JPH06502424A

JPH06502424A - グラム−陰性菌感染の予防又は処置のためのヒト抗体製造用免疫原剤としての封入高−濃度リピドａ組成物

Info

Publication number: JPH06502424A
Application number: JP4500694A
Authority: JP
Inventors: アルビング，カール・エル
Original assignee: アルビング，カール・アール
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 1991-10-21
Publication date: 1994-03-17
Also published as: WO1992006709A1; EP0554364A1; CA2094588A1; AU8928791A; EP0554364A4; AU667028B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

グラム−陰性菌感染の予防又は処置のためのヒト抗体製造用免疫原剤としての封入高−濃度すピドＡ組酸物■、政府利権（ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　１ｎｔｅｒｅ ’ｓｔ）本文に記載される発明は、我々に特許権使用料を支払うことなく米国政府が、又は政府の目的のために製造、許可又は使用することができる。Ｔ１．発明の技術的分野本発明はグラム−陰性菌感染の予防又は処置のための免疫療法剤としての封入高濃度リビドＡ組成物及びヒト単クローン性抗体に関する。Ｉ　Ｉ　１発明の背景グラム−陰性菌感染世界中で、グラム−陰性菌への感染により起こる敗血症は死亡の主要原因のひとつである。グラム−陰性菌は環境中いたるところにあり、空気、水、食物中に存在し、腸には特に高濃度で存在する。皮膚の表面はグラム−陰性菌で覆われ、多くの皮膚感染はこれらの生物によって起こる。その広範囲における分布のために、これらの細菌は他の疾病に伴って日和見感染を起こす。例えば敗血症は病院内での死亡の最も普通の原因であり、特に癌、外傷及び熱傷などの状態に伴うと思われている。皮膚の熱傷に伴う死亡の主要原因は感染及びグラム−陰性シュードモナス生物によって起こる敗血症である。はとんどの尿路感染はグラム−陰性生物によって起こる。慢性病によって弱った患者又は大きな外傷あるいは熱傷による損傷を持つ患者、あるいは腸の穿通損傷を持つ患者は致命的グラム−陰性菌敗血症に罹る危険が特にある。下痢を起こすダラム−陰性菌感染は、幼児の死亡の主要原因のひとつである。グラム−陰性菌敗血症の通常の処置は、感受性生物に対して活性な抗体の投与による。そのような抗体を広く用いることにより耐性株又は生物が連続的に出現し、それが抗体による処置の有効性を制限してきた。さらに処置は適した抗体の機敏な投与に依存していることが多いが、通常生物が抗体に感受性であり最適有力抗体が用いられていることを証明する実験室的確定試験は、グラム−陰性生物の単離及び成育ならびに候補抗体による阻害を含む。感受性試験を行うには通常少な（とも１〜２日を要し、多くの感染が急性なために不適当な、又は亜最適（ｓｕｂ。ｐ　ｔ　ｉｍａ　］）抗体治療が用いられることが多い。リピドＡを用いた免疫療法亜最適抗体の使用は、抗体−耐性生物の出現の責を担うべき主要因子のひとつである。グラム−陰性菌敗血症の処置のための免疫療法の新しい戦略が開発された。この方法はリピドＡに対して特異性を有する単クローン性（又は多クローン性）ヒト抗体の投与を含む。免疫療法に用いられるリピドＡに対する単クローン性又は多クローン性抗体は、敗血症を有する患者における静脈内投与により得られ、通常比較的大感染がすでに起きてしまった場合のみに用いられる。これらの患者は多（の場合すでに中毒状況にあり、それが免疫療法による処置をより困難にする。リピドＡの構造上記の免疫療法的方法の合理性は、はとんどすべてのグラム−陰性菌が、すべてのグラム−陰性菌の表面を覆うリポ多糖票分子の主要成分としてリピドＡを含むという事実に基づいている。リポ多糖類の一般的構造は以下の通りである：（オリゴ糖繰り返し単位）、−（コアオリゴ糖）−（ケトデオキシオクトネート）３−リビドＡリビドＡの構造はほとんどのグラム−陰性菌に関して完全に定義されており、全合成された。それは（Ｂ〜１，６）−結合Ｄ−グルコサミン二糖の主鎖を含み、それが１及び４′位にホスフェート残基を有する。グルコサミン部分の可能な部位のそれぞれにアミド化又はエステル化長鎖脂肪酸（一般にＤ−３−ヒドロキシ及び／又はアシルオキシ脂肪酸）が存在する。種々の細菌から誘導された分子には、リビドＡの構造における小さい差がある。さらにいわゆる“本来の”リビドＡ（すなわちグラム−陰性菌から単離することにより誘導された非修飾リビドＡ）は通常、上記の“完全な”リビドＡと同一の基本構造を持つがホスホリル化の程度が異なる、又は脂肪酸の数あるいは構造が異なる分子の混合物を含む。毒性の少ないモノホスホリル　リビドＡは、１位にホスフェート残基がない。リビドＡの毒性グラム−陰性菌の免疫療法へのさらに有用な方法は、リポ多糖類に対するそのリビドＡ成分を介したワクチンの開発にある（すなわち免疫予防）。リポ多糖類の毒性が非常に高いことにより、この方法に対する理論的及び実際的障害が現れた。リポ多糖類の同義語は“内毒素′であり、リポ多糖類の内毒素活性のすべてはリビドＡ成分により起こる。リポ多糖類は試験管内生物系を用いて研究すると、又は生体内に注射すると字義通り多数の生物学的活性を有する。これらの活性の多くは毒性を伴い、グラム− 陰性菌感染及び敗血症の間に通常観察される有害な反応に対応する。これらの活性の中には二発熱原住、好中球減少、血小板減少、低血圧及びショック、ノヨック肺、腎不全、悪液質及び死亡が含まれる。これらの毒性効果のすべてはリポ多糖類のリビドＡ成分により起こる。従って、リビドＡをゆっくり放出し、それにより体中の高濃度の純すビドＡの存在によって起こる有害で致命的な結果を避けることを可能にする遮蔽又は“隠蔽”リピドＡを高濃度で含む組成物が必要である。ＩＶ、発明の概略従ってリビドＡが製薬学的に許容しつる封入−配達材料中に隔離された、埋め込まれた、又は“隠蔽された“リピドＡ〜含有成分を活性成分として含み、該材料が（ａ）リピドＡの疎水性脂肪酸部分をその水性環境から物理的に隔離、“隠蔽゛又は遮蔽してそれにより該部分が宿主−哺乳類中でその毒性を現すのを妨げることができ、（ｂ）該材料から１８５−２．２００マイクログラムの範囲内の投薬量でリビドＡをゆっくり放出することができる新規免疫活性組成物の提供が本発明の目的である。リピドＡは本来のリピドＡ、モノホスホリル　リピドＡ又はジホスホリル　リピドＡであることができる。本発明の実行には１８５−２１９．２２０−５４９．５５０−１０９９及び１１００−２２００マイクログラムの範囲内の高濃度が特に有用であることがわかった。封入遅延−放出配達材料又はデバイスは、リポソーム、生物適合性−生物分解性ポリマー、ミクロカプセル又は小型法、機械的遅延薬剤−放出デバイス及びこれらの組み合わせであることができる。グラム−陰性菌感染に対するワクチン、及びエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　Ｉ　ａ）　、ンユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、メニンゴコックス（ｍｅｎ　ｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）及びゴノコックス（ｇｏｎｏｃ。ｃｃｕｓ）を含むグラム−陰性菌による感染の前又は後の哺乳類の処置のための免疫療法的方法の提供も本発明の目的である。リピドＡの毒性及びその結果としてのこの物質に対する満足できる有効なヒトのワクチンの製造の困難さの故に、グラム−陰性菌に感染した患者の治療のための免疫療法生成物としてリピドＡに対するヒト多クローン性又は単クローン性抗体の利用がしばしば提案されてきた。Ｚｉｅｇｌｅｒ、Ｅ、Ｊ、　、ｅｔ　ａｌ、　、“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆＧｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ　ａｎｄ　ｓｈ。ｃｋ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｔｏ　ａ　ｍｕｔａｎｔ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、”Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ。