JPH06293651A - Ｈｉｖ感染予防剤、ａｉｄｓ発症防止剤及びａｉｄｓ治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ４６ＮＷ−０４Ａ物質を有効成分として含有
するＨＩＶ感染予防剤；４６ＮＷ−０４Ａ物質を有効成
分として含有するＡＩＤＳ発症防止剤及びＡＩＤＳ治療
剤。 【効果】 安全性が高く、優れたＨＩＶ─１感染予防効
果、ＡＩＤＳ発症防止効果及びＡＩＤＳ治療効果を有す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、４６ＮＷ−０４Ａ物質
を有効成分として含有するＨＩＶ感染予防剤、ＡＩＤＳ
発症防止剤及びＡＩＤＳ治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、
ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency viru
s；ＨＩＶ）の感染により生体の免疫機能が阻害され、
発症してくる症候群である。ＨＩＶに感染して免疫不全
症状が出るには数年から１０年以上の潜伏期間がある。
この時期は無症候性キャリア（Asymptomatic Carrier;A
C)といわれる状態で免疫能は保たれている。しかし、こ
の時期においても、ＡＩＤＳにおける最も特徴的な変化
といえるＣＤ４陽性のヘルパー／インデューサー機能を
もつＴ細胞数の低下がみられる。ＣＤ４陽性細胞の低下
はその後も進行し、全身性リンパ節腫脹（Progressive
Generalized Lymphadenopathy; PGL）の症状を時には呈
し、免疫能低下に関連した症状を呈するようになる。こ
の時期は、ＣＤ４陽性細胞がおよそ２００個／μl だ
が、広範囲の帯状疱疹や結核病変の再燃、カンジダ性口
内炎や消化管カンジダ症などを合併してくる。また、原
因不明の発熱が続いたり、急激な体重減少や下痢なども
みられ、これらはＡＩＤＳ関連症候群（ＡＩＤＳ Relat
ed Complex ; ARC）と呼ばれる。さらにＣＤ４陽性細胞
数が低下すると、カリニ肺炎やクリプトコッカス髄膜
炎、サイトメガロ肺炎、網膜炎などの日和見感染症が関
連した悪性リンパ腫，病態はいまだ不明だが、ＨＩＶ脳
症（ＡＩＤＳ Dementia Complex ）などの重篤な症状を
呈し、多くは数か月から１年で死亡する。ＨＩＶとして
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２などが見出されている。現在、
世界中でＨＩＶ感染・ＡＩＤＳ発症が増加傾向にあり、
効果的な治療法は現在のところ見いだされておらず、感
染予防、発症防止、治療の観点から効果的薬剤の探究が
精力的に進められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、効力
のあるＨＩＶ感染予防剤、ＡＩＤＳ発症防止剤及びＡＩ
ＤＳ治療剤を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、４６ＮＷ
−０４Ａ物質が、全く意外にもＨＩＶ感染予防効果を奏
することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、４６ＮＷ−０４Ａ物質を有効成分とする
ＨＩＶ感染予防剤、ＡＩＤＳ発症防止剤及びＡＩＤＳ治
療剤に関する。本発明に用いられる４６ＮＷ−０４Ａ物
質は、下記の物理化学的性質を有している。 (a) 分子量：１１２６（ＳＩ−マススペクトルによる） (b) 元素分析（実測値）：炭素 56.98％，水素 8.49
％，窒素 11.0 ％ (c) 紫外線吸収スペクトル：図１に示す。 (d) 赤外線吸収スペクトル：図２に示す。 (e) 水素核磁気共鳴スペクトル：図３に示す。 (f) 炭素核磁気共鳴スペクトル：図４に示す。 (g) シリカゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値： 0.３２（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３：
１） 0.５１（展開溶媒 酢酸エチル：メタノール＝１：１） (h) 溶媒に対する溶解性： メタノール、エタノール、アセトンに易溶 水に不溶 (i) 呈色反応： 陽性 ブロモクレゾールグリーン、ジニトロフェニールヒドラ
ジン、ドラーゲンドルフ、８−ヒドロキシキノリン−Ｎ
Ｈ₃ 、アニスアルデヒドの各試薬 陰性 過マンガン酸カリウム、アンスロン、バートン、酢酸
銅、リーガル、モーリシュ、ニンヒドリン、ローダミン
の各試薬

