JPH06303986A - 形質転換した原核宿主細胞の製法 - Google Patents
形質転換した原核宿主細胞の製法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 原核細胞、特にバチルス種株中のポリペプチ
ド（Ｐ．Ｐ．と略す）をコードするＤＮＡ−配列の安定
な染色体遺伝子増幅のための簡単な方法を提供する。 【構成】 Ｐ．Ｐ．をコードするＤＮＡ−配列を少なく
とも１つその染色体ＤＮＡ中に有する原核細胞を主に、
ａ）Ｐ．Ｐ．の発現及び分泌の為必要な配列を含めて
Ｐ．Ｐ．をコードするＤＮＡ−配列を含有するＤＮＡ−
フラグメント、及びｂ）選択可能なマーカーをコードす
るＤＮＡ−配列を有する少なくとも１つのＤＮＡ−フラ
グメントからなり、形質転換に好適で、かつ環状ＤＮＡ
で形質転換し引続き使用したＤＮＡを少なくとも１つ染
色体に組込んだ細胞を選択可能なマーカーを用いて選択
し、かつこのように形質転換した細胞を単離する。
ド（Ｐ．Ｐ．と略す）をコードするＤＮＡ−配列の安定
な染色体遺伝子増幅のための簡単な方法を提供する。 【構成】 Ｐ．Ｐ．をコードするＤＮＡ−配列を少なく
とも１つその染色体ＤＮＡ中に有する原核細胞を主に、
ａ）Ｐ．Ｐ．の発現及び分泌の為必要な配列を含めて
Ｐ．Ｐ．をコードするＤＮＡ−配列を含有するＤＮＡ−
フラグメント、及びｂ）選択可能なマーカーをコードす
るＤＮＡ−配列を有する少なくとも１つのＤＮＡ−フラ
グメントからなり、形質転換に好適で、かつ環状ＤＮＡ
で形質転換し引続き使用したＤＮＡを少なくとも１つ染
色体に組込んだ細胞を選択可能なマーカーを用いて選択
し、かつこのように形質転換した細胞を単離する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は原核微生物、特にバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株中のポリペプチドをコード
するＤＮＡ−配列の安定な染色体遺伝子増幅のための簡
単な方法に関する。
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株中のポリペプチドをコード
するＤＮＡ−配列の安定な染色体遺伝子増幅のための簡
単な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物、特にバチルス菌株はポリペプチ
ドの微生物学的製造のために、特に重要なバチルス酵
素、例えばプロテアーゼ又はアミラーゼ等の製造のため
に広範囲に産業上用いられる。そのような酵素の製造の
最適化における重要な目的はバチルス菌によるこの酵素
の発現を高めることである。このためには、例えば発現
の調節を最適化するか、又はバチルス菌中の酵素に関す
る遺伝学的情報及びその発現を何倍にもすることができ
る。遺伝学的情報を何倍かにするためには、公知技術に
おいては一方では必要な遺伝学的情報を有するプラスミ
ドの数をバチルス菌中で増やすことが提案され、他方で
は興味あるポリペプチドに関する発現を、これをコード
する遺伝学的情報をバチルス菌の染色体ＤＮＡ中に複数
組み込むことにより上昇させることがこころみられてい
る。しかしながら、プラスミド数の上昇は安定性を考え
ると興味ある酵素の大量生産の方法には好適ではない。
従って、公知技術においては発現の上昇のためには染色
体−ＤＮＡ中への遺伝学的情報の複数の組込みが努力さ
れている。
ドの微生物学的製造のために、特に重要なバチルス酵
素、例えばプロテアーゼ又はアミラーゼ等の製造のため
に広範囲に産業上用いられる。そのような酵素の製造の
最適化における重要な目的はバチルス菌によるこの酵素
の発現を高めることである。このためには、例えば発現
の調節を最適化するか、又はバチルス菌中の酵素に関す
る遺伝学的情報及びその発現を何倍にもすることができ
る。遺伝学的情報を何倍かにするためには、公知技術に
おいては一方では必要な遺伝学的情報を有するプラスミ
ドの数をバチルス菌中で増やすことが提案され、他方で
は興味あるポリペプチドに関する発現を、これをコード
する遺伝学的情報をバチルス菌の染色体ＤＮＡ中に複数
組み込むことにより上昇させることがこころみられてい
る。しかしながら、プラスミド数の上昇は安定性を考え
ると興味ある酵素の大量生産の方法には好適ではない。
従って、公知技術においては発現の上昇のためには染色
体−ＤＮＡ中への遺伝学的情報の複数の組込みが努力さ
れている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は興味あるポリペプチド、有利に酵素をコードするＤＮ
Ａ配列が、有機体、有利にバチルスのゲノム中にこのＤ
ＮＡ配列の付加的なコピーの安定な染色体組込みにより
何倍にもなる簡単で一般的に使用可能な方法をつくり出
すことである。
は興味あるポリペプチド、有利に酵素をコードするＤＮ
Ａ配列が、有機体、有利にバチルスのゲノム中にこのＤ
ＮＡ配列の付加的なコピーの安定な染色体組込みにより
何倍にもなる簡単で一般的に使用可能な方法をつくり出
すことである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この課題は興味あるポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ−配列を少なくとも２つ染
色体に含有する形質転換原核宿主細胞を製造するための
本発明による方法により解決し、この方法は興味あるポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列をすでに少なくとも
１つその染色体ＤＮＡ中に有する原核細胞を、主に ａ） 興味あるポリペプチドの発現及び場合により分泌
のために必要な配列をも含めて、興味あるポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ−フラグメン
ト、及び ｂ） 選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ−配列を
有する少なくとも１つのＤＮＡ−フラグメントからな
り、かつ宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ宿主細
胞中で自己複製の能力を有するＤＮＡ配列を有さない、
環状ＤＮＡで形質転換し、引き続き選択可能なマーカー
を用いて使用した環状ＤＮＡを少なくとも１つ染色体に
組込んだ細胞を選択し、かつこのように形質転換した細
胞を単離することを特徴とする。
ペプチドをコードするＤＮＡ−配列を少なくとも２つ染
色体に含有する形質転換原核宿主細胞を製造するための
本発明による方法により解決し、この方法は興味あるポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列をすでに少なくとも
１つその染色体ＤＮＡ中に有する原核細胞を、主に ａ） 興味あるポリペプチドの発現及び場合により分泌
のために必要な配列をも含めて、興味あるポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ−フラグメン
ト、及び ｂ） 選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ−配列を
有する少なくとも１つのＤＮＡ−フラグメントからな
り、かつ宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ宿主細
胞中で自己複製の能力を有するＤＮＡ配列を有さない、
環状ＤＮＡで形質転換し、引き続き選択可能なマーカー
を用いて使用した環状ＤＮＡを少なくとも１つ染色体に
組込んだ細胞を選択し、かつこのように形質転換した細
胞を単離することを特徴とする。
【０００５】形質転換に好適な環状ＤＮＡが主にフラグ
メントａ）及びフラグメントｂ）を含有するとは、本願
発明においては、短かいＤＮＡ配列、例えばリンカー配
列、例えば環状ＤＮＡの構成のために必要なリンカー配
列を更に含有していてよいことを意味する。
メントａ）及びフラグメントｂ）を含有するとは、本願
発明においては、短かいＤＮＡ配列、例えばリンカー配
列、例えば環状ＤＮＡの構成のために必要なリンカー配
列を更に含有していてよいことを意味する。
【０００６】フラグメントａ）中に含有される興味ある
ポリペプチドの発現のために及び場合により分泌のため
に必要な配列はこのために必要なプロモーター、オペレ
ーター、エンハンサー、ターミネーター及びシグナル配
列及び更に場合により例えばプロテアーゼの分泌に必要
であるような前及び後配列も必要である。
ポリペプチドの発現のために及び場合により分泌のため
に必要な配列はこのために必要なプロモーター、オペレ
ーター、エンハンサー、ターミネーター及びシグナル配
列及び更に場合により例えばプロテアーゼの分泌に必要
であるような前及び後配列も必要である。
【０００７】フラグメントｂ）中で選択可能なマーカー
をコードするＤＮＡ−配列としては形質転換細胞の選択
を可能とする一般的に常用のすべてのＤＮＡ−配列を使
用することができる。この種の一般的に常用の選択法は
例えば使用した細胞の栄養要求性突然変異体又は有利に
抗生物質耐性である。
をコードするＤＮＡ−配列としては形質転換細胞の選択
を可能とする一般的に常用のすべてのＤＮＡ−配列を使
用することができる。この種の一般的に常用の選択法は
例えば使用した細胞の栄養要求性突然変異体又は有利に
抗生物質耐性である。
【０００８】有利には本発明方法において宿主有機体と
してはバチルス、有利にバチルス・アルカロフィルス
（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・リヒェニホ
ルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・
ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用する。有利にポ
リペプチドは、例えば、プロテアーゼ、有利にアルカリ
性で、かつ特に高アルカリ性プロテアーゼ並びにα−ア
ミラーゼ、リパーゼ又はセルラーゼである。
してはバチルス、有利にバチルス・アルカロフィルス
（ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・リヒェニホ
ルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・
ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用する。有利にポ
リペプチドは、例えば、プロテアーゼ、有利にアルカリ
性で、かつ特に高アルカリ性プロテアーゼ並びにα−ア
ミラーゼ、リパーゼ又はセルラーゼである。
【０００９】興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列を宿主細胞のゲノム中に組込むことは本発明方法に
おいて簡単な相同組換えにより達せられる。このために
は、興味あるポリペプチドに関するＤＮＡ−配列をすで
に少なくとも１つ含有し、かつこのポリペプチドの発現
のために必要なＤＮＡ−配列を含有する宿主細胞を本発
明により、染色体宿主細胞ＤＮＡに相同のＤＮＡ配列を
示す環状ＤＮＡで形質転換する。この際この相同ＤＮＡ
−配列は同時に興味あるポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ−配列を含有するＤＮＡ−フラグメントａ）に相当す
る。従って、本発明において、相同組換えのために、更
なる特別な、宿主有機体の染色体ＤＮＡに相同な目標Ｄ
ＮＡ配列（ターゲット−ＤＮＡ配列）は必要ではない、