Ｍｅｄ、３０７：１２２５−１２３０　（１９８２）：Ｔｅｎｇ、Ｎ、Ｎ。Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔＧｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＩｇＭ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、’″ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、８２：１７９０−１７９４　（１９８４）；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ、Ｊ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆＧｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　５ｈｏｃｋ　ａｎｄ　ｄｅａｔｈ　ｉｎｓｕｒｇｉｃａｌ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｂｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔ。ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｃｏｒｅ　ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ、”Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　ｉ　：５９−６３　（１３Ｊｕｌ　１９８５）；Ｋｉｒｋｌａｎｄ、　Ｔ、　Ｎ、　、ｅｔ　ａｌ、、　”Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅｆｉｎｅ　５ｐｅｃｉｆｊｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ−１ｉｐｉｄ　Ａａｎｔｉｂｏｃｌｉｅｓ、”　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：３６１４−３６１９　（１９８６）：Ｂｏｇａｒｄ、Ｗ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、。 −Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｊｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｊｄｅ：Ａｓ５ｏｃｊａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓ−ｇｅｎｕｓ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｉｔｂ　１ｒｐｒｄ　Ａ　５ｐｅｃｊｆｊｃｉｔｙ、”Ｉｎｆｅｃｔ。Ｉｍｍｕｎ、５５：８９９−９０８　（１９８７）；Ｚｉｅｇｌｅｒ、Ｅ。Ｊ、、−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｃｏｒｅ：Ｔｈｅ　ｅｍｐｅｒｏｒ’　ｓ　ｎｅｗ　ｃｌｏｔｈｅｓ７”　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１５８：２８６−２９０　（１９８８）；Ｗａｒｄ、Ｄ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　１ｉｐｏｐ。Ｉｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ａｎｔｉ−１ｉｐｉｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、’ｃＩｉｎ。Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、７２＋１５７−１６３　（１９８８）を参照。従って本発明の別の目的は、“過剰免疫′多クローン性抗血清の形態のヒト抗体又はグラム−陰性菌と反応性でグラム−陰性菌によって起こる敗血症の有効な受動予防（ｐａｓｓｉｖｅ　ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）又は治療的処置を与えるヒト単クローン性抗体の提供であり、該単クローン性抗体は、保護的ヒト抗体を生産する遺伝子を含む自己再生キャリ１　ヤー細胞により生産される。本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし本発明の精神及び範囲内で種々の変更及び修正がこの詳細な説明から当該技術における熟練者に明らかになるので、詳細な説明及び特定の実施例は本発明の好ましい具体化を示すが、単に例示のみのためである。予想に反し、リポソーム、生物適合性生物分解性ポリマー、ミクロカプセル、小型味、遅延−放出デバイス又はこれらの組み合わせなどの遅延薬剤放出材料内に封入された非常に高濃度のリビドＡを含む抗免疫原性組成物を哺乳類宿主に、筋肉内又は皮下を含む全身的注射により与えることができることを見いだした。ヒトに安全に投与することができるリピドＡの投薬量、特にモノホスホリル　リピドＡ　（ＭＰＬ）の投薬量は毒性により制限されることが先行文献により確立されている。Ｖｏｓｊｋａ、　Ｇ、Ｊ、　、ｅｔ　ａｌ、　、Ｐｈａｓｅ−Ｉ　５ｔｕｄｙ　’ｏｆ　１ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｌｉｐｉｄ− Ａ。 ”Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、１８：１０７−１１２　（１９８４）を参照。ＭＰＬの最高安全静脈内投薬量はＩｎ”当たり１００ μｇのＭＰＬであることが確立されている。通常の表面積を１．７−１．　８ｍ ”と仮定するとＭＰＬの最高安全投薬量は１７０−１８０μｇである。出願人等は１８５−２，２００マイクログラムの範囲のリビドＡの投薬量を毒性効果なしに哺乳類宿主に投与し、非常に高力価の抗体を生産することができることを見いだし、抗体の力価は低投薬量のリピドＡの場合に得られる力価より高い。得られたリビドＡに対する抗体活性の量は最初の１回の初期免疫化の間に投与されたリポソーム　リピドＡの投薬量に比例した。合計で同量のリポソーム　リピドＡを異なる時間の多数回の注射に分けた投薬量で与えた場合でさえ、得られる抗体活性はリポソーム　リピドＡの全投薬量を１回で与えた場合の量に達しなかった。対人材料の使用による毒性の抑制動物における実験研究により、リピドＡの毒性の多くがホスフェート基のひとつ（１４位における）及び脂肪酸部分に起因することが示された。モノホスホリル　リピドＡは発熱原性の低下により決定される毒性が非常に減少しているが、本来の（ジホスホリル）リピドＡにおいて観察される内毒性のすべてを失うわけではない。一般に脂肪酸基のないリピドＡは非発熱原性であり、発熱原性の程度は脂肪酸基の存在数に関連すると思われる。出願人等及び他は文献で、本来のリピドＡの毒性の多く、及びモノホスホリル　リビドＡの残留毒性の多くを、リポソームなどの対人材料にリピドＡを包み込むことにより抑制することができることを示した。Ｒａｍ５ｅｙ、Ｒ，Ｂ、、ａｔ　ａｌ、、”Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　１ｉｐｉｄ　Ａ　ａｎｄ　ｌｊｐｏｓｏｍｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１ｉｐｉｄ　Ａ　ｏｎ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ、Ｂｏ。ｏｄ　Ａ　ａｎｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　１ｉｐｉｄ　Ａ　ｗｉｔｈ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ　ａｍ。ｅｂｏｃｙｔｅｓ、”　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、３９：１３８５−１３９１　（１９８３）；Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、。 ”Ｍｏｄｕｌａｔｊｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ、”　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：２６６３−２６７０（１９８７）：Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ８．　”Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＬＰＳ　ｉｎ　Ｉｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ　ｉｔｓ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅｔｕｍｏｒｊｃｉｄａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、”　Ｊ、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ。４３：４３６−４４４　（１９８８）；Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｒ，Ｌ、。ｅｔ　ａｌ、、“Ｉｍｍｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　１ｉｐｏｓ。ｍａｌ　ｍａｌａｒｉａ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎｉｎ　ｍｏｎｋｅｙｓ：Ａｄｊｕｖａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆａｌｕｍｉｎｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　１ｉｐｉｄ　Ａ、”Ｖａｃｃｉｎｅ７：５０６−５１２　（１９８９）；Ａｌｖｉｎｇ、Ｃ，Ｒ，、＆　Ｒ。Ｌ、Ｒｉｃｈａｒｄｓ、”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ目ｐｉｄ　Ａ：Ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｎｏｎｔｏｘｉｃ　ａｄｊｕｃａｎｔ　ｆｏｒ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｍａｌａｒｉａ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ、”　ＩｍｍｕｎｏＬ　Ｌｅｔｔ、２５：２７５−２８０　（１９９０）を参照。リポソームはリン脂質及び他の脂質などの脂質の二重層を含み、脂質の疎水性領域が互いの方向を向き、脂質の親水性領域が脂質を懸濁した水相に向く。隣接する脂質分子はファン　デル　ワールス力により結合し、これにより内部の水空間を囲む脂質二重層を含む膜を構成する脂質小球体（ｓｐｈｅｒｕｌｅｓ）が自動的に形成される。リビドＡが脂質二重層中に含まれる場合、脂質の頭部（ジグルコサミン　ジホフエート）に対して特異的であることが知られている抗−リピドＡ抗体がリポソーム性すビドＡに容易に結合することを示すことができる。これは凝集又は補体結合を起こすことができ、補体活性化が脂質二重層のリンスを起こして内部水空間に存在するマーカー化合物へのリポソームの透過性を向上させることを示すことができる。免疫学的研究を行う他の方法には、酵素−結合イムノソルベントアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）における抗原としてのリビドＡを含むリポソームの利用、あるいはリポソームの表面において免疫学的反応が起こったことを“目立たせ”、視覚化するための蛍光抗体又は染料を用いて標識した抗体の使用、あるいは抗体を吸着するための吸着剤粒子としてのリポソームの利用を含むことができる。これから、リピドＡ分子が親水性部分を水性媒体に向け、疎水性（脂肪酸）部分を脂質二重層に埋め込んで予想された方法で配向していることが結論される。類似の種類の研究を用い、抗−リピドＡ抗体が赤血球に吸着したリビドＡに結合できることを示すことができる。上記のリピドＡの配向に関する予想された結果は、脂肪酸基により起こる毒性効果は脂肪酸が水性環境に達し難い理由により減少するか又は除去されることである。この結果は実際に観察された。我々の実験室及び他の実験室は、うさぎ中のリピドＡによって起こる好中球減少、インターロイキン−１分泌及び発熱原性が、リビドＡがリポソーム中に存在する場合にすべて顕著に減少することを示した。Ｒａｍ５ｅｙ、Ｒ。Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、、”Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　１ｉｐｉｄ　Ａ　ａｎｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１ｉｐｉｄ　Ａｏｎ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ、”Ｂ］ｏｏｄ　５６：２０７−３１０　（１９８０）；Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、−Ｍ。ｄｕｌａｔｊｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａＩ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｂｙ　１ｎｃｏｒｐｏｒａＮｏｎ　１ｎｔｏ　Ｉｉｐｏｓｏｍｅｓ、”Ｊ、１ｍｍｕｎｏ！、１３８：２６６３−２６７０　（１９８７）：Ｄｉｊｋｓｔｒａ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、−Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆＬＰＳ　ｉｎ　Ｉｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ　１ｔｓａｂｔｌｉｔｙ　ｔｏ　１ｎｄｕｃｅ　ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ。 ”　Ｊ、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ、４３：４３６−４４４　（１９８８）：Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｒ，Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｉｐｏｓｏｍａｌ　ｍａｌａｒｉａ　５ｐｏｒ。ｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｌｍｉｎｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅａｎｄ　ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　ｌ１ｐｉｄ　Ａ、Ｖａｃｃｉｎｅ　７：５０６−５１２　（１９８９）；Ａｌｖｉｎｇ、Ｃ，Ｒ，、＆　Ｒ，Ｌ、Ｒｉｃｈａｒｄ、−Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　１ｉｐｉｄ　Ａ：Ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｎｏｎｔｏｘｉｃ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｆｏｒ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｍａｌａｒｉａ　５ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ、”　Ｉｍｍｕｎｏｌ。Ｌｅ　ｔ　ｔ、２５　：　２７５−２８０　（１９９０）を参照。広く用いられる内毒活性の測定のひとつは、リムルス変形細胞リンス（Ｌｉｍｕｌｕｓａｍｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓｉｓ）（ＬＡＬ）試験の利用である。この試験ではカブトガニの変形細胞がらの抽出成分（ｌｙｓａｔｅ）が内毒素の存在下で凝集する。この試験は内毒素の存在に関する最も敏感な試験のひとつである。我々は本来のリビドＡをリポソーム中に挿入することによりＬＡＬ活性を１０．０００倍以上低下させることができた。