JPH06261779A - フルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法 - Google Patents
フルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法Info
- Publication number
- JPH06261779A JPH06261779A JP8410393A JP8410393A JPH06261779A JP H06261779 A JPH06261779 A JP H06261779A JP 8410393 A JP8410393 A JP 8410393A JP 8410393 A JP8410393 A JP 8410393A JP H06261779 A JPH06261779 A JP H06261779A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fructose
- fcp
- bisphosphate
- fbp
- diesterase
- Prior art date
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 フルクトース １，２−サイクリック，６−
ビスリン酸に、ジエステラーゼを反応させることを特徴
とするフルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法。 【効果】 容易に高収率のＦＢＰを製造することが可能
となる。
ビスリン酸に、ジエステラーゼを反応させることを特徴
とするフルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法。 【効果】 容易に高収率のＦＢＰを製造することが可能
となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フルクトース ２，６
−ビスリン酸（以下ＦＢＰと略記する）の製造法に関す
るものである。
−ビスリン酸（以下ＦＢＰと略記する）の製造法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】生体における糖代謝の調節には生化学的
な機序が多く知られている。たとえば、インスリンホル
モンによる調節や、別のホルモンであるグルカゴン、ア
ドレナリンによる調節、またはいわゆるセカンドメッセ
ンジャーと呼ばれるサイクリック アデノシン ５’−
モノリン酸による調節、さらにアデノシン ５’−モノ
リン酸（以下ＡＭＰと略記する）、アデノシン ５’−
トリリン酸（以下ＡＴＰと略記する）、クエン酸による
調節、および本発明に関するＦＢＰによる調節などが報
告されている。生体における糖代謝は解糖系と呼ばれる
一連の経路により行われるが、この経路においてはホス
ホフルクトキナーゼ（［Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１］、
以下ＰＦＫと略記する）と呼ばれる酵素が重要な調節因
子である。本発明に関するＦＢＰは、まさにこのＰＦＫ
を活性化する因子であり、このことにより、糖代謝の調
節をおこなっている。このように、ＦＢＰは糖代謝に関
する因子として非常に重要であることが、近年、確認さ
れている。
な機序が多く知られている。たとえば、インスリンホル
モンによる調節や、別のホルモンであるグルカゴン、ア
ドレナリンによる調節、またはいわゆるセカンドメッセ
ンジャーと呼ばれるサイクリック アデノシン ５’−
モノリン酸による調節、さらにアデノシン ５’−モノ
リン酸（以下ＡＭＰと略記する）、アデノシン ５’−
トリリン酸（以下ＡＴＰと略記する）、クエン酸による
調節、および本発明に関するＦＢＰによる調節などが報
告されている。生体における糖代謝は解糖系と呼ばれる
一連の経路により行われるが、この経路においてはホス
ホフルクトキナーゼ（［Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１］、
以下ＰＦＫと略記する）と呼ばれる酵素が重要な調節因
子である。本発明に関するＦＢＰは、まさにこのＰＦＫ
を活性化する因子であり、このことにより、糖代謝の調
節をおこなっている。このように、ＦＢＰは糖代謝に関
する因子として非常に重要であることが、近年、確認さ
れている。
【０００３】ＦＢＰの製造法としては、原料となるフル
クトース １，６−ジリン酸（以下ＦＤＰと略記する）
から、ジシクロヘキシルカルボジイミドを触媒として用
いてフルクトース １，２−サイクリック，６−ビスリ
ン酸（以下ＦＣＰと略記する）を得、さらに、このＦＣ
Ｐをアルカリで部分分解する方法（ファン・シャフチン
ゲン、ハーズ著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー誌、１１７巻、３１９頁（１９８１
年）、植田、古谷、シェリー著、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー誌、２５６巻、８６７９頁
（１９８１年）、および特開昭６０−１６１９９４な
ど）が知られている。ＦＢＰおよびＦＣＰの単離法とし
て、高収率で高純度な粉末として単離された例は、本発
明者らの調査によれば今までに見あたらない。この理由
は、ＦＢＰおよびＦＣＰが水溶液中で極めて不安定なこ
と、ＦＣＰからＦＢＰへの加水分解による変換が数％と
