JPH06265542A - マウス腸管障害の診断方法 - Google Patents

マウス腸管障害の診断方法

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JPH06265542A
JPH06265542A JP21570792A JP21570792A JPH06265542A JP H06265542 A JPH06265542 A JP H06265542A JP 21570792 A JP21570792 A JP 21570792A JP 21570792 A JP21570792 A JP 21570792A JP H06265542 A JPH06265542 A JP H06265542A
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JP
Japan
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mouse
intestinal
asialo
affection
feces
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JP21570792A
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English (en)
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Koji Okada
康志 岡田
Satoshi Matsumoto
敏 松本
Yoshinori Umezaki
良則 梅崎
Ryuichiro Tanaka
隆一郎 田中
Hiromi Setoyama
裕美 瀬戸山
Hiroyuki Kitajima
博之 北島
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Yakult Honsha Co Ltd
Original Assignee
Yakult Honsha Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 糞便中の糖脂質成分を検出することによって
腸管障害を簡便且つ迅速に診断することを目標に、まず
実験動物のマウスの腸管障害の簡便且つ迅速な診断方法
を得る。 【構成】 マウス糞便中のアシアルGM1とフコシルア
シアルGM1の含量を測定し、前記アシアルGM1に対
する前記フコシルアシアルGM1の相対量の有意な増大
を指標とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、腸管の障害を検出して
治療する際に有効な腸管障害の診断方法に関するもので
ある。
【0002】
【従来の技術】昨今、食生活や生活様式の変化、各種ス
トレス要因の増加などから、大腸癌や胃腸障害などの疾
患が急増している。また、他の疾患治療のための各種薬
剤投与に伴い、腸管に異状や障害が引き起こされること
もある。これらの疾患や障害の原因や治療方法、治療薬
の開発等の研究においては、マウスを始めとする各種実
験動物の系が用いられている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、実験動
物の腸管の異状や障害の診断方法、特に簡便で迅速な診
断方法は確立されていない。一方、血液、尿、糞便は生
体より最も入手し易い材料であるが、血液や尿に比べて
糞便から得られる情報は十分に利用されていなかった。
特に、糞便には食物残渣、細菌、無機成分、脱落した腸
上皮細胞等消化管に関する情報が多く含まれているにも
かかわらず、このような糞便を用いた消化管障害の検出
を行う簡便、迅速且つ確実な診断方法はなかった。
【0004】本発明は、近年ヒトのガン診断に使われ、
腸管障害と密接に結びついているとされている糖脂質成
分に注目し、糞便中の該成分を検出することによって腸
管障害を簡便且つ迅速に診断することを目標に、まず実
験動物マウスの腸管障害の簡便且つ迅速な診断方法を得
ることを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項1に記載の発明に係るマウス腸管障害の診断
方法では、マウス糞便中のアシアロGM1とフコシルア
シアロGM1の含量を測定するものである。
【0006】また、請求項2に記載のマウス腸管障害の
診断方法では、請求項1に記載のマウス腸管障害の診断
方法において、前記アシアロGM1に対する前記フコシ
ルアシアロGM1の相対量の増大を指標とするものであ
る。
【0007】また、請求項3に記載の発明に係るマウス
腸管障害の診断方法では、前記請求項1に記載のマウス
腸管障害の診断方法において、前記アシアロGM1及び
フコシルアシアロGM1の含量の測定は、抗アシアロG
M1抗体および抗フコシルアシアロGM1抗体を用いた
薄層クロマトグラフィ免疫染色法によって行なうもので
ある。
【0008】
【作用】本発明は、マウス糞便中のアシアロGM1に対
するフコシルアシアロGM1の相対量の増大を指標とす
ることによってマウス腸管障害を検出するものである。
これは、腸管障害によって生じる腸上皮細胞の糖脂質成
分の変化に着目し、マウス糞便中の糖脂質のうちアシア
ロGM1(以下、GA1と記す)およびフコシルアシア
ロGM1(以下、FGA1と記す)の含有量を測定して
みたところ、正常マウスにおいてはFGA1がほとんど