しかしリポソーム性すビドＡのＬＡＬ活性はリポソーム中のリピドＡのエピトープ密度に依存し、リポソーム性すピドＡの濃度を非常に増加させるか又は減少させることによりいわゆるそれぞれ”リムルス−陽性”又は“リムルス−陰性“リポソームを製造できることを見いだした。Ｒａｍ５ｅｙ、Ｒ，Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、、’Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｌｉｐｉｄ　Ａ　ａｎｃｌ　Ｉｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌｉｐｉｄ　Ａ　ｏｎ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｉｎ。ｇｅｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ、”Ｂｌｏｏｄ５６：２０７−３１０　（１９８０）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、ＥＣ，、ｅｔ　ａｌ、、 ”Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　１ｉｐｉｃｌＡ　ａｎｄ　Ｉｉｐｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　１ｉｐｉｄＡ　ｗｉｔｈ　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｏｈｅｍｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅｓ、”　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、３９：１３８５−１３９０　（１９８３）；Ｄｉ　ｊｋｓｔｒａ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、−ＭｏｄｕＩａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃＮｖｉｔｙ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｂｙ　ｉｎｃ。ｒｐｏｒａｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　Ｉｉｐｏｓｏｍｅｓ、’Ｊ、ＩｍｍｕｎｏＬ　１３８：２６６３−２６７０　（１９８７）を参照。これに基づき、非常に高濃度のリビドＡを含むリポソームがより少量のリピドＡを含むリポソームと質的に異なる生物学的活性を示すことができることが明らかである。更にリポソーム性すピドＡはそれ自体、非すポソーム性すピドＡと質的に異なる性質を有する。ヒトにおけるリポソーム性すビドＡの毒性の欠如リピドＡを含むリポソームの生体内における毒性が減少することが予想されるという認識に基づき、モノホスホリル　リビドへをヒトのマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に関する候補ワクチンとして用いられるリポソーム中に含ませた。これらのリポソームはマラリアに対する免疫化に用いられる組み替え抗原も含んだ。リポソーム性すビドＡは組み替え抗原の免疫原性を強化する補薬として働き、リポソーム自身も他の補薬、水酸化アルミニウム（明Ｗ）と共に吸着された。候補ワクチンを、例えば０．８−１２及び１６−２０週に３回、５グループのヒトのボランティア（グループ１は５人のボランティア、グループ２−４は６人、グループ５は７人）に注射した。ワクチンの安全性の試験のために投薬量を順に増加させて注射したが、各グループは正確に同量の明響を与えられた。ワクチンの投薬量は以下の通りである：リポソームの希釈に基づいてグループ１．１　：　１００　ニゲループ２゜１　：　１０　；グループ３．１：４；グループ４，１：２ニゲループ５．１：１（すなわち非希釈）。グループ５は各筋肉内注射の間に２．　２ｍｇのモノホスホリル　リピドへを与えられ、これは我々の知る限りでこれまでにヒトの患者に目的を持って与えられたリビドＡの最高の投薬量である。遊離のモノホスホリル　リビドＡをヒトのボランティアに静脈内で与えた、以前に公開された研究は、ヒトに用いることができる最高安全投薬量は我々がリポソーム中で筋肉内に投与した最高投薬量の約１２分の１であることを示した。遊離のモノホスホリル　リビドＡの１２分の１投薬量の静脈内投与で、かなりの程度の反応誘起性（ｒｅａｃｔ。ｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び毒性が観察された。Ｖｏｓｉｋａ、ｅｔ　ａｌ。、’Ｐｈａｓｅ−１５ｔｕｄｙ　ｏｆ　１ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｌｉｐｉｄ−Ａ、”Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、１８　：１０７−１１２　（１９８４）、対照的に出願人等は、最高投薬量のモノホスホリル　リピドＡにおいてさえ有意な急性毒性効果が観察されないことを見いだした。ヒトにおけるリピドＡに対する抗体の誘導リピドＡに対するＩｇＧ抗体の存在に関して各ボランティアの血清を調べ、はとんどの血清がリビドＡに対する抗体を含むことを見いだした。ミクロタイタープレートウェルにおいて、精製リビドＡを抗原として用いた固相酵素−結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）にヨリ我々の免疫学的試験を行った。免疫反応を研究するための他の方法には、ラジオイムノアッセイ、抗原又は抗原を含むリポソームあるいは細胞の綿状反応、補体結合、蛍光抗体分析又はマーカーとして他の染料を用いた他の分析、及びリピドＡで覆われた赤血球の血球凝集反応、ならびに同種の赤血球を用いた血球凝集阻止反応分析を含む、抗体と精製抗原の反応性を測定する他の多くの標準的方法が含まれる。上記の分析及びそれに類似した他の分析はすべて抗原−抗体反応という同一主題に基づく変法であり、当該技術において標準的である。我々は、各グループのボランティアにリピドＡに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の両方を含む血清を存する患者が含まれており、増加は常にワクチンの注射の前に採血した免疫学的試験との比較に基づいているが、リピドＡの投薬量を増加させて注射した患者の間でＩｇＧ抗体力価が実質的に増加し、グループ５において最高量の抗体が観察されることを見いだした。従ってリピドＡに対する抗体量の最適免疫結果は、リポソームの不在下で安全に与えることができない投薬量のリビドＡを用いてのみ達成できると結論した。我々は、この方法が最高量のＩｇＧ抗体を得るためのこれまでに記載された唯一の安全に見える方法であり、そのような量の抗体は最初の採血時（２週間）においてさえ得られると結論した。我々が得た衝撃的な観察のひとつは、モノホスホリル　リビドＡを含むリポソームを用いて免疫化することにより、本来のリピドＡに対する抗体を生産したことであることを指摘しなければならない。先行技術において、リピドＡのＣ１位におけるホスフェート残基がリビドＡに対する抗体の特異性に寄与できることが示された。実際に本来のリビドＡに対する多クローン性抗血清につき記載があり、その場合抗血清中の抗体は０４″位のホスフェートを含むが０１位のホスフェートの欠如したリピドＡの類似体と反応しない。Ｂｒａｄｅ、ｅｔ　ａｌ、。ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＩＭＭＵＮＩＴＹ、ｖｏｌ、５５．　ｐＩ）２６３６−２６４４．１９８７年１１月（゛タイプ　ｅ′抗体特異性をまとめたその中の図３の要約及び表１１を参照）。同文献中で逆に、抗血清はＣ４’　ホスフェートを含むリビドＡ類似体と反応できないことを示すことができると記載されている（上記の表１の抗体タイプｄ）。これに基づき先行技術から、モノホスホリル　リビドＡ（すなわち１位のホスフェートの欠如したリビドへ）に対する抗体が必ず本来のリピドＡと反応することは証明されないことが明らかである。少なくともいくつかの場合には、１位ホスフェートが本来のリビドＡに対する抗体の特異性を主に決定する限界免疫優性因子（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎ。ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｆａｃｔｏｒ）である。