JPH10513354A

JPH10513354A - ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖の保護基の完全除去法

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Publication number: JPH10513354A
Application number: JP8523954A
Authority: JP
Inventors: エールライン，ラインホルト; バイスヒ，ガブリエレ
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1996-02-01
Publication date: 1998-12-22
Also published as: AU4717296A; CA2211186A1; EP0801684A1; IL117018A0; ZA96921B; US5888777A; WO1996024683A1

Abstract

(57)【要約】ヒドロキシル保護基を酵素的除去する、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖の製造法およびヌクレオシドを、カルボニルビスアゾールで活性化させた糖−１−リン酸と反応させ、ヒドロキシル保護基を、酵素的除去する、これらの糖の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖の保護基の完全除去法本発明は、ヒドロキシル保護基を酵素的に除去する、ヌクレオチド二リン酸および三リン酸糖の製造法および、ヌクレオチドとカルボニルビスアゾールで活性化させた糖−１−リン酸を結合させ、次いでヒドロキシル保護基を酵素的に除去する、これらの糖の製造法に関する。エネルギー運搬体および構造単位としてのその重要性の他に、炭水化物は細胞間伝達および細胞間認識過程の情報担体としての重要な役割を担う。それらは、天然でポリ−、オリゴ−、ジ−またはモノ−サッカライドまたは糖抱合体、典型的に糖タンパク質、糖脂質および糖ステロイドとして得られる。オリゴサッカライドおよび糖抱合体は、化学的および酵素的方法の組み合わせにより最も有効に製造し得る。そこで使用される重要な酵素は、とりわけ、いわゆるＬeloir経路のグリコシルトランスフェラーゼである[Ｉchikawa et al.，Ａnal．Ｂiochem． 202:215-238(1992)]。該酵素は、結合すべきグリコシド結合に関する高い部位特異性および立体特性により区別される。酵素は、いわゆる活性化ヌクレオチド一リン酸および二リン酸糖(提供体)の糖ユニットを、各酵素により特異的ではあるが、広範囲の異なる受容基質に移す。提供体は、特に、これらの化合物を単純で、大規模および高収率で製造することが現在まで不可能であるため、このタイプのグリコシド合成を限定すると考えられる。一つの可能な化学合成は、非保護糖リン酸と例えば、モルホリン基により活性化されたヌクレオシドを反応させ、対応するヌクレオシド二リン酸糖とすることから成る[Ｇokhale et al.，Ｃan．Ｊ．Ｃhem．68:1063-1071(1990)]。このピロリン酸結合の結合は、吸湿性ヒドロキシル基のために、水に非常に感受性であり、非保護遊離体で行うことは困難である。更に、非保護遊離体が慣用の結合溶媒(ジメチルホルムアミド、ピリジン)にあまり溶解性でないため、長い反応時間が必要である[Ｌeon et al.，Ｓynthesis 689-691(1994)]。望ましくない副産物の形成に加えて、多くの非保護糖リン酸が不安定である。結果として、通常収 -2095(1981)；Ｇokhale et al.，Ｃan．Ｊ．Ｃhem．68:1063-1071(1990)]。保護試薬は、既知の過程では、所望の標的構造を維持しながら、結合段階後の保護基を完全に除去することが可能でないと考えられるため、現在まで使用されていない。従って、炭素原子２および３でＯ−ベンゾイル保護されているグアノシン二リン酸グルコースは、実質的分解で脱ベンゾイル化できるだけである。分解なしの保護基の完全な除去は、リン酸基を有しない非電荷糖原子の場合のみ可能である[ＷaldmannおよびＳebastian，Ｃhem．Ｒev．94:911-937(1994)]。例外は、その全てが塩基安定性ＮＨＡｃ置換基をヘキソースの炭素原子２に有し、炭素原子１でα−立体配置である、あるＯ−アシル−保護ウルジン二リン酸ヘキソースである。それらは、１Ｍ水酸化ナトリウムで化学的に脱アシル化し得る[Ｙamazaki et al.，Ｃarbohydr．Ｒes．79:C9-C12(1980)；Ｙamazaki et al.，Ｃan．Ｊ．Ｃhem．59:2247-2252(1981)；Ｔhomas et al.，Ｃarbohydr．Ｒes．184:77-85(1 988)]。可能な化学合成に加えて、特異的な天然に存在する提供体がまた多酵素システムを使用して製造できる。しかしながら、これらの酵素システムの非常な欠点は、それらが容易に入手可能ではなく、天然基質にのみ使用できることである[Ｈe idlas et al.，Ｊ．Ｏrg．Ｃhem．57:146-151(1992)]。驚くべきことに、ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖が、糖残基にＯ−アシル保護基を使用して、および、最終反応段階において、これらの保護基を特異的酵素の作用によって除去することにより、高い収率で合成できることが、本発明により判明した。従って、ピロリン酸架橋のためにヌクレオチドを糖リン酸に結合させるのに特に有用な、保護基を有する試薬を使用した重要な合成段階を行うことをまた最初に可能にした。結合は高い収率で行われ、結合生産物はまた容易に精製でき、安定であり、貯蔵できる。従って、糖モノマーから出発して、実質的に高く、産業規模での経済的製造をも可能にする全収率を得ることが可能である。態様の一つにおいて、本発明は、保護ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖から、式−Ｃ(Ｏ)Ｒの糖残基(式中、Ｒは直鎖または分枝鎖アルキル、好ましくはＣ₁−Ｃ₈アルキル、最も好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル、非置換フェニルまたはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁−Ｃ₄アルコキシ置換フェニルである)のヒドロキシル保護基の完全な除去による、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖の製造法に関し、本方法は、除去を酵素的に行うことを含む。ヒドロキシル保護基の説明的例は、式−Ｃ(Ｏ)Ｒ(式中、Ｒはメチル、エチル、ｎ−およびｉ−プロピル、ｎ−、ｉ−、ｓ−およびｔ−ブチルおよびペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチルの全ての可能な異性体、非置換フェニルまたは、メチル、エチル、ｎ−およびｉ−プロピル、ｎ−、ｉ−、ｓ−およびｔ− ブチル、メトキシ、エトキシ、ｎ−およびｉ−プロポキシ、ｎ−、ｉ−、ｓ−およびｔ−ブトキシからなる群から選択される１個から３個の異なるまたは同一の置換基で置換されているフェニル)である。置換フェニルの典型的例は、トルエン、ｏ−、ｍ−およびｐ−キシレン、シュードクモール、メシチレン、トリメチルベンゼン、エチルベンゼン、ジメチルプロピルベンゼンおよびクモール由来のものである。本発明の範囲内で、糖は糖モノマー、糖ダイマーの意味と理解され、糖ダイマーの場合、糖モノマーが他方にα−またはβ−(アノマー中心→ｎ)グリコシド結合的に結合し、ｎは１から９の数および用語(アノマー中心→ｎ)は２つの関係するモノマーのグリコシド結合の位置を示す。本発明の範囲内で、モノマー糖は、その構造が式(ＣＨ₂Ｏ)_m(式中、ｍは好ましくは３から９の整数)に従う化合物ならびにポリヒドロキシアルデヒド、ポリヒドロキシケトン、ポリヒドロキシ酸およびポリヒドロキシアミンおよびそれらの誘導体の全てを意味すると理解される。糖モノマーは、有機化学および生化学の標準の作業から既知である[例えば、Ｂeyer/Ｗalter，Ｌehrbuch der Ｏrganischen Ｃhemie，Ｓ．