【０００５】本発明に用いられる４６ＮＷ−０４Ａ物質
は、シュードモナス sp.４６ＮＷ−０４株（微工研寄託
菌ＦＥＲＭ Ｐ−９５７９）より得られる物質であり、
魚類病原ウイルスに対する抗ウイルス活性を有すること
が知られている（特開平１−９５７９２号公報）。しか
しながら、４６ＮＷ−０４Ａ物質がＨＩＶ感染予防効
果、ＡＩＤＳ発症防止効果及び治療効果を有すること
は、従来全く知られていなかった。４６ＮＷ−０４Ａ物
質は、特開平１−９５７９２号公報に記載された方法に
従って、シュードモナス sp.４６ＮＷ−０４株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−９５７９）を培養し、培養物から４６ＮＷ−０
４Ａ物質を採取することにより製造される。なお、ここ
で当該細菌の培養は、通常のシュードモナス菌の培養条
件により、数時間から数日間、静置、振盪または攪拌培
養するのが好ましい。４６ＮＷ−０４Ａ物質の培養液中
からの分離・精製は次のようにして行うことができる。
培養液に酢酸エチルを添加して攪拌し、酢酸エチル層を
集めて減圧濃縮後、シリカゲル等に吸着させ、クロロホ
ルム：メタノール（９：１）からクロロホルム：メタノ
ール（１：１）で溶出し、シリカゲルＴＬＣのＲｆ値
０．３２（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３：
１）の分画を得る。当該分画を減圧濃縮しシリカゲルＴ
ＬＣによる精製を数回繰り返し４６ＮＷ−０４Ａ物質を
得ることができる。このようにして得られる４６ＮＷ−
０４Ａ物質は、優れたＨＩＶ感染予防効果を有し、かつ
極めて毒性が低いのでＨＩＶ感染予防剤、ＡＩＤＳの発
症防止剤及びＡＩＤＳ治療剤の有効成分として有用であ
る。

【０００６】本発明のＨＩＶ感染予防剤、ＡＩＤＳの発
症防止剤及び治療剤は、経口的または非経口的に投与す
ることができる。経口投与剤としては、通常散剤、錠
剤、乳剤、カプセル剤、液剤などの形態が挙げられる。
これらの経口投与剤は有効成分の他に、乳糖、澱粉、デ
キストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ
酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウムといった賦
形剤、補助剤、添加剤などの製剤添加物を含んでもよ
い。また非経口投与剤としては、注射剤などの形態が挙
げられ、注射剤の場合には無菌性の水性または非水性の
溶剤、懸濁剤、乳濁剤などを含む。水性の溶剤、懸濁剤
としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が挙げら
れる。非水性の溶剤、懸濁剤としては、例えばプロピレ
ングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の
ような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリ
ソルベート80（登録商標）などが挙げられる。さらに乳
化剤、分散剤のような補助剤を含んでもよい。これら
は、例えばバクテリア保留フィルターによる濾過または
Ｘ線照射によって無菌化される。また、無菌の固体組成
物を製造した後、使用前に無菌水または無菌の注射用溶
媒に溶解して使用することもできる。上記の各製剤は常
法に従って製造することができる。本発明のＨＩＶ感染
予防剤、ＡＩＤＳの発症防止剤及び治療剤の投与量は、
投与方法、患者の年齢、体重、状態及び疾患の種類によ
って異なるが、通常、経口投与としては一日当たり１０
〜３００mg、好ましくは５０〜２００mg、非経口投与と
しては一日当たり５〜２００mg、好ましくは１０〜１５
０mgであり、これを１〜５回に分割して投与すればよ
い。

