JPH06197761A - ロータウイルス組換体およびその調製方法 - Google Patents
ロータウイルス組換体およびその調製方法Info
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- JPH06197761A JPH06197761A JP5302103A JP30210393A JPH06197761A JP H06197761 A JPH06197761 A JP H06197761A JP 5302103 A JP5302103 A JP 5302103A JP 30210393 A JP30210393 A JP 30210393A JP H06197761 A JPH06197761 A JP H06197761A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】培養不可能なヒトロータウイルス親株を培養可
能な動物ロータウイルス親株と共に同時感染させて得た
ヒトロータウイルス／動物ロータウイルス組換体の親株
を、動物ロータウイルスの38ｋｄ糖タンパクに特異的に
結合し、かつ動物ロータウイルス親株を中和するモノク
ローナル抗体もしくは超免疫テンジクネズミ抗血清で中
和し、さらにプラークを経てワクチンに適する形態に精
製することによりヒトおよび動物の遺伝子を含みかつヒ
トロータウイルスの抗原血清型を有する組換体を調製す
る。 【効果】ヒトロータウイルス病に対するワクチン前駆体
およびワクチンの製造に有用なロータウイルス組換体が
得られる。
能な動物ロータウイルス親株と共に同時感染させて得た
ヒトロータウイルス／動物ロータウイルス組換体の親株
を、動物ロータウイルスの38ｋｄ糖タンパクに特異的に
結合し、かつ動物ロータウイルス親株を中和するモノク
ローナル抗体もしくは超免疫テンジクネズミ抗血清で中
和し、さらにプラークを経てワクチンに適する形態に精
製することによりヒトおよび動物の遺伝子を含みかつヒ
トロータウイルスの抗原血清型を有する組換体を調製す
る。 【効果】ヒトロータウイルス病に対するワクチン前駆体
およびワクチンの製造に有用なロータウイルス組換体が
得られる。
Description
【０００１】技術分野 この発明は、ヒトロータウイルス／動物ロータウイルス
組換体を調製し、単離し、および性質を調べるために使
用される方法、および弱毒化生ワクチンおよびワクチン
前駆体の製造方法に関する。この発明の手法では、所望
のヒト表現型をもった組換体を選ぶために、（１）高力
価の超免疫抗血清または（２）モノクローナル抗血清の
新しい使用が関与している。抗血清単独またはモノクロ
ーナル抗血清は、それが３４−３８Ｋｄ糖タンパクのみ
に対するあるいは動物ウイルス親株に対する高力価の中
和活性をもつ限り、ヒトの表現型をもった組換体ロータ
ウイルスを選択するために充分使用し得ることが発見さ
れたが、ここが新規な点である。同様に、新規な生産物
として弱毒化生ワクチン前駆体およびワクチンがある。
ワクチンとしての組換体ウイルス（野生形の動物ウイル
スを用いる）には、親株として温度感受性動物ウイルス
を用いた他の組換体ワクチンに対して少なくとも２つの
利点のあることが注目される。すなわち（１）組換体ウ
イルスは、様々な突然変異によって生みだされた毒性の
弱いウイルスよりも潜在的に安定であること、および
（２）ヒトロータウイルス遺伝子は温度感受性動物ロー
タウイルスを用いて調製される組換体の中には存在する
が、非温度感受性動物ロータウイルスの親株を用いて調
製される組換体の中にはあまり存在しないことである。
組換体を調製し、単離し、および性質を調べるために使
用される方法、および弱毒化生ワクチンおよびワクチン
前駆体の製造方法に関する。この発明の手法では、所望
のヒト表現型をもった組換体を選ぶために、（１）高力
価の超免疫抗血清または（２）モノクローナル抗血清の
新しい使用が関与している。抗血清単独またはモノクロ
ーナル抗血清は、それが３４−３８Ｋｄ糖タンパクのみ
に対するあるいは動物ウイルス親株に対する高力価の中
和活性をもつ限り、ヒトの表現型をもった組換体ロータ
ウイルスを選択するために充分使用し得ることが発見さ
れたが、ここが新規な点である。同様に、新規な生産物
として弱毒化生ワクチン前駆体およびワクチンがある。
ワクチンとしての組換体ウイルス（野生形の動物ウイル
スを用いる）には、親株として温度感受性動物ウイルス
