼ遺伝子のクローニングのために使用されたオリゴヌ
クレオチドプライマーは、 ５′−GAG−ATC−TGA−AGC−TTG−AAG−ACG−CCA−AAA
−ACA−TAA−AG−３′（センス、配列ID番号:9）および ５′−ACG−CAT−CTG−GCG−CGC−CGAA−TAC−CGT−CGA
−CCT−CGA−３′（アンチセンス、配列ID番号:10）で
あり、これらを使用してルシフェラーゼレポーター遺伝
子を鋳型として含む商業的に入手可能なプラスミド（pT
3/T7-Luc）（Clontech社）を用いる標準的なPCR反応を
行った。これらのプライマーは、Hind IIIとBasH II制
限酵素部位に接した約1.9kbのルシフェラーゼ遺伝子に
相当する産物を与えることが期待された。この断片は、
標準的な方法によりゲル精製し、沈殿し、洗浄し、そし
て水に再懸濁した。 ras−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の構築を
行うために、rasおよびルシフェラーゼのPCR産物を適当
な制限酵素により切断し、制限酵素NheI,Hind III、お
よびBssH IIを用いて、３部分のライゲーションによっ
て、ステロイドで誘導されるマウス乳癌ウイルス（（MM
TV）のプロモーターを含む発現ベクター中にクローン化
した。この結果、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子にフレ
ームがあった形で融合されたH-rasの配列（−53から＋6
5）の挿入を含むクローンが得られた。このようにして
得られた発現ベクターは、ステロイド誘導性のMMTVプロ
モーターによって発現が調節されるras−ルシフェラー
ゼ融合産物をコードする。 実施例３ プラスミドDNAによる細胞のトランスフェク
ション トランスフェクションは、Current Protocols in Mo
lecular Biology（F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,
D.D.Moore、J.A.Smith,J.G.Seidman,K.Strah1編、John
Wiley and Sons,NY）中のM.E.Greenbergによる記載を以
下のように変更して行った。Hela細胞を、５×105細胞
／ディッシュになるように60mmのディッシュに藩種し
た。全部で10μｇのDNAを各ディッシュに添加したが、
このうち９μｇはras−ルシフェラーゼレポータープラ
スミドであり、１μｇは、恒常的に発現するラウス肉腫
ウイルス（RSV）プロモーターにより調節されるラット
グルココルチコイド受容対を発現するベクターであっ
た。16から20時間後に、リン酸カルシウム−DNA共沈物
を、3mM EGTAを含むトリス緩衝生理食塩液（50mM トリ
ス塩酸（pH7.5）、150mM 塩化ナトリウム）で洗浄して
除去した。次に、10％牛胎児血清を含む新鮮な培地を細
胞に添加した。この時点において、レポーター遺伝子発
現をデキサメタゾンで活性化する前に、細胞をアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドで前処理した。 実施例４ 細胞のオリゴヌクレオチドによる処理 プラスミドトランスフェクションにすぐ続いて、37℃
に暖められたOpti-MEM（ギブコ社）で細胞を３回洗浄し
た。10μg/mlのＮ−［１−（2,3−ジオレイルオキシ）
プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライ
ド（DOTMA）（Bethesda Research Labs,Gaitherburg,M
D）を含む2mlのOpti-MEMを、各ディッシュに添加し、オ
リゴヌクレオチドを直接添加して、37℃で４時間インキ
ュベートした。次に、Opti-MEMを除去し、オリゴヌクレ
オチドを含む適当な増殖培地で置き換えた。この時点に
おいて、最終濃度0.2μＭのデキサメタゾンで細胞を処
理することにより、レポーター遺伝子の発現を活性化さ
せた。ステロイド処理から12〜16時間後に細胞を回収し
た。 実施例５ ルシフェラーゼのアッセイ ルシフェラーゼが、Current Protocols in Molecular
Biology（F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moo
re、J.A.Smith,J.G.Seidman,K.Strah1編、John Wiley a
nd Sons,NY）中のM.E.Greenbergによる記載したがっ
て、界面活性剤Triton-X100による細胞溶解物から抽出
した。Dynatech ML1000ルミノメーターを用いて、625μ
Ｍのルシフェリン（シグマ社）の添加により発生する蛍
光のピークを測定した。アッセイの直線域にデータが確
かに集まるように、各抽出物毎に抽出物の量を変えて、
ルシフェラーゼアッセイを複数回行った。 実施例６ ras−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドによる阻害 前述の実施例中に記載されたras−ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子システムを使用して、H-rasの翻訳開始
コドン、または活性化Ｈ−rasの第12コドン点突然変異
部を標的とした一連のアンチセンスフォスフォロチオエ
ート誘導体をスクリーニングした。この最初のシリーズ
のうち、６つのオリゴヌクレオチドが、有意にそして再
現性をもってras−ルシフェラーゼ活性を阻害すること
が同定された。これらオリゴヌクレオチド（全てフォス
フォロチオエート誘導体）の塩基配列、配列参照番号お
よび配列ID番号を表１に示す。 図１は、正常なras−ルシフェラーゼレポーター遺伝
子または変異型ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子
を発現する細胞を、フォスフォロチオエートオリゴヌク
レオチド誘導体2503（配列ID番号:2）の濃度を増加させ
て処理した用量依存性試験を示す。この化合物は、H-ra
sのRNA転写物の翻訳開始コドンを標的としている。図１
に示すように、このオリゴヌクレオチドによる細胞の処
理はras−ルシフェラーゼ活性の阻害をもたらし、正常
型および変異型の標的rasのいずれも約50nMのIC50値を
示した。対照オリゴヌクレオチドは20塩基対のランダム
なフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体で
ある。結果は、オリゴヌクレオチドで処理していないト
ランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性に対する
パーセンテージを表現される。ras翻訳開始コドンを標
的としたオリゴヌクレオチドが変異型、正常型rasの両
方の発現を同程度減少させるという観察は、２つの標的
がAUG翻訳開始部位を囲む領域中で同一の配列組成を有
していることから予期される。 図２は、変異型（活性型）H-ras RNAの第12コドン点