【０００７】

【実施例】以下、製造例、製剤例及び試験例によって本
発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を越
えない限り下記例の記載に限定されるものではない。 製造例 （４６ＮＷ−０４Ａ物質の製造）シュードモナス sp.４
６ＮＷ−０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−９５７９）をＣＹＧ液
体培地（カザミノ酸（Difco 社製）0.５％、酵母エキス
（Difco 社製）0.０５％、グルコース0.１％、NaCl 0.
６８％、KCl 0.０４％，MgSO₄ ・7H₂O 0.０２％，CaCl・2
H₂O を含む培地 pH 7.2）１００ml／５００ml容フラス
コに接種し、２５℃で２日間１６０×ｇで振とう培養し
た。培養液２５mlずつを４本の５リットル容三角フラス
コ中のＣＹＧ液体培地2.５リットルに接種し、２５℃で
２日間１６０×ｇで振とう培養した。得られた培養上清
液１０リットルを同量の酢酸エチルで２回抽出した。２
０リットルの酢酸エチル層を２リットルまで濃縮し、無
水硫酸ナトリウムで脱水後、褐色の粗抽出物1.３ｇを得
た。同じ操作を３回行い計３０リットルの培養液から3.
８ｇの油状粗抽出物を得、これを少量のメタノール−ク
ロロホルムに溶解させ、シリカゲル（キーゼゲル６０，
メルク社製）を充填したカラム（５０mm×１５０mm）上
に得た。クロロホルム，クロロホルム：メタノール
（９：１）から順次（１：１）に極性を上げながら溶出
させた。活性画分を濃縮後、少量のメタノール−クロロ
ホルム混液に溶解させ、展開溶媒をクロロホルム，クロ
ロホルム：メタノール（９：１）から同（７：１）、
（５：１）に順次極性を高めながらＴＬＣ（キーゼルゲ
ル６０Ｆ２５４，メルク社製）を行った。ＴＬＣを５回
行い最終的に８００mgの精製４６ＮＷ−０４Ａを白色粉
末として得た。

【０００８】製剤例１ （腸溶性顆粒剤） ４６ＮＷ−０４Ａ物質 ２ｇ 乳糖 ３２ｇ トウモロコシ澱粉 １２ｇ 結晶セルロース ３ｇ 上記成分を均一に混合し、7.５％ヒドロキシプロピルセ
ルロース水溶液２０mlを加え、押出し造粒機により直径
0.５mmスクリーンを用いて顆粒とし、直ちにマルメライ
ザーにより丸めた後、乾燥した。この乾燥顆粒に下記組
成のフィルムコーティング液１９０ｇを流動造粒機を用
いてコーティングし、腸溶性顆粒剤とした。コーティン
グ液の組成は下記のとおりである。 コーティング液組成： ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート 5.０ （Ｗ／Ｗ）％ ステアリン酸 0.２５（Ｗ／Ｗ）％ 塩化メチレン ５0.０ （Ｗ／Ｗ）％ エタノール ４4.７５（Ｗ／Ｗ）％

【０００９】製剤例２ （注射剤）４６ＮＷ−０４Ａ物質 ２５ｍｇを８０ V/V
％アルコール１2.５mlに溶かし、プロピレングリコール
４０ml、クエン酸７５ｍｇ及びリン酸一水素ナトリウム
0.４５ｇを含む水溶液を加え、水で１００mlとしてアン
プルに分注し、注射剤とした。