を用いた他の組換体ワクチンに対して少なくとも２つの
利点のあることが注目される。すなわち（１）組換体ウ
イルスは、様々な突然変異によって生みだされた毒性の
弱いウイルスよりも潜在的に安定であること、および
（２）ヒトロータウイルス遺伝子は温度感受性動物ロー
タウイルスを用いて調製される組換体の中には存在する
が、非温度感受性動物ロータウイルスの親株を用いて調
製される組換体の中にはあまり存在しないことである。
【０００２】ロータウイルスは、ヒトおよび動物の乳児
の下痢を起こす主な原因である。不幸にも、ヒトロータ
ウイルスに関する疫学、生物学、および免疫学の研究
は、組織培養では生育の難しいこれらのウイルスを増殖
させるときにぶつかる困難な問題点によって阻まれてき
た。最近の研究では、少なくとも何種類かのヒトロータ
ウイルスの単離物は直接培養し得ることが示されている
（ウィアットら，米国特許第４，３４１，８７０号）。
ヒトロータウイルスの培養に際し問題となっている難点
を打開するための戦略として、この発明は以下の点を利
用している。すなわちロータウイルスゲノムの断片化す
る性質、および培養不可能なヒトロータウイルスと培養
可能なウシロータウイルスの温度感受性（ｔｓ）突然変
異体とを組換えることによって培養不可能なヒトロータ
ウイルスを増殖させるための同時感染に際し、高頻度の
遺伝子組換体が得られることである。ｔｓ突然変異体を
使用することと関連して、高力価の超免疫抗血清を過剰
に利用した。生体外で増殖を制限する培養不可能なヒト
ロータウイルスの遺伝子は、組織培養に適応したウシロ
ータウイルスからの相当する遺伝子によって置換えられ
た。組換えられた遺伝子をもつウイルスは「組換ウイル
ス」または「組換体」と呼ばれている。
の下痢を起こす主な原因である。不幸にも、ヒトロータ
ウイルスに関する疫学、生物学、および免疫学の研究
は、組織培養では生育の難しいこれらのウイルスを増殖
させるときにぶつかる困難な問題点によって阻まれてき
た。最近の研究では、少なくとも何種類かのヒトロータ
ウイルスの単離物は直接培養し得ることが示されている
（ウィアットら，米国特許第４，３４１，８７０号）。
ヒトロータウイルスの培養に際し問題となっている難点
を打開するための戦略として、この発明は以下の点を利
用している。すなわちロータウイルスゲノムの断片化す
る性質、および培養不可能なヒトロータウイルスと培養
可能なウシロータウイルスの温度感受性（ｔｓ）突然変
異体とを組換えることによって培養不可能なヒトロータ
ウイルスを増殖させるための同時感染に際し、高頻度の
遺伝子組換体が得られることである。ｔｓ突然変異体を
使用することと関連して、高力価の超免疫抗血清を過剰
に利用した。生体外で増殖を制限する培養不可能なヒト
ロータウイルスの遺伝子は、組織培養に適応したウシロ
ータウイルスからの相当する遺伝子によって置換えられ
た。組換えられた遺伝子をもつウイルスは「組換ウイル
ス」または「組換体」と呼ばれている。
【０００３】この組換体を選択するために用いられるこ
の高力価抗血清に加え、ウシの親株に対して選択圧を加
えるためにこの温度感受性突然変異体が必要であるとい
うことが最初に考えられた（グリーンバーグら，Proc.N
atl.Acad.Sci.USA，７８巻，１号，４２０−４２４頁，
１９８１年１月）。グリーンバーグの論文に記載されて
いるように、最初に、この所望のウイルス組換体を選択
することは、混合感染から得られる子株をヒトロータウ
イルスは中和しない高い特異性をもつウシロータウイル
スにさらすことによって可能となった。続いて、ｔｓ−
ウシロータウイルスの親株およびｔｓ−組換体を死滅さ
せるために制限温度（３９℃）で、生残ったウイルスの
プラークを形成させた。
の高力価抗血清に加え、ウシの親株に対して選択圧を加
えるためにこの温度感受性突然変異体が必要であるとい
うことが最初に考えられた（グリーンバーグら，Proc.N
atl.Acad.Sci.USA，７８巻，１号，４２０−４２４頁，
１９８１年１月）。グリーンバーグの論文に記載されて
いるように、最初に、この所望のウイルス組換体を選択
することは、混合感染から得られる子株をヒトロータウ
イルスは中和しない高い特異性をもつウシロータウイル
スにさらすことによって可能となった。続いて、ｔｓ−
ウシロータウイルスの親株およびｔｓ−組換体を死滅さ
せるために制限温度（３９℃）で、生残ったウイルスの
プラークを形成させた。