突然変異を標的とした化合物である。フォスフォロチオ
エートオリゴヌクレオチド誘導体2570（配列ID番号:3）
で細胞を処理した用量依存性試験を示す。対照オリゴヌ
クレオチドは20塩基対のランダムなフォスフォロチオエ
ートオリゴヌクレオチド誘導体である。結果は、オリゴ
ヌクレオチドで処理していないトランスフェクトした細
胞のルシフェラーゼ活性に対するパーセンテージで表現
される。図に示すように、このオリゴヌクレオチドの濃
度を増加させて細胞を処理した結果、変異型または正常
型のras−ルシフェラーゼを発現する細胞中のras−ルシ
フェラーゼ活性はいずれも用量依存的に阻害された。し
かし、データをよく検証すると、低濃度においてオリゴ
ヌクレオチド2570は、正常型に比較して変異型のras−
ルシフェラーゼに対し約３倍の選択性を示すことが示さ
れている。事実、オリゴヌクレオチド2570は、変異型ra
s−ルシフェラーゼでは約100nMというIC50値を示したの
に対し、非変異型に対しては約250nMというIC50値を示
した。 図３は、正常型または変異型のras−ルシフェラーゼ
を発現する細胞を、Ｈ−rasの翻訳開始コドンまたは第1
2コドン点突然変異を標的としたオリゴヌクレオチドに
より単一用量（0.5μＭ）で処理した典型的な試験結果
を示す。試験されたアンチセンスフォスフォロチオエー
トオリゴヌクレオチド誘導体は表１に示される。対照オ
リゴヌクレオチド（2504）は、20塩基対のランダムなフ
ォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体であ
る。結果は、オリゴヌクレオチドで処理していないトラ
ンスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性に対するパ
ーセンテージで表現される。図３に示すように、ras−
翻訳開始コドンを標的とした化合物2503（配列ID番号:
2）は、最もras−ルシフェラーゼ活性の阻害作用が強か
った。活性化rasの第12コドン点突然変異を標的とした
これらの３つの化合物の中で、17merのオリゴヌクレオ
チド2570（配列ID番号:3）のみが正常型に対する場合と
比較して変異型ras−ルシフェラーゼに対して選択的で
あることが示された。このことはまた、活性化Ｈ−ras
遺伝子に相補的な13のアンチセンスオリゴヌクレオチド
の全て、不規則な対照オリゴヌクレオチド（1966）、お
よび野生型rasの第12コドンに相補的な対照オリゴヌク
レオチド（2907）について得られたデータを要約した図
４にも示されている。各オリゴヌクレオチドについて、
その長さ、相補的な領域、およびras−ルシフェラーゼ
融合タンパク質の発現抑制活性が示されている。第12コ
ドン点突然変異を標的としたより長いフォフフォロチオ
エートは、ras−ルシフェラーゼ発現に対する実質的な
アンチセンス活性を示すのに対し、変異型のras−ルシ
フェラーゼ発現の選択的な阻害を示さなかった。17ヌク
レオチド長以下の、第12コドン点突然変異を標的とした
フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチドは、いずれ
の型のras−ルシフェラーゼに対しても活性を示さなか
った。これらの結果は、ras−配列を標的としたフォス
フォロチオエートオリゴヌクレオチドの効果的なアンチ
センス活性を示す。 実施例７ ２−（アミノ）アデニン−置換オリゴヌクレ
オチドの合成 オリゴヌクレオチドおよびフォスフォロチオエートオ
リゴヌクレオチド誘導体は、以下の例外を除いて実施例
１にしたがって合成される。すなわち、２−（アミノ）
アデニンが好ましい部位においては、標準フォスフォア
ミダイトを商業的に入手可能な２−アミノデオキシアデ
ノシン フォスフォアミダイト（ChemGenes）で置き換
える。 実施例８ ras−ルシフェラーゼ遺伝子発現の２−（ア
ミノ）アデニン−修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドによる阻害 活性化rasの第12コドン点突然変異に相補的な一連の
アンチセンスフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、実施例７に記載されているように合成さ
れ、変異した第12コドンのウラシルに相補的な部位に２
−（アミノ）アデニンを有する。アデニンの２位のアミ
ノ基はラウシルの２位の酸素と水素結合しうるため、通
常の２つの水素結合と異なり３つの水素結合が形成され
る。このことは、この部位における修飾されたＡ−Ｇミ
スマッチのために野生型コドンに対するこのオリゴの安
定性を非安定化するか、または影響を与えないにもかか
わらず、活性化ras遺伝子に対する２−（アミノ）アデ
ニン修飾型アンチセンスオリゴヌクレイチドのハイブリ
ダイゼーションを大きく安定化するのに寄与する。
れる活性型に散発的に変換する遺伝子であるras遺伝子
の発現阻害のための組成物と方法に関する。本発明はま
た、活性型ras遺伝子の特異的な阻害に関する。さらに
本発明は、細胞と組織中のras遺伝子の正常型と活性型
の検出に関し、これは研究と診断のための研究試薬とキ
ットのための基礎を形成する。さらに、本発明はras遺
伝子の活性化によって生ずる状態の処置に関する。 発明の背景 細胞増殖と分化を直接的または間接的に調節する細胞
遺伝子の変換は、癌の主要な原因と考えられる。ヒトの
腫瘍形成との関係が示唆される、癌遺伝子と呼ばれる遺
伝子は約30ファミリーある。そのようなファミリーのメ
ンバーであるras遺伝子ファミリーは、しばしば、ヒト
腫瘍中で突然変異を起こしていることが見いだされる。
正常状態においては、ras遺伝子によって産生されるタ
ンパク質は、正常な細胞増殖と成熟に寄与していると考
えられる。産生されるタンパク質中の３つの重要な部位
の１つにおいてアミノ酸の変換を生ずるras遺伝子の突
然変異は、腫瘍形成との関係が示唆される型への変換を
起こす。そのような突然変異を持つ遺伝子は、“活性
型”と呼ばれる。そのようなras活性化を引き起こす点
突然変異は、発癌性物質や他の環境因子によって引き起
こされ得ると考えられる。90％以上の膵腺癌、およそ50
％の結腸腺腫と腺癌、およそ50％の肺腺癌と甲状腺腫、
および、急性骨髄性白血病や脊髄異形成症候群といった
血液の悪性腫瘍の大部分が活性化されたras癌遺伝子を
有することが見つかっている。全体としておよそ10から
20％のヒト腫瘍が３つのras遺伝子（H-ras,K-ras,N-ra
s）の１つに突然変異を有している。 現在のところ、特定の腫瘍細胞中で活性化されている
癌遺伝子の発現を抑制することにより、細胞をより正常
な増殖状態を戻しうると信じられている。たとえば、Fe
ramiscoら（Nature,314:639-642、1985年）は、活性化r
as遺伝子により悪性腫瘍化した細胞に、ras遺伝子によ
って産生されるタンパク質に結合する抗体をマイクロイ
ンジェクションすると、細胞は増殖速度を低下させ、よ
り正常な形態に変化する。このことは、典型的な癌細胞
の制御されない増殖における、活性化ras遺伝子産物の