それというのもその機能は興味あるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を有する前記ＤＮＡフラグメントａ）
により満たされているためである。更に、ここで使用し
た環状ＤＮＡは少なくとも１つのマーカーＤＮＡ配列を
有し、このマーカーＤＮＡ配列は例えば抗生物質耐性を
コードし、かつこの環状ＤＮＡでの宿主有機体の形質転
換が達せられた後は、興味あるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を１つより多く含有するような形質転換体
の選択を助ける。宿主有機体の染色体ＤＮＡ中にこの環
状ＤＮＡを組み込んだ形質転換体だけが得られかつ選択
されることを確実にするために、使用した環状ＤＮＡは
宿主有機体中でこのＤＮＡの自己複製を可能とするＤＮ
Ａ配列を決して有さない。プラスミドの形での環状ＤＮ
Ａの引き渡しはこうして決して生じない。本発明方法に
より興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列を
ゲノム中に安定に組込んだ形質転換した宿主細胞が得ら
れる。
配列を宿主細胞のゲノム中に組込むことは本発明方法に
おいて簡単な相同組換えにより達せられる。このために
は、興味あるポリペプチドに関するＤＮＡ−配列をすで
に少なくとも１つ含有し、かつこのポリペプチドの発現
のために必要なＤＮＡ−配列を含有する宿主細胞を本発
明により、染色体宿主細胞ＤＮＡに相同のＤＮＡ配列を
示す環状ＤＮＡで形質転換する。この際この相同ＤＮＡ
−配列は同時に興味あるポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ−配列を含有するＤＮＡ−フラグメントａ）に相当す
る。従って、本発明において、相同組換えのために、更
なる特別な、宿主有機体の染色体ＤＮＡに相同な目標Ｄ
ＮＡ配列（ターゲット−ＤＮＡ配列）は必要ではない、
それというのもその機能は興味あるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を有する前記ＤＮＡフラグメントａ）
により満たされているためである。更に、ここで使用し
た環状ＤＮＡは少なくとも１つのマーカーＤＮＡ配列を
有し、このマーカーＤＮＡ配列は例えば抗生物質耐性を
コードし、かつこの環状ＤＮＡでの宿主有機体の形質転
換が達せられた後は、興味あるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を１つより多く含有するような形質転換体
の選択を助ける。宿主有機体の染色体ＤＮＡ中にこの環
状ＤＮＡを組み込んだ形質転換体だけが得られかつ選択
されることを確実にするために、使用した環状ＤＮＡは
宿主有機体中でこのＤＮＡの自己複製を可能とするＤＮ
Ａ配列を決して有さない。プラスミドの形での環状ＤＮ
Ａの引き渡しはこうして決して生じない。本発明方法に
より興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列を
ゲノム中に安定に組込んだ形質転換した宿主細胞が得ら
れる。
【００１０】本発明方法において形質転換に必要な環状
ＤＮＡの製造は自体常用の方法により行なうことができ
る。このためにはまず興味あるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ−配列、並びに宿主有機体中でのポリペプチド
発現及び場合によりポリペプチド分泌に必要な調節配
列、シグナル配列、プロモーター配列、ターミネーター
配列及びポリペプチドのプレー及びプロ単位をコードす
るＤＮＡ−配列を自体この興味あるポリペプチドを生産
する微生物から単離する。例えばバクテリア（“ドナー
・バクテリア”）、特に興味あるポリペプチド、例えば
プロテアーゼ又はアミラーゼを生産するバチルス種から
染色体ＤＮＡを自体公知法により単離し、かつ好適な制
限エンドヌクレアーゼで部分的に加水分解する。得られ
たドナーＤＮＡの制限フラグメントを、例えばゲル電気
泳動により大きさに従って分離し、かつ所望の大きさの
フラグメントを好適なベクターＤＮＡ、例えばプラスミ
ド−ＤＮＡと組換えすることができる。試験管内組換え
プラスミド（ベクターＤＮＡ＋ドナーＤＮＡの制限フラ
グメント）でバクテリア、有利にバチルス種を形質転換
し、かつこの形質転換体をベクターＤＮＡの公知標識特
性（抗生物質耐性）により選択する。この形質転換体中
で、興味あるポリペプチド、（例えばプロテアーゼ又は
アミラーゼを分泌するクローンを探す。所望のポリペプ
チド活性を有するクローンから最終的にこの形質転換体
中に導入されたプラスミド−ＤＮＡを単離する。バクテ
リアの新たな形質転換により、ポリペプチド活性がプラ
スミド結合しているかどうか、すなわちポリペプチド活
性が標識特性と連結しているかどうかを調べることがで
きる。こうして単離されたプラスミドは公知制限部位を
有するベクターＤＮＡと共に興味あるポリペプチドに関
する所望の構造遺伝子、並びにポリペプチド発現に必要
な調節配列、シグナル配列、プロモーター配列及びター
ミネーター配列及び場合によりポリペプチドのプレー及
びプロ単位をコードするＤＮＡ−配列を含有する。ベク
ターが他の、しかしながらここでは必要とされていない
ドナーバクテリアからのＤＮＡ配列を含有する場合、必
要でない配列をベクターの更なる使用の前に取り除くこ
と、及びドナーＤＮＡ配列を主にポリペプチドに関する
構造遺伝子に及びその発現及び場合により分泌に必要な
ＤＮＡ−配列に制限することが場合によりすすめられ
る。このためには、例えば付加的に必要でないＤＮＡ−
配列を包含するプラスミドをいくつかの異なる制限エン
ドヌクレアーゼで切断し（制限し）、得られたＤＮＡ−
フラグメントをゲル電気泳動法により大きさに従って分
離し、かつ見い出された帯状パターンにつき制限地図を
つくる。ドナーＤＮＡ配列の範囲にある制限位置がこう
して見い出される。プラスミドの制限地図の知識は選択
した制限エンドヌクレアーゼで切断することによりこの
プラスミドからドナーバクテリアからの必要な配列だけ
を包含するドナーＤＮＡ配列のＤＮＡ−フラグメントを
取り出すことを可能にする。この大きさが減少したドナ
ーＤＮＡ配列を好適なベクター中に再たび構築すること
により新規プラスミドが得られ、これはポリペプチド発
現の能力があり、かつ本発明方法に使用した環状ＤＮＡ
の生成のためのベースとして使用することができる。そ
のようなｐＣＬＥＡＮ４として表わされる大きさの減少
したプラスミドの例は図１の制限地図で示される。この
プラスミドにおいて興味あるポリペプチドはバチルス・
アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐ
ｈｉｌｕｓ）からの高アルカリ性プロテアーゼである。
ＤＮＡの製造は自体常用の方法により行なうことができ
る。このためにはまず興味あるポリペプチドをコードす
るＤＮＡ−配列、並びに宿主有機体中でのポリペプチド
発現及び場合によりポリペプチド分泌に必要な調節配
列、シグナル配列、プロモーター配列、ターミネーター
配列及びポリペプチドのプレー及びプロ単位をコードす
るＤＮＡ−配列を自体この興味あるポリペプチドを生産
する微生物から単離する。例えばバクテリア（“ドナー
・バクテリア”）、特に興味あるポリペプチド、例えば
プロテアーゼ又はアミラーゼを生産するバチルス種から
染色体ＤＮＡを自体公知法により単離し、かつ好適な制
限エンドヌクレアーゼで部分的に加水分解する。得られ
たドナーＤＮＡの制限フラグメントを、例えばゲル電気
泳動により大きさに従って分離し、かつ所望の大きさの
フラグメントを好適なベクターＤＮＡ、例えばプラスミ
ド−ＤＮＡと組換えすることができる。試験管内組換え
プラスミド（ベクターＤＮＡ＋ドナーＤＮＡの制限フラ
グメント）でバクテリア、有利にバチルス種を形質転換
し、かつこの形質転換体をベクターＤＮＡの公知標識特
性（抗生物質耐性）により選択する。この形質転換体中
で、興味あるポリペプチド、（例えばプロテアーゼ又は
アミラーゼを分泌するクローンを探す。所望のポリペプ
チド活性を有するクローンから最終的にこの形質転換体
中に導入されたプラスミド−ＤＮＡを単離する。バクテ
リアの新たな形質転換により、ポリペプチド活性がプラ
スミド結合しているかどうか、すなわちポリペプチド活
性が標識特性と連結しているかどうかを調べることがで
きる。こうして単離されたプラスミドは公知制限部位を
有するベクターＤＮＡと共に興味あるポリペプチドに関
する所望の構造遺伝子、並びにポリペプチド発現に必要
な調節配列、シグナル配列、プロモーター配列及びター
ミネーター配列及び場合によりポリペプチドのプレー及
びプロ単位をコードするＤＮＡ−配列を含有する。ベク
ターが他の、しかしながらここでは必要とされていない
ドナーバクテリアからのＤＮＡ配列を含有する場合、必
要でない配列をベクターの更なる使用の前に取り除くこ
と、及びドナーＤＮＡ配列を主にポリペプチドに関する
構造遺伝子に及びその発現及び場合により分泌に必要な
ＤＮＡ−配列に制限することが場合によりすすめられ
る。このためには、例えば付加的に必要でないＤＮＡ−
配列を包含するプラスミドをいくつかの異なる制限エン
ドヌクレアーゼで切断し（制限し）、得られたＤＮＡ−
フラグメントをゲル電気泳動法により大きさに従って分
離し、かつ見い出された帯状パターンにつき制限地図を
つくる。ドナーＤＮＡ配列の範囲にある制限位置がこう
して見い出される。プラスミドの制限地図の知識は選択
した制限エンドヌクレアーゼで切断することによりこの
プラスミドからドナーバクテリアからの必要な配列だけ
を包含するドナーＤＮＡ配列のＤＮＡ−フラグメントを
取り出すことを可能にする。この大きさが減少したドナ
ーＤＮＡ配列を好適なベクター中に再たび構築すること
により新規プラスミドが得られ、これはポリペプチド発
現の能力があり、かつ本発明方法に使用した環状ＤＮＡ
の生成のためのベースとして使用することができる。そ
のようなｐＣＬＥＡＮ４として表わされる大きさの減少
したプラスミドの例は図１の制限地図で示される。この
プラスミドにおいて興味あるポリペプチドはバチルス・
アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐ
ｈｉｌｕｓ）からの高アルカリ性プロテアーゼである。
【００１１】本発明方法に使用可能な環状ＤＮＡの形成
のためには、前記ｐＣＬＥＡＮ４型のプラスミドからプ
ラスミドの宿主細胞中での複製を可能とするＤＮＡ−配
列を検出する。出発ベクターが多くのＤＮＡ−配列、例
えば種々の抗生物質耐性をコードするＤＮＡ−配列を含
有している場合、必要ではない抗生物質耐性ＤＮＡ配列
をベクターから除去することもできる。前記プラスミド
ｐＣＬＥＡＮ４の例の場合、例えば機能ｒｅｐＵ及びｏ
ｒｉＢ並びに抗生物質ネオマイシンもしくはカナマイシ
ンに対する耐性を含有する。制限地図の知識により、必
要のないＤＮＡ−配列をプラスミドから好適な選択され
た制限エンドヌクレアーゼで切断することにより除去す
ることができる。プラスミドｐＣＬＥＡＮ４の場合、例
えば制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩでベクターから、
バチルス種中でプラスミドを複製するための機能並びに
ネオマイシン及びカナマイシンに対する耐性を含有する
フラグメントを欠失させ、かつ引き続き残ったＤＮＡを
ＤＮＡ−リガーゼを用いて環状ＤＮＡ中に導入する。興
味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列並びに抗
生物質耐性フレオマイシンに関する配列がこの失欠ベク
ターから環状ＤＮＡ（ｐＣＬＥＡＮ４−ｄｅｌ）として
得られる。この環状ＤＮＡとの、例えばバチルス・アル
カロフィルスの染色体中への相同組換えによる統合は興