Ｈirzel Ｖerlag Ｓtuttgart，425-468(1991)；Ｌehninger，Ｂiochemistry 298-321(1993)；Ｋen nedyおよびＷhite，Ｋennedy(編)Ｃarbohydrate Ｃhemistry，Ｃlarendon Ｐres s，Ｏxford3-41(1988)]。説明的例は、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロースを含むＤ−およびＬ−アルドピラノースおよびＤ−およびＬ−アルドフラノースから成る群、典型的にリブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースを含むＤ−およびＬ−ケトピラノースおよびＤ−およびＬ−ケトフラノースからなる群ならびにＤ−およびＬ−ジケトピラノース、典型的にペントジウロースおよびヘキソジウロースからなる群から選択される糖モノマーである。 “糖モノマー”なる用語は、また引用した例の置換をされた糖モノマーも含む。当業者にとって、糖モノマーは、典型的にＤ−およびＬ−立体配置のデオキシ糖、好ましくはフコース、ロデオース、ラムノースおよびジキトキソースのような２−、３−、４−および６−デオキシアルドース、グルカル、ガラクタルおよびフカルのような１,２−ジデオキシアルドースおよび１−、３−、４−および６−デオキシケトース、Ｄ−およびＬ−立体配置の２−、３−、４−および６− デオキシアミノ糖、典型的にはグルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミンおよびフコサミン、Ｎ−アシルグルコサミン、Ｎ−アシルマンノサミン、Ｎ−アシルガラクトサミンおよびＮ−アシルフコサミンのようなデオキシアシルアミノ糖、好ましくはそれらのＣ₁−Ｃ₄アルキルエステルおよび２−、３−、４−および６−デオキシハロゲノ糖(ハロゲンは、好ましくはＦ、ＣｌまたはＢｒ)、典型的には２−フルオロフコース、および２−、３−、４−および６−デオキシスルフヒドリル糖ならびにこれらの置換基の独立した組み合わせを含む。糖モノマーは、グルコン酸またはグルクロン酸のようなアルドン酸、アルダン酸およびウロン酸ならびにＮ−アミド結合であり、ホスファチジルまたはポリオール置換基を有するアミノ酸担持糖モノマーを意味するとも理解される。置換糖モノマーはまた６炭素原子より長い炭素鎖を有するもの、典型的にはヘプトース、オクトース、ノノース、ヘプツロース、オクツロースおよびノヌロース、また前記の基準に従って置換された代表的なもの、例えば、ケトデオキシオクタン酸、ケトデオキシノナン酸、Ｎ−アシルノイラミン酸およびＮ−アシルムラミン酸を意味するとも理解される。本発明の範囲内の好ましい糖モノマーは、アラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、２−フルオロフコース、２−アミノフコースおよびローデオースである。本発明の範囲内で二量体糖は、２つの同一のまたは別の前記モノマーに由来するものを意味すると理解される。結合は好ましくはα−またはβ−Ｏ−グリコシドであるが、Ｓ−、Ｎ−およびＣ−グルコシド結合もまた可能である。結合に関与する一方の全ての炭素原子が適している。説明的例は、特に(１→２)−、(１ →３)−、(１→４)−、(１→５)−、(１→６)−、(２→３)−および(２→６)グリコシド結合である。二量体糖の典型的例は、トレハロース、ソフォロース、コジビオース、ラミナリボース、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチビオース、スクロースおよびラクトースからなる群から選択されるものである。本発明の範囲内で、ヌクレオシドは天然および非天然合成ヌクレオシドを意味すると理解される。合成ヌクレオシドは天然建築ブロックの修飾を含む。好適な修飾は、核塩基残基(典型的に置換、置換基の除去)およびフラノース環(典型的に２'−ヒドロキシル基における置換、フラノース−Ｏ−原子の置換、フラノース環のモノ−またはビカルバサイクリッル環による置換)における修飾である。特に好ましいヌクレオシドはグアノシン、キサントシ、イノシン、ウリジン、２'−デオキシ−２−アミノアデノシン、２'−デオキシ−５−メチルシチジン、２'−デオキシアデノシン、２'−デオキシシチジン、２'−デオキシグアノシおよびチミジンである。グアノシン、キサントシン、イノシンおよびウリジンは特に非常に好ましい。修飾建築ブロックは、好ましくはプリンおよびピリミジンの天然ヌクレオシド由来であり、特に好ましくはアデノシン、シチジン、グアノシン、２−アミノアデノシン、５−メチルシチジン、ウリジン由来のものおよび上記のデオキシ誘導体である。ヌクレオシドは２−'修飾リボヌクレオシドであり得る。保護ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖は、好ましくは式Ｉ〔式中、ｎは１または２；Ｘは酸素、硫黄または炭素原子；ＺはＮａ、Ｋ、ＬｉまたはＭｇ；Ｒ₆はＨまたはＣＨ₂Ｒ₇；Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₇は互いに独立してＨ、ハロゲン(好ましくはＦ、ＣｌまたはＢｒ)、ＳＨ、ＮＨ₂、ＮＨＲまたは −Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｒ基；Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、非置換フェニルもしくはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁−Ｃ₄アルコキシ置換フェニル、およびＨｅｔはプリンまたはピリミジン塩基〕で示される化合物であり、非保護二リン酸および三リン酸糖は好ましくは式II 〔式中、ｎ、Ｘ、ＺおよびＨｅｔは式Ｉで定義の意味；Ｒ₆'はＨまたはＣＨ₂Ｒ₇ '、Ｒ₂'、Ｒ₃'、Ｒ₄'およびＲ₇'は互いに独立してＨ、ハロゲン(好ましくはＦ、ＣｌまたはＢｒ)、ＳＨ、ＮＨ₂、ＮＨＲまたはＯＨ、Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ₁ −Ｃ₈アルキル、非置換またはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁−Ｃ₄アルコキシ置換フェニル〕で示される化合物である。Ｘは酸素または炭素原子、好ましくは酸素原子、ＺはＮａ、Ｋ、ＬｉまたはＭｇ、好ましくはＮａ、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆は互いに独立して−ＯＣ(Ｏ)−Ｒ基、Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ₁−Ｃ₄アルキルまたはフェニルおよびＨｅｔはプリンまたはピリミジン塩基である式Ｉで示される化合物が、特に有用であることが判明した。特に好ましい式Ｉで示される化合物は、Ｒがメチル、エチル、ｉ−またはｎ−プロピルであるものである。糖残基で保護されており、その保護基が同一であるヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖を使用することが好ましい。本発明の範囲内の好ましいヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖は、グアノシン二リン酸フコース、キサントシン二リン酸フコース、イノシン二リン酸フコース、グアノシン二リン酸−２−フルオロフコース、グアノシン二リン酸−β− Ｌ−２−アミノフコース、グアノシン三リン酸フコース、グアノシン二リン酸− Ｄ−アラビノース、グアノシン二リン酸−β−Ｌ−ガラクトース、ウリジン二リン酸ガラクトース、グアノシン二リン酸−β−Ｌ−グルコース、グアノシン二リン酸−α−Ｄ−マンノースおよびグアノシン二リン酸−β−Ｄ−ローデオースである。新規方法は可溶性または固定化酵素で行うことが出来る。酵素の選択は保護基のタイプおよび糖の立体配置に依存する。機能的に均一の酵素または酵素混合物で作業することが有用であることが判明した。保護基が−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₃基である場合、保護基をアセチルエステラーゼで除去する。保護基が−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₂ＣＨ₃基である場合、保護基をアセチルエステラーゼ、リパーゼまたはこれら二つの酵素の混合物で除去する。−Ｃ(Ｏ)−Ｃ₃ −Ｃ₈アルキルおよび非置換または置換−Ｃ(Ｏ)−フェニルを除去する場合、リパーゼの使用が好ましい。