関与を支持するものと説明されている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌遺伝子の抑
制は、様々な癌遺伝子ファミリーの役割を理解するため
の有用な道具であるということが証明されている。“ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド”とは、その遺伝子の
「センス」、またはコーディング鎖に相補的な小さなオ
リゴヌクレオチドを意味し、これは結果としてその遺伝
子のmRNA転写物に対してもまた相補的であり、これに対
しても特異的にハイブリダイズしうる。Holtら（Mol.Ce
ll Biol.、８、963-973、1988年）は、癌遺伝子c-mycの
mRNA転写物に特異的にハイブリダイズするアンチセンス
オリゴヌクレオチドを、培養されたHL-60白血病細胞に
添加すると、増殖が抑制され、分化が誘導されることを
示した。Anfossiら（Proc.Natl.Acad.Sci.,86,3379-338
3、1989年）は、c-myb癌遺伝子のmRNA転写物に特異的に
ハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド
が、ヒト骨髄性白血病細胞株の増殖を抑制することを示
した。Wickstromら（Proc.Natl.Acad.Sci.,85,1028-103
2,1988年）は、培養したHL60白血病細胞の増殖と同様
に、c-myc癌遺伝子のタンパク質産物の発現が、c-myc m
RNAと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドによって抑制されることを示した。米国特
許4871838（Bosら）は、N-rasの第13コドン中の突然変
異を検出するための、その変異に相補的なオリゴヌクレ
オチドを開示している。 これら全てのケースにおいて、修飾されていないオリ
ゴヌクレオチドの不安定性が主要な問題点である。これ
らは細胞内酵素により分解されるからである。PCT/US38
/01024（Zonら）は、HL-60白血病細胞の増殖およびこれ
らの細胞中のDNA合成を抑制するための、増幅されたc-m
yc癌遺伝子の翻訳開始領域にハイブリダイズするフォス
フォロチオエート誘導体オリゴヌクレオチドの作用を開
示した。Tiddら（Anti-Cancer Drug Design,3,117-127,
1988年）は、活性化されたN-ras癌遺伝子に特異的にハ
イブリダイズするメチルフォスフォネート誘導体アンチ
センスオリゴヌクレオチドを検討し、これが生化学的分
解に耐性であり、培養したヒトHT29細胞に毒性を示さな
い一方で、これがN-ras遺伝子の発現を抑制せず、この
細胞に影響を与えないことを見いだした。Changら（Ant
i-Cancer Drug Design,4,221-232,1989年）は、Balb-ra
s遺伝子のmRNA転写物に特異的にハイブリダイズする、
メチルフォスフォネート誘導体およびフォスフォロチオ
エート誘導体オリゴヌクレオチドの両方が、インビトロ
においてこの遺伝子のタンパク質産物の翻訳を抑制しう
ることを示した。Changらが使用したアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、ra
s遺伝子の翻訳開始領域に特異的にハイブリダイズする
ため、これらオリゴヌクレオチドの、ras遺伝子の正常
型（野生型）と変異型（活性化型）に対する結合能力の
比較は行われなかった。 H-ras遺伝子は、即座に治療が施されない場合には突
然の死をしばしば引き起こす遺伝病であるlong Q−Ｔ症
候群と呼ばれる重篤な心不整脈との関係が示唆されてい
る。乱れた鼓動の始まりには前兆がないことがしばしば
である。H-ras遺伝子が正確にlong Q−Ｔ症候群の原因
であるかはどうかははっきりしない。しかし、この症候
群の遺伝と第11染色体上のH-ras遺伝子周辺領域の特定
の変異の存在との間には、非常に高い相関がある。この
ため、H-ras遺伝子は、long Q−Ｔ症候群による心臓突
然死の高リスクの優れた指標となる。 ras遺伝子の発現を調節しうる構成物の提供と、そし
て特に活性化型ras遺伝子の発現を特異的に調節する構
成物の提供が強く望まれている。動物におけるras遺伝
子の検出と診断の方法の提供が強く望まれている。ま
た、ras遺伝子活性化から生ずる病態の診断と治療の方
法を提供することが望まれている。加えて、ras遺伝子
の検出と研究のための、改良された研究キットと試薬が
望まれている。 発明の目的 本発明は、哺乳類ras遺伝子に由来するRNAまたはDNA
と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドお
よびオリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的と
する。 また本発明は、アンチセンスとras遺伝子から産生す
るmRNAとの相互作用によりras遺伝子の発現を調節しう
るオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体
を提供することを目的とする。 また本発明は、ras遺伝子の活性化された変異型のmRN
Aに選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド誘導体を提供することを目的
とする。 また本発明は、ras mRNAの変異した第12コドン領域と
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体と
のハイブリダイズによって、ras遺伝子の活性型の発現
を特異的に抑制することを目的とする。 また本発明は、ras遺伝子の正常型（野生型）から活
性型への変異を検出することを目的とする。 また本発明は、活性化したras遺伝子の存在に起因す
る、形態的に類似した腫瘍を区別する診断および高リス
ク状態の同定を目的とする。 また本発明は、ras遺伝子の野生型から変異型（すな
わち活性型）への変異に起因する病態の診断と治療の方
法の提供を目的とする。 発明の要約 本発明にしたがって、ヒトras遺伝子に由来するDNAま
たはRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドおよびオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。こ
のオリゴヌクレオチドは、そのような特異的なハイブリ
ダイゼーションを果たすために充分な同一性と数のヌク
レオチド単位から構成される。好ましくは、このオリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体は、遺伝
子の転写開始コドンと特異的にハイブリダイズし、また
好ましくはこのオリゴヌクレオチドはCATの配列を含
む。他の好ましい態様によれば、活性化H-ras遺伝子の
第12コドンと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体が提供され、こ