味あるポリペプチド遺伝子（ここでは高アルカリ性プロ
テアーゼ）を用いて可能である。
のためには、前記ｐＣＬＥＡＮ４型のプラスミドからプ
ラスミドの宿主細胞中での複製を可能とするＤＮＡ−配
列を検出する。出発ベクターが多くのＤＮＡ−配列、例
えば種々の抗生物質耐性をコードするＤＮＡ−配列を含
有している場合、必要ではない抗生物質耐性ＤＮＡ配列
をベクターから除去することもできる。前記プラスミド
ｐＣＬＥＡＮ４の例の場合、例えば機能ｒｅｐＵ及びｏ
ｒｉＢ並びに抗生物質ネオマイシンもしくはカナマイシ
ンに対する耐性を含有する。制限地図の知識により、必
要のないＤＮＡ−配列をプラスミドから好適な選択され
た制限エンドヌクレアーゼで切断することにより除去す
ることができる。プラスミドｐＣＬＥＡＮ４の場合、例
えば制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩでベクターから、
バチルス種中でプラスミドを複製するための機能並びに
ネオマイシン及びカナマイシンに対する耐性を含有する
フラグメントを欠失させ、かつ引き続き残ったＤＮＡを
ＤＮＡ−リガーゼを用いて環状ＤＮＡ中に導入する。興
味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列並びに抗
生物質耐性フレオマイシンに関する配列がこの失欠ベク
ターから環状ＤＮＡ（ｐＣＬＥＡＮ４−ｄｅｌ）として
得られる。この環状ＤＮＡとの、例えばバチルス・アル
カロフィルスの染色体中への相同組換えによる統合は興
味あるポリペプチド遺伝子（ここでは高アルカリ性プロ
テアーゼ）を用いて可能である。
【００１２】本発明による環状ＤＮＡ−構造は、試験管
内で ａ） 興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列
及び該配列を含有するプラスミドから制限エンドヌクレ
アーゼを用いて相応するＤＮＡ−配列を切断することに
より得られたＤＮＡ−配列を、 ｂ） 耐性標識を含有するプラスミドから制限エンドヌ
クレアーゼで相応するＤＮＡ配列を切断することにより
得られた耐性標識と、ＤＮＡ−リガーゼを用いて組換え
し、こうして環状ＤＮＡを生ぜしめることによっても製
造することができる。
内で ａ） 興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ−配列
及び該配列を含有するプラスミドから制限エンドヌクレ
アーゼを用いて相応するＤＮＡ−配列を切断することに
より得られたＤＮＡ−配列を、 ｂ） 耐性標識を含有するプラスミドから制限エンドヌ
クレアーゼで相応するＤＮＡ配列を切断することにより
得られた耐性標識と、ＤＮＡ−リガーゼを用いて組換え
し、こうして環状ＤＮＡを生ぜしめることによっても製
造することができる。
【００１３】耐性標識としては抗生物質耐性をコードす
るＤＮＡ−配列であって、このＤＮＡ−配列が ａ） 形質転換すべき微生物中で分泌され、かつ ｂ） 形質転換すべき微生物はこれに対して本来耐性を
示さない抗生物質に対する耐性をコードしている、のが
すべて有利に適している。例えば、耐性遺伝子はクロラ
ムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリン、カ
ナマイシン、ネオマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオ
マイシン又はフレオマイシン群から選択された１つの抗
生物質に対する耐性をコードしていてよい。特に好適で
あるのは抗生物質フレオマイシンに対する耐性をコード
するプラスミドｐＵＢ１１０からのＤＮＡ−配列であ
る。
るＤＮＡ−配列であって、このＤＮＡ−配列が ａ） 形質転換すべき微生物中で分泌され、かつ ｂ） 形質転換すべき微生物はこれに対して本来耐性を
示さない抗生物質に対する耐性をコードしている、のが
すべて有利に適している。例えば、耐性遺伝子はクロラ
ムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリン、カ
ナマイシン、ネオマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオ
マイシン又はフレオマイシン群から選択された１つの抗
生物質に対する耐性をコードしていてよい。特に好適で
あるのは抗生物質フレオマイシンに対する耐性をコード
するプラスミドｐＵＢ１１０からのＤＮＡ−配列であ
る。
【００１４】興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ
−配列を染色体ＤＮＡ中にすでに少なくとも１つ含有す
る微生物の形質転換により、相同組換えを介して興味あ
るポリペプチドに関する遺伝子の場所にこのポリペプチ
ドをコードする更なるＤＮＡ−配列をこれに属する、発
現及び場合による分泌のために必要な配列と共に宿主有
機体の染色体中に統合することができる。この際、興味
あるポリペプチドをコードする付加的なＤＮＡ−配列及
びこれに属する発現及び場合により分泌に必要な配列は
単純なクロスオーバーにより染色体中に、もともとのす
でに含有されているこのポリペプチドをコードするＤＮ
Ａと新しく導入した同様にこのポリペプチドをコードす
るＤＮＡとの間に抗生物質耐性をコードするＤＮＡ−配
列が存在するように組込まれる。引き続き、形質転換し
た微生物をこの抗生物質耐性を用いて選択するが、この
際この微生物を付加的に相応する抗生物質を一定の濃度
添加した栄養培地上で培養する。この条件下では、本発
明による環状ＤＮＡをその染色体ＤＮＡ中に統合して有
する形質転換体だけが増殖可能である。培地に添加した
抗生物質の濃度は、興味あるポリペプチドをコードする
ＤＮＡ−配列少なくとも２つ及び耐性標識をコードする
ＤＮＡ−配列１つを染色体ＤＮＡ中に含有する形質転換
体が少なくとも選択されるように選択する。
−配列を染色体ＤＮＡ中にすでに少なくとも１つ含有す
る微生物の形質転換により、相同組換えを介して興味あ
るポリペプチドに関する遺伝子の場所にこのポリペプチ
ドをコードする更なるＤＮＡ−配列をこれに属する、発
現及び場合による分泌のために必要な配列と共に宿主有
機体の染色体中に統合することができる。この際、興味
あるポリペプチドをコードする付加的なＤＮＡ−配列及
びこれに属する発現及び場合により分泌に必要な配列は
単純なクロスオーバーにより染色体中に、もともとのす
でに含有されているこのポリペプチドをコードするＤＮ
Ａと新しく導入した同様にこのポリペプチドをコードす
るＤＮＡとの間に抗生物質耐性をコードするＤＮＡ−配
列が存在するように組込まれる。引き続き、形質転換し
た微生物をこの抗生物質耐性を用いて選択するが、この
際この微生物を付加的に相応する抗生物質を一定の濃度
添加した栄養培地上で培養する。この条件下では、本発
明による環状ＤＮＡをその染色体ＤＮＡ中に統合して有
する形質転換体だけが増殖可能である。培地に添加した
抗生物質の濃度は、興味あるポリペプチドをコードする
ＤＮＡ−配列少なくとも２つ及び耐性標識をコードする
ＤＮＡ−配列１つを染色体ＤＮＡ中に含有する形質転換
体が少なくとも選択されるように選択する。
【００１５】高めた抗生物質濃度でこの種の形質転換体
を培養することにより、抗生物質耐性をコードするＤＮ
Ａ−配列の多くのコピー、従って興味あるポリペプチド
をコードするＤＮＡ−配列の多くのコピーをゲノム中に
有する後続世代を単離することができる。この種のクロ
ーンは興味あるポリペプチドの更に上昇した生産により
優れている。
を培養することにより、抗生物質耐性をコードするＤＮ
Ａ−配列の多くのコピー、従って興味あるポリペプチド
をコードするＤＮＡ−配列の多くのコピーをゲノム中に
有する後続世代を単離することができる。この種のクロ
ーンは興味あるポリペプチドの更に上昇した生産により
優れている。
【００１６】ゲノム中に隣接する反復ＤＮＡ−配列を有
するこの種の構造は常用の実験用菌株においては不安定
であることが示されている。一般に複数の突然変異サイ
クルの後に単離され、従って一般に減少した組換え能力
を示す産業上高性能の菌株、例えば抗生物質マイトマイ
シンＣに対して高まった感度により認識可能である菌株
中ではこの種の反復配列は抗生物質の不存在における大
量生産を実施するために十分に安定である。不安定性が
観察される場合、組換え不能な後続世代を、常用の突然
変異誘発物質で突然変異させた後抗生物質マイトマイシ
ンＣに対して高まった感度を示す突然変異体を探すこと
により単離することが可能である。
するこの種の構造は常用の実験用菌株においては不安定
であることが示されている。一般に複数の突然変異サイ
クルの後に単離され、従って一般に減少した組換え能力
を示す産業上高性能の菌株、例えば抗生物質マイトマイ
シンＣに対して高まった感度により認識可能である菌株
中ではこの種の反復配列は抗生物質の不存在における大
量生産を実施するために十分に安定である。不安定性が
観察される場合、組換え不能な後続世代を、常用の突然
変異誘発物質で突然変異させた後抗生物質マイトマイシ
ンＣに対して高まった感度を示す突然変異体を探すこと
により単離することが可能である。
【００１７】
【実施例】次に、本発明をより詳細に説明するために典
型的な実施例を開示するが、これは本発明を限定するも
のではない。
型的な実施例を開示するが、これは本発明を限定するも
のではない。
【００１８】他に記載のない限り、一般にマニアティス
等（Ｍａｎｉａｔｉｓ等＝Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載され
ている方法により実施した。
等（Ｍａｎｉａｔｉｓ等＝Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載され
ている方法により実施した。
【００１９】ここで使用した出発ベクターは購入可能で
あり、かつ制限なく提供可能である；又は自体公知の方
法により入手可能なベクターから製造される。こうし
て、ベクターＭ１３ｇ１３１をアメルスハム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌ
ａｎｄ）から入手した。
あり、かつ制限なく提供可能である；又は自体公知の方
法により入手可能なベクターから製造される。こうし
て、ベクターＭ１３ｇ１３１をアメルスハム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌ
ａｎｄ）から入手した。
【００２０】多くの場面で使用した制限エンドヌクレア
ーゼは公知技術に属し、かつ市販されている。この公知
の制限エンドヌクレアーゼを使用する際にその都度必要
な制限条件は同様に公知である。
ーゼは公知技術に属し、かつ市販されている。この公知
の制限エンドヌクレアーゼを使用する際にその都度必要
な制限条件は同様に公知である。
【００２１】制限エンドヌクレアーゼとの恒温保持の
後、蛋白質を自体公知法で抽出により（例えばフェノー
ル及びクロロホルムを用いて）除去し、かつ切断したＤ
ＮＡを（例えば水性フラクションからエタノールで沈殿
させることにより）単離し、かつ更なる使用に提供す
る。
後、蛋白質を自体公知法で抽出により（例えばフェノー
ル及びクロロホルムを用いて）除去し、かつ切断したＤ
ＮＡを（例えば水性フラクションからエタノールで沈殿
させることにより）単離し、かつ更なる使用に提供す
る。
【００２２】制限エンドヌクレアーゼでベクターを切断
し、場合により引き続き末端５′−ホスファート基をア
ルカリ性ホスファターゼ（デホスホリル化）で加水分解
する。例中で５′−末端の脱ホスホリル化を実施する限
り、これは自体公知法で行なった。脱ホスホリル化の実
施、及びこのために必要な試薬の更なる記載はマニアテ
ィス等（第１３３〜１３４頁）に見られる。