【０００４】この発明においては、温度感受性突然変異
体は用いず、テンジクネズミを用いて調製されるような
超免疫抗体であり得る抗血清の有効性、または次のよう
なあるモノクローナル抗体およびその子株（９５４／１
５９／３３；９５４／９６／１８；および９５２／３／
６８）から選ばれるモノクローナル抗体の有効性に信頼
が置かれている。
体は用いず、テンジクネズミを用いて調製されるような
超免疫抗体であり得る抗血清の有効性、または次のよう
なあるモノクローナル抗体およびその子株（９５４／１
５９／３３；９５４／９６／１８；および９５２／３／
６８）から選ばれるモノクローナル抗体の有効性に信頼
が置かれている。
【０００５】混合感染を受けたヒトロータウイルスＤ株
およびウシロータウイルスＵＫ株から性質が調べられた
最初の組換体の中で、ヒトロータウイルスＤ株由来の遺
伝子を１つもつものが３つあり、同じ遺伝子を２つもつ
ものが３つある。有体に言うと、これらの組換体の中で
これらの遺伝子の残りはウシの親株ＵＫに由来する。 寄託の記述 モノクローナル抗体およびその子孫として本出願に記載
された細胞系によって生産される次の抗体，９５４／１
５９／３３；９５４／９６／１８；および９５２／３／
６８は、メリーランド州２０２０５，ベテスダの米国国
立衛生研究所，第７ビルにあるアレルギーおよび感染症
研究所のＬ．Ｉ．Ｄ．研究室に寄託された。この寄託所
では同じような研究所のために標準的な方法で管理が行
われており、液体窒素蒸気中で−７０℃の貯蔵で操作が
行われ、またこの研究所は活発に増殖するハイブリドー
マ細胞の無菌単離体および低温保存用培地にこれらの細
胞を懸濁させたものを提供し、また定期的な観察と生育
性試験のための解凍法を備えている。この寄託所は現在
ロバートＭ．チャノック博士の管轄下にある。これらの
抗体は１９８２年３月１８日および１９８２年４月５日
に寄託され、前者の日付からこの出願書の提出日まで、
サンプルを必要とする当該技術分野の研究者に入手可能
であった。ウシロータウイルス（ＮＣＤＶ）はＡＴＣＣ
（＃ＶＲ−４５２）から入手し得るよく知られたウイル
スである。ＡＴＣＣ．株カタログII，第３版，３４３頁
（１９８１）参照。次のヒト／ウシ組換体ロータウイル
スは１９８３年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、その
寄託番号はＡＴＣＣ＃ＶＲ２９６９である。この組換体
はヒトロータウイルス血清型１であるが、ウシロータウ
イルスＵＫ遺伝子をも含んでいる。それはＨＤ／ＢＲＶ
−１，クローン４７−１−１，１９８３年６月１６日と
呼称されている。
およびウシロータウイルスＵＫ株から性質が調べられた
最初の組換体の中で、ヒトロータウイルスＤ株由来の遺
伝子を１つもつものが３つあり、同じ遺伝子を２つもつ
ものが３つある。有体に言うと、これらの組換体の中で
これらの遺伝子の残りはウシの親株ＵＫに由来する。 寄託の記述 モノクローナル抗体およびその子孫として本出願に記載
された細胞系によって生産される次の抗体，９５４／１
５９／３３；９５４／９６／１８；および９５２／３／
６８は、メリーランド州２０２０５，ベテスダの米国国
立衛生研究所，第７ビルにあるアレルギーおよび感染症
研究所のＬ．Ｉ．Ｄ．研究室に寄託された。この寄託所
では同じような研究所のために標準的な方法で管理が行
われており、液体窒素蒸気中で−７０℃の貯蔵で操作が
行われ、またこの研究所は活発に増殖するハイブリドー
マ細胞の無菌単離体および低温保存用培地にこれらの細
胞を懸濁させたものを提供し、また定期的な観察と生育
性試験のための解凍法を備えている。この寄託所は現在
ロバートＭ．チャノック博士の管轄下にある。これらの
抗体は１９８２年３月１８日および１９８２年４月５日
に寄託され、前者の日付からこの出願書の提出日まで、
サンプルを必要とする当該技術分野の研究者に入手可能
であった。ウシロータウイルス（ＮＣＤＶ）はＡＴＣＣ
（＃ＶＲ−４５２）から入手し得るよく知られたウイル
スである。ＡＴＣＣ．株カタログII，第３版，３４３頁
（１９８１）参照。次のヒト／ウシ組換体ロータウイル
スは１９８３年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、その
寄託番号はＡＴＣＣ＃ＶＲ２９６９である。この組換体
はヒトロータウイルス血清型１であるが、ウシロータウ
イルスＵＫ遺伝子をも含んでいる。それはＨＤ／ＢＲＶ