酵素は天然源、例えば動物、微生物または植物由来であり得るが、遺伝子工学由来でもあり得る。商品として入手可能な酵素、典型的に、オレンジの皮由来のアセチルエステラーゼ(EC3.1.1.6)のような植物酵素は特に簡便である。反応は緩衝液存在下で行い得るが、驚くべきことに、その非存在下でも行い得る。緩衝液が存在する場合、簡便には電解性緩衝液、典型的にはＮａＣｌ、ＭｇＨＰＯ₄、２−モルホリノエタンスルホン酸−水和物−ＮａＯＨ、Ｎ−(２−アセトアミノ)−２−アミノエタンスルホン酸−ＮａＯＨ−ＮａＣｌ、３−モルホリノプロパンスルホン酸−ＮａＯＨ−ＮａＣｌ、Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−２−アミノエタンスルホン酸−ＮａＯＨ−ＮａＣｌ、４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−エタンスルホン酸−ＮａＯＨ−ＮａＣｌおよびイミダゾール−ＨＣｌ−ＮａＣｌである。反応は好ましくは室温から４０℃の温度範囲、好ましくは３７℃で行う。ｐＨは簡便にはｐＨ６.５からｐＨ７.５の範囲、好ましくはｐＨ７であり、例えば、ｐＨプローブおよび自動計量ユニットの助けにより有効に自動的に一定に保つ。更に、緩衝液、温度およびｐＨの選択は使用する各酵素および反応する基質により決定され、特別の場合には、予め指示されている領域から外れることがある。本発明はまた、保護ヌクレオシド二リン酸または三リン酸から、式−Ｃ(Ｏ)− Ｒ(Ｒは直鎖または分枝鎖アルキル、好ましくはＣ₁−Ｃ₈アルキル−、最も好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキル、非置換フェニルまたはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁ −Ｃ₄アルコキシ置換フェニル)のヒドロキシル保護基を完全に除去することによるヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖の製造法にも関し、本方法は緩衝液非存在下での酵素的除去の実行を含む。生産物は、保護基を除去した後、容易に精製できる。保護基を緩衝液存在下で除去した場合、クロマトグラフ法が特に適している。生産物はゲル浸透クロマトグラフィー、典型的に、Ｓephadex(登録商標)カラム、例えば、Ｂiogel P-2で脱塩し、次いでグリコシルトランスフェラーゼ存在下、グリコシル受容体と直接反応させ得る。酵素的保護基除去を緩衝液非存在下で行う場合、非保護生産物を適当な沈殿剤、典型的にはエタノールまたはエタノール／イソプロパノールまたはエタノール／アセトンの混合物と共に沈殿させることにより精製し得る。新規方法に従って得られる収率は実質的に増加している。現在まで、例えば、グアノシン二リン酸−β−Ｌ−フコースの製造のための有効な準備のための多酵素システムを得ることは不可能であり［Ｙamamoto et al.，Ａgric．Ｂiol．Ｃh em．48:823-824(1984)；ＳtillerおよびＴhiem，Ｌiebigs Ａnn．Ｃhem．467-47 1(1992)]、ヌクレオシド二リン酸糖はまだ化学合成しなければならなかった。Ｌ −フコースから開始して、糖は約１０％の全収率で得られる[Ｇokhale et al., Ｃan．Ｊ．Ｃhem．68:1063-1071(1990)]。ここで、二リン酸結合の架橋は非保護で非常に不安定なフコース−１−リン酸を使用して行った。最終生産物を処理するために、全９個のクロマトグラフィー精製段階が必要であった。比較して、新規過程の全収率は通常５０％より上である。別の態様において、本発明は、保護糖−１−リン酸をヌクレオシド一リン酸または二リン酸と反応させる、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖の製造法に関し、本方法は糖−１−リン酸または対応するヌクレオシドを、結合前にカルボニルビスアゾールで活性化させ、結合を行った後、酵素的に保護基を除去することを含む。カルボニルジイミダゾールを使用したモノイミダゾリルホスホン酸の製造および対称および非対称ピロホスホン酸の製造におけるその使用は既知である[Ｓcha ller et al.，Ｃhem．Ｂer．74:1621-1633(1961)]。カルボニルビスアゾールの典型的例はカルボニルジイミダゾール、カルボニルジトリアゾール、チオカルボニルジイミダゾールおよびカルボニルジオキシジベンズトリアゾールである。保護一リン酸糖エステルを、例えば、極性溶媒の存在下、過剰なカルボニルビスアゾールと反応させる。次いで、過剰なカルボニルジアゾールを、簡便には適確な量の無水メタノールを使用して分解する。この活性化後、活性化糖リン酸をそのまま、または単離した後、ヌクレオチド建築ブロックのトリアルキルアンモニウム塩と反応させ、保護ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖とする。最初に得たイミダゾール塩を、次いで、イオン交換器で濾過し、それをイオンＺと交換する。次いで、続く精製は、逆層シリカまたは適当な沈殿剤、典型的にはエタノールまたはエタノール／イソプロパノールまたはエタノール／アセトンの混合物を使用して行うことができる。反応は、水非存在下、無水極性非水酸化溶媒中で、室温から８０℃の温度範囲、好ましくは４０℃から５０℃、最も好ましくは４０℃で有効に行う。反応を超音波浴で行うことが有効であることが判明した。極性非水酸化溶媒の典型的例は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフオキシド、アセトン、ジオキサン、ピリジンおよびアセトニトリルならびにこれらの混合物である。新規方法により得られた非保護化合物は、Ｌeloir経路(上記参照)の異なるグリコシルトランスフェラーゼの提供体として働く。この経路の中で、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖の糖残基を受容体に移す。この受容体は、糖、タンパク質のアミノ酸または脂質、ステロイドまたはマクロ環のＯＨ基であり得る。得られた生産物は、特異的病原細胞タイプまたはタンパク質を検出する(診断)または免疫応答を緩和するための、例えば、粘着過程に選択的に影響を及ぼすのに使用できるため(例えば、活性化内皮細胞での白血球の粘着の阻害)、薬理学的に非常に興味深い[Ｓeyfried，Ｄevelopmental Ｂiology 123:286-291(1987)；Ｈa komori，Ｃancer Ｒes．45:2405(1985)；ＢlockおよびＣlausen(編)，Ｃomplex Ｃarbohydrates in Ｄrug Ｒesearch，Ａlfred Ｂenzon Ｓymposium 36，Ｍunks gaard，Ｃopenhagen(1994)118-130，153-164，246-256，280-290，297-310，337 -349，366-367，368-379，382-393，397-409，414-427]。以下の実施例は本発明をより詳細に説明する。実施例１：グアノシン二リン酸フコース(ＧＤＰ−フコース)の製造(方法Ａ) (ａ)Ｉchikawa et al.，Ｊ．Ｏrg．Ｃhem．57:2943-2946(1992)の方法に従って得られる６０５mg(１.６３mmol)のトリ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコース−１ −リン酸を３mlの無水ジメチルホルムアミドに溶解する。この溶液に３９０mg( ２.４９mmol)のカルボニルジイミダゾールを添加し、透明な溶液を９０分間、室温(ＲＴ)で撹拌する。過剰なカルボニルジイミダゾールを、次いで、０.８６mmo lの無水メタノールで分解する。２０分間、ＲＴで撹拌した後、溶媒の幾つかを高真空で除去する。４mlのジメチルホルムアミド中の７８１mg(１.８０mmol)のグアノシン−１−リン酸のトリブチルアンモニウム塩の溶液を、次いで、急速に滴下する。得られる懸濁液を２４時間に渡り、４０℃で超音波浴で超音波処理する。得られる溶液を、４０℃で蒸発乾固して濃縮し、残渣をジオキサンから凍結乾燥す合わせ、濃縮し、更にもう一度ジオキサンから凍結乾燥する。得られた粉末をＲＰ−１８ゲルで精製、９５０mg(６８％)のＧＤＰ−２,３,４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコースを白色粉末形で得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm，４.