し、場合により引き続き末端５′−ホスファート基をア
ルカリ性ホスファターゼ（デホスホリル化）で加水分解
する。例中で５′−末端の脱ホスホリル化を実施する限
り、これは自体公知法で行なった。脱ホスホリル化の実
施、及びこのために必要な試薬の更なる記載はマニアテ
ィス等（第１３３〜１３４頁）に見られる。
【００２３】部分的な加水分解とは制限エンドヌクレア
ーゼによるＤＮＡの不完全な消化を表わす。この際、制
限条件はＤＮＡ−基質中で、使用した制限エンドヌクレ
アーゼのすべての認識位置ではなく、いくつかの位置を
切断するように選択する。
ーゼによるＤＮＡの不完全な消化を表わす。この際、制
限条件はＤＮＡ−基質中で、使用した制限エンドヌクレ
アーゼのすべての認識位置ではなく、いくつかの位置を
切断するように選択する。
【００２４】一定のＤＮＡ−フラグメントの獲得及び単
離のために、例えばＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで
処理した後、生じたＤＮＡ−フラグメントを自体公知法
でゲル電気泳動により（例えばアガロースゲル上で）分
離し、引き続き分子量を介して（公知分子量を有する参
照−ＤＮＡ−フラグメントと比較することにより測定）
同定し、かつ所望のＤＮＡ−フラグメントを相応するゲ
ル帯域から分離する。
離のために、例えばＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで
処理した後、生じたＤＮＡ−フラグメントを自体公知法
でゲル電気泳動により（例えばアガロースゲル上で）分
離し、引き続き分子量を介して（公知分子量を有する参
照−ＤＮＡ−フラグメントと比較することにより測定）
同定し、かつ所望のＤＮＡ−フラグメントを相応するゲ
ル帯域から分離する。
【００２５】連結は自体公知の条件下に、例えば連結す
べきＤＮＡ−フラグメントのほぼ同モル量を、その０．
５μｇあたりＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ約１０単位を有す
る緩衝液中で実施することができる（例えば、マニアテ
ィス等、第１４６頁参照）。
べきＤＮＡ−フラグメントのほぼ同モル量を、その０．
５μｇあたりＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ約１０単位を有す
る緩衝液中で実施することができる（例えば、マニアテ
ィス等、第１４６頁参照）。
【００２６】形質転換とは微生物中へのＤＮＡの挿入で
あり、こうしてＤＮＡはこの自律性でプラスミド−ＤＮ
Ａとして復製されるか、又は染色体に組込まれ、かつ場
合により発現されうる。バチルス種の形質転換に関して
は、例えばアナグノストポウロス等（Ａｎａｇｎｏｓｔ
ｏｐｏｕｌｏｓ等、１９６１年、Ｊ．Ｂａｃｔ．、第８
１巻、第７４１〜７４６頁）により記載された方法が好
適である。
あり、こうしてＤＮＡはこの自律性でプラスミド−ＤＮ
Ａとして復製されるか、又は染色体に組込まれ、かつ場
合により発現されうる。バチルス種の形質転換に関して
は、例えばアナグノストポウロス等（Ａｎａｇｎｏｓｔ
ｏｐｏｕｌｏｓ等、１９６１年、Ｊ．Ｂａｃｔ．、第８
１巻、第７４１〜７４６頁）により記載された方法が好
適である。
【００２７】ポリクロン化部位（ポリリンカー）は制限
エンドヌクレアーゼに関する認識部位の多くが密に隣接
する短〜中程度の二本鎖ＤＮＡ−フラグメントである。
例中で使用した、ベクターＭ１３ｔｇ１３１から由来す
るポリクローン化部位は例えば約０．０７ｋＢ（キロ塩
基）の大きさを有し、かつ１４の異なる制限エンドヌク
レアーゼに関する認識部位を有する。
エンドヌクレアーゼに関する認識部位の多くが密に隣接
する短〜中程度の二本鎖ＤＮＡ−フラグメントである。
例中で使用した、ベクターＭ１３ｔｇ１３１から由来す
るポリクローン化部位は例えば約０．０７ｋＢ（キロ塩
基）の大きさを有し、かつ１４の異なる制限エンドヌク
レアーゼに関する認識部位を有する。
【００２８】例１において使用し、かつバチルス・アル
カロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｃａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ）ＨＡ１と名付けたバチルス・アルカロフィルス菌
株はドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｎ（ＤＳＭ））に１９８９年７月２８日にＤＳＭ番号５
４６６として寄託された。他の使用した微生物は購入可
能である、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＤ２４４（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ １Ａ
４６）又はバチルス・ズブチリスＢＤ３６６（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ
１Ｅ６）。
カロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｃａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ）ＨＡ１と名付けたバチルス・アルカロフィルス菌
株はドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｎ（ＤＳＭ））に１９８９年７月２８日にＤＳＭ番号５
４６６として寄託された。他の使用した微生物は購入可
能である、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＤ２４４（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ １Ａ
４６）又はバチルス・ズブチリスＢＤ３６６（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ
１Ｅ６）。
【００２９】本発明の範囲において使用した更なる微生
物はバチルスＤＳＭ５４６６から、もしくは市販の微生
物から次に記載した方法により生ぜしめることができ
る： １． バチルス・アルカロフィルスＨＡ１３９／２８及
びＨＡ２８／１２ 両方の菌株はバチルス・アルカロフィルスＨＡ１から派
生したものである。両者は例えばドイツ特許出願第４０
２３４５８号公報に記載されているように強く高アルカ
リ性プロテアーゼを分泌し、かつ産業上の生産性菌株と
して使用することができる。この種の菌株はバチルス・
アルカロフィルスＨＡ１を突然変異誘発物質、例えば１
−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンを用い
て従来の十分に公知の方法により処理し、引き続き出発
菌株より大きい加水分解領域を形成することのできる突
然変異体を蛋白質−寒天プレート上で捜すことにより獲
得できる。繰り返しの突然変異サイクルにより更に上昇
したプロテアーゼ形成を有する菌株を単離することがで
きる。
物はバチルスＤＳＭ５４６６から、もしくは市販の微生
物から次に記載した方法により生ぜしめることができ
る： １． バチルス・アルカロフィルスＨＡ１３９／２８及
びＨＡ２８／１２ 両方の菌株はバチルス・アルカロフィルスＨＡ１から派
生したものである。両者は例えばドイツ特許出願第４０
２３４５８号公報に記載されているように強く高アルカ
リ性プロテアーゼを分泌し、かつ産業上の生産性菌株と
して使用することができる。この種の菌株はバチルス・
アルカロフィルスＨＡ１を突然変異誘発物質、例えば１
−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジンを用い
て従来の十分に公知の方法により処理し、引き続き出発
菌株より大きい加水分解領域を形成することのできる突
然変異体を蛋白質−寒天プレート上で捜すことにより獲
得できる。繰り返しの突然変異サイクルにより更に上昇
したプロテアーゼ形成を有する菌株を単離することがで
きる。
【００３０】２． バチルス・リヒェニホルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＫＣ１４
／１−４２２ この菌株はアルカリ性プロテアーゼを強く分泌し、かつ
産業上の生産性菌株として使用することのできるバチル
ス・リヒェニホルミスに関する。この種の菌株は、例え
ばバチルス・リヒェニホルミス型菌株（ドイツ微生物保
存機関においてＤＳＭ１３という番号で入手可能であ
る）を突然変異誘発物質、例えば１−メチル−３−ニト
ロ−１−ニトロソグアニジンを用いて従来の十分に公知
の方法により処理し、引き続き出発菌株より大きい加水
分解領域を形成することのできる突然変異体を蛋白質−
寒天プレート上で捜すことにより得ることができる。突
然変異サイクルを繰り返すことにより、更に上昇したプ
ロテアーゼ形成を有する菌株を単離することができる。
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＫＣ１４
／１−４２２ この菌株はアルカリ性プロテアーゼを強く分泌し、かつ
産業上の生産性菌株として使用することのできるバチル
ス・リヒェニホルミスに関する。この種の菌株は、例え
ばバチルス・リヒェニホルミス型菌株（ドイツ微生物保
存機関においてＤＳＭ１３という番号で入手可能であ
る）を突然変異誘発物質、例えば１−メチル−３−ニト
ロ−１−ニトロソグアニジンを用いて従来の十分に公知
の方法により処理し、引き続き出発菌株より大きい加水
分解領域を形成することのできる突然変異体を蛋白質−
寒天プレート上で捜すことにより得ることができる。突
然変異サイクルを繰り返すことにより、更に上昇したプ
ロテアーゼ形成を有する菌株を単離することができる。
【００３１】３． バチルス・リヒェニホルミスＳＥＥ
ＴＴ１８ この菌株はα−アミラーゼを強く分泌し、かつ産業上の
生産菌株として使用することのできるバチルス・リヒェ
ニホルミスに関する。この種の菌株は、例えばバチルス
・リヒェニホルミス菌株（米国寄託機関においてＡＴＣ
Ｃ２７８１１という番号で入手可能である）を突然変異
誘発物質、例えば１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロ
ソグアニジンを用いて従来の十分に公知な方法により処
理し、引き続き出発菌株より大きい加水分解領域（ルゴ
ール溶液で被覆することにより検出）を形成することの
できる突然変異体をデンプン−寒天プレート上で捜すこ
とにより獲得することができる。突然変異サイクルを繰
り返すことにより、更に上昇したアミラーゼ形成を有す
る菌株を単離することができる。
ＴＴ１８ この菌株はα−アミラーゼを強く分泌し、かつ産業上の
生産菌株として使用することのできるバチルス・リヒェ
ニホルミスに関する。この種の菌株は、例えばバチルス
・リヒェニホルミス菌株（米国寄託機関においてＡＴＣ
Ｃ２７８１１という番号で入手可能である）を突然変異
誘発物質、例えば１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロ
ソグアニジンを用いて従来の十分に公知な方法により処
理し、引き続き出発菌株より大きい加水分解領域（ルゴ
ール溶液で被覆することにより検出）を形成することの
できる突然変異体をデンプン−寒天プレート上で捜すこ
とにより獲得することができる。突然変異サイクルを繰
り返すことにより、更に上昇したアミラーゼ形成を有す
る菌株を単離することができる。
【００３２】例１ Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１からのゲノムＤＮＡ−ライ
ブラリーの製造及び高アルカリ性プロテアーゼに関する