リピドＡを用いて免疫化することにより生成される複合特異性の観点から、ホスフェート基の欠如したリピドＡの誘導体（即ちモノホスホリル　リビドＡ）を用いた免疫化が、ホスフェート基を含む本来のリビドＡに対する抗体を誘起することは明らかではない。Ｂｒａｄｅ　ｅｔ　ａｌ、は、リビドＡに対する抗体を生産することができ（タイプｅ抗体）、それはモノホスホリルリビドへに欠如しているＣ１ホスフェート基の存在を必要とすることを示した。そのような抗−０１−ホスフェート抗体がリポソーム性の本来のリピドＡにより独自に誘起されないことは明らかでない。従って抗−０１−ホスフェート抗体がリポソーム性すビドＡにより独占的に誘起される場合、それらはＣ１−ホスフェート基の欠如したリポソーム性モノホスホリル　リピドＡを用いた免疫化により誘起することはできない。リポソーム性抗−敗血症ワクチンの利用に関して提案された戦略我々は、リポソーム性抗−敗血症ワクチンを免疫予防に（他の種類のワクチンの場合のようにその従来の利用形式で）、又はすでに敗血症の現れた患者又は敗血症の現れる危険のある患者（例えば外傷又は熱傷に会った患者あるいは老齢又は癌あるいは長期の寝たきり状態を起こす病気などの慢性病のために衰弱した患者）における免疫療法剤として用いることができることを予想する。結果は、ワクチンが投与後２週間以内に有効となることを示しているが、グループ５で達成された非常に高い水準はワクチンがもっと早い時期にさえ有効であり得ることを示している。ワクチンは、例えば基礎となる刺激的状況の修正（例えば膿瘍の除去、癌の除去、穿孔性腸の閉鎖、感染静脈内カテーテルの除去、感染心臓弁の除去など）などの他の治療的手段と合わせて、あるいは抗生物質、ステロイド、抗癌剤を同時に投与して、又は通常リポソーム性抗−敗血症ワクチンの不在下で治療的利益を有することが期待される免疫療法的、あるいは他の治療的手段と合わせて用いることができる。我々の抗−敗血症ワクチンからの別の予期せぬ利証は、ワクチンの最高の初期投薬量で達成された（グループ５）抗体活性の高い力価は、単にもっと少ない投薬量のワクチンで多数回の免疫化を行うことによってまねられないことであるようだ。２週間後に観察されたグループ５の■ｇＧ抗−リビドＡの量は、他のグループがその後免疫化を続け、グループ５に最初に与えられた投薬量と同等のリビドＡの投薬量となった後に観察された最高の量より高かった。図１において、各グループは８週（グループ１−３）又は１０週（グループ４及び５）で最初の免疫化投薬量と同一の追加免疫を受けた。従って２回目（追加）の免疫化の後、グループ４は２回の注射でグループ５の最初の１回の免疫化投薬量中に存在したリビドＡの投薬量と同一の合計投薬量のリポソーム性モノホスホリル　リピドＡを与えられた。それにもかかわらず追加免疫の２週間後に測定すると、グループ４は、２倍の抗原投薬量をグループ５のボランティアに与えて最初の免疫化を行った２週間後に達成された量の半分よりわずかに高い程度のＩｇＧ抗体量しか達成しなかった。他の戦略を用いた類似の結果の予想リピドＡを含むリポソームの使用の正味の結果は、リビドＡの脂肪酸が水性環境から“隠蔽”されることである。この結果はおそらく他の種類の粒子又は戦術によっても達成することができる。例えば種々の種類のポリマー、ミクロカプセル及び小型法はすべて同様の結果を達成できると思われる。゛リポソーム″、″ミクロカプセル”、“小型球”、“ポリマー性薬剤配達ビヒクル”、　“遅延放出デバイス′などの用語又は他の雇似の用語は、薬剤及び蛋白質のための種々の種類の運搬系を述べるためにしばしば文献中で非公式に用いられるが、そのような命名の意味につき普遍的同意あるいは一般的に受け入れられた国家的又は国際的協定はない。リポソームは通常内部水性空間を囲むことができる脂質膜から成ると理解され、膜は種々の種類の脂質から成る。本発明に従い用いられるリポソームは種々の方法で作ることができる。リポソームの寸法はそれを作るのに用いられる方法に依存して変わる。溶液中のリポソームは一般に球状の小胞の形であり、１層か又は数層の脂質分子の同心内層を有し、それぞれの脂質分子は式ＸＹで表され、ここでＸは疎油性− 親水性部分であり、Ｙは親油性−疎水性部分である。溶液中では同心内層は親水性部分が水相と接触したままとなるように配置される。例えば水相がリポソームの内部及び外部の両方に存在する場合、脂質分子は最高でｘｙ−ｙｘの配置の二重膜を形成し、これはラメラとして知られている。かくして本発明におけるリポソームは既知の実験室的方法に従って調製することができる。ひとつの好ましい具体化においてリポソームは、予想されるリポソームの懸濁液の体積の１０倍以上の体積の例えばガラス製作ナシ型−フラスコなどの容器中で、所望の割合でリピドＡを含む用いる脂質を混合することにより作ることができる。回転蒸発器を用い、負圧下にて約４０℃で溶媒を除去する。水栓に取り付けたフィルターポンプアスピレータ−から得られる真空を使用することができる。通常溶媒は約２−５分以内で除去する。組成物はさらに真空下のデシケータ−中で乾燥する。乾燥された脂質は時間と共に劣化するので一般に約１週間後に捨てる。乾燥脂質は、すべての脂質フィルムがガラスから離れるまで振ることにより無菌の発熱物質を含まない水中で約３０ｍＭのリン脂質に水和することができる。その後水性リポソームをアリコードに分け、それぞれをワクチンびんに入れ、凍結乾燥し、真空下で密封する。別法の場合リポソームを他の既知の実験室的方法、例えばＢａｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３：２３８　５２（１９６５）の方法；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、“ＬｉｐｏｓＯｍｅｓ′於ＤＲＵＧ　ＣＡＲＲＩＥＲ８ＩＮ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＡＮＤＭＥＤＩＣＩＮＥ、［１，２８７３４１（Ｇ、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　ｅｄ、１９７９）の方法；Ｄｅａｍｅｒ　ａｎｄ　Ｕｓｔｅｒ。 ”Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”於ＬＩＰＯ３ＯＭＥＳ　（Ｍ、　０ｓｔｒ。ｅｄ、１９８３）（７）方法；及び例えば５ｚｏｋａ、Ｊｒ、　ａｎｄＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、’Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｌａｒｇｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ａｑｕｅｏｕｓ　５ｐａｃｅ　ａｎｄＨｉｇｈ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｈａｓｅ　Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ、”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｋ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　７５　：　４１９４−９８　（１９７８）により記載の逆−相蒸発法に従って調製することができる。前記の方法は水性材料を捕獲するそれぞれの能力及びそれぞれの水性空間一対一脂質比が異なる。本発明において閉鎖膜の存在は必要でなく、脂質が自己−集合して粒子状構造を形成することだけが必要である。単独で、又は他の脂質と組み合わせてリポソームを構成するのに用いられてきた脂質には、リン脂質、糖脂質、糖リン脂質、ジグリセリド、トリグリセリド、ステロール、ステロイド、テルペノイド、遊離脂肪酸及びリポイダルビタミン（Ｉｉｐｏｉｄａｌ　ｖｉｔａｍｉｎｓ）が含まれる。蛋白質又は他のポリマーと複合させた合成脂肪族アシル基を含む多数のリポソーム構造が作られてきた。不溶性疎水性蛋白質の再構成に脂質を用いたリポソームも形成することができる。本出願において″ミクロカプセル”及び“小型球 ”という用語は、抗原分子（リビドＡなど）のためのキャリヤーとして用いられる粒子状構造物を言い、構造物を形成する分子はそれがリポソーム、脂質、蛋白質又は種々の他の種類のポリマーであっても、抗原性材料が即座に放出されるのを防ぐ拡散障壁となる。免疫系への抗原性材料の遅延放出は、これらの構造物により助長される。ポリマーから成る粒子などの粒子からの封入材料の放出は、拡散により起こるのが最も普通である。