８ppm)：１.２０d，８.２Ｈz，３Ｈ；２.０３s，３Ｈ；２.１７s，３Ｈ；２.２４s，３Ｈ；４.０２dq，１.８Ｈz，８.２Ｈz，１Ｈ；４. ２４m，２Ｈ；４.４１m，１Ｈ；４.５４m，１Ｈ；５.１１m，２Ｈ；５.３６m，２Ｈ；５.９５d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１４s，１Ｈ。¹³Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，６２ .８９６Ｈz) １８.５２ppm，２３.５０ppm(２×Ｃ)，２３.９５ppm，６８.８０ ppm，７３.４０ppm(d，８.７３Ｈz)，７３.６４ppm，７３.６８ppm，７４.２５p pm，７７.４８ppm，８７.０２ppm(d，９.２Ｈz)，９９.００(d，４.５Ｈz)，１１９.５７ppm，１４１.０６ppm，１５５.１１ppm，１５７.４１ppm，１６２.２８ppm，１７６.２４ppm，１７６.７６ppm，１７７.１８ppm。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ，１０１.２５６Ｈz)：−１１.３１ppm，d，１８.１７Ｈz；−１３.４０ppm， d，１８.１７Ｈz。 (ｂ)６４９mg(８５μmol)のＧＤＰ−２,３,４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ− フコースを２.４mlの０.０７５ＮＮａＣｌ溶液にｐＨ６.７８で溶解し、この溶液に１.６mlのアセチルエステラーゼ溶液(７５Ｕ、オレンジの皮、３.１.１. ６、Ｓigma)を添加する。反応混合物のｐＨを６.７８に１ＮＮａＯＨ溶液で一定に保つ。反応をＲＴで撹拌しながら行う。反応を２４.８２mlの０.１ＮＮａＯＨ溶液(理論的に２５.５ml)の消費で停止する。反応混合物をバイオゲルＰ− ２カラム(３cm×７４cm)で脱塩し、ＧＤＰフコースを含む溶出液を合わせて凍結乾燥、５４０mgの粉末ＧＤＰ−フコースを得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４Ｈz)：１.２１d(８.２Hz)，３Ｈ；３.５２dd(８.３Ｈz，１０.３Ｈz)，１Ｈ；３.６６m，２Ｈ；３.７４dq(１.８Ｈz，８.２Ｈz)，１Ｈ．４.２４m，２Ｈ；４.４１m，１Ｈ；４.５４dd(３.４Ｈz，５.５Ｈz)，１Ｈ；５.９５d(６.９Ｈz) ，１Ｈ；８.１４s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(１０１.２５６Ｈz)：−１２.７０ppm， d，２０.０３Ｈz；−１０.８６ppm，d，２０.０３Ｈz。実施例２：グアノシン二リン酸フコース(ＧＤＰ−フコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)３.０g(５.５mmol)のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩を３６mlの無水ジメチルホルムアミドに、アルゴン下、ＲＴで溶解する。この溶液に撹拌しながら、１.９g(１１.７mmol)のカルボニルジイミダゾールを添加し、撹拌を更に４０分間、ＲＴで続ける。混合物に、次いで、１９５.５μlの乾燥メタノールを注入し、２０分間撹拌し、次いで、高真空に１５分間付す。４８mlの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した２.５５g(６.９mmol)のトリ−Ｏ−アセチル −β−Ｌ−フコース−１−リン酸を滴下した後、反応混合物を４０時間撹拌する。反応が終了した時、溶媒を約４０℃で高真空下除去し、残渣を水に取り込み、 DOWEX-Sカラム(Ｎａ⁺−形、７cm×３５cm)で分画する。糖を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥する。得られる粉末(５.２ｇ)を８０mlの水に溶解し、次いで、２１００Ｕ(１４０μl)のウシ腸アルカリホスファターゼ(Ｂoehringer)を添加し、一晩、ｐＨ＝７.７で撹拌する。混合物を約４０℃で約５０mlまで濃縮し、２５０mlのエタノールで希釈する。残渣を遠心して除き、１００mlのエタノールで洗浄し、ジオキサン／水でから凍結乾燥させて、３.６g(８７％)のトリ−Ｏ− アセチル−ＧＤＰ−フコースを得る。この物質の分光画像データは実施例１のものと同一である。 (ｂ)５００mg(６６０μmol)のトリ−Ｏ−アセチル−ＧＤＰ−フコースを３mlの水に溶解し、３７℃で、３mlの水に溶解した２５０Ｕの予備処理したアセチルエステラーゼ(７５Ｕ、オレンジの皮、３.１.１.６、Ｓigma；約３.５時間、６× １ｌの２回蒸留水に対して透析することにより予備処理)とインキュベートする。反応混合物のｐＨを、０.１mの水酸化ナトリウム溶液およびｐＨ測定装置(dos imate)で６.８に維持する。理論的量の水酸化ナトリウム溶液消費後、溶液を１５０mlのエタノールで希釈し、沈殿を遠心して除き、２５mlの水に取り込み、AM ICONフィルター(ＹＭ−１０)で濾過する。濾液を凍結乾燥し、３８２mg(９２％) のＧＤＰ−フコースを得る。本生産物は、実施例１により得られたものと同一である。サンプルのＵＶスペクトルは、９７％ＧＤＰ−フコース含量を示す。実施例３：キサントシン二リン酸フコース(ＸＤＰ−フコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)一般的に実施例２の方法に従い、５３５mg(５９％)のＸＤＰ−２,３,４−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコースを白色粉末形で、６６７mg(１.２mmol)のキサントシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、３３５mg(２.１mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび４５０mg(１.８mmol)のトリ−Ｏ−アセチル−β −Ｌ−フコース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨ z，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２０d，８.２Ｈz，３Ｈ；２.０４s，３Ｈ；２. １７s，３Ｈ；２.２３s，３Ｈ；４.０１dq，〜１Ｈz，８.２Ｈz，１Ｈ；４.２５ m，２Ｈ；４.３７m，１Ｈ；４.６８m，１Ｈ；５.２１m，４Ｈ；５.９５d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０９s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.３０ppm，d，１８.３３Ｈz；−１３.４４ppm，d，１８.３３Ｈz。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、４３０ mg(全収率：５６％)のＸＤＰ−フコースを白色粉末形で得る。サンプルのＵＶスペクトルは１００％ＸＤＰ−フコース含量を示す。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０. １３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２３d，８.２Ｈz，３Ｈ；３.６９m，４Ｈ；４.２１m，２Ｈ；４.３７m，１Ｈ；４.５２m，１Ｈ；４.６８m，１Ｈ；４ .９０dd，２.７Ｈz，８.３Ｈz，１Ｈ；５.９３d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０６s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.１２ppm，d，１９. ５４Ｈz；−１２.９８ppm，d，１９.５４₂Ｈz。実施例４：イノシン二リン酸フコース(ＩＤＰ−フコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、６３２mg(７０％)のＩＤＰ−２,３,４−トリ−Ｏ −アセチル−β−Ｌ−フコースを白色粉末形で、６４８mg(１.２mmol)のイノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、３３５mg(２.１mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび４５０mg(１.８mmol)のトリ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２１d，７.６Ｈz，３Ｈ；２.０２s，３Ｈ；２.１６s，３Ｈ；２.２４s，３Ｈ；４.１５dq，１.５Ｈz，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２７m，２Ｈ；４.４２m，１Ｈ；４.５７m，１Ｈ；４.６９m，１Ｈ；５.１５m，２Ｈ；５.３０m，２Ｈ；６.１６d，６.９Hz，１Ｈ；８.２２s，１Ｈ；８.４９s，１Ｈ。³¹Ｐ −ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.４２ppm，d，１９.２０Ｈz；− １３.５０ppm，d，１９.２０Ｈz。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従い酵素的に脱アセチル化し、４４０mg (全収率：５９％)のＩＤＰ−フコースを白色粉末形で得る。サンプルのＵＶスペクトルは９７％ＩＤＰ−フコース含量を示す。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２０d，７.６Ｈz，３Ｈ；３.５６dq，１. ５Ｈz，７.６Ｈz，１Ｈ；３.７２m，３Ｈ；４.２２m，２Ｈ；４.４０m，１Ｈ；４.５３m，１Ｈ；４.９１dd，２.７Ｈz，７.６Ｈz，１Ｈ；６.１９d，６.９Ｈz ，１Ｈ；８.１７s，１Ｈ；８.４２s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.１３ppm，d，１８.６０Ｈz；−１２.９３ppm，d，１８.６０Ｈz。実施例５：グアノシン二リン酸−Ｄ−アラビノース(ＧＤＰ−アラビノース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、５５３mg(８５％)のＧＤＰ−２,３,４−トリ−Ｏ −アセチル−α−Ｄ−アラビノースを白色粉末形で、４５１mg(０.９mmol)のグアノシン一リン酸トリブチルアンモニウム塩、２８６mg(１.７mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび３７０mg(１.０mmol)のトリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ− アラビノース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz ，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：２.０１s，３Ｈ；２.１２s，６Ｈ；３.８４dd，１.４Ｈz，１３.１Ｈz，１Ｈ；４.０２dd，３.４Hz，１３.１Hz，１Ｈ；４.２１m，２Ｈ；４.３２m，１Ｈ；４.４８m，１Ｈ；４.７０m，１Ｈ；５.２１m，４Ｈ；５. ８７d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０３s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.４１ppm，d，１９.３０Ｈz；−１３.５９ppm，d，１９.３０Ｈz 。 (ｂ)５１８mgの本サンプルを、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、４１８mg(全収率：７７％)のＧＤＰ−アラビノースを白色粉末形で得る。ＵＶスペクトルは、９９％ＧＤＰ−アラビノース含量を確認する。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：３.６９m，３Ｈ；３.９４m ，２Ｈ；４.２２m，２Ｈ；４.３５m，１Ｈ；４.５２m，１Ｈ；４.７５m，２Ｈ；４.８２m，１Ｈ；５.８９d，６.９Hz，１Ｈ；８.０９s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.１０ppm，d，１６.６Ｈz；−１２.８５ppm ，d，１６.６Ｈz 実施例６：グアノシン二リン酸−β−Ｌ−ガラクトース(ＧＤＰ−ガラクトース) の製造(方法Ｂ) (ａ)一般的に実施例２の方法に従って、５７５mg(７１％)のＧＤＰ−２,３,４, ６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−ガラクトースを白色粉末形で、５０７mg( ０.９mmol)のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、３２２mg(１.９ mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび５００mg(１.２mmol)のテトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｌ−ガラクトース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.９８s，３Ｈ；２.０２s，３Ｈ；２.１３s，３Ｈ；２.１６s，３Ｈ；４.１６m，５Ｈ；４.２２m，１Ｈ；４.４９m，１Ｈ；５.１１m，１Ｈ；５.３０m，１Ｈ；５.４０m，１Ｈ；５.８９d，６. ９Ｈz，１Ｈ；８.０９s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：− １１.３４ppm，d，１８.６Ｈz；−１３.６９ppm，d，１８.６Ｈz。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、２９４ mg(全収率：４６％)のＧＤＰ−ガラクトースを白色粉末形で得る。本サンプルのＵＶスペクトルは、１００％ＧＤＰ−ガラクトース含量を確認する。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：３.６３m，５Ｈ；３. ９２d，２.８Ｈz，１Ｈ；４.２７m，２Ｈ；４.４９m，１Ｈ；４.５８m，１Ｈ；４.９５t，７.５Ｈz，１Ｈ；５.９５d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１２s，１Ｈ。³¹Ｐ −ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.１９ppm，d，２０.２Ｈz；−１２.８９ppm，d，２０.２Ｈz。¹³Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，６２.８９６ＭＨz，ppmで) ：６３.３０；６７.４５d；７０.７０；７２.４８；７３.３２d；７４.３６；７５.９２；７７.９６；８５.８０d；８８.８８；１００.５８d；１１８.１９；１３９.５３；１５３.７７；１５５.９４；１６０.９１。実施例７：グアノシン二リン酸−β−Ｌ−グルコース(ＧＤＰ−グルコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、６４０mg(８０％)のＧＤＰ−２,３,４,６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−グルコースを白色粉末形で、５０７mg(０.９mmol) のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、３２２mg(１.９mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび５００mg(１.２mmol)のテトラ−Ｏ−アセチル− β−Ｌ−グルコース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：２.０４s，３Ｈ；２.０５s，３Ｈ；２.０８s，３Ｈ；２.１３s，３Ｈ；３.９４m，１Ｈ；４.１０dd，１.４Ｈz，１２.４Ｈz，１Ｈ；４.２３m，３Ｈ；４.３２m，１Ｈ；４.４９dd，１.３Ｈz，５.５Ｈz，１Ｈ；５.００t，７.６Ｈz，１Ｈ；５.０８t，８.９Ｈz，１Ｈ；５.２５t，８.９Ｈz，１Ｈ；５.３１t，８.２Ｈz，１Ｈ；５.９２d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１１s ，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.