低く、かつこの工程で副成するＦＤＰとの分離が極めて
困難なことにあるものと考えられる。
クトース １，６−ジリン酸（以下ＦＤＰと略記する）
から、ジシクロヘキシルカルボジイミドを触媒として用
いてフルクトース １，２−サイクリック，６−ビスリ
ン酸（以下ＦＣＰと略記する）を得、さらに、このＦＣ
Ｐをアルカリで部分分解する方法（ファン・シャフチン
ゲン、ハーズ著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー誌、１１７巻、３１９頁（１９８１
年）、植田、古谷、シェリー著、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー誌、２５６巻、８６７９頁
（１９８１年）、および特開昭６０−１６１９９４な
ど）が知られている。ＦＢＰおよびＦＣＰの単離法とし
て、高収率で高純度な粉末として単離された例は、本発
明者らの調査によれば今までに見あたらない。この理由
は、ＦＢＰおよびＦＣＰが水溶液中で極めて不安定なこ
と、ＦＣＰからＦＢＰへの加水分解による変換が数％と
低く、かつこの工程で副成するＦＤＰとの分離が極めて
困難なことにあるものと考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、容易に高収
率でＦＢＰを製造する方法を提供することを目的とする
ものである。
率でＦＢＰを製造する方法を提供することを目的とする
ものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、このよう
な課題を解決するために鋭意研究を行ってきた結果、Ｆ
ＣＰに、ジエステラーゼを反応させることにより、ＦＢ
Ｐを大量かつ容易に製造する方法を見いだし、本発明を
完成した。すなわち本発明は、ＦＣＰに、ジエステラー
ゼを反応させることを特徴とするＦＢＰの製造方法を要
旨とするものである。
な課題を解決するために鋭意研究を行ってきた結果、Ｆ
ＣＰに、ジエステラーゼを反応させることにより、ＦＢ
Ｐを大量かつ容易に製造する方法を見いだし、本発明を
完成した。すなわち本発明は、ＦＣＰに、ジエステラー
ゼを反応させることを特徴とするＦＢＰの製造方法を要
旨とするものである。
【０００６】以下に、本発明を詳細に説明する。ＦＢＰ
は、近年動物組織中に微量物質として発見され、下記一
般式
は、近年動物組織中に微量物質として発見され、下記一
般式
【０００７】
【化１】
【０００８】で表される糖リン酸である。
【０００９】本発明のＦＣＰからＦＢＰを製造する方法
は、ＦＣＰにジエステラーゼを作用させて、ＦＣＰの１
位のエステル結合を加水分解することで開環し、ＦＢＰ
を合成するものである。この際、ＦＣＰにジエステラー
ゼを作用させるには、例えばＦＣＰを含有する水溶液中
で作用させる。
は、ＦＣＰにジエステラーゼを作用させて、ＦＣＰの１
位のエステル結合を加水分解することで開環し、ＦＢＰ
を合成するものである。この際、ＦＣＰにジエステラー
ゼを作用させるには、例えばＦＣＰを含有する水溶液中
で作用させる。
【００１０】本発明に用いるＦＣＰとしては、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを触媒としてＦＤＰから得られ
たものなど、公知の方法によって得られるものを用いる
ことができる。
ヘキシルカルボジイミドを触媒としてＦＤＰから得られ
たものなど、公知の方法によって得られるものを用いる
ことができる。
【００１１】原料として用いるＦＣＰの使用量に特に制
限はなく、生成量に応じて適宜必要量を決定すればよ
い。通常の反応では、ＦＣＰは、０．００１〜１０００
ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１００ｍｍｏｌ／
Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌを用い
る。
限はなく、生成量に応じて適宜必要量を決定すればよ
い。通常の反応では、ＦＣＰは、０．００１〜１０００
ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１００ｍｍｏｌ／
Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌを用い
る。
【００１２】本発明に用いられるジエステラーゼは、Ｆ
ＢＰ合成活性を有する限り、市販の酵素であっても、精
製された酵素であっても、部分精製された酵素であって
も、さらに微生物または組織そのもの、または破砕液で
あってもよく、また、酵素の由来についても制限はな
く、その例としては、ウシ心臓由来、ヘビ由来などであ
る。
ＢＰ合成活性を有する限り、市販の酵素であっても、精
製された酵素であっても、部分精製された酵素であって
も、さらに微生物または組織そのもの、または破砕液で
あってもよく、また、酵素の由来についても制限はな
く、その例としては、ウシ心臓由来、ヘビ由来などであ
る。
【００１３】市販のものとしてはＢＭＹ社製のNuclease
P1 ，Ribonuclease A，Deoxyribonuclease I （グレー
ドＩ），Phosphodiesterase （ウシ由来）やシグマ社製
のリボヌクレアーゼＡ，デオキシリボヌクレアーゼ（Ａ
ＴＰ依存型），ホスホジエステラーゼ２’：３’などが
あげられる。
P1 ，Ribonuclease A，Deoxyribonuclease I （グレー