検出されないのに対して薬物によって腸管粘膜の異常、
障害が誘導されるとFGA1が増大するという現象を見
出した結果、このマウス糞便中のアシアロGM1に対す
るフコシルアシアロGM1の相対量を薄層クロマトグラ
フィ(TLC)免疫染色法で検出することにより、マウ
スを傷つけることなく早期に且つ簡便にマウスの腸管障
害を診断する事を可能としたものである。
【0009】
【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。腸上皮
に障害を与えた場合、腸上皮細胞の糖脂質成分に変化が
生じることは明らかである。そこで、本実施例では、糞
便中の糖脂質成分の定量を行なうことによってマウス腸
粘膜の異状、障害の検出を試みた。
【0010】本実施例では、糖脂質成分の検出法として
以下に示すTLC免疫染色法を用いた(図1)。マウス
から採取した糞便をデシケーター中で乾燥し、重量を測
定した(1)のち、糞便の約5倍量のメターノールを加
えて均一化した。さらにクロロフォルムを前記メタノー
ルの倍量加え、十分に撹拌して脂質を抽出し、これをグ
ラスフィルタで濾過して抽出濾過液を得た(2)。
【0011】一定糞便重量(通常0.5mg)当たりの
抽出液をTLCプレート(ベーカー社:ガラス製)上に
スポットし(3)、クロロフォルム:メタノール:水
(60:40:8,v/v)の展開溶媒で1時間展開し
た。このクロマト板を乾燥後(5)、緩衝液A(1%オ
ブアルブミン,1%ポリブニールピロリドン,0.02
%NaN3 /PBS)にゆっくりと浸し、37℃で1時
間振盪した(6)。
【0012】緩衝液Aを除去(7)し、目的とする糖脂
質抗体を緩衝液B(3%ポリビニールピロリドン/PB
S)で適当に希釈した抗体液を加え、37℃で2時間振
盪した(8)。抗体液を除去した後、洗浄液(0.1%
ツィーン20/PBS)で十分洗浄し(9)、ペルオキ
シダーゼ標識抗ウサギIgG抗体を緩衝液Bで適当に希
釈したものを加え、37℃で1時間反応させた(1
0)。
【0013】液を除去して洗浄液で洗浄した(11)
後、反応基質液(0.3%4ークロロナフトール/メタ
ノール:200mM NaCl/50mMトリス緩衝液
pH7.4:3%H22 ,50:250:1)を加
え、室温で15〜30分反応させた(12)。
【0014】以上の操作で発色したTLCプレートを十
分に水洗いして乾燥させ(13)、直ちにポラロイドカ
メラで撮影し、500nmの波長においてデンシトメー
ターで定量した(14)。この方法においては、マウス
糞便は一粒有れば糖脂質の検出は十分可能である。ま
た、展開液は、目的とする脂質成分に応じて調整する。
また、用いるTLCプレートは、上記に示したものに限
るものではないがプレート上における抗原物質の分離度
がより良いものが好ましい。
【0015】なお、上記TLC免疫染色法の定量性を各
々異なる量のGA1を用いて検討した結果、20〜30
0ngの範囲で定量可能であることがわかった(図
2)。
【0016】実施例1 マウスを用いた実験において、腸上皮に機械的な障害を
与えた時や、蛋白合成阻害剤シクロヘキシミド(CH
X)を投与することによって腸上皮に障害を与えると、
腸上皮細胞の糖脂質成分が変化することは明らかであ
る。そこで、CHXを腹腔投与して腸管障害を誘導した
マウスの腸粘膜から糖脂質成分を抽出し、その経時的変
化を追ってみた。
【0017】その結果、図3に示されるように、投与後
10時間目からGA1からFGA1への一過性の変化が
観察された。ここでデンシトメトリーを行い定量化し
た。FGA1/GA1比の経時的変化を見ると、FGA
1/GA1比の上昇は投与後24時間で最大となり、そ
の後減少した。このとき、GA1からFGA1への変化
を触媒する酵素であるフコシルトランスフェラーゼ(F
T)の活性上昇がFGA1/GA1比の上昇より早く観
察され、投与後10時間で最大となりその後減少してい
る。
【0018】次に、3頭のマウス(CHXー1, CHXー2, CHXー
3 )にCHXを上記と同様に腹腔投与し、以後経時的に
糞便を各々採取し、TLC免疫染色法を用いてFGA1
/GA1比の変化を追ってみた。その結果、図4に示す
如く、いずれのマウスにおいても投与後10時間目から
FGA1/GA1比の上昇が観察され、2日後に最大と
なりその後減少していた。このFGA1/GA1比は、
前述の腸粘膜での場合に比較して約1日遅れで変化して
いた。これは、腸内容物の移動時間に対応していると考
えられる。
【0019】以上の結果から、腸粘膜において観察され
る糖脂質成分の変化を、糞便を用いたTLC免疫染色法
によって検出可能であることが明らかとなった。すなわ
ち、マウスにおいては、TLC免疫染色法を用いて糞便
中のGA1対するFGA1の相対量の増大を指標とする
ことによって腸管粘膜の異状、障害を検出することが可
能であることがわかった。
【0020】実施例2 そこで、マウスにおける抗生物質セフォペラソンで誘導
した実験下痢症について、マウス糞便中のGA1とFG
A1の相対的変化をTLC免疫染色法によって検出し、
腸管粘膜の異状、障害の診断を試みた。
【0021】5頭のマウス(No.1〜No.5)に各々セフォ
ペラゾンを1週間連続胃内投与し、各マウス毎に投与前
(b)、投与中4日目(d4)、投与(1週間)後1日
目(a1)、3日目(a3)、5日目(a5)、7日目
(a7)において糞便を採取し、各々TLC免疫染色法