３９ppm，d，１９ .４Ｈz；−１３.８６ppm，d，１９.４Ｈz。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、２９０ mg(全収率：４６％)のＧＤＰ−グルコースを白色粉末形で得る。本サンプルのＵＶスペクトルは、１００％ＧＤＰ−グルコース含量を確認する。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：３.３４m，２Ｈ；３.４６m ，２Ｈ；３.６７dd，６.２Ｈz，１２.４Ｈz，１Ｈ；３.８５dd，１.４Ｈz，１２ .４Ｈz，１Ｈ；４.２１m，２Ｈ；４.４３m，１Ｈ；４.５１m，１Ｈ；４.７５t，５.５Ｈz，１Ｈ；４.９４t，６.９Ｈz，１Ｈ；５.８７d，６.９Ｈz，１Ｈ；８. ０６s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.２０ppm，d ，２０.１Ｈz；−１２.９４ppm，d，２０.１Ｈz。¹³Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，６２.８９６ＭＨz，ppmで)：６３.２８；６７.８４d；７１.９３；７２.９３；７６.１３d；７６.２７；７７.６７；７９.０１；８６.２６d；８９.３２；１００.４２ｄ；１１８.６８；１４０.０３；１５４.２３；１５６.３９；１６１.４０。実施例８：グアノシン二リン酸−２−フルオロフコース(ＧＤＰ−２Ｆ−フコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)一般的に実施例２の方法に従って、２７４mg(１００％)のＧＤＰ−３,４− ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｌ−フコースを白色粉末形で、１９７mg (０.４mmol)のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、１２５mg(０. ７mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび１５０mg(０.４mmol)のジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｌ−フコース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.１９d，７.６Ｈz，３Ｈ；２.０６s，３Ｈ；２.２１s，３Ｈ；４.４１q，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２３m，２Ｈ；４.３５m，１Ｈ；４.５３m，２Ｈ；４.７６t，５.５Hz，１Ｈ；５.３７m，３Ｈ；５.９３d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１１s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.０５ppm，d，１９.２Ｈz；−１３.１９ppm，d，１９. ２Ｈz (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、１９１ mg(全収率：８０％)のＧＤＰ−２Ｆ−グルコースを白色粉末形で得る。本サンプルのＵＶスペクトルは、１００％生産物含量を確認する。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２１d，７.６Ｈz，３Ｈ；３. ７９m，２Ｈ；４.００m，１Ｈ；４.２１m，２Ｈ；４.２６m，１Ｈ；４.３５m，１Ｈ；４.５０m，２Ｈ；５.１６m，１Ｈ；５.９１d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０９s ，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.２９ppm，d，１９ .５Ｈz；−１３.２３ppm，d，１９.５Ｈz。¹³Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１００.６２ＭＨz，ppmで)：６５.６１d；７０.７８；７１.５４d；７１.９９d；７２.０５；７４.００；８４.１０d；８７.１３；９０.９４dd；９５.７８dd；１１６.４８；１３７.８５；１５２.０４；１５４.２９；１５９.３１。¹⁹Ｆ−ＮＭＲ(Ｄ₆− ＤＭＳＯ，２３５.３６ＭＨz)：−２０５.７９ppm。実施例９：ウリジン二リン酸ガラクトース(ＵＤＰ−ガラクトース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、３５０mg(５５％)のＵＤＰ−２,３,４,６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトースを白色粉末形で、４２６mg(０.８mmol )のウリジン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、２２５mg(１.４mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび３５０mg(０.８mmol)のテトラ−Ｏ−アセチル−α −Ｄ−ガラクトース−１−リン酸から得る。ここで、生産物はエタノール／水相に可溶性のままであるため、不純物を沈殿物として遠心除去する。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、１３３ mg(全収率：２７％)のＵＤＰ−ガラクトースを白色粉末形で得る。¹Ｈ−ＮＭＲは、本化合物についての参考文献のものと対応する[Ｈeidlas et al.，Ｊ．Ｏrg .Ｃhem．57:146-151(1992)]。実施例１０:グアノシン三リン酸フコース(ＧＴＰ−フコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、２４０mg(６０％)のＧＴＰ−２,３,４−トリ−Ｏ −アセチル−β−Ｌ−フコースを白色粉末形で、３００mg(０.５mmol)のグアノシン二リン酸のトリブチルアンモニウム塩、１６５mg(１.０mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび２２１mg(０.６mmol)のトリ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.１８d，７.６Ｈz，３Ｈ；１.９８s，３Ｈ；２.１２s，３Ｈ；２.１９s，３Ｈ；４.１０q，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２５m，２Ｈ；４.３５m，１Ｈ；４.５１m，１Ｈ；４.７５m，１Ｈ；５.２０m，４Ｈ；５.８７d，６.９Ｈz ，１Ｈ；８.０６s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１. １６ppm，d，１７.７Ｈz；−１３.２８ppm，d，１６.０Ｈz；−２２.７２ppm，b road t，１６.５Ｈz。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、１３３ mg(全収率：３５％)のＧＴＰ−フコースを白色粉末形で得る。本サンプルのＵＶスペクトルは、９８％生産物含量を確認する。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２６d，７.６Ｈz，３Ｈ；３.６６m，３Ｈ；３.７１q，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２７m，２Ｈ；４.４９m，１Ｈ；４.５８m，１Ｈ；４.９７m，１Ｈ；５.９２d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０１s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.５３ppm，d，１７.６Ｈz；−１３.０９ppm，d，１６.４Ｈz；−２２.７７ppm，t，１６.８Ｈz。¹³Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１００.６１ＭＨz，ppmで)：１５.７２；６５.６３d；７０.６５；７１.２５d ；７１４３；７１.７６；７２.７３；７４.０６；８４.００d；８６.９６；９８ .４０d；１１９.３３；１３６.８８；１５１.５０；１５３.６０；１５９.００。