ドＩ），Phosphodiesterase （ウシ由来）やシグマ社製
のリボヌクレアーゼＡ，デオキシリボヌクレアーゼ（Ａ
ＴＰ依存型），ホスホジエステラーゼ２’：３’などが
あげられる。
【００１４】さらに、酵素の使用量についても特に制限
はなく、その生成量に応じて適宜必要量を決定すればよ
い。通常の反応では、ジエステラーゼは、０．００１〜
１００００ユニット／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１
００ユニット／Ｌを用いる。
はなく、その生成量に応じて適宜必要量を決定すればよ
い。通常の反応では、ジエステラーゼは、０．００１〜
１００００ユニット／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜１
００ユニット／Ｌを用いる。
【００１５】反応をスムーズに進行させるために、マグ
ネシウム、マンガン、カルシウム等の２価の金属イオ
ン、カリウム、ナトリウム、リチウム等の１価の金属イ
オンを添加することもできる。これらの使用量について
は特に制限はなく、単独もしくは複数で用いることがで
き、その生成量に応じて適宜必要量を決定すればよい。
通常の反応では、２価の金属イオンでは、用いるＡＴＰ
の１倍当量から２倍当量が用いられる。また、１価の金
属イオンでは、触媒量から２価の金属イオンと同量が用
いられる。
ネシウム、マンガン、カルシウム等の２価の金属イオ
ン、カリウム、ナトリウム、リチウム等の１価の金属イ
オンを添加することもできる。これらの使用量について
は特に制限はなく、単独もしくは複数で用いることがで
き、その生成量に応じて適宜必要量を決定すればよい。
通常の反応では、２価の金属イオンでは、用いるＡＴＰ
の１倍当量から２倍当量が用いられる。また、１価の金
属イオンでは、触媒量から２価の金属イオンと同量が用
いられる。
【００１６】反応温度としては０〜８０℃が適当であ
り、好ましくは２０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜
５０℃であり、反応時間としては目的とするＦＢＰが得
られる時間であれば特に制限はないが、好ましくは２〜
３０時間である。
り、好ましくは２０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜
５０℃であり、反応時間としては目的とするＦＢＰが得
られる時間であれば特に制限はないが、好ましくは２〜
３０時間である。
【００１７】本発明の方法により得られたＦＢＰ含有液
からＦＢＰを精製するには、公知の方法によりおこなう
ことができ、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ陰イ
オン交換樹脂を用いたトリエチルアミン炭酸緩衝液によ
るイソクラティック溶出法やＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ陰イオン交換樹脂を用いたリン酸ナトリウム緩衝液
によるイソクラティック溶出法などがあげられる。
からＦＢＰを精製するには、公知の方法によりおこなう
ことができ、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ陰イ
オン交換樹脂を用いたトリエチルアミン炭酸緩衝液によ
るイソクラティック溶出法やＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ陰イオン交換樹脂を用いたリン酸ナトリウム緩衝液
によるイソクラティック溶出法などがあげられる。
【００１８】他の方法として、本発明の方法により得ら
れたＦＢＰ含有液に亜鉛塩を添加し、生じた沈澱を除去
した後、さらに亜鉛塩を加えてＦＢＰ亜鉛塩を沈澱させ
分取する方法などがあげられる。
れたＦＢＰ含有液に亜鉛塩を添加し、生じた沈澱を除去
した後、さらに亜鉛塩を加えてＦＢＰ亜鉛塩を沈澱させ
分取する方法などがあげられる。
【００１９】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。
する。
【００２０】実施例に用いた試薬類のうち、ＦＣＰは上
述した公知の方法に基づいて得られたもの、即ち、ピリ
ジン（石津製薬社製）中のＦＤＰにジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ナカライテスク社製）を作用させてＦＣ
Ｐとなし、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ陽イオン交換樹脂（ダウケ
ミカル社製）を用いて塩変換を行い、水酸化ナトリウム
水溶液を用いて、ナトリウム塩としたものを、乾燥させ
て得られた粉末を用いた。ジエステラーゼはＢＭＹ社製
のNuclease P1 を用いた。その他の試薬については総て
市販のものを用いた。
述した公知の方法に基づいて得られたもの、即ち、ピリ
ジン（石津製薬社製）中のＦＤＰにジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ナカライテスク社製）を作用させてＦＣ
Ｐとなし、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ陽イオン交換樹脂（ダウケ
ミカル社製）を用いて塩変換を行い、水酸化ナトリウム
水溶液を用いて、ナトリウム塩としたものを、乾燥させ
て得られた粉末を用いた。ジエステラーゼはＢＭＹ社製