れらは好ましくはGACの配列を含む。他の好ましい態様
においては、活性化H-ras遺伝子の変異した第12コドン
と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。この態様に
おいては、そのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド誘導体は好ましくはGACの配列を含む。そ
のようなオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容しうる担
体中に含まれることが都合よくそして望ましい。 他の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドとオ
リゴヌクレオチド誘導体は、オリゴヌクレオチドのヌク
レオチド単位間の少なくともいくつかの結合基が、フォ
スフォロチオエート部分等の硫黄含有化学種を含むよう
に形成される。 他の態様によれば、本発明は、細胞または組織中のヒ
トras遺伝子の発現を調節する方法、および、活性化を
誘導する変異を有していると疑われる細胞または組織中
において、活性化されたras遺伝子の発現を特異的に調
節する方法に関する。また本発明は、細胞または組織中
のras遺伝子を検出する方法、および、前述の変異を起
こした遺伝子を有していると疑われる細胞または組織中
の活性化ras遺伝子を特異的に検出する方法に関する。
この方法は、前述の遺伝子の作用を阻害し、または検出
するために、本発明にしたがうオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド誘導体と、ヒトras遺伝子を含む
と疑われる細胞または組織とを接触させることを含む。 さらに別の態様によれば、本発明は、ras遺伝子の活
性化を誘導する変異を有すると疑われる動物の診断法と
治療法に関する。この方法は、この遺伝子の発現を調節
し、この遺伝子の活性化によって生ずる状態を治療し、
またはその診断を行うために、動物、細胞、組織または
体液と本発明にしたがうオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド誘導体とを接触させることを含む。 図面の簡単な説明 図１は、H-ras転写開始コドン（AUG）を標的としたオ
リゴヌクレオチドを使用したras−ルシフェラーゼ融合
タンパク質の発現抑制の用量依存性を示す棒グラフであ
る。発現は、ルシフェリンを添加した時に発する光の量
によってアッセイされたルシフェラーゼ活性の測定によ
って定量される。 図２は、活性化H-rasの変異した第12コドン領域を標
的としたオリゴヌクレオチドを使用したras−ルシフェ
ラーゼ融合タンパク質の発現抑制の用量依存性を示す棒
グラフである。発現は、ルシフェリンを添加した時に発
する光の量によってアッセイされたルシフェラーゼ活性
の測定によって定量される。 図３は、アンチセンスフォスフォチオエート化合物に
よるras−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現の単一
用量による抑制を示す棒グラフである。発現は、ルシフ
ェリンを添加した時に発する光の量によってアッセイさ
れたルシフェラーゼ活性の測定によって定量される。 図４は、活性化H-ras遺伝子と特異的にハイブリダイ
ズしうる13のアンチセンスヌクレオチドのデータを要約
した表および棒グラフである。それぞれのオリゴヌクレ
オチドについて、その長さ、特異的にハイブリダイズす
る活性化ras遺伝子の領域、ras−ルシフェラーゼ融合タ
ンパク質の発現抑制活性を示す。 発明の詳細な記述 悪性腫瘍は、癌細胞に特徴的な制御された増殖の喪
失、すなわち連続的な制御不能の増殖、周辺組織への侵
入能力、および他の臓器への転移能力を誘導する、一連
の段階的で進行性の変化を通して発達する。厳密に制御
されたインビトロの研究によって、正常細胞と癌細胞の
増殖を性格付ける因子が定義され、細胞増殖と分化を制
御する特定のタンパク質が同定されてきた。さらに、厳
密に制御された定量的なインビトロアッセイで細胞の形
質転換を研究することが可能であることによって、形質
転換した細胞の表現型を誘導しうる特定の遺伝子が同定
されてきた。そのような癌の原因遺伝子または癌遺伝子
は、それらが産生するタンパク質の発現調節の変化を誘
導する突然変異によって形質転換誘導能を獲得すると信
じられている。ある場合には、そのような変化はプロモ
ーターやエンハンサーといった非コード調節領域のDNA
中において起こり、癌遺伝子の転写活性の変化を誘導
し、その遺伝子産物の過剰または過小産生を引き起こ
す。他の場合には、遺伝子変異は癌遺伝子のコード領域
内において起こり、非活性、過剰な活性または正常型
（野生型）の遺伝子産物とは異なった活性を示す遺伝子
産物の産生を誘導する。 今日までに30以上の細胞性癌遺伝子ファミリーが同定
されている。これらの遺伝子は、それらの細胞内局在と
それらのタンパク質産物の推定上の作用機構によって分
類することができる。ras癌遺伝子は、細胞膜の内側に
存在する類縁タンパク質をコードする遺伝子ファミリー
のメンバーである。rasタンパク質群はアミノ酸レベル
で高度に保存され、GTPに対して高親和性かつ特異的に
結合し、そしてGTPase活性を有している。細胞内におけ
るras遺伝子産物の機能は明らかでないが、GTP結合タン
パク質、またはＧタンパク質として知られている信号伝
達タンパク質群とかなりの配列ホモロジーを有するとい
う生化学的性質は、ras遺伝子産物が細胞膜を介しての
細胞外信号の伝達に関係して、基本的な細胞調節機能に
おいて基礎的な役割を果たしていることを示唆する。 H-ras,K-ras,およびN-rasと呼ばれる３つのras遺伝子
は、哺乳類のゲノム中で同定されている。哺乳類ras遺
伝子は、それらのコード配列内の単一の点突然変異によ
り形質転換を誘導する性質を獲得する。自然に発生する
ras癌遺伝子中の突然変異は、第12番、第13番、第61番
のコドンに存在する。ヒト腫瘍中で見つかる活性型ras
変異で最もよく検出されるのは、H-ras遺伝子の第12コ
ドン中の変異であり、これはGGCからGTCへの塩基の変化
によりrasタンパク質産物のGTPase調節領域中のグリシ
ンからバリンへの変化をもたらす。この単一アミノ酸の
変化はrasタンパク質機能の正常な調節を喪失させると
考えられ、それにより正常な制御された細胞タンパク質
を常に活性なタンパク質に変換する。そのような正常ra
sタンパク質機能の脱制御が、正常から悪性の増殖への
形質転換の原因であると信じられている。 本発明は、ヒトras癌遺伝子発現抑制のためのオリゴ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を提供す
る。本発明はまた、rasの変異型発現を選択的に抑制す
るためのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
誘導体を提供する。 本発明においては、「オリゴヌクレオチド」との用語
は、天然に生ずる塩基と天然のフォスフォジエステル結
合によって結合したフラノシル基から形成される複数の