遺伝子の単離 天然単離体バチルス・アルカロフィルスＨＡ１（ドイツ
微生物保存機関においてＤＳＭ５４６６という番号で寄
託）からサイトー等（Ｓａｉｔｏ等、１９６３年、Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第７２巻、
第６１９〜６２９頁）の方法により染色体ＤＮＡを単離
し、かつ制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａにより部分
的に加水分解した。
ブラリーの製造及び高アルカリ性プロテアーゼに関する
遺伝子の単離 天然単離体バチルス・アルカロフィルスＨＡ１（ドイツ
微生物保存機関においてＤＳＭ５４６６という番号で寄
託）からサイトー等（Ｓａｉｔｏ等、１９６３年、Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第７２巻、
第６１９〜６２９頁）の方法により染色体ＤＮＡを単離
し、かつ制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａにより部分
的に加水分解した。
【００３３】制限フラグメントを寒天ゲル上で電気泳動
により分離し、かつこのフラグメントを大きさ３〜８ｋ
Ｂで単離した。
により分離し、かつこのフラグメントを大きさ３〜８ｋ
Ｂで単離した。
【００３４】バチルス・アルカロフィルスＨＡ１から単
離し、かつ大きさにより選択したＤＮＡ−フラグメント
をプラスミドのベクターＤＮＡ ｐＵＢ１１０（例２中
で記載したように獲得）と試験管内で新に組み合わせ
た。
離し、かつ大きさにより選択したＤＮＡ−フラグメント
をプラスミドのベクターＤＮＡ ｐＵＢ１１０（例２中
で記載したように獲得）と試験管内で新に組み合わせ
た。
【００３５】このためにはまずプラスミドｐＵＢ１１０
を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで制限し、引き続
き子牛の腸からのアルカリ性ホスファターゼを用いて脱
ホスホリル化した。引き続き、制限し、脱ホスホリル化
したベクターＤＮＡ２μｇをバチルス・アルカロフィル
スＤＮＡ−フラグメント８μｇと共に全容量１００μｌ
でＴ４−ＤＮＡリガーゼと共に１６℃で２４時間恒温保
持した。
を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで制限し、引き続
き子牛の腸からのアルカリ性ホスファターゼを用いて脱
ホスホリル化した。引き続き、制限し、脱ホスホリル化
したベクターＤＮＡ２μｇをバチルス・アルカロフィル
スＤＮＡ−フラグメント８μｇと共に全容量１００μｌ
でＴ４−ＤＮＡリガーゼと共に１６℃で２４時間恒温保
持した。
【００３６】試験管内で新しく組み合わせて、得られた
ＤＮＡで、菌株バチルス・ズブチリスＢＤ２４４のプロ
トプラストをチャング及びコーヘン（Ｓ．Ｃｈａｎｇ及
びＮ．Ｃｏｈｅｎ、１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．、第１６８巻、第１１１〜１１５頁）に記載さ
れた方法により形質転換した。この形質転換体をネオマ
イシンを有するプレート上で選択し、引き続きスキムミ
ルク寒天上に移す。実験した形質転換体１３８００のう
ちで、スキムミルク寒天の蛋白加水分解により明らかに
より大きな領域を形成するものが１つ見い出された。こ
のクローンからプラスミド−ＤＮＡがマニアティス等の
方法により単離された。このプラスミド中に含まれる
Ｂ．アルカロフィルス−ＤＮＡからのクローン化フラグ
メントは大きさ４．１ｋＢを有し、かつバチルス・アル
カロフィルスＨＡ１からの高アルカリ性プロテアーゼに
関する完全な情報を有した。
ＤＮＡで、菌株バチルス・ズブチリスＢＤ２４４のプロ
トプラストをチャング及びコーヘン（Ｓ．Ｃｈａｎｇ及
びＮ．Ｃｏｈｅｎ、１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．、第１６８巻、第１１１〜１１５頁）に記載さ
れた方法により形質転換した。この形質転換体をネオマ
イシンを有するプレート上で選択し、引き続きスキムミ
ルク寒天上に移す。実験した形質転換体１３８００のう
ちで、スキムミルク寒天の蛋白加水分解により明らかに
より大きな領域を形成するものが１つ見い出された。こ
のクローンからプラスミド−ＤＮＡがマニアティス等の
方法により単離された。このプラスミド中に含まれる
Ｂ．アルカロフィルス−ＤＮＡからのクローン化フラグ
メントは大きさ４．１ｋＢを有し、かつバチルス・アル
カロフィルスＨＡ１からの高アルカリ性プロテアーゼに
関する完全な情報を有した。
【００３７】更なる方法を簡単にするために、４．１ｋ
Ｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントをまず大きさにおい
て減少させた。このためには、このＤＮＡ−フラグメン
ト上に存在する制限エンドヌクレアーゼに関する認識部
位を種々の制限エンドヌクレアーゼでこのプラスミドを
切断し、かつ寒天ゲル上の電気泳動により制限されたＤ
ＮＡのフラグメントを分離することにより調べた。制限
エンドヌクレアーゼＡｖａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切
断することにより得られた２．３ｋＢの大きさのＤＮＡ
−フラグメントが確かめられ、これは高アルカリ性プロ
テアーゼに関する完全な情報を有し、かつ更なる方法に
使用された。このためには、４．１ｋＢ−フラグメント
を有する前記プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＡｖ
ａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで制限した。２．３ｋＢの大
きさのＤＮＡ−フラグメントを単離し、あらかじめ同様
にＡｖａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断したベクターｐ
ＵＢ１３１（例２に記載したように製造）と連結した。
Ｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントをまず大きさにおい
て減少させた。このためには、このＤＮＡ−フラグメン
ト上に存在する制限エンドヌクレアーゼに関する認識部
位を種々の制限エンドヌクレアーゼでこのプラスミドを
切断し、かつ寒天ゲル上の電気泳動により制限されたＤ
ＮＡのフラグメントを分離することにより調べた。制限
エンドヌクレアーゼＡｖａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切
断することにより得られた２．３ｋＢの大きさのＤＮＡ
−フラグメントが確かめられ、これは高アルカリ性プロ
テアーゼに関する完全な情報を有し、かつ更なる方法に
使用された。このためには、４．１ｋＢ−フラグメント
を有する前記プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＡｖ
ａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで制限した。２．３ｋＢの大
きさのＤＮＡ−フラグメントを単離し、あらかじめ同様
にＡｖａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断したベクターｐ
ＵＢ１３１（例２に記載したように製造）と連結した。
【００３８】得られたプラスミドをｐＣＬＥＡＮ４と名
付け、これを菌株Ｂ．ズブチリスＢＤ２２４中に導入し
た。この形質転換体は高アルカリ性プロテアーゼを分泌
することができ、このことはＡｖａＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ−フラグメントがＢ．アルカロフィルスＨＡ１からの
高アルカリ性プロテアーゼに関する完全な構造遺伝子を
含有することを示した。このプラスミドｐＣＬＥＡＮ４
の制限地図は図１中に示されている。
付け、これを菌株Ｂ．ズブチリスＢＤ２２４中に導入し
た。この形質転換体は高アルカリ性プロテアーゼを分泌
することができ、このことはＡｖａＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ−フラグメントがＢ．アルカロフィルスＨＡ１からの
高アルカリ性プロテアーゼに関する完全な構造遺伝子を
含有することを示した。このプラスミドｐＣＬＥＡＮ４
の制限地図は図１中に示されている。
【００３９】例２ プラスミドｐＵＢ１１０の単離及び精製及びベクターｐ
ＵＢ１３１の構成 菌株バチルス・ズブチリスＢＤ３６６（ｐＵＢ１１０）
からＴ．Ｊ．グリクザン等（Ｔ．Ｊ．Ｇｒｙｃｚａｎ
等、１９７８年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１３４
巻、第３１８〜３２９頁）による方法により、プラスミ
ドｐＵＢ１１０を単離し、かつ引き続きマニアティス等
の方法（第９３頁）により塩化セシウム−密度傾斜−遠
心分離により精製した。ベクターｐＵＢ１１０は制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩに関するわ
ずかに１つ存在する制限部位を有し、かつマーカーとし
てネオマイシン及びフレオマイシンに対する抗生物質−
耐性に関してコードするＤＮＡ−配列、並びにバチルス
種中での復製に関して必要なＤＮＡ−配列（“ｏｒｉｇ
ｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”）を有する。
ＵＢ１３１の構成 菌株バチルス・ズブチリスＢＤ３６６（ｐＵＢ１１０）
からＴ．Ｊ．グリクザン等（Ｔ．Ｊ．Ｇｒｙｃｚａｎ
等、１９７８年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１３４
巻、第３１８〜３２９頁）による方法により、プラスミ
ドｐＵＢ１１０を単離し、かつ引き続きマニアティス等
の方法（第９３頁）により塩化セシウム−密度傾斜−遠
心分離により精製した。ベクターｐＵＢ１１０は制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩに関するわ
ずかに１つ存在する制限部位を有し、かつマーカーとし
てネオマイシン及びフレオマイシンに対する抗生物質−
耐性に関してコードするＤＮＡ−配列、並びにバチルス
種中での復製に関して必要なＤＮＡ−配列（“ｏｒｉｇ
ｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”）を有する。
【００４０】前記の得られたプラスミドｐＵＢ１１０を
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで制限した。７９０Ｂｐ（塩
基対）を有する小さい方のフラグメントをベクターＭ１
３ｔｇ１３１からＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ ＩＩ−フラグメ
ントとして予め単離された塩基対６７個からなるポリリ
ンカーにより置き換えた。このようにして得られたｐＵ
Ｂ１３１という名称を有するベクターはこうしてｐＵＢ
１１０の由来のものであり、これは約０．８ｋＢの大き
さのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを欠失させ、
かつそのかわりにポリクローン化位を組み込んだもので
ある。名称ｐＵＢ１３１を有するベクターの制限地図を
図２に示す。
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで制限した。７９０Ｂｐ（塩
基対）を有する小さい方のフラグメントをベクターＭ１