【００１０】試験例１ 宿主細胞としてＭ１０細胞（human T cell leukemia vi
rus type I：HTLV-Iで形質転換したヒトＴ細胞株である
MT-4細胞（東京医科歯科大学医学部微生物学研究室山本
直樹博士より分与）からサブクローニングしたHIV-1 高
感受性細胞株：Ikuta K. et al., Jpn. J. Cancer Res.
(Gann) 79, 418-423 (1988)）を使用した。ＨＩＶ−１
は、感染性ＨＩＶ−１粒子産生性ＤＮＡクローンpNL432
（京都大学ウイルス研究所足立昭夫博士より分与；Adac
hi A. et al., Journal of Vivology, Vol 59, p284-29
1(1986））をヒト結腸癌細胞SW-480株（京都大学ウイル
ス研究所足立昭夫博士より分与；Adachi A. et al., J.
Vivology, 61 , 209-213(1987)）にトランスフェクシ
ョン（transfection）し、その細胞培養液中に放出され
たＨＩＶ−１粒子を、下記に示すウイルス定量後、使用
した。ウイルス定量は、５×10⁵ 個のＭ１０細胞に、各
１０倍毎に段階希釈した上記ウイルス液を加え、３７℃
で５％CO₂ を含むインキュベーター中で培養した。４日
後、ＨＩＶ−１抗体陽性患者血清を用いた間接蛍光抗体
法（Indirect immunofluorescence test:IF test；Kish
i M. et al., J. General Vivology, 73, 77-87(1992)
）で、ＨＩＶ−１抗原陽性細胞がどの段階の希釈ウイ
ルスによる感染まで認められたを調べ、TCID₅₀／mlを求
めた。本試験で得られたＨＩＶ−１力価は１×10^4.5TCI
D₅₀ ／mlであり、このウイルス液を１０％の胎児仔牛血
清（FCS ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＣＭと
略す）で希釈し１×10^3.8TCID₅₀ ／mlとし、５０μｌを
各実験系に加えた。４６ＮＷ−０４Ａ物質は、１％DMSO
（ジメチルスルホキシド）を含むＣＭで２０、１０、５
及び2.５μｇ／５０μｌに調整し各試験に用いた。

【００１１】ＨＩＶ−１感染阻止試験：９６ウエルマイ
クロプレートの各ウエル（well）に１×10⁶ 個のＭ１０
細胞含有ＣＭを１００μｌ分注し、１×10^3.8TCID₅₀ ／
mlに調整されたＨＩＶ−１液５０μｌをそれぞれ加えた
後、各濃度の４６ＮＷ−０４Ａ物質を含む液（各ウエル
における最終濃度は、それぞれ１００、５０、２５、１
2.５μｇ／mlとなる）をそれぞれ加えた。さらに、下記
表１中に示すように対照群を設けた。当該９６ウエルマ
イクロプレートを３７℃で５％CO₂ インキュベーター中
で１時間培養した後、ＣＭ１mlで２回洗浄し、ＣＭ２０
０μｌ中で細胞を懸濁させ（細胞密度：５×10⁵cells/m
l ）、３７℃で５％CO₂ インキュベーター中で培養し、
４日毎にトリパンブルー染色法で生細胞数を計測後、生
細胞数で５×10⁵cells/ml となるように細胞密度をＣＭ
で希釈することによって調整した。また、４日毎の細胞
について、ＨＩＶ−１抗原発現を上記の間接蛍光抗体法
で調べた。各ウエルにおける感染多重度（multiplicity
of infection;m.o.i.）は、約0.００３であった。結果
を下記表１に示す。