結合したヌクレオチド単位を意味する。この用語は、天
然に生ずる化学種または天然に生ずるサブユニットから
構成される合成された化学種について用いられる。 本発明において使用される「オリゴヌクレオチド誘導
体」との用語は、オリゴヌクレオチドと同様に機能する
が、天然には生じない部分を有しているものを意味す
る。したがって、オリゴヌクレオチド誘導体は変換され
た糖部分または糖間結合を有していてもよい。これらの
うちで典型的なものは、フォスフォロチオエートおよび
当該技術分野で使用されることが知られている他の硫黄
含有化学種である。これらは変換された塩基単位または
本発明の精神と一致した他の修飾を含む。 特定の好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチドの
少なくともいくつかのフォスフォジエステル結合は、活
性を調節すべきRNAな存在する細胞内領域に侵入するた
めの組成物の能力を増強し、かつ、細胞内酵素による分
解に対する組成物の耐性をより高めるように機能する構
造によって置換される。そのような結合には硫黄を含む
ことが好ましい。現時点では、そのような置換はフォス
フォロチオエート結合を含むことが好ましい。他の結
合、たとえばアルキルフォスフォチオエート結合、Ｎ−
アルキルフォスフォアミデート、フォスフォロジチオエ
ート、アルキルフォスフォネート、および短鎖のアルキ
ルまたはシクロアルキル構造もまた有用である。他の好
ましい態様によれば、フォスフォジエステル結合は、実
質的には同時に非イオン性かつ非キラルである構造、あ
るいは、配列特異的でありかつ実質的にキラルである構
造と置換される。当業者は、本発明の実施において使用
するための他の結合を選択し得るであろう。 オリゴヌクレオチド誘導体はまた、少なくともいくつ
かの修飾した塩基の形を含有する化学種を含んでいても
よい。したがって、自然界において通常観察されるもの
以外のプリンおよびピリミジンを使用してもよい。その
ような一つの態様によれば、一つまたは複数の塩基は２
−（アミノ）アデニンを含む。他のそのような態様で
は、一つまたは複数の塩基は、２−（メチルアミノ）ア
デニン,2−（アルキルアミノ）アデニン、２−（イミダ
ゾリルアルキル）アデニン,2−（アミノアルキルアミ
ノ）アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン
を含む。同様に、本発明の本質的な教示にしたがう限
り、ヌクレオチド単位のフラノース部分の修飾もまた起
こりうる。 そのような誘導体は、天然のオリゴヌクレオチド（ま
たは天然のラインに沿った合成オリゴヌクレオチド）と
機能的に交換可能であることについて最もよく記述され
るが、天然の構造と一つまたは複数の違いを有してい
る。全てのそのような誘導体は、ras遺伝子またはこれ
に由来するmRNAとハイブリダイズし、ras遺伝子の機能
または発現を抑制するために効果的に機能する限り、本
発明に包含される。 本発明にしたがうオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド誘導体は、好ましくは約10から約30のサブユ
ニットを含む。より好ましくは、そのようなオリゴヌク
レオチドおよび誘導体は約15から約25のサブユニットを
含む。当業者には理解されるように、サブユニットと
は、フォスフォジエステルまたは他の結合により隣合う
サブユニットに適当に結合する一つの塩基と糖の組み合
わせである。 本発明のオリオヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、H-ras遺伝子に由来するメッセンジャーRNA
とハイブリダイズしうるように設計される。そのような
ハイブリダイゼーションは、それが達成される際には、
そのメッセンジャーRNAの正常な役割を抑制し、細胞中
におけるその機能の喪失を生ずる。抑制されるべきメッ
センジャーRNAの機能は、タンパク質への翻訳場所へのR
NAの移動、RNAからタンパク質への実際の翻訳、一つま
たは複数のmRNA種の生成のためのRNAのスプライシン
グ、および、恐らくはRNA自身によって行われるかも知
れない独立の異化活性等の、生体に重要な全ての機能を
含む。RNA機能のそのような抑制の全体としての効果
は、H-ras遺伝子の発現の抑制である。N-ras,K-rasとい
った他の哺乳類のras遺伝子のタンパク質産物は、最初
の85アミノ酸に渡ってH-rasと同一である。３つのras遺
伝子の塩基配列は、同一ではないが、周知であり、当業
者はN-rasおよびK-ras遺伝子と特異的にハイブリダイズ
しうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘
導体を調製する指針として本発明を使用し得るであろ
う。 本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、診断、治療、および研究試薬とキットとし
て利用し得る。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチド誘導体は、ras遺伝子とハイブリダイズ
するため、この事実を利用するサンドイッチ法または他
のアッセイ法が容易に構築可能である。さらに、本発明
のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体
はras遺伝子の変異型（活性化型）に特異的にハイブリ
ダイズするため、細胞もしくは組織の野生型のrasから
活性型のrasへの変換をスクリーニングするためのアッ
セイを工夫し得る。そのようなアッセイは、形態的に類
似の腫瘍を区別する診断や、ras遺伝子の活性化に由来
して高まる癌のリスクの検出に利用し得る。オリゴヌク
レオチドまたは誘導体のras遺伝子とのハイブリダイゼ
ーションを検出するための手段のための準備は、日常的
に成し得る。そのような準備は、酵素コンジュゲーショ
ン、放射活性ラベルまたは他の適当な検出システムを含
み得る。ras遺伝子または活性化ras遺伝子の存在または
不在を検出するキットもまた製造しうる。 以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。 実施例 実施例１ オリゴヌクレオチド合成 修飾されていないオリゴヌクレオチドは、標準のヨー
ドによる酸化およびフォスフォアミデート化学を用い
て、自動DNA合成装置（Applied Biosystems model 380
B）で合成した。フォスフォチオネートオリゴヌクレオ
チドのためには、亜リン酸結合の段階的なチオ化（thia
tion）のために、標準酸化ボトルを、0.2Mの3H−1,2−
ベンゾジオール−３−オン 1,1−ジオキサイド溶液を
含むアセトニトリルに交換した。チオ化の待ち段階は68
秒に延ばし、続いてキャッピング段階を行った。CPGカ
ラムからの分離および濃縮水酸化アンモニウム中での脱
ブロック（55℃、18時間）の後、オリゴヌクレオチドを
2.5倍体積のエタノールと0.5M塩化ナトリウムで２回沈
殿させて精製した。分析ゲル電気泳動は、20％アクリル