のNuclease P1 を用いた。その他の試薬については総て
市販のものを用いた。
【００２１】ＦＢＰを含む糖類の検出は、ＬＣモジュー
ル１（ウオーターズ社製）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーシステムならびに４１０示差屈折計をもちいて
おこなった。分析用カラムはケムコパックＮＵＣＬＥＯ
ＳＩＬ（ケムコ社製、４．６×２５０ｍｍ）を用いた。
移動相は５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を０．５ｍＬ／
ｍｉｎで用いた。
ル１（ウオーターズ社製）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーシステムならびに４１０示差屈折計をもちいて
おこなった。分析用カラムはケムコパックＮＵＣＬＥＯ
ＳＩＬ（ケムコ社製、４．６×２５０ｍｍ）を用いた。
移動相は５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を０．５ｍＬ／
ｍｉｎで用いた。
【００２２】実施例１ ＦＣＰを１ｍｍｏｌ／Ｌを含む５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬ中に、ジエステ
ラーゼを２０ユニット／Ｌとなるように添加し、３７℃
で８時間の反応を行った。この実験の結果を図１に示し
た。図１から分かるように、ジエステラーゼを用いるこ
とで、ＦＣＰから直接ＦＢＰが効率よく合成されること
が示された。
ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬ中に、ジエステ
ラーゼを２０ユニット／Ｌとなるように添加し、３７℃
で８時間の反応を行った。この実験の結果を図１に示し
た。図１から分かるように、ジエステラーゼを用いるこ
とで、ＦＣＰから直接ＦＢＰが効率よく合成されること
が示された。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、容易に高収率のＦＢＰ
を製造することが可能となる。
を製造することが可能となる。
【図１】本発明のＦＢＰ合成反応の結果を示した図であ
る。
る。
Claims (1)
- 【請求項１】 フルクトース １，２−サイクリック，
６−ビスリン酸に、ジエステラーゼを反応させることを
特徴とするフルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8410393A JPH06261779A (ja) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | フルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法 |
| EP94104091A EP0616036B1 (en) | 1993-03-17 | 1994-03-16 | Process for producing fructose 2,6-disphosphate and purification process thereof |
| DE69419639T DE69419639T2 (de) | 1993-03-17 | 1994-03-16 | Verfahren zur Herstellung von Fructose-2,6-diphosphat und Reinigungsverfahren hierfür |
| US08/213,738 US5501965A (en) | 1993-03-17 | 1994-03-16 | Process for producing fructose 2,6-bisphosphate and purification process thereof |
| US08/562,739 US5968787A (en) | 1993-03-17 | 1995-11-27 | Process for producing fructose 2,6,-bisphosphate and purification process thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8410393A JPH06261779A (ja) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | フルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261779A true JPH06261779A (ja) | 1994-09-20 |
Family
ID=13821194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8410393A Pending JPH06261779A (ja) | 1993-03-17 | 1993-03-17 | フルクトース ２，６−ビスリン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06261779A (ja) |
-
1993
- 1993-03-17 JP JP8410393A patent/JPH06261779A/ja active Pending
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