でGA1及びFGA1について検出を行った。
【0022】各々の結果をコントロール(セフォペラゾ
ン投与しない)マウス)の場合と比較して図5に示し
た。No.3マウス以外のマウスにおいては、図中*印で示
すように投与後5日目(a5)以降に水様性便すなわち
下痢症状が観察され、その直後にFGA1/GA1比の
上昇が見られた。このように下痢症状が生じた時に糞便
中の糖脂質成分に変化が観察されたことから、腸粘膜に
何らかの異状が生じていると診断される。
【0023】実施例3 次に、マウスにおける抗癌剤5ーフロロウラシル投与に
よる日和見感染モデルについて、腸管粘膜の異状、障害
の診断を試みた。3頭のマウス(No.1〜No.3)に各々5
ーフロロウラシルを投与し、以後経時的に各々糞便を採
取してTLC免疫染色法によってGA1およびFGA1
の検出を行った。
【0024】図6にその結果を示したように、No.1〜N
o.3のいずれのマウスにおいても5ーフロロウラシル投
与後6日以降にFGA1/GA1比の上昇が見られた。
この時期は、腸内大腸菌の肝臓への移転が観察される時
期と一致していた。従って、このようなGA1からFG
A1への変化は腸管粘膜のバリヤー構造の崩壊を示して
いる可能性がある。
【0025】実施例4 前記の実施例2のセフォラベンゾンで誘導された実験下
痢においては、腸管粘膜の異状、障害が診断されたが、
下痢が生じた時に必ずしも腸粘膜の異状、障害が生じて
いるわけではない。従って、本発明の腸管障害検出の指
標となる糖脂質成分の変化は、腸管粘膜に異状、障害が
起こっている時にのみ検出されることが望ましい。そこ
で、本実施例では、腸管障害は生じていない下痢症状の
場合についてその糞便中のFGA1/GA1比の上昇が
TLC免疫染色法で検出されるかどうか検討した。
【0026】マウスに、浸透圧性の下剤であるラクツロ
ースを経口投与し、下痢が生じた時点から糞便を採取し
てTLC免疫染色を行った。その結果、FGA1/GA
1比の上昇は観察されなかった。このことから、腸管粘
膜に何らかの異状が生じた時にのみ糖脂質成分の変化が
起こっており、これを検出することによって腸管障害を
診断することが可能であると確認できた。
【0027】
【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、マウス糞
便中のアシアロGM1に対するフコシルアシアロGM1
の相対量をTLC免疫染色法で検出することにより、マ
ウスを傷つけることなく早期に且つ簡便にマウスの腸管
障害を診断する事を可能としたという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図1】糞便中の糖脂質成分のTLC免疫染色法による
分析の説明図である。
【図2】TLC免疫染色法の定量性を示す説明図であ
り、(a)は各々異なる量のGA1についてTLC免疫
染色を行った結果を説明する模式図、(b)は(a)の
TLCプレートをデンシトメーターで測定した結果を示
す線図である。
【図3】本発明の第1の実施例におけるマウスの腸管粘
膜のFGA1/GA1比とFT活性の経時的変化を示す
線図である。
【図4】本発明の第1の実施例における各マウス糞便中
のFGA1/GA1比の経時的変化を示す説明図であ
る。
【図5】本発明の第2の実施例における各マウス糞便中
のFGA1/GA1比の経時的変化を説明する模式図で
ある。
【図6】本発明の第3の実施例における各マウス糞便中
のFGA1/GA1比の経時的変化を説明する模式図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 隆一郎 東京都港区東新橋1丁目1番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 瀬戸山 裕美 東京都港区東新橋1丁目1番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 北島 博之 大阪府和泉市光明台1丁目8番9号

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 マウス糞便中のアシアロGM1とフコシ
    ルアシアロGM1の含量を測定することを特徴とするマ
    ウス腸管障害の診断方法。
  2. 【請求項2】前記アシアロGM1に対する前記フコシル
    アシアロGM1の相対量の増大を検出することを特徴と
    する請求項1に記載のマウス腸管障害の診断方法。
  3. 【請求項3】 前記アシアロGM1及びフコシルアシア
    ロGM1の含量の測定は、抗アシアロGM1抗体および
    抗フコシルアシアロGM1抗体を用いた薄層クロマトグ
    ラフィ免疫染色法によって行なうことを特徴とする請求
    項1に記載のマウス腸管障害の診断方法。
JP21570792A 1992-07-22 1992-07-22 マウス腸管障害の診断方法 Pending JPH06265542A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006284330A (ja) * 2005-03-31 2006-10-19 Gunma Univ アシアロgm1の免疫学的測定キット並びに抗アシアロgm1抗体の免疫学的測定キット
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