３ｔｇ１３１からＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ ＩＩ−フラグメ
ントとして予め単離された塩基対６７個からなるポリリ
ンカーにより置き換えた。このようにして得られたｐＵ
Ｂ１３１という名称を有するベクターはこうしてｐＵＢ
１１０の由来のものであり、これは約０．８ｋＢの大き
さのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを欠失させ、
かつそのかわりにポリクローン化位を組み込んだもので
ある。名称ｐＵＢ１３１を有するベクターの制限地図を
図２に示す。
【００４１】例３ Ｂ．アルカロフィルス種の形質転換 Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１３９／２８及びＨＡ２８／
１２をチャング及びコーヘン（１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６８巻、第１１１〜１１５
頁）が記載したプロトプラスト法により形質転換し、こ
れを次のように変えた：成長培地は１Ｍ炭酸塩緩衝液
（Ｎａ2ＣＯ3 ５３ｇ、ＮａＨ2ＣＯ3 ４２ｇ、全１０
００ｍｌ）１％を含有する。“ＤＭ３”−再生プレート
のｐＨ−値を注ぐ前にＮａＯＨでｐＨ７．８に調節す
る。再生プレートは形質転換体の選択のためにフレオマ
イシン３０μｇ／ｍｌを含有する。
１２をチャング及びコーヘン（１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６８巻、第１１１〜１１５
頁）が記載したプロトプラスト法により形質転換し、こ
れを次のように変えた：成長培地は１Ｍ炭酸塩緩衝液
（Ｎａ2ＣＯ3 ５３ｇ、ＮａＨ2ＣＯ3 ４２ｇ、全１０
００ｍｌ）１％を含有する。“ＤＭ３”−再生プレート
のｐＨ−値を注ぐ前にＮａＯＨでｐＨ７．８に調節す
る。再生プレートは形質転換体の選択のためにフレオマ
イシン３０μｇ／ｍｌを含有する。
【００４２】例４ Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１からの高アルカリ性プロテ
アーゼの染色体遺伝子増幅 図２中のベクターｐＵＢ１３１の制限地図が示すよう
に、制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩに関する切断位が
それぞれ１９７６Ｂｐ及び２８６２Ｂｐで見い出され
る。その間に存在する８８６Ｂｐ−フラグメントの除去
により機能ｒｅｐＵ、ｏｒｉＢ及びｎｅｏr／ｋａｎａr
はこうして除かれ、こうして生じたＤＮＡはもはや宿主
細胞中で自己復製することはできない。プラスミドｐＣ
ＬＥＡＮ４（図１）はＢ．アルカロフィルスＨＡ１から
の高アルカリ性プロテアーゼに関する２．３ｋＢの大き
さのＤＮＡ−フラグメント中に全くＮｓｉＩに関する認
識位を有さない。プラスミドｐＣＬＥＡＮ４からの８８
６Ｂｐ−ＮｓｉＩ−フラグメントの欠失により宿主細胞
中でもはや自己復製性でないＤＮＡが得られた。しかし
このＤＮＡを用いてＢ．アルカロフィルス及び他のバチ
ルス種を形質転換することができる、それというのも −このＤＮＡは更にフレオマイシン耐性マーカーを含有
し、かつこうして選択可能であり、かつ −プロテアーゼ遺伝子を用いて例えばＢ．アルカロフィ
ルスの染色体中に相同組換えにより組込むことが可能で
ある。
アーゼの染色体遺伝子増幅 図２中のベクターｐＵＢ１３１の制限地図が示すよう
に、制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩに関する切断位が
それぞれ１９７６Ｂｐ及び２８６２Ｂｐで見い出され
る。その間に存在する８８６Ｂｐ−フラグメントの除去
により機能ｒｅｐＵ、ｏｒｉＢ及びｎｅｏr／ｋａｎａr
はこうして除かれ、こうして生じたＤＮＡはもはや宿主
細胞中で自己復製することはできない。プラスミドｐＣ
ＬＥＡＮ４（図１）はＢ．アルカロフィルスＨＡ１から
の高アルカリ性プロテアーゼに関する２．３ｋＢの大き
さのＤＮＡ−フラグメント中に全くＮｓｉＩに関する認
識位を有さない。プラスミドｐＣＬＥＡＮ４からの８８
６Ｂｐ−ＮｓｉＩ−フラグメントの欠失により宿主細胞
中でもはや自己復製性でないＤＮＡが得られた。しかし
このＤＮＡを用いてＢ．アルカロフィルス及び他のバチ
ルス種を形質転換することができる、それというのも −このＤＮＡは更にフレオマイシン耐性マーカーを含有
し、かつこうして選択可能であり、かつ −プロテアーゼ遺伝子を用いて例えばＢ．アルカロフィ
ルスの染色体中に相同組換えにより組込むことが可能で
ある。
【００４３】プラスミドｐＣＬＥＡＮ４ １０μｇをＮ
ｓｉＩで切断した。加水分解したＤＮＡを寒天ゲル上で
分離し、かつ大きい方のフラグメント（５１７３Ｂｐ）
を単離した。これをＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを用いて環
状ＤＮＡとした。
ｓｉＩで切断した。加水分解したＤＮＡを寒天ゲル上で
分離し、かつ大きい方のフラグメント（５１７３Ｂｐ）
を単離した。これをＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを用いて環
状ＤＮＡとした。
【００４４】このｐＣＬＥＡＮ４−ｄｅｌと名付けた環
状ＤＮＡは抗生物質ネオマイシン／カナマイシンに対す
る耐性をもはやコードせず、かつ機能ｒｅｐＵ及びｏｒ
ｉＢを有さないので、もはや自己復製はできず、もしく
はこうしてバクテリア細胞中ではもはやプラスミドとし
て存在することはできなかった。
状ＤＮＡは抗生物質ネオマイシン／カナマイシンに対す
る耐性をもはやコードせず、かつ機能ｒｅｐＵ及びｏｒ
ｉＢを有さないので、もはや自己復製はできず、もしく
はこうしてバクテリア細胞中ではもはやプラスミドとし
て存在することはできなかった。
【００４５】次に、環状ＤＮＡ ｐＣＬＥＡＮ４−ｄｅ
ｌを菌株Ｂ．アルカロフィルスＨＡ２８／１２及びＢ．
アルカロフィルスＨＡ１３９／２８中に挿入した。この
選択はフレオマイシン耐性により行なった（例３参
照）。
ｌを菌株Ｂ．アルカロフィルスＨＡ２８／１２及びＢ．
アルカロフィルスＨＡ１３９／２８中に挿入した。この
選択はフレオマイシン耐性により行なった（例３参
照）。
【００４６】この得られた形質転換体のうち菌株ＨＡ２
８／１２においては形質転換体ＨＡ２８／１２−ＩＮＴ
５４２を及び菌株ＨＡ１３９／２８においては形質転換
体ＨＡ１３９／２８−ＩＮＴ１を更なる実験に選択し
た。この両方の形質転換体において、何回も実験したプ
ラスミド単離においても全くプラスミド−ＤＮＡは検出
することはできなかった。この形質転換体から単離した
ＤＮＡを用いて、Ｂ．ズブチリスはフレオマイシン耐性
又はカナマイシン／ネオマイシン耐性により形質転換さ
れることができなかった。こうして、形質転換体はエピ
ソームの要素を有さなかった。
８／１２においては形質転換体ＨＡ２８／１２−ＩＮＴ
５４２を及び菌株ＨＡ１３９／２８においては形質転換
体ＨＡ１３９／２８−ＩＮＴ１を更なる実験に選択し
た。この両方の形質転換体において、何回も実験したプ
ラスミド単離においても全くプラスミド−ＤＮＡは検出
することはできなかった。この形質転換体から単離した
ＤＮＡを用いて、Ｂ．ズブチリスはフレオマイシン耐性
又はカナマイシン／ネオマイシン耐性により形質転換さ
れることができなかった。こうして、形質転換体はエピ
ソームの要素を有さなかった。
【００４７】サザン・ブロット法により、ｐＣＬＥＡＮ
４−ｄｅｌ−ＤＮＡが相同組換えにより、高アルカリ性
プロテアーゼに関する遺伝子の位置でその都度の宿主有
機体ＨＡ２８／１２もしくはＨＡ１３９／２８中に組込
まれたことが示されることができた。
４−ｄｅｌ−ＤＮＡが相同組換えにより、高アルカリ性
プロテアーゼに関する遺伝子の位置でその都度の宿主有
機体ＨＡ２８／１２もしくはＨＡ１３９／２８中に組込
まれたことが示されることができた。
【００４８】菌株Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１３９／２
８−ＩＮＴ１及びＢ．アルカロフィルスＨＡ２８／１２
−ＩＮＴ５４２をフレオマイシン３０μｇ／ｍｌを含有
する“ＤＭ３”−再生プレート上で単離した。フレオマ
イシンに対する耐性の程度は使用した成長培地に依存し
た。前記の形質転換体を常用の実験用培地、例えばトリ
プトース血液寒天塩基プレート又はルリア・ブロース
（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）寒天プレート上ではフレオ
マイシン濃度最大３μｇ／ｍｌに対してのみ耐性であっ
た。より高いフレオマイシン濃度への適応は上昇するフ
レオマイシン濃度を有する液体培地中でこの菌株を繰り
返し培養することにより可能であった。この種の適応菌
株はゲノムあたりフレオマイシン耐性遺伝子の多くのコ
ピー並びにＢ．アルカロフィルスＨＡ１からの高アルカ
リ性プロテアーゼに関する遺伝子の多くのコピーを有す
る。
８−ＩＮＴ１及びＢ．アルカロフィルスＨＡ２８／１２
−ＩＮＴ５４２をフレオマイシン３０μｇ／ｍｌを含有
する“ＤＭ３”−再生プレート上で単離した。フレオマ
イシンに対する耐性の程度は使用した成長培地に依存し
た。前記の形質転換体を常用の実験用培地、例えばトリ
プトース血液寒天塩基プレート又はルリア・ブロース
（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）寒天プレート上ではフレオ
マイシン濃度最大３μｇ／ｍｌに対してのみ耐性であっ
た。より高いフレオマイシン濃度への適応は上昇するフ
レオマイシン濃度を有する液体培地中でこの菌株を繰り
返し培養することにより可能であった。この種の適応菌
株はゲノムあたりフレオマイシン耐性遺伝子の多くのコ
ピー並びにＢ．アルカロフィルスＨＡ１からの高アルカ
リ性プロテアーゼに関する遺伝子の多くのコピーを有す
る。
【００４９】例５ 振盪フラスコ中でのプロテアーゼ収量の測定 相応する出発菌株及びより高いフレオマイシン濃度に適
応した菌株（例４）である例４からの菌株Ｂ．アルカロ
フィルスＨＡ１３９／２８−ＩＮＴ１及びＢ．アルカロ
フィルスＨＡ２８／１２−ＩＮＴ５４２を次に記載した
条件下に培養した。３１時間の培養時間の後、培養上澄
中の蛋白質分解活性を測定した。結果を表１中に記載す
る。出発菌株の収量はそれぞれ１００％として使用し
た。
応した菌株（例４）である例４からの菌株Ｂ．アルカロ
フィルスＨＡ１３９／２８−ＩＮＴ１及びＢ．アルカロ
フィルスＨＡ２８／１２−ＩＮＴ５４２を次に記載した
条件下に培養した。３１時間の培養時間の後、培養上澄
中の蛋白質分解活性を測定した。結果を表１中に記載す
る。出発菌株の収量はそれぞれ１００％として使用し
た。
【００５０】培養条件：予培地（１０００ｍｌ中トリプ
トン１５ｇ、酵母エキス７．５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、デン
プン５０ｇ、トウモロコシ膨潤水１０ｍｌ）５０ｍｌを
テストすべき菌株の個々のコロニーで接種し、かつそら
せ板を有するエルレンマイヤーフラスコ中で３７℃及び
３２０ｒｐｍで１８時間恒温保持した。この培養物２．
５ｍｌで主要培養培地（１０００ｍｌ中あらびき大豆４
０ｇ、デンプン１００ｇ、トウモロコシ膨潤水２０ｍ
ｌ）５０ｍｌを接種し、かつそらせ板を有するエルレン
マイヤーフラスコ中で３７℃及び３２０ｒｐｍで恒温保
持した。両方の培地は付加的に炭酸塩緩衝液（１０００
ｍｌ中Ｎａ2ＣＯ3 ５３ｇ、ＮａＨＣＯ3 ４２ｇ）１
５０ｍｌを付加的に含有する。結果は表１中に示す。
トン１５ｇ、酵母エキス７．５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、デン