【００１２】

【表１】 ─────────────────────────────────── 生細胞数（cells /ml) HIV-1 抗原陽性率(%) 群 ４日 ８日 12日 ４日 ８日 12日 ─────────────────────────────────── 投与群 100μg/ml 1.50x10⁶ 1.50x10⁶ 1.60x10⁶ 0 0 0 50 μg/ml 1.20x10⁶ 1.40x10⁶ 1.40x10⁶ 0 0 0 25 μg/ml 1.10x10⁶ 5x10⁴ died 10 100 100 12.5 μg/ml 1.30x10⁶ died NT^*1 10 100 NT^*1 ─────────────────────────────────── 対照群 HIV-1(+) 1.10x10⁶ died NT^*1 10 100 NT^*1 1%DMSO 含有CM HIV-1(-) 1.80x10⁶ 1.10x10⁶ 1.80x10⁶ 0 0 0 1%DMSO 含有CM HIV-1(-) 1.30x10⁶ 1.50x10⁶ 1.90x10⁶ 0 0 0 CM のみ HIV-1(-) 1.00x10⁶ 1.30x10⁶ 1.40x10⁶ 0 0 0 100μg/ml^*2 ─────────────────────────────────── *1 測定せず（Not Tested) *2 46NW-04A 100μg/ml投与

【００１３】Ｍ１０細胞にＨＩＶ−１を感染した結果、
ＨＩＶ−１抗原（主にＧａｇ及びＥｎｖ抗原）の発現
は、感染後４日で１０％の細胞で、感染後８日ではすべ
ての細胞で認められた。また、生細胞数は、感染後４日
（1.10×10⁶ cells/ml）では、コントロールである非感
染細胞数（1.30×10⁶ cells/ml）との間に有意の差は認
められなかったが、感染後８日までには全ての細胞がＨ
ＩＶ−１の持つ細胞障害性で死滅した。本発明の４６Ｎ
Ｗ−０４Ａ物質の投与１００μｇ／mlあるいは５０μｇ
／mlの群では、感染後１２日が経過してもＨＩＶ−１抗
原の発現はＩＦ test で検出限界以下であり、また、生
細胞数も感染後１２日まで非感染細胞数と同レベルであ
り、細胞増殖性は保たれていた。以上の結果より、Ｍ１
０細胞に対するＨＩＶ−１の感染が阻止されていること
が明らかになった。

【００１４】試験例２ 宿主細胞としてＭ10細胞を使用した。ＨＩＶ−１とし
て、MOLT-4細胞（Minowada J. et al., Journal of Nat
ionalCancer Institute, 49, 891-895 (1972)；東京医
科歯科大学医学部微生物学研究室山本直樹博士より分
与）にＬＡＩ（大阪大学微生物病研究所感染病理学部門
栗村敬博士より分与）を感染させ、その培養上清中に放
出されたウイルスを用い、当該ウイルスの力価は、Ｍ10
細胞に感染後、ＨＩＶ−１抗体陽性者血清を一次抗体、
FITC-conjugated 抗ヒトＩｇＧ抗体を二次抗体に用いた
間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）でウイルス抗原発現を検出し
た系で１×10^7.5TCID₅₀ ／mlであった。このウイルス原
液を１％ DMSO を含むＣＭで 100倍から100000倍まで各
10倍希釈し、その各100 μl を本実験に用いた。４６Ｎ
Ｗ−０４Ａ物質は、１％DMSOを含むＣＭを希釈溶媒とし
て５及び2.５μｇ／５０μｌに調整し各試験に用いた。
一濃度のウイルス液及び試薬に対して９６ウエルマイク
ロプレートを４ウエル用い、感染後５日目に、上記同様
の間接蛍光抗体法でＨＩＶ−１抗原発現を調べ、１ウエ
ルに１個でも抗原発現細胞があれば陽性として、４６Ｎ
Ｗ−０４Ａ物質存在下でどれだけ感染率が低下するか検
討した。

【００１５】感染阻害実験 ９６ウエルマイクロプレートの各ウエル（well）に５×
10⁴ 個のＭ10細胞を１％DMSO含有ＣＭ５０μｌに懸濁分
注し、100 倍希釈、1000倍希釈、10000 倍希釈及び1000
00倍希釈に調整されたウイルス溶液１００μｌをそれぞ
れ加えた後(m.o.i. は各々、0.64、0.064 、0.0064及び
0.00064 である) 、４６ＮＷ−０４Ａ物質を含む液（各
ウエルにおける最終濃度は、それぞれ２５μｇ／mlとな
る、またコントロールとして４６ＮＷ−０４Ａ物質無添
加群を置く）を５０μｌそれぞれ加える。当該９６ウエ
ルマイクロプレートを３７℃で５％CO₂ インキュベータ
ー中で５日間培養した後、上記の測定法にて、ＨＩＶ−
１抗原発現率を測定した。その結果を下記表２に示す。