ポリマーからの材料の拡散の機構は多要素から成り、ポリマーフィルムにより囲まれた溜からの放出；放出されるべき材料がポリマー中に均一に分布しているマトリックスからの放出：ポリマー主鎖からの材料の分裂：回りの溶媒への暴露によるポリマーの溶解：ポリマー中の孔の形成による、又は予備形成された孔を通る浸透膨潤に起因する漏れを招く水の透過；及び外部磁場の負荷による材料の放出を含む。これらの機構のぞれぞれの正味の結果は、放出するべき材料の初期の隔離及び゛隠蔽”、及びそれに続く比較的ゆっくりした放出であり、放出はその機構及びポリマーミクロクブセル又は小型球の化学的及び物理的組成の性質により調節される。これらの機構はさらに詳細にＬａｎｇｅｒ、 ”Ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ、”５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：１５２７−１５３３により記載されている。Ｌａｎｇｅｒは、上記に既述されている拡散及び放出は、封入又は隔離抗原に対する抗体の製造を含む免疫学的用途にも適用できることも指摘している。我々は、リビドＡを含むリポソームが“遅延放出“デバイスとしても働く証拠を有する。我々は、マウスの筋肉内に注射したリピドＡを含む蛍光−標識リポソームの組成物のかなりの割合（おそらく半分程度ンが、注射部位に少なくとも１週間残っていることを見いだした。毒性リビドＡの遅延放出は無毒性であるが高い免疫原性刺激を起こす。リピドＡの遅延放出は、生体内で薬剤又は他の治療物質を放出するために設計されたいずれの種類の粒子又はデバイスによっても行うことができる。４、

【図面の簡単な説明】

図１はリビドＡに対するヒトＩｇＧ応答を示す。本来のリピドＡに対するＩｇＧ抗体量をＥＬＩＳＡにより測定し、１／１００希釈の血清の４０５ｎｍにおける吸収として示す。各線は各グループにおけるそれぞれのヒト血清中で観察された値の平均を示す。各グループはＤＭＰＣ。ＤＭＰＧＳＣＨＯＬ、リピドＡ及びＲ３２ＮＳ１を含むリポソームで免疫化した。注射の前にリポソームを下記に示す通りに希釈し、補薬としての明春と混合した。グループＶは２．２ｍｇのモノホスホリル　リビドへを含むリポソームで免疫化した。免疫化の前にこのワクチンをグループＩＶ、ＩＩＩ、ＩＩ及び工のためにそれぞれ１／２．１／４．１／ｌＯ及び１／１００に希釈した。グループ■ 、ＩＩ及びＩＩＩは０及び８週に免疫化しニゲループＩＶはＯ及び１０週に免疫化し；グループＶは０及び１２週に免疫化した。データは、非希釈ワクチンを用いた１回の注射（０週におけるグループＶ）が２週間後に（１２週後でさえ）、１／２希釈（グループＴＶ）の２回の注射より高い免疫応答を起こすこを示している。図２はリピドＡに対する患者のＩｇＧ応答を示す。これは５グループの各々における注射後０及び２週間の応答を示す。これはグループＶのボランティアのすべてが免疫後に実質的に高い量のリビドＡに対する抗体を現すことを示している。データは、ある患者が免疫化前でさえ高い量のリビドＡに対する抗体を有することも示している。図３はリピドＡに対する患者のＩｇＧ応答を示す。これはリピドＡに対する抗体の免疫前の量を各ボランティアの血清において引き去ると、グループＶの患者が最も一貫性があり、免疫化により最も高量のリビドＡに対する抗体が誘起されることを示している。図４は追加免疫後２週間におけるリビドＡに対する患者のヒトＩｇＧ応答を示す。追加注射時間は、図１への凡例中に記載する。追加免疫後でさえグループＶは、患者が高い抗体力を現すことにおいて他のすべてのグループより優っている。図５はリビドＡに対する患者のＩｇＭ応答を示す。これは、各ボランティアの血清において免疫化前のリピドＡに対する抗体の量を引き去ると、グループＩと比較してグループＴＩ、ＩＩＩ、■ｖ及びＶの患者がより良い一貫性を有し、免疫化により、より高い量のリピドＡに対する抗体を誘起することを示している。グループＶの場合すべての患者が高い量を現すことを示し、最も一貫して高い量のＩｇＭが観察される。図６はリピドＡに対する患者のＩｇＡ応答を示す。これはグループ■ＩＳ　ＩＩＩ、ＩＶ及びＶの患者がリビド、へに対するＩｇＡ抗体を現すことを示す。特にグループＩＶ及びＶにおける量は、より一貫性があり、グループｆより゛高い。図７はグループ■におけるリポソームの注射後の各リポソーム構造物に対するＩｇＧ応答を示す。注射に用いたリポソームは、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）　、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）　、コレステロール（ＣＨＯＬ）及びモノホスホリル　リピドＡを含む。成分のそれぞれを、個別に精製された各成分に対するＩｇＧ抗体の出現に関してＥＬＩＳＡにより調べた。リビドＡの場合、患者に０．０２２ｍｇのモノホスホリル　リビドＡを含むリポソームを注射したが、精製された本来のリビドＡを用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。データは免疫前の値がある場合はそれを免疫後の値から引き去って示す（初期免疫後２週間）。ＥＬＩＳＡ分析のための各血清を１／１００に希釈した。それぞれの場合に優勢な抗体活性がリビドＡに対して現れた。図８はグループＩＩにおけるリポソームの注射後の各リポソーム構造物に対するＩｇＧ応答を示す。注射に用いたリポソームは、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）　、コレステロール（ＣＨＯＬ）及びモノホスホリル　リピドＡを含む。成分のそれぞれを、個別に精製された各成分に対するＩｇＧ抗体の出現に関してＥＬＩＳＡにより調べた。リビドＡの場合、患者に０．２２ｍｇのモノホスホリル　リビドＡを含むリポソームを注射したが、精製された本来のリビドＡを用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。データは免疫前の値がある場合はそれを免疫後の値から引き去って示す（初期免疫後２週間）。ＥＬＩＳＡ分析のための各血清を１／１００に希釈した。それぞれの場合に優勢な抗体活性がリビドＡに対して現れた。図９はグループＩＩＩにおけるリポソームの注射後の各リポソーム構造物に対するＩｇＧ応答を示す。注射に用いたリポソームは、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）　、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）　、コレステロール（ＣＨＯＬ）及びモノホスホリル　リピドへを含む。成分のそれぞれを、個別に精製された各成分に対するＩｇＧ抗体の出現に関してＥＬＩＳＡにより調べた。リビドＡの場合、患者に０．５５ｍｇのモノホスホリル　リピドＡを含むリポソームを注射したが、精製された本来のリピドＡを用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。データは免疫前の値がある場合はそれを免疫後の値から引き去って示す（初期免疫後２週間）。ＥＬＩＳＡ分析のための各血清を１／１００に希釈した。それぞれの場合に優勢な抗体活性がリピドＡに対して現れた。図１０はグループ■Ｖにおけるリポソームの注射後の各リポソーム構造物に対するＩｇＧ応答を示す。注射に用いたリポソームは、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）　、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）　、コレステロール（ＣＨＯＬ）及びモノホスホリル　リピドＡを含む。成分のそれぞれを、個別に精製された各成分に対するＩｇＧ抗体の出現に関してＥＬＩＳＡにより調べた。リピドＡの場合、患者に１．１ｍｇのモノホスホリル　リビドＡを含むリポソームを注射したが、精製された本来のリビドＡを用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。データは免疫前の値がある場合はそれを免疫後の値がら引き去って示す（初期免疫後２週間）。ＥＬＩＳＡ分析のための各血清を１／１００に希釈した。それぞれの場合に優勢な抗体活性がリピドＡに対して現れた。図１１はグループＶにおけるリポソームの注射後の各リポソーム構造物に対するＩｇＧ応答を示す。注射に用いたリポソームは、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）及びモノホスホリル　リビドへを含む。