アミド、8M尿素、454mMトリスーホウ酸緩衝液,pH＝7.0
で行った。オリゴヌクレオチドとフォスフォロチオエー
トは、完全長物質が80％以上であることをポリアクリル
アミドゲル電気泳動から判断した。 実施例２ ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築 この研究において記述されるras−ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子は、PCR技術を用いて構築された。変異
型（第12コドン）と非変異型（野生型）ヒトH-ras遺伝
子のエクソン１の５′領域のPCRによるクローニングの
プライマーとして使用するために、オリゴヌクレオチド
プライマーを合成した。H-ras遺伝子の鋳型は、ATCC（A
merican Type Culture Collection,Bethesda,MD）から
購入した（ATCC番号41000、41001）。オリゴヌクレオチ
ドPCRプライマー５′−ACA−TTA−TGC−TAG−CTT−TTT
−GAG−TAA−ACT−TGT−GGG−GCA−GGA−GAC−CCT−GT
−３′（センス、配列ID番号:7）、および ５′−GAG−ATC−TGA−AGC−TTC−TGG−ATG−GTC−AGC
−GC−３′（アンチセンス、配列ID番号:8）を、変異型
と非変異型H-ras遺伝子を鋳型として用いる標準PCR反応
において使用した。これらのプライマーは、NheIとHind
III制限酵素部位に接した、正常および変異H-rasの配
列−53から＋65（転写開始部位に対して）に相当する14
5塩基対のDNA産物を作ることが期待される。PCR産物
は、標準的な方法によりゲル精製し、沈殿し、洗浄し、
そして水に再懸濁した。 P.pyralis（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクロ
ーニングのためのPCRプライマーは、PCR産物がアミノ末
端のメチオニン残基を除いて完全長のルシフェラーゼタ
ンパク質をコードするように設計された。このメチオニ
ン残基はアミノ末端がリジン、続いてロイシンという２
つのアミノ酸で置き変わられるようにした。ルシフェラ
ーゼ遺伝子のクローニングのために使用されたオリゴヌ
クレオチドプライマーは、 ５′−GAG−ATC−TGA−AGC−TTG−AAG−ACG−CCA−AAA
−ACA−TAA−AG−３′（センス、配列ID番号:9）および ５′−ACG−CAT−CTG−GCG−CGC−CGAA−TAC−CGT−CGA
−CCT−CGA−３′（アンチセンス、配列ID番号:10）で
あり、これらを使用してルシフェラーゼレポーター遺伝
子を鋳型として含む商業的に入手可能なプラスミド（pT
3/T7-Luc）（Clontech社）を用いる標準的なPCR反応を
行った。これらのプライマーは、Hind IIIとBasH II制
限酵素部位に接した約1.9kbのルシフェラーゼ遺伝子に
相当する産物を与えることが期待された。この断片は、
標準的な方法によりゲル精製し、沈殿し、洗浄し、そし
て水に再懸濁した。 ras−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の構築を
行うために、rasおよびルシフェラーゼのPCR産物を適当
な制限酵素により切断し、制限酵素NheI,Hind III、お
よびBssH IIを用いて、３部分のライゲーションによっ
て、ステロイドで誘導されるマウス乳癌ウイルス（（MM
TV）のプロモーターを含む発現ベクター中にクローン化
した。この結果、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子にフレ
ームがあった形で融合されたH-rasの配列（−53から＋6
5）の挿入を含むクローンが得られた。このようにして
得られた発現ベクターは、ステロイド誘導性のMMTVプロ
モーターによって発現が調節されるras−ルシフェラー
ゼ融合産物をコードする。 実施例３ プラスミドDNAによる細胞のトランスフェク
ション トランスフェクションは、Current Protocols in Mo
lecular Biology（F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,
D.D.Moore、J.A.Smith,J.G.Seidman,K.Strah1編、John
Wiley and Sons,NY）中のM.E.Greenbergによる記載を以
下のように変更して行った。Hela細胞を、５×105細胞
／ディッシュになるように60mmのディッシュに藩種し
た。全部で10μｇのDNAを各ディッシュに添加したが、
このうち９μｇはras−ルシフェラーゼレポータープラ
スミドであり、１μｇは、恒常的に発現するラウス肉腫
ウイルス（RSV）プロモーターにより調節されるラット
グルココルチコイド受容対を発現するベクターであっ
た。16から20時間後に、リン酸カルシウム−DNA共沈物
を、3mM EGTAを含むトリス緩衝生理食塩液（50mM トリ
ス塩酸（pH7.5）、150mM 塩化ナトリウム）で洗浄して
除去した。次に、10％牛胎児血清を含む新鮮な培地を細
胞に添加した。この時点において、レポーター遺伝子発
現をデキサメタゾンで活性化する前に、細胞をアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドで前処理した。 実施例４ 細胞のオリゴヌクレオチドによる処理 プラスミドトランスフェクションにすぐ続いて、37℃
に暖められたOpti-MEM（ギブコ社）で細胞を３回洗浄し
た。10μg/mlのＮ−［１−（2,3−ジオレイルオキシ）
プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライ
ド（DOTMA）（Bethesda Research Labs,Gaitherburg,M
D）を含む2mlのOpti-MEMを、各ディッシュに添加し、オ
リゴヌクレオチドを直接添加して、37℃で４時間インキ
ュベートした。次に、Opti-MEMを除去し、オリゴヌクレ
オチドを含む適当な増殖培地で置き換えた。この時点に
おいて、最終濃度0.2μＭのデキサメタゾンで細胞を処
理することにより、レポーター遺伝子の発現を活性化さ
せた。ステロイド処理から12〜16時間後に細胞を回収し
た。 実施例５ ルシフェラーゼのアッセイ ルシフェラーゼが、Current Protocols in Molecular
Biology（F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moo
re、J.A.Smith,J.G.Seidman,K.Strah1編、John Wiley a
nd Sons,NY）中のM.E.Greenbergによる記載したがっ
て、界面活性剤Triton-X100による細胞溶解物から抽出
した。Dynatech ML1000ルミノメーターを用いて、625μ
Ｍのルシフェリン（シグマ社）の添加により発生する蛍
光のピークを測定した。アッセイの直線域にデータが確
かに集まるように、各抽出物毎に抽出物の量を変えて、