【００１６】

【表２】 ＨＩＶ−１抗原発現率（％） ──────────────────────────────────── ウイルスの希釈倍率 100 1000 10000 100000 25μg/ml投与群 ＃１ 50 <1 0 0 ＃２ 0 0 0 0 ＃３ <1 <0.1 0 0 ＃４ <1 0 0 0 ──────────────────────────────────── 無投与群 ＃１ 100 80 5 <0.01 ＃２ 100 90 10 <0.01 ＃３ 100 90 5 <0.01 ＃４ 100 90 20 <0.01 ──────────────────────────────────── 注）＃１〜４は４ウエルそれぞれのＨＩＶ−１抗原発現
率（％）を示す。

【００１７】1000倍希釈したウイルス液５０μｌを、５
×10⁴ 個の細胞及び最終濃度２５μｇ／mlの４６ＮＷ−
０４Ａ物質を含む系１５０μｌに加え感染した時（m.o.
i.＝0.064 ）、４ウエルの内２つのウエルでHIV-1 抗原
の発現は検出されず、他の２ウエルで１％以下でHIV-1
抗原の発現が検出された。４６ＮＷ−０４Ａ物質非存在
下では、１×10^7.5TCID₅₀ ／mlであるＬＡＩの力価を、
４６ＮＷ−０４Ａ物質25μg/ml投与群では１×10⁵ TCID
₅₀／mlにまで低下させ、ＬＡＩのＭ10細胞への感染力を
約１／３２０低下させることができた。

【００１８】試験例３ 毒性試験 正常ＩＣＲ系マウス（雄、７週齢、１群３匹）を18時間
絶食した後、４６ＮＷ−０４Ａ物質１０mg/kg を0.5 ％
カルボキシメチルセルロース懸濁液として経口投与し
た。対照群には、0.5 ％カルボキシメチルセルロース溶
液のみを経口投与し、その後、14日間にわたり観察し
た。この間マウスに飼料と水を自由に与えて飼育した。
その結果、４６ＮＷ−０４Ａ物質投与群と対照群の体重
推移は同様で、何ら変化は見られなかった。

【００１９】寄託 本発明で使用する４６ＮＷ−０４Ａ物質を製造するため
に用いるシュードモナス sp.４６ＮＷ−０４株は、昭和
62年９月10日通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されて、微工研条寄第ＦＥＲＭ Ｐ−９５７９
号の受託番号を得ている。

【００２０】

【発明の効果】安全性が高く、優れたＨＩＶ─１感染予
防効果、ＡＩＤＳの発症防止効果及び治療剤効果を有す
る。

【００２１】

【図面の簡単な説明】

【図１】４６ＮＷ−０４Ａ物質の紫外線吸収スペクトル
である。

【図２】４６ＮＷ−０４Ａ物質の赤外線吸収スペクトル
である。

【図３】４６ＮＷ−０４Ａ物質の水素核磁気共鳴スペク
トルである。

【図４】４６ＮＷ−０４Ａ物質の炭素核磁気共鳴スペク
トルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近野 孝英 東京都中央区銀座７−10−１ サッポロビ ール株式会社内 (72)発明者 亀井 勇統 東京都中央区銀座７−10−１ サッポロビ ール株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ４６ＮＷ−０４Ａ物質を有効成分として
   含有するＨＩＶ感染予防剤。
2. 【請求項２】 ４６ＮＷ−０４Ａ物質を有効成分として
   含有するＡＩＤＳ発症防止剤またはＡＩＤＳ治療剤。