成分のそれぞれを、個別にｆｌＩＩＭされた各成分に対するＩｇＧ抗体の出現に関してＥＬＩＳＡにより調べた。リビドＡの場合、患者に２．２ｍｇのモノホスホリル　リピドへを含むリポソームを注射したが、精製された本来のリビドＡを用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。データは免疫前の値がある場合はそれを免疫後の値から引き去って示す（初期免疫後２週間）。ＥＬ４ＳＡ分析のための各血清を１／１００に希釈した。それぞれの場合に優勢な抗体活性がリビドＡに対して現れた。図１２はグループＶの患者からの抗血清により引き起こされた膜に対する補体− 媒介免疫損傷を示す。リポソームの内部からの捕獲されたグルコースマーカーの放出を招くリポソームの補体−依存性リシスを、ＤＭＰＣ，ＣＨＯＬ、ＤＭＰＧ及びモノホスホリル　リピドＡ　（２，２ｍｇ）を含むリポソームで免疫化した後０．２及び１４週でグループＶの各患者から採取した血清を用いて測定した。抗原として本来のリビドＡを含むか又は含まないリポソームの補体−媒介リシスを調べた。破線は分析におけるバックグラウンド変動と比較して有意な量の免疫損傷がリポソームに対して起こった場合の量を示すために過去に用いられてきたグルコース放出の独断的値を示す。結果はリビドＡを含むリポソームに対して実質的免疫損傷が起こり、これは１４週において増加さえしていることを示している。補体を活性化して膜の損傷を起こす能力は、血清がグラム−陰性菌生物の感染に対して保護する体の防御機構を活性化する能力の尺度である。Ｖｌ、本発明の実施例の詳細な説明下記に示す実施例は、非常に高い投薬量のリビドＡを含み、ワクチン及びリビドＡと反応性のヒト単及び多クローン性抗体の製造に用いることができる免疫活性組成物の製造における本発明の実行を、制限を含まずに例示する方法である。代表的実験の概要は、グラム−陰性菌によって起こる感染（敗血症）の予防及び処置に有用であると予想されるリビドＡに対する抗体の製造につながる免振法組成物の製造法を例示するように選択した。実験法及び結果リポソームの調製　免疫化のためのリポソームを１，８／領　２／１゜５のモル比のシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）　、シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）及びフレステロール（Ｃｈｏｐ）の混合物から調製した。ＤＭＰＣ及びＤＭＰＧはＡｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ、Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬから購入した。ＣｈｏｌはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。ＭＯ）から購入し、使用前にエタノールから３回再結晶した。モノホスホリル　リビドＡ　（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｃ、）を、１μモルのリン脂質当たり５２．６μｇの濃度でリポソームに挿入した。すべての脂質は再蒸留クロロホルム中の溶液として調製した。丸底フラスコ中に適量の脂質溶液を加えた後、溶媒がすべて蒸発し、脂質の薄いフィルムがフラスコの壁に残されるまで回転蒸発器で蒸発させた。さらにフラスコを高真空下のデシケータ−中で終夜乾燥した。その後脂質を無菌で発熱物質を含まない水（ＵＳＰ）で水和し、リン脂質濃度を約４０ｍＭとした。その後水和脂質をワクチンびんに分け、凍結乾燥した。凍結乾燥の後、真空中で−びんに栓をし、暗所で４℃にて保存した。後に各びんに薬剤物質、ＳＫ　＆　Ｆ　１０５１５４（Ｒ３２ＮＳ１）を注入した。Ｒ３２ＮＳ１を用いた再構成の後、びん中のリン脂質の濃度は２５０ｍＭであった。１８時間インキュベートした後、びんを手で振り、脂質をすべて懸濁した。その後びんを無菌のＰＢＳ、ｐＨ６，４で洗浄し、遠心した。さらに２回洗浄した後、リポソームをＰＢＳ、ｐＨ６，４を用いて再懸濁した。その後無菌法を用いて１びん当たり０．９ｍｌでリポソームをワクチンびんに分配した。ＰＢＳを用いて１．２−１．８ｍｇのＡＩ／ｍｌの範囲に希釈した明響濃厚液（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｒ、Ｌｏｔ　＃Ｃ１７５０２，Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｋａｎｋａｋｅｅ、ＩＬ）を各ワクチンびんに、０．７ｍｌの体積で分配した。最終生成物のリン脂質濃度は５５ｍＭであった。リビドＡ濃度は２．９ｍｇ／ｍｌであった。ＥＬＩＳＡ　Ｓ、ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５（Ｌｉｓｔ　Ｂｉ。ｌｏｇｉｃｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）からのリビドＡを抗原として用いて酵素−結合イムノソルベントアッセイを行った。“Ｕ”底ポリスチレンミクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　ＩＩ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ。ＶＡ）のウェルにリビドＡの５０μｍ−０，０２μｍ／μｍエタノール性溶液を塗布した。ウェルをヒユームフード中で約１時間空気乾燥した。すぐに使用しないプレートは一２０℃にて使用時まで保存した。すべてのウェルに遮断緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）（ＩＱ％の熱不活性化牛脂児血清を含むＰＢＳ）を１００μｍの体積で加え、室温に２時間保った。プレートを逆さにして遮断緩衝液を除去し、その後プレートを鋭くたたいてウェルの内容物をすべて除去した。ヒト血清を遮断緩衝液中で１ニー１００に希釈し、ウェル当たり５０μｍの体積でウェルに三重に加えた。４℃で終ｆｆ１８時間インキュベートした後、ウェルの内容物を吸引し、プレートをＰＢＳのみで３回洗浄し、５０μｍの適したアルカリリン酸塩−複合羊抗一ヒトＩｇ　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をウェルに加えた。複合体を遮断緩衝液中で希釈し、ウェルに加えて最終濃度をウェル当たり５ｎｇとした。室温で２時間インキュベートした後、ウェルの内容物を吸引し、プレートをＰＢＳのみで３回洗浄した。その後５０μｍの基質、ジェタノールアミン緩衝液中で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェートをウェルに加え、暗所にて室温で１時間インキュベートした。ＵＶマックスキネチックプレートリーダー（ＵＶ　ｍａｘ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、）を用い、４０５ｎｍにて吸収を読み取った。抗原のみが欠如したウェルにおける値を引き去った後の値を記録した。瞬　６Ｊ　哨　−哨　０（％ｌ　−Ｑ３１七り−８０〜わＷ１４　へり−ＩＪ’）Ｑｒｒ５　〜　−　◇ 〜−ｃＱ　ｔｏ’ｅ〜０＝　ｏｏｄｄＦＩＧ、７ＤＭＰＣ，ＤＭＰＧ、ＣＨＯＬ及びリビドＡに対するグループＩのＩｇＧ応答抗原ＦＩＧ、８ＤＭＰＣ，ＤＭＰＧ、ＣＨＯＬ及びリピドＡに対するグループ■のＩｇＧ応答抗原対するグループ■のＩｇＧ応答抗原ＤＭＰＣ，ＤＭＰＧ、ＣＨＯＬ及びリビドＡに対するグループ■のＩｇＧ応答抗原ＦＩＧ、ＩＩＤＭＰＣ，ＤＭＰＧ、ＣＨＯＬ及びリビドＡに対するグループＶのＩｇＧ応答抗原８惺♀８５？記８で９１００Ｙ、　−ｃ　１／　、６％：１１１ｙ？所’ｌｔ閑ａ調査報告 −１゜１Ａ１．１颯　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０７５０７フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵＵ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．リビドＡが製薬学的に許容しうる抗原配達ビヒクル中に埋め込まれており、該材料が（ａ）リピドＡの疎水性脂肪酸部分をその水性環境から物理的に隔離してそれにより該部分が宿主−哺乳類中でその毒性を現すのを妨げることができ、（ｂ）ヒトにおけるモノホスホリル　リピドＡにつき確立されている最高安全投薬量（１００μｇ／ｍ２）より高い投薬量である１８５−２，２００マイクログラムの範囲内の投薬量で該材料からリピドＡをゆっくり放出することができる、リピドＡ−含有成分を活性成分として含む免疫活性組成物。