−１，クローン４７−１−１，１９８３年６月１６日と
呼称されている。
【０００６】背景技術 グリーンバーク，ハリーＢ．ら，「培養可能なウシロー
タウイルスのｔｓ突然変異を用いた混合感染に際しての
遺伝子組換体による培養不可能なヒトロータウイルスの
分離」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，７８巻，１号，４２
０−４２４頁，１９８１年１月。ウシロータウイルスの
ｔｓ遺伝子を用いて、生体外で増殖を抑制する生育しに
くいロータウイルスの遺伝子は、組織培養に適合したロ
ータウイルスからの相当する遺伝子によって置換えられ
た。
タウイルスのｔｓ突然変異を用いた混合感染に際しての
遺伝子組換体による培養不可能なヒトロータウイルスの
分離」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，７８巻，１号，４２
０−４２４頁，１９８１年１月。ウシロータウイルスの
ｔｓ遺伝子を用いて、生体外で増殖を抑制する生育しに
くいロータウイルスの遺伝子は、組織培養に適合したロ
ータウイルスからの相当する遺伝子によって置換えられ
た。
【０００７】カリカ，アントニーＲ．ら，「中和および
サブグループ抗原の遺伝情報を指定するヒトロータウイ
ルス（ＷＡ株）およびウシロータウイルス（ＵＫ株）の
遺伝子」，Virology，１１２，３８５−３９０，（１９
８１）。ウシロータウイルス（ＵＫ株）のｔｓ突然変異
体と培養不可能または可能なヒトロータウイルス（ＷＡ
株）とを混合感染させて回収した１６種のロータウイル
ス組換体を解析した結果、９番目の遺伝子に対応するＲ
ＮＡ断片は、中和抗体を誘導しそれと反応するタンパク
の遺伝情報を指定すること、６番目の遺伝子に対応する
ＲＮＡ断片はサブグループ抗原の遺伝情報を指定するこ
と、およびおそらく細胞培養で培養不可能なヒトロータ
ウイルスの増殖の制限には４番目の遺伝子に対応するＲ
ＮＡ断片が起因していること、が示された。
サブグループ抗原の遺伝情報を指定するヒトロータウイ
ルス（ＷＡ株）およびウシロータウイルス（ＵＫ株）の
遺伝子」，Virology，１１２，３８５−３９０，（１９
８１）。ウシロータウイルス（ＵＫ株）のｔｓ突然変異
体と培養不可能または可能なヒトロータウイルス（ＷＡ
株）とを混合感染させて回収した１６種のロータウイル
ス組換体を解析した結果、９番目の遺伝子に対応するＲ
ＮＡ断片は、中和抗体を誘導しそれと反応するタンパク
の遺伝情報を指定すること、６番目の遺伝子に対応する
ＲＮＡ断片はサブグループ抗原の遺伝情報を指定するこ
と、およびおそらく細胞培養で培養不可能なヒトロータ
ウイルスの増殖の制限には４番目の遺伝子に対応するＲ
ＮＡ断片が起因していること、が示された。
【０００８】フローレス，ジョージら，「ロータウイル
ス組換体の遺伝型を決める上での転写プローブの使
用」，Virology．１２１，２８８−２９５（１９８
２）。
ス組換体の遺伝型を決める上での転写プローブの使
用」，Virology．１２１，２８８−２９５（１９８
２）。
【０００９】グリーンバーグ，ハリーＢ．ら，「遺伝子
組換えによる培養不可能なヒトロータウイルスの分離お
よび血清型決定」，Infection and immunity，３７巻１
号，１０４−１０９頁，１９８２年７月。この論文で
は、遺伝子組換えにより巧みに分離された５０種の培養
不可能なヒトロータウイルス中で３３種が示されてい
る。
組換えによる培養不可能なヒトロータウイルスの分離お
よび血清型決定」，Infection and immunity，３７巻１
号，１０４−１０９頁，１９８２年７月。この論文で
は、遺伝子組換えにより巧みに分離された５０種の培養
不可能なヒトロータウイルス中で３３種が示されてい
る。
【００１０】カリカ，アントニーＲ．ら，「血球凝集反
応の遺伝情報を指定するロータウイルス遺伝子の同定お
よびプロテアーゼ活性の高まったプラークの同定」，Vi
rolo gy，１２５，１９４−２０５，１９８３。ウシロー
タウイルス（ＵＫコンプトン株）およびアカゲザルロー
タウイルス（ＭＭＵ１８００６株）の温度感受性突然変
異体が用いられ、ＭＡ１０４細胞への同時感染により１
６種の組換体を得た。他の結果から、中和抗体が８番目
または９番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片に連鎖して