実施例１１：グアノシン二リン酸−α−Ｄ−マンノース(ＧＤＰ−マンノース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、６３１mg(７９％)のＧＤＰ−２,３,４,６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノースを白色粉末形で、５０８mg(１.０mmol) のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、３２３mg(１.９mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび５００mg(１.２mmol)のテトラ−Ｏ−アセチル− α−Ｄ−マンノース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.９９s，３Ｈ；２.０７s，３Ｈ；２.１２s，３Ｈ；２.１９s，３Ｈ；４.０３d，１１.０Ｈz，１Ｈ；４.２５m，２Ｈ；４.３７m，３Ｈ；４.５０m，１Ｈ；４.７７t，６.９Ｈz，１Ｈ；５.２５t，９.６Ｈz ，１Ｈ；５.３８dd，２.８Ｈz，１０.３Ｈz，１Ｈ；５.６１d，１０.３Ｈz，１Ｈ；５.９４d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１３s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１ .２５６ＭＨz)：−１１.４２ppm，d，２０.２Ｈz；−１４.４６ppm，d，２０.２Ｈz。 (ｂ)サンプル全部を、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、４７９ mg(全収率：７５％)のＧＤＰ−マンノースを白色粉末形で得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：３.８３m，５Ｈ；４.０９m ，１Ｈ；４.２５m，２Ｈ；４.４９m，１Ｈ；４.５２t，４.２Ｈz，１Ｈ；５.５２ dd，２.１Ｈz，７.６Ｈz，１Ｈ；５.９４d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１０s，１Ｈ。³¹ Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.１６ppm，d，２０.２Ｈz； −１３.７４ppm，d，２０.２Ｈz。¹³Ｃ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，６２.８９６ＭＨz，ppm で)：６３.３５；６７.８４d；７２.４３；７２.９１d；７２.９４；７６.２９；７６.４１；８６.２２d；８９.４７；９９.０３d；１１８.７３；１５４.１９；１５６.４８；１６１.４８。実施例１２：グアノシン二リン酸−β−Ｌ−２−アミノ−フコース(ＧＤＰ−２ −ＮＨ₂−フコース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、３００mg(５６％)のＧＤＰ−２−アミノ−３,４ −ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコースを白色粉末形で、３９８mg(０.８mmol) のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、２５２mg(１.６mmol)のカルボニルジイミダゾールおよび３００mg(０.９mmol)の２−アミノ−３,４−ジ− Ｏ−アセチル−β−Ｌ−フコース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.１９d，７.６Ｈz，３Ｈ；２. ０９s，３Ｈ；２.２２s，３Ｈ；３.０１dd，８.３Ｈz，１０.３Ｈz，１Ｈ；４. ００q，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２８m，２Ｈ；４.４９m，１Ｈ；４.５６m，１Ｈ；４.９１m，１Ｈ；５.０８t，８.３Ｈz，１Ｈ；５.２１d，３.４Ｈz，１Ｈ；５. ９７d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.１４s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.３０ppm，d，２０.３Ｈz；−１３.１４ppm，d，２０.３Ｈz。 (ｂ)８５mgの本サンプルを、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、７０mg(９４％)のＧＤＰ−２−ＮＨ₂−フコースを白色粉末形で得る。本サンプルのＵＶスペクトルは、９５％生産物含量を確認する。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２２d，７.６Ｈz，３Ｈ；３.１７dd，８.３Ｈz，１０.３Ｈz，１Ｈ；３.６８m，３Ｈ；４.２０m，２Ｈ；４.５０m，１Ｈ；４.７１m，１Ｈ；５.１７t，６.９Ｈz，１Ｈ；５.８８d，６.９Ｈz ，１Ｈ；８.０６s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１. １９ppm，d，２０.３Ｈz；−１３.５７ppm，d，２０.３Ｈz。実施例１３：グアノシン二リン酸−β−Ｄ−ローデオース(ＧＤＰ−ローデオース)の製造(方法Ｂ) (ａ)実施例２の方法に従って、７５０mg(９３％)のＧＤＰ−２,３,４−トリ−Ｏ −アセチル−β−Ｄ−ローデオースを白色粉末形で、５８６mg(１.０mmol)のグアノシン一リン酸のトリブチルアンモニウム塩、３７２mg(１.７mol)のカルボニルジイミダゾールおよび５００mg(１.３mmol)のトリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ− ローデオース−１−リン酸から得る。¹Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz ，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.１９d，７.６Ｈz，３Ｈ；２.０３s，３Ｈ；２.１４s，３Ｈ；２.２３s，３Ｈ；４.０７dq，〜１Ｈz，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２２m ，２Ｈ；４.３８m，１Ｈ；４.５４m，１Ｈ；５.２４m，４Ｈ；５.９５d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０２s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１.２５６ＭＨz)：−１１.３０ppm，d，１８.５Ｈz；−１３.４０ppm，d，１８.５Ｈz。 (ｂ)７４０mgの本サンプルを、実施例２の方法に従って酵素的に脱アセチル化し、２８９mg(全収率：４３％)のＧＤＰ−ローデオースを白色粉末形で得る。¹Ｈ −ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，２５０.１３４ＭＨz，Ｄ₂Ｏのppm：４.８ppm)：１.２３d，７. ６Ｈz，３Ｈ；３.６２m，３Ｈ；３.７５q，７.６Ｈz，１Ｈ；４.２０m，２Ｈ；４.３４m，１Ｈ；４.５２m，１Ｈ；４.７６m，１Ｈ；４.９１t，６.９Ｈz，１Ｈ；５.９３d，６.９Ｈz，１Ｈ；８.０５s，１Ｈ。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ，１０１. ２５６ＭＨz)：−１０.８９ppm，d，２０.１Ｈz；−１２.７２ppm，d，２０.１Ｈz。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．除去を酵素的に行うことを含む、式−Ｃ(Ｏ)Ｒの糖残基(式中、Ｒは直鎖または分枝鎖アルキル、非置換フェニルまたはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁− Ｃ₄アルコキシ置換フェニルである)のヒドロキシル保護基の完全な除去による、保護ヌクレオシド二リン酸または二リン酸糖からヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖を製造する方法。２．ＲがＣ₁−Ｃ₈アルキルである、請求項１記載の方法。３．ＲがＣ₁−Ｃ₄アルキルである、請求項１記載の方法。４．ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖の糖残基が糖モノマーまたは糖ダイマーの残基であり、糖ダイマーの場合、糖モノマーが他方にα−またはβ−( アノマー中心→ｎ)グリコシド結合的に結合し、ｎは１から９の数および用語(アノマー中心→ｎ)は２つの関係するモノマーのグリコシド結合の位置を示すものである、請求項１記載の方法。５．糖モノマーが、その構造が式(ＣＨ₂Ｏ)_m(式中、ｍは好ましくは３から９の整数)に従う化合物ならびにポリヒドロキシアルデヒド、ポリヒドロキシケトン、ポリヒドロキシ酸およびポリヒドロキシアミンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項４記載の方法。６．糖モノマーが、Ｄ−およびＬ−アルドピラノースおよびＤ−およびＬ−アルドフラノースから成る群、Ｄ−およびＬ−ケトピラノースおよびＤ−およびＬ −ケトフラノースからなる群、またはＤ−およびＬ−ジケトピラノースからなる群から選択される、請求項５記載の方法。７．糖モノマーが、Ｄ−およびＬ−立体配置のデオキシ糖、Ｄ−およびＬ−立体配置の２−、３−、４−および６−デオキシアミノ糖、デオキシアシルアミノ糖、２−、３−、４−および６−デオキシハロゲノ糖(ハロゲンは、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ)、および２−、３−、４−および６−デオキシスルフヒドリル糖からなる群から選択される、請求項５記載の方法。８．糖モノマーが、２−、３−、４−および６−デオキシアルドース、１,２ −ジデオキシアルドース、１−、３−、４−および６−デオキシケトース、Ｄ− およびＬ−立体配置の２−、３−、４−および６−デオキシアミノ糖、デオキシアシルアミノ糖、２−、３−、４−および６−デオキシハロゲノ糖(ハロゲンは、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ)、および２−、３−、４−および６−デオキシスルフヒドリル糖からなる群から選択される、請求項７記載の方法。９．糖がフコース、ラムノース、ジキトキソース、グルカル、ガラクタル、フカル、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、フコサミン、Ｎ−アシルグルコサミン、Ｎ−アシルマンノサミン、Ｎ−アシルガラクトサミンおよびＮ− アシルフコサミンからなる群から選択される、請求項８記載の方法。１０．糖モノマーがアラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、２−フルオロフコース、２−アミノフコースまたはローデオースである、請求項４記載の方法。１１．ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖の一部としてのヌクレオシドが天然または非天然合成ヌクレオシドである、請求項１記載の方法。１２．ヌクレオシドがグアノシン、キサントシ、イノシン、ウリジン、２'− デオキシ−２−アミノアデノシン、２'−デオキシ−５−メチルシチジン、２'− デオキシアデノシン、２'−デオキシシチジン、２'−デオキシグアノシおよびチミジンからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。１３．ヌクレオシドがグアノシン、キサントシ、イノシンおよびウリジンからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。１４．保護ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖が式Ｉ〔式中、ｎは１または２；Ｘは酸素、硫黄または炭素原子；ＺはＮａ、Ｋ、ＬｉまたはＭｇ；Ｒ₆はＨまたはＣＨ₂Ｒ₇；Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₇は互いに独立してＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＨ₂、ＮＨＲまたは−Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｒ；Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、非置換フェニルもしくはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁−Ｃ₄アルコキシ置換フェニル、およびＨetはプリンまたはピリミジン塩基〕で示される化合物である、請求項１記載の方法。１５．非保護二リン酸および三リン酸糖が式II 〔式中、Ｘは酸素、硫黄または炭素原子；ＺはＮａ、Ｋ、ＬｉまたはＭｇ；Ｒ₆' はＨまたはＣＨ₂Ｒ₇'、Ｒ₂'、Ｒ₃'、Ｒ₄'およびＲ₇'は互いに独立してＨ、ハロゲン、ＳＨ、ＮＨ₂、ＮＨＲまたはＯＨ、およびＨetはプリンまたはピリミジン塩基〕で示される化合物である、請求項１記載の方法。１６．Ｘは酸素または炭素原子、ＺはＮａ、Ｋ、ＬｉまたはＭｇ、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆は互いに独立して−ＯＣ(Ｏ)−Ｒ基、Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ₁− Ｃ₄アルキルまたはフェニルおよびＨｅｔはプリンまたはピリミジン塩基である、請求項１４記載の方法。１７．Ｘは酸素原子、ＺはＮａ、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ4およびＲ₆は互いに独立して− ＯＣ(Ｏ)−Ｒ基、Ｒは直鎖または分枝鎖Ｃ₁−Ｃ₄アルキルまたはフェニルおよびＨｅｔはプリンまたはピリミジン塩基である、請求項１６記載の方法。１８．Ｒがメチル、エチル、ｉ−またはｎ−プロピルである、請求項１７記載の方法。１９．糖残基で保護されており、その保護基が同一であるヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖を使用する、請求項１記載の方法。２０．ヌクレオシド二リン酸および三リン酸糖が、グアノシン二リン酸フコース、キサントシン二リン酸フコース、イノシン二リン酸フコース、グアノシン二リン酸−２−フルオロフコース、グアノシン二リン酸−β−Ｌ−２−アミノフコース、グアノシン三リン酸フコース、グアノシン二リン酸−Ｄ−アラビノース、グアノシン二リン酸−β−Ｌ−ガラクトース、ウリジン二リン酸ガラクトース、グアノシン二リン酸−β−Ｌ−グルコース、グアノシン二リン酸−α−Ｄ−マンノースおよびグアノシン二リン酸−β−Ｄ−ローデオースである、請求項１記載の方法。２１．酵素的除去を可溶性または固定化酵素で行う、請求項１記載の方法。２２．酵素的除去を機能的に均一の酵素または酵素混合物で行う、請求項１記載の方法。２３．−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₃保護基の酵素的除去をアセチルエステラーゼで行う、請求項１記載の方法。２４．Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₂ＣＨ₃保護基の酵素的除去をアセチルエステラーゼ、リパーゼまたはこれら二つの酵素の混合物で行う、請求項１記載の方法。２５．−Ｃ(Ｏ)−Ｃ₃−Ｃ₈アルキルおよび非置換または置換−Ｃ(Ｏ)−フェニル保護基の酵素的除去をリパーゼで行う、請求項１記載の方法。２６．緩衝液非存在下での酵素的除去の実行を含む、式−Ｃ(Ｏ)−Ｒ(Ｒは直鎖または分枝鎖アルキル、非置換フェニルまたはＣ₁−Ｃ₄アルキル−またはＣ₁ −Ｃ₄アルコキシ置換フェニル)のヒドロキシル保護基を完全に除去することによる、保護ヌクレオシド二リン酸または三リン酸からヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖を製造する方法。２７．糖−１−リン酸または対応するヌクレオシドを結合前に、カルボニルビスアゾールで活性化させ、結合を行った後、酵素的に保護基を除去することを含む、保護糖−１−リン酸をヌクレオシド一リン酸または二リン酸と反応させる、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸糖を製造する方法。２８．カルボニルビスアゾールが、カルボニルジイミダゾール、カルボニルジトリアゾール、チオカルボニルジイミダゾールまたはカルボニルジオキシジベンズトリアゾールである、請求項２７記載の方法。