２．リピドＡが本来のリピドＡ、モノホスホリル　リピドＡ、ジホスホリル　リピドＡ又はそれらの誘導体あるいは分解生成物から成る群より選ばれる請求の範囲第１項記載の組成物。３．リピドＡがモノホスホリル　リピドＡである請求の範囲第２項記載の組成物。４．リピドＡがジホスホリル　リピドＡである請求の範囲第２項記載の組成物。５．リピドＡが本来のリビドＡである請求の範囲第２項記載の組成物。６．リピドＡが本来のリピドＡの誘導体又は分解生成物である請求の範囲第２項記載の組成物。７．リピドＡの投薬量が基本的に１８５−２１９、２２０−５４９、５５０−１０９９及び１１００−２，２００マイクログラムから成る範囲より選ばれる請求の範囲第１項記載の組成物。８．リピドＡの投薬量が１８５−２１９マイクログラムの範囲内である請求の範囲第７項記載の組成物。９．リピドＡの投薬量が２２０−５４９マイクログラムの範囲内である請求の範囲第７項記載の組成物。１０．リピドＡの投薬量が５５０−１０９９マイクログラムの範囲内である請求の範囲第７項記載の組成物。１１．リピドＡの投薬量が１１００−２２００マイクログラムの範囲内である請求の範囲第７項記載の組成物。１２．抗原−配達ビヒクルが生物適合性−生物分解性リポソーム、生物適合性− 生物非分解性リポソーム、ポリマー及び遅延放出デバイス、ならびにこれらの組み合わせから成る群より選ばれる請求の範囲第１項記載の組成物。１３．配達材料がリボソーム又はポリマーである請求の範囲第１２項記載の組成物。１４．配達材料がポリマーである請求の範囲第１３項記載の組成物。！５．配達材料がリポソームである請求の範囲第１３項記載の組成物。１６．配達材料がミクロカプセルの形態である請求の範囲第１３項記載の組成物。１７．配達材料が小型球の形態である請求の範囲第１３項記載の組成物。１８．配達材料が遅延放出デバイスである請求の範囲第１２項記載の組成物。１９．リピドＡが製薬学的に許容しうる封入−配達材料中に埋め込まれており、該材料が（ａ）リピドＡの疎水性脂肪酸部分をその水性環境から物理的に隔離してそれにより該部分が宿主−哺乳類中でその毒性を現すのを妨げることができ、（ｂ）１８５−２，２００マイクログラムの範囲内の投薬量で該材料からリピドＡをゆっくり放出することができ、リピドＡ−含有成分を活性成分として含む、グラムー陰性菌によって起こる敗血症に対するヒトのワクチン。２０．リピドＡが本来のリピドＡ、モノホスホリル　リピドＡ及びジホスホリル　リピドＡ又はそれらの免疫原性誘導体、サブユニット構造あるいは分解生成物から成る群より選ばれる請求の範囲第１９項記載のワクチン。２１．リピドＡがモノホスホリル　リピドＡである請求の範囲第２０項記載のワクチン。２２．リピドＡがジホスホリル　リピドＡである請求の範囲第２０項記載のワクチン。２３．リピドＡが本来のリピドＡである請求の範囲第２０項記載のワクチン。２４．リピドＡが本来のリピドＡの免疫原性誘導体、サブユニット構造又は分解生成物である請求の範囲第２０項記載のワクチン。２５．リピドＡがモノホスホリル　リピドＡの免疫原性誘導体、サブユニット構造又は分解生成物である請求の範囲第２０項記載のワクチン。２６．リピドＡがジホスホリル　リピドＡの免疫原性誘導体、サブユニット構造又は分解生成物である請求の範囲第２０項記載のワクチン。２７．リピドＡの投薬量が基本的に１８５−２１９、２２０−５４９、５５０− １０９９及び１１００−２，２００マイクログラムから成る範囲より選ばれる請求の範囲第２０項記載のワクチン。２８．リピドＡの投薬量が１８５−２１９マイクログラムの範囲内である請求の範囲第２７項記載のワクチン。２９．リピドＡの投薬量が２２０−５４９マイクログラムの範囲内である請求の範囲第２７項記載のワクチン。３０．リピドＡの投薬量が５５０−１０９９マイクログラムの範囲内である請求の範囲第２７項記載のワクチン。３１．リピドＡの投薬量が１１００−２２００マイクログラムの範囲内である請求の範囲第２７項記載のワクチン。３２．抗原配達ビヒクルが生物適合性−生物分解性ポリマー及びリポソーム、遅延放出デバイス、ならびにこれらの組み合わせから成る群より選ばれる請求の範囲第１９項記載のワクチン。３３．配達材料がリポソーム又はポリマーである請求の範囲第３２項記載のワクチン。３４．配達材料がポリマーである請求の範囲第３３項記載のワクチン。３５．配達材料がリポソームである請求の範囲第３３項記載のワクチン。３６．配達材料がミクロカプセルの形態である請求の範囲第３３項記載のワクチン。３７．配達材料が小型球の形態である請求の範囲第３３項記載のワクチン。３８．配達材料が遅延放出デバイスである請求の範囲第３２項記載のワクチン。３９．哺乳類に請求の範囲第１項記載の組成物を注射する段階を含む免疫療法的方法。４０，グラムー陰性菌によって起こる敗血症に罹る前に哺乳類に組成物を注射する請求の範囲第３９項記載の方法。４１．グラムー陰性菌によって起こる敗血症に罹った後に哺乳類に組成物を注射する請求の範囲第３９項記載の方法。４２．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第４１項記載の方法。４３．哺乳類がヒトである請求の範囲第３９項記載の方法。４４．抗原性リピドＡと反応性であるヒト単クローン性抗体を誘起するために組成物をヒトに注射し、保護的ヒト抗体を生産する遺伝子を含む自己−再生キャリヤー細胞により核抗体を製造する、請求の範囲第４３項記載の方法。４５．グラムー陰性菌と反応性で、グラムー陰性菌によって起こる敗血症に対する有効な受動予防又はその有効な治療的処置を与えるヒト単クローン性抗体を誘起するために組成物をヒトに注射し、保護的ヒト抗体を生産する遺伝子を含む自己−再生キャリヤー細胞により該抗体を製造する、請求の範囲第４３項記載の方法。４６．該抗体が有効な受動予防を与える請求の範囲第４５項記載のヒト単クローン性抗体。４７．該抗体が有効な治療的処置を与える請求の範囲第４５項記載のヒト単クローン性抗体。４８．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第４５項記載のヒト単クローン性抗体。４９．ヒトがグラムー陰性菌に感染する前に受動予防を生ずる量のヒト単クローン性抗体を用いてヒトを処置する段階を含むグラムー陰性菌への感染又は感染の効果に対するヒトの受動予防のための治療法。５０．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第４９項記載の方法。５１．感染の抑制又は改善を生ずるのに有効な量のヒト単クローン性抗体でヒトを処置する段階を含むグラムー陰性菌に感擬したヒトの処置のための治療法。５２．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第５１項記載の方法。５３．グラムー陰性菌と反応性であり、グラムー陰性菌によって起こる敗血症に対する有効な受動予防又は有効な治療的処置を与える多クローン性抗体を含む過剰免疫血漿を誘起するために組成物をヒトに注射し、そのような抗体を生産することができるヒトドナーにより該抗体−含有血漿を製造する、請求の範囲第３９項記載の方法。５４．ドナーの血液のプラスマフェレーシスを行い、形成された血液成分を血漿から取り除く請求の範囲第５３項記載の方法。５５．形成された血液の成分を血漿から分離し、ヒトドナーに戻す請求の範囲第５４項記載の方法。５６．血漿をヒトに注射する請求の範囲第５５項記載の方法。５７．抗体が有効な受動予防を与える請求の範囲第５３項記載の多クローン性抗体。５８．抗体が有効な治療的処置を与える請求の範囲第５３項記載の多クローン性抗体。５９．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第５３項記載の多クローン性抗体。６０．ヒトがグラムー陰性菌に感染する前に受動予防を生ずる量のヒト多クローン性抗体を用いてヒトを処置する段階を含むグラムー陰性菌への感染又は感染の効果に対するヒトの受動予防のための治療法。６１．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第６０項記載の方法。６２．感染の抑制又は改善を生ずるのに有効な量のヒト多クローン性抗体でヒトを処置する段階を含むグラムー陰性菌に感染したヒトの処置のための治療法。６３．グラムー陰性菌が基本的にエシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、プロテウス、シゲラ、ビブリオ、メニンゴコックス及びゴノコックスから成る群より選ばれる請求の範囲第６２項記載の方法。