プン５０ｇ、トウモロコシ膨潤水１０ｍｌ）５０ｍｌを
テストすべき菌株の個々のコロニーで接種し、かつそら
せ板を有するエルレンマイヤーフラスコ中で３７℃及び
３２０ｒｐｍで１８時間恒温保持した。この培養物２．
５ｍｌで主要培養培地（１０００ｍｌ中あらびき大豆４
０ｇ、デンプン１００ｇ、トウモロコシ膨潤水２０ｍ
ｌ）５０ｍｌを接種し、かつそらせ板を有するエルレン
マイヤーフラスコ中で３７℃及び３２０ｒｐｍで恒温保
持した。両方の培地は付加的に炭酸塩緩衝液（１０００
ｍｌ中Ｎａ2ＣＯ3 ５３ｇ、ＮａＨＣＯ3 ４２ｇ）１
５０ｍｌを付加的に含有する。結果は表１中に示す。
【００５１】 表１ フレオマイシン 培養上澄中 菌株Ｂ．アルカロフィルス に対する耐性 での活性 ＨＡ １３９／２８ ０ μｇ／ｍｌ １００％ ＨＡ １３９／２８−ＩＮＴ １ ３ μｇ／ｍｌ １７０％ ＨＡ １３９／２８−ＩＮＴ １ ５ μｇ／ｍｌ １７５％ ＨＡ １３９／２８−ＩＮＴ １ １０ μｇ／ｍｌ １８０％ ＨＡ １３９／２８−ＩＮＴ １ ２０ μｇ／ｍｌ １６０％ ＨＡ １３９／２８−ＩＮＴ １ ２５ μｇ／ｍｌ １２０％ ＨＡ ２８／１２ ０ μｇ／ｍｌ １００％ ＨＡ ２８／１２−ＩＮＴ ５４２ ３ μｇ／ｍｌ １３５％ ＨＡ ２８／１２−ＩＮＴ ５４２ １０ μｇ／ｍｌ １３５％ 例６ ＤＮＡ−統合の安定性 ａ） 例４からのＢ．アルカロフィルスＨＡ２８／１２
−ＩＮＴ５４２をルリアーブロース（Ｈ2Ｏ １０００
ｍｌ中のトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ−１０ｍｌ炭酸塩緩衝液／１ｌ培地）中で５０世
代の間培養した。引き続き、菌を抗生物質を含有しない
寒天プレート上にばらばらに離し、ペトリシャーレの熟
成後、コロニー１００個をフレオマイシン３μｇ／ｍｌ
を含有する寒天プレート上に移す。フレオマイシンの存
在において成長する能力のないコロニーは全く見い出さ
れなかった。この結果は、マーカーフレオマイシン耐性
が染色体中で高い安定性を有することを示す。
−ＩＮＴ５４２をルリアーブロース（Ｈ2Ｏ １０００
ｍｌ中のトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ−１０ｍｌ炭酸塩緩衝液／１ｌ培地）中で５０世
代の間培養した。引き続き、菌を抗生物質を含有しない
寒天プレート上にばらばらに離し、ペトリシャーレの熟
成後、コロニー１００個をフレオマイシン３μｇ／ｍｌ
を含有する寒天プレート上に移す。フレオマイシンの存
在において成長する能力のないコロニーは全く見い出さ
れなかった。この結果は、マーカーフレオマイシン耐性
が染色体中で高い安定性を有することを示す。
【００５２】ｂ） 例４からの菌株Ｂ．アルカロフィル
スＨＡ１３９／２８及びＢ．アルカロフィルスＨＡ１３
９／２８−ＩＮＴ１を例５中で記載したように（培地の
処方及び培養条件）培養した。
スＨＡ１３９／２８及びＢ．アルカロフィルスＨＡ１３
９／２８−ＩＮＴ１を例５中で記載したように（培地の
処方及び培養条件）培養した。
【００５３】予培養培地２０ｍｌを寒天プレートの菌株
の個々のコロニーでその都度接種した。Ｂ．アルカロフ
ィルスＨＡ１３９／２８−ＩＮＴ１に関する培地はフレ
オマイシン１０μｇ／ｍｌを含有する（この菌株はあら
かじめ相応する抗生物質濃度に適応された）。１８時間
の恒温保持の後、この培地５０μｌをフレオマイシン不
含の主要培養培地５０ｍｌ中に導入した。２４時間の恒
温保持の後、この細胞を希釈率１：１０００で新鮮な主
要培養培地に移した。フレオマイシン不存在のこの種の
副次培養を全部で４回実施した。個々の培地の培養上澄
中の蛋白加水分解活性をそのつど３１時間後に測定し
た。図４中にこの実際の結果を示してある。
の個々のコロニーでその都度接種した。Ｂ．アルカロフ
ィルスＨＡ１３９／２８−ＩＮＴ１に関する培地はフレ
オマイシン１０μｇ／ｍｌを含有する（この菌株はあら
かじめ相応する抗生物質濃度に適応された）。１８時間
の恒温保持の後、この培地５０μｌをフレオマイシン不
含の主要培養培地５０ｍｌ中に導入した。２４時間の恒
温保持の後、この細胞を希釈率１：１０００で新鮮な主
要培養培地に移した。フレオマイシン不存在のこの種の
副次培養を全部で４回実施した。個々の培地の培養上澄
中の蛋白加水分解活性をそのつど３１時間後に測定し
た。図４中にこの実際の結果を示してある。
【００５４】Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１３９／２８の
第１の培地中の蛋白加水分解活性を１００％とした。こ
の実験は、Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１３９／２８−Ｉ
ＮＴ１の表現型“強化プロテアーゼ分泌”が著しく安定
であることを示す。
第１の培地中の蛋白加水分解活性を１００％とした。こ
の実験は、Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１３９／２８−Ｉ
ＮＴ１の表現型“強化プロテアーゼ分泌”が著しく安定
であることを示す。
【００５５】例７ バチルス・リヒェニホルミスからのアルカリ性プロテア
ーゼの染色体の遺伝子増幅 Ｂ．リヒェニホルミスのアルカリ性プロテアーゼに関す
る遺伝子の染色体上での増幅をプロテアーゼ過剰分泌
Ｂ．リヒェニホルミスにおいて実施した。この実験は
Ｂ．アルカロフィルスの高アルカリ性プロテアーゼに関
する遺伝子の増幅のための実験に相応して実施した（例
３〜５参照）。
ーゼの染色体の遺伝子増幅 Ｂ．リヒェニホルミスのアルカリ性プロテアーゼに関す
る遺伝子の染色体上での増幅をプロテアーゼ過剰分泌
Ｂ．リヒェニホルミスにおいて実施した。この実験は
Ｂ．アルカロフィルスの高アルカリ性プロテアーゼに関
する遺伝子の増幅のための実験に相応して実施した（例
３〜５参照）。
【００５６】図３はプラスミドｐＬＩ１の制限地図を示
す。このプラスミドはプラスミドｐＣＬＥＡＮ４と類似
に構成されており、これはｐＣＬＥＡＮ４中の２．３ｋ
Ｂの大きさＤＮＡ−フラグメントに相応するインサート
をコードするが、しかしｐＣＬＥＡＮ４におけるように
Ｂ．アルカロフィルスからの高アルカリ性プロテアーゼ
に関するものではなくて、Ｂ．リヒェニホルミスからの
アルカリ性プロテアーゼに関するものである。
す。このプラスミドはプラスミドｐＣＬＥＡＮ４と類似
に構成されており、これはｐＣＬＥＡＮ４中の２．３ｋ
Ｂの大きさＤＮＡ−フラグメントに相応するインサート
をコードするが、しかしｐＣＬＥＡＮ４におけるように
Ｂ．アルカロフィルスからの高アルカリ性プロテアーゼ
に関するものではなくて、Ｂ．リヒェニホルミスからの
アルカリ性プロテアーゼに関するものである。
【００５７】自己複製に必要なＤＮＡ−配列を制限エン
ドヌクレアーゼＮｓｉＩを用いて取り除くことはプラス
ミドｐＬＩ１においては不可能である。それというのも
ＮｓｉＩに関する更なる認識位はアルカリ性プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ配列中に存在するためである。
ドヌクレアーゼＮｓｉＩを用いて取り除くことはプラス
ミドｐＬＩ１においては不可能である。それというのも
ＮｓｉＩに関する更なる認識位はアルカリ性プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ配列中に存在するためである。
【００５８】従って、プラスミドｐＬＩ１を制限エンド
ヌクレアーゼＢｓｐＨ１及びＮｃｏ１で制限し、かつア
ガロースゲル電気泳動により４４７９ｋＢの大きさのフ
ラグメントを単離し、引き続きこれをＴ４−ＤＮＡ−リ
ガーゼを用いて環状ＤＮＡとした。この連結は、両方の
ヌクレアーゼが同じ突出一本鎖を作り出すので可能であ
った。環状ＤＮＡをプロトプラスト−形質転換により
Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２２中に導入し
た。この形質転換をチャング及びコーヘン（１９７９
年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．第１６８巻、第１１
１〜１１５頁）に記載されているように実施した。この
選択はフレオマイシン３５μｇ／ｍｌを含有する“ＤＭ
３”−再生プレートで行なった。得られた形質転換体の
中から菌株Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２２
−ＩＮＴ１４を選択した。
ヌクレアーゼＢｓｐＨ１及びＮｃｏ１で制限し、かつア
ガロースゲル電気泳動により４４７９ｋＢの大きさのフ
ラグメントを単離し、引き続きこれをＴ４−ＤＮＡ−リ
ガーゼを用いて環状ＤＮＡとした。この連結は、両方の
ヌクレアーゼが同じ突出一本鎖を作り出すので可能であ
った。環状ＤＮＡをプロトプラスト−形質転換により
Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２２中に導入し
た。この形質転換をチャング及びコーヘン（１９７９
年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．第１６８巻、第１１
１〜１１５頁）に記載されているように実施した。この
選択はフレオマイシン３５μｇ／ｍｌを含有する“ＤＭ
３”−再生プレートで行なった。得られた形質転換体の
中から菌株Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２２
−ＩＮＴ１４を選択した。
【００５９】Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２
２ＩＮＴ１４及びＢ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−
４２２を例５に記載されているように培養した。
２ＩＮＴ１４及びＢ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−
４２２を例５に記載されているように培養した。
【００６０】しかしながら、この培地は炭酸塩緩衝液を
全く含有しない。Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−
４２２−ＩＮＴ１４の培養上澄液中の蛋白加水分解活性
はＢ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２２における
より２０％程高い。
全く含有しない。Ｂ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−
４２２−ＩＮＴ１４の培養上澄液中の蛋白加水分解活性
はＢ．リヒェニホルミスＫＣ１４／１−４２２における
より２０％程高い。
【００６１】例８ バチルス・リヒェニホルミスからのα−アミラーゼの染
色体遺伝子増幅 アミラーゼ過剰分泌Ｂ．リヒェニホルミスにおいてＢ．
リヒェニホルミスのα−アミラーゼに関する遺伝子の染
色体上での増幅が記載された。
色体遺伝子増幅 アミラーゼ過剰分泌Ｂ．リヒェニホルミスにおいてＢ．
リヒェニホルミスのα−アミラーゼに関する遺伝子の染
色体上での増幅が記載された。
【００６２】この実験はＢ．アルカロフィルスの高アル
カリ性プロテアーゼに関する遺伝子の増幅に関してと同
様にして実施した（例３〜５参照）。
カリ性プロテアーゼに関する遺伝子の増幅に関してと同
様にして実施した（例３〜５参照）。
【００６３】プラスミドｐＳＥＨ１はプラスミドｐＣＬ
ＥＡＮ４と同様に構成されているが、ｐＣＬＥＡＮ４中
のプロテアーゼに相応するインサートはここではＢ．リ
ヒェニホルミスＡＴＣＣ２７８１１からのα−アミラー
ゼをコードした。