ルシフェラーゼアッセイを複数回行った。 実施例６ ras−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドによる阻害 前述の実施例中に記載されたras−ルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子システムを使用して、H-rasの翻訳開始
コドン、または活性化Ｈ−rasの第12コドン点突然変異
部を標的とした一連のアンチセンスフォスフォロチオエ
ート誘導体をスクリーニングした。この最初のシリーズ
のうち、６つのオリゴヌクレオチドが、有意にそして再
現性をもってras−ルシフェラーゼ活性を阻害すること
が同定された。これらオリゴヌクレオチド（全てフォス
フォロチオエート誘導体）の塩基配列、配列参照番号お
よび配列ID番号を表１に示す。 図１は、正常なras−ルシフェラーゼレポーター遺伝
子または変異型ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子
を発現する細胞を、フォスフォロチオエートオリゴヌク
レオチド誘導体2503（配列ID番号:2）の濃度を増加させ
て処理した用量依存性試験を示す。この化合物は、H-ra
sのRNA転写物の翻訳開始コドンを標的としている。図１
に示すように、このオリゴヌクレオチドによる細胞の処
理はras−ルシフェラーゼ活性の阻害をもたらし、正常
型および変異型の標的rasのいずれも約50nMのIC50値を
示した。対照オリゴヌクレオチドは20塩基対のランダム
なフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体で
ある。結果は、オリゴヌクレオチドで処理していないト
ランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性に対する
パーセンテージを表現される。ras翻訳開始コドンを標
的としたオリゴヌクレオチドが変異型、正常型rasの両
方の発現を同程度減少させるという観察は、２つの標的
がAUG翻訳開始部位を囲む領域中で同一の配列組成を有
していることから予期される。 図２は、変異型（活性型）H-ras RNAの第12コドン点
突然変異を標的とした化合物である。フォスフォロチオ
エートオリゴヌクレオチド誘導体2570（配列ID番号:3）
で細胞を処理した用量依存性試験を示す。対照オリゴヌ
クレオチドは20塩基対のランダムなフォスフォロチオエ
ートオリゴヌクレオチド誘導体である。結果は、オリゴ
ヌクレオチドで処理していないトランスフェクトした細
胞のルシフェラーゼ活性に対するパーセンテージで表現
される。図に示すように、このオリゴヌクレオチドの濃
度を増加させて細胞を処理した結果、変異型または正常
型のras−ルシフェラーゼを発現する細胞中のras−ルシ
フェラーゼ活性はいずれも用量依存的に阻害された。し
かし、データをよく検証すると、低濃度においてオリゴ
ヌクレオチド2570は、正常型に比較して変異型のras−
ルシフェラーゼに対し約３倍の選択性を示すことが示さ
れている。事実、オリゴヌクレオチド2570は、変異型ra
s−ルシフェラーゼでは約100nMというIC50値を示したの
に対し、非変異型に対しては約250nMというIC50値を示
した。 図３は、正常型または変異型のras−ルシフェラーゼ
を発現する細胞を、Ｈ−rasの翻訳開始コドンまたは第1
2コドン点突然変異を標的としたオリゴヌクレオチドに
より単一用量（0.5μＭ）で処理した典型的な試験結果
を示す。試験されたアンチセンスフォスフォロチオエー
トオリゴヌクレオチド誘導体は表１に示される。対照オ
リゴヌクレオチド（2504）は、20塩基対のランダムなフ
ォスフォロチオエートオリゴヌクレオチド誘導体であ
る。結果は、オリゴヌクレオチドで処理していないトラ
ンスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性に対するパ
ーセンテージで表現される。図３に示すように、ras−
翻訳開始コドンを標的とした化合物2503（配列ID番号:
2）は、最もras−ルシフェラーゼ活性の阻害作用が強か
った。活性化rasの第12コドン点突然変異を標的とした
これらの３つの化合物の中で、17merのオリゴヌクレオ
チド2570（配列ID番号:3）のみが正常型に対する場合と
比較して変異型ras−ルシフェラーゼに対して選択的で
あることが示された。このことはまた、活性化Ｈ−ras
遺伝子に相補的な13のアンチセンスオリゴヌクレオチド
の全て、不規則な対照オリゴヌクレオチド（1966）、お
よび野生型rasの第12コドンに相補的な対照オリゴヌク
レオチド（2907）について得られたデータを要約した図
４にも示されている。各オリゴヌクレオチドについて、
その長さ、相補的な領域、およびras−ルシフェラーゼ
融合タンパク質の発現抑制活性が示されている。第12コ
ドン点突然変異を標的としたより長いフォフフォロチオ
エートは、ras−ルシフェラーゼ発現に対する実質的な
アンチセンス活性を示すのに対し、変異型のras−ルシ
フェラーゼ発現の選択的な阻害を示さなかった。17ヌク
レオチド長以下の、第12コドン点突然変異を標的とした
フォスフォロチオエートオリゴヌクレオチドは、いずれ
の型のras−ルシフェラーゼに対しても活性を示さなか
った。これらの結果は、ras−配列を標的としたフォス
フォロチオエートオリゴヌクレオチドの効果的なアンチ
センス活性を示す。 実施例７ ２−（アミノ）アデニン−置換オリゴヌクレ
オチドの合成 オリゴヌクレオチドおよびフォスフォロチオエートオ
リゴヌクレオチド誘導体は、以下の例外を除いて実施例
１にしたがって合成される。すなわち、２−（アミノ）
アデニンが好ましい部位においては、標準フォスフォア
ミダイトを商業的に入手可能な２−アミノデオキシアデ
ノシン フォスフォアミダイト（ChemGenes）で置き換
える。 実施例８ ras−ルシフェラーゼ遺伝子発現の２−（ア
ミノ）アデニン−修飾型アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドによる阻害 活性化rasの第12コドン点突然変異に相補的な一連の
アンチセンスフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチ
ド誘導体は、実施例７に記載されているように合成さ
れ、変異した第12コドンのウラシルに相補的な部位に２
−（アミノ）アデニンを有する。アデニンの２位のアミ
ノ基はラウシルの２位の酸素と水素結合しうるため、通
常の２つの水素結合と異なり３つの水素結合が形成され
る。このことは、この部位における修飾されたＡ−Ｇミ
スマッチのために野生型コドンに対するこのオリゴの安
定性を非安定化するか、または影響を与えないにもかか
わらず、活性化ras遺伝子に対する２−（アミノ）アデ
ニン修飾型アンチセンスオリゴヌクレイチドのハイブリ
ダイゼーションを大きく安定化するのに寄与する。