ＥＡＮ４と同様に構成されているが、ｐＣＬＥＡＮ４中
のプロテアーゼに相応するインサートはここではＢ．リ
ヒェニホルミスＡＴＣＣ２７８１１からのα−アミラー
ゼをコードした。
【００６４】プラスミドｐＳＥＨ１中の自己複製に必要
であるＤＮＡ−配列の欠失を制限エンドヌクレアーゼＮ
ｓｉＩを用いて実施した。環状ＤＮＡをプロトプラスト
−形質転換により菌株Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ
１８中に導入した。得られた形質転換体の中から菌株
Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８−ＩＮＴ１３を選
択した。Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８−ＩＮＴ
１３及びＢ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８をラクト
ース、綿の実粉、大豆粉及びトウモロコシ膨潤水を含有
する培地中で培養した。Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴ
Ｔ１８−ＩＮＴ１３の培養上澄中の殿粉加水分解活性は
Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８におけるより２５
％程高かった。
であるＤＮＡ−配列の欠失を制限エンドヌクレアーゼＮ
ｓｉＩを用いて実施した。環状ＤＮＡをプロトプラスト
−形質転換により菌株Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ
１８中に導入した。得られた形質転換体の中から菌株
Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８−ＩＮＴ１３を選
択した。Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８−ＩＮＴ
１３及びＢ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８をラクト
ース、綿の実粉、大豆粉及びトウモロコシ膨潤水を含有
する培地中で培養した。Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴ
Ｔ１８−ＩＮＴ１３の培養上澄中の殿粉加水分解活性は
Ｂ．リヒェニホルミスＳＥＥＴＴ１８におけるより２５
％程高かった。
【図１】プラスミドｐＣＬＥＡＮ４の制限地図を示す図
である。
である。
【図２】プラスミドｐＵＢ１３１の制限地図を示す図で
ある。
ある。
【図３】プラスミドｐＬＩ１の制限地図を示す図であ
る。
る。
【図４】Ｂ．アルカロフィルスＨＡ１３９／２８及びＨ
Ａ１３９／２８−ＩＮＴ１の培養上澄中の蛋白加水分解
活性を棒グラフとしてあらわした図である。
Ａ１３９／２８−ＩＮＴ１の培養上澄中の蛋白加水分解
活性を棒グラフとしてあらわした図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 デトレフ ヴィルケ ドイツ連邦共和国 ヴェニヒゼン ラント ヴェール ６ (72)発明者 マグレート ケラー ドイツ連邦共和国 ハノーヴァー 71 ク ロンスベルガー シュトラーセ 16 (72)発明者 ベルンハルト メーラー ドイツ連邦共和国 ハノーヴァー 61 リ ューネブルガー ダム 28 (72)発明者 アントワーヌ アモリ ベルギー国 リクサンサール アヴェニュ ベル エール 44
Claims (6)
- 【請求項１】 興味あるポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ−配列を少なくとも２つ染色体上に有する形質転換し
た原核宿主細胞を製造するための方法において、興味あ
るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をすでに少なく
とも１つその染色体ＤＮＡ中に有する原核細胞を、主に ａ） 興味あるポリペプチドの発現及び場合により分泌
のために必要な配列をも含めて、興味あるポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ−フラグメン
ト、及び ｂ） 選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ−配列を
有する少なくとも１つのＤＮＡ−フラグメントからな
り、かつ宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ宿主細
胞中で自己複製の能力を有するＤＮＡ配列を有さない、
環状ＤＮＡで形質転換し、引き続き使用した環状ＤＮＡ
を少なくとも１つ染色体に組込んだ細胞を選択可能なマ
ーカーを用いて選択し、かつこのように形質転換した細
胞を単離することを特徴とする形質転換した原核宿主細
胞の製法。 - 【請求項２】 宿主細胞としてバチルス種、有利にバチ
ルス・アルカロフィルス又はバチルス・リヒェニルホル
ミスを使用する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 フラグメントａ）中の興味あるポリペプ
チドをコードするＤＮＡ−配列がプロテアーゼ、有利に
アルカリ性プロテアーゼをコードする請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 フラグメントａ）中の興味あるポリペプ
チドをコードするＤＮＡ−配列がアミラーゼ、有利にα
−アミラーゼをコードする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 フラグメントｂ）中の選択可能なマーカ
ーとして抗生物質に対する耐性をコードするＤＮＡ−配
列を使用する請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 フラグメントｂ）中の選択可能なマーカ
ーとして抗生物質フレオマイシンに対する耐性をコード
するＤＮＡ−配列を使用する請求項５記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4216246A DE4216246A1 (de) | 1992-05-16 | 1992-05-16 | Einfaches Verfahren zur stabilen chromosomalen Genamplifikation |
| DE4216246.7 | 1992-05-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303986A true JPH06303986A (ja) | 1994-11-01 |
Family
ID=6459063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5112830A Pending JPH06303986A (ja) | 1992-05-16 | 1993-05-14 | 形質転換した原核宿主細胞の製法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0570787A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06303986A (ja) |
| KR (1) | KR930023461A (ja) |
| BR (1) | BR9301900A (ja) |
| CA (1) | CA2096284A1 (ja) |
| DE (1) | DE4216246A1 (ja) |
| FI (1) | FI932215A (ja) |
| MX (1) | MX9302822A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1002109A1 (en) * | 1997-07-03 | 2000-05-24 | Novo Nordisk A/S | Protein producing cell containing multiple copies of a desired gene and a screenable marker but no selection marker |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR82200B (ja) * | 1983-07-06 | 1984-12-13 | Gist Brocades Nv | |
| FR2563533B1 (fr) * | 1984-04-27 | 1986-08-22 | Centre Nat Rech Scient | Procede d'amplification de l'expression d'un gene determine chez bacillus subtilis et souches obtenues |
| FR2569723B1 (fr) * | 1984-08-31 | 1986-09-19 | Centre Nat Rech Scient | Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique |
| AU620326B2 (en) * | 1987-02-27 | 1992-02-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms |
-
1992
- 1992-05-16 DE DE4216246A patent/DE4216246A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-05-06 KR KR1019930007771A patent/KR930023461A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-05-08 EP EP9393107517A patent/EP0570787A3/de not_active Withdrawn
- 1993-05-14 JP JP5112830A patent/JPH06303986A/ja active Pending
- 1993-05-14 CA CA002096284A patent/CA2096284A1/en not_active Abandoned
- 1993-05-14 FI FI932215A patent/FI932215A/fi unknown
- 1993-05-14 BR BR9301900A patent/BR9301900A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-05-14 MX MX9302822A patent/MX9302822A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI932215A (fi) | 1993-11-17 |
| DE4216246A1 (de) | 1993-11-18 |
| FI932215A0 (fi) | 1993-05-14 |
| EP0570787A2 (de) | 1993-11-24 |
| CA2096284A1 (en) | 1993-11-17 |
| KR930023461A (ko) | 1993-12-18 |
| EP0570787A3 (en) | 1994-08-17 |
| MX9302822A (es) | 1993-11-01 |
| BR9301900A (pt) | 1993-11-23 |
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