配列番号:1 配列の長さ:20塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 CTTATATTCC GTCATCGCTC 配列番号:2 配列の長さ:20塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 TCCGTCATCG CTCCTCAGGG 配列番号:3 配列の長さ:17塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 CCACACCGAC GGCGCCC 配列番号:4 配列の長さ:19塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 CCCACACCGA CGGCGCCCA 配列番号:5 配列の長さ:21塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 GCCCACACCG ACGGCGCCCA C 配列番号:6 配列の長さ:23塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 TGCCCACACC GACGGCGCCC ACC 配列番号:7 配列の長さ:47塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No 配列 ACATTATGCT AGCTTTTTGA GTAAACTTGT GGGGCAGGAG ACCCTG
T 配列番号:8 配列の長さ:29塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 GAGATCTGAA GCTTCTGGAT GGTCAGCGC 配列番号:9 配列の長さ:35塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No 配列 GAGATCTGAA GCTTGAAGAC GCCAAAAACA TAAAG 配列番号:10 配列の長さ:33塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 ACGCATCTGG CGCGCCGATA CCGTCGACCT CGA
T 配列番号:8 配列の長さ:29塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 GAGATCTGAA GCTTCTGGAT GGTCAGCGC 配列番号:9 配列の長さ:35塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:No 配列 GAGATCTGAA GCTTGAAGAC GCCAAAAACA TAAAG 配列番号:10 配列の長さ:33塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類:Genomic DNA ハイポセティカル配列:No アンチセンス:Yes 配列 ACGCATCTGG CGCGCCGATA CCGTCGACCT CGA
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エッカー，デーヴィッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，コリブリ・レーン 2609 (56)参考文献 Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｓｕｐｐｌ．15 ｐａｒｔ Ｄ （1991 Ｆｅｂ）Ｐ．32 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, ｖｏｌ．10，Ｎｏ．５（1991 Ｍａｙ) Ｐ．1111−1118 Ｓｃｉ．Ｃｈｉｎａ Ｓｅｒ．Ｂ Ｃ ｈｅｍ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ｅａｒｔｈ Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．34，Ｎｏ．１ （1991 Ｊａｎ）Ｐ．35−41 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，Ｖｏｌ．５（1990）Ｐ．267−275
Claims (10)
- 【請求項１】ヒトH-ras遺伝子の選択されたDNAまたはRN
Aに実質的に相補的であり、かつ、次のいずれかの配
列： を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。 - 【請求項２】請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド誘導体および薬学的に許容しうる担体を含む、ヒ
トH-ras遺伝子の発現を調節するための医薬組成物。 - 【請求項３】オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌ
クレオチド単位間結合基が硫黄含有化学種を含む、請求
項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体。 - 【請求項４】前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエ
ートを含む、請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド誘導体。 - 【請求項５】細胞または組織中のH-ras遺伝子の存在を
検出する方法であって、該細胞または組織を、請求項１
記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体と接触さ
せることを含む方法。 - 【請求項６】アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の
少なくとも１つのヌクレオチド単位間結合基が硫黄含有
化学種を含む、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオエ
ートを含む、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】特定のオリゴヌクレオチドが活性化された
H-rasと野生型のH-rasに対して異なる親和性を有するこ
とに基づいて、活性化されたH-rasを検出する方法であ
って、活性化H-rasを含むと疑われる細胞または組織を
オリゴヌクレオチド： と接触させ、かつ、細胞または組織の同一のサンプルを
請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体と接触させる
ことを含む方法。 - 【請求項９】少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの少
なくとも１つのヌクレオチド単位間結合基が硫黄含有化
学種を含む、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】前記硫黄含有化学種がフォスフォロチオ
エートを含む、請求項９記載の方法。
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