いること、および血球凝集反応（ＨＡ）の抗原が４番目
の遺伝子に対応するＲＮＡ断片に連鎖していることが明
らかにされた。
応の遺伝情報を指定するロータウイルス遺伝子の同定お
よびプロテアーゼ活性の高まったプラークの同定」，Vi
rolo gy，１２５，１９４−２０５，１９８３。ウシロー
タウイルス（ＵＫコンプトン株）およびアカゲザルロー
タウイルス（ＭＭＵ１８００６株）の温度感受性突然変
異体が用いられ、ＭＡ１０４細胞への同時感染により１
６種の組換体を得た。他の結果から、中和抗体が８番目
または９番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片に連鎖して
いること、および血球凝集反応（ＨＡ）の抗原が４番目
の遺伝子に対応するＲＮＡ断片に連鎖していることが明
らかにされた。
【００１１】グリーンバーグ，ハリーら，「モノクロー
ナル抗体を用いたロータウイルスのサブグループタンパ
クの血清型分析」，Infection and Imunity ，３９巻，
１号，９１−９９頁，１９８３年１月。この論文におい
てグリーンバーグと彼の共同研究者らは、６番目の遺伝
子のタンパク産物と関連した抗原特異性を示しているロ
ータウイルスサブグループという言葉に焦点を合せてい
る。６番目のロータウイルス遺伝子の産物とは４２Ｋｄ
の主要な内部構造をもつタンパクのことであり、そして
著者らは、抗原として２つに区別されるサブグループと
特異的に反応するモノクローナル抗体について記載して
いる。このタンパクはヴィリオン上に大量に存在してお
り、補体結合アッセイ、免疫粘着血球凝集アッセイ（Ｉ
ＡＨＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および酵素
結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む様々な抗体
アッセイ系を用いて容易に検出され得る。
ナル抗体を用いたロータウイルスのサブグループタンパ
クの血清型分析」，Infection and Imunity ，３９巻，
１号，９１−９９頁，１９８３年１月。この論文におい
てグリーンバーグと彼の共同研究者らは、６番目の遺伝
子のタンパク産物と関連した抗原特異性を示しているロ
ータウイルスサブグループという言葉に焦点を合せてい
る。６番目のロータウイルス遺伝子の産物とは４２Ｋｄ
の主要な内部構造をもつタンパクのことであり、そして
著者らは、抗原として２つに区別されるサブグループと
特異的に反応するモノクローナル抗体について記載して
いる。このタンパクはヴィリオン上に大量に存在してお
り、補体結合アッセイ、免疫粘着血球凝集アッセイ（Ｉ
ＡＨＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および酵素
結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む様々な抗体
アッセイ系を用いて容易に検出され得る。
【００１２】グリーンバーグ，ハリーＢ．ら，「ヒトロ
ータウイルスのＷおよびＤＳ株の増殖抑制、中和および
サブグループ特異性の遺伝情報を指定する遺伝子」，Ge
nera l Virology，６４，３１３−３２４，１９８３。ロ
ータウイルスの血清型を決定するに際し、Ｗウイルスの
９番目の遺伝子断片とＤＡ−１ヒトロータウイルスの８
番目の遺伝子断片とは血清型特異性において関連してお
り、一方Ｗウイルスの６番目の遺伝子断片はサブグルー
プ特異性において関連していることが明らかとなった。
ータウイルスのＷおよびＤＳ株の増殖抑制、中和および
サブグループ特異性の遺伝情報を指定する遺伝子」，Ge
nera l Virology，６４，３１３−３２４，１９８３。ロ
ータウイルスの血清型を決定するに際し、Ｗウイルスの
９番目の遺伝子断片とＤＡ−１ヒトロータウイルスの８
番目の遺伝子断片とは血清型特異性において関連してお
り、一方Ｗウイルスの６番目の遺伝子断片はサブグルー
プ特異性において関連していることが明らかとなった。
【００１３】グリーンバーグ，ハリーＢ．ら，「アカゲ
ザルロータウイルスの２つの表面タンパクに結合するモ
ノクローナル抗体の産生と予備検定」，J.Virology，４
７，２６７−２７５，１９８３。アカゲザルロータウイ
ルスの血清型は３種の主要ヒトロータウイルスの血清型
の１つと同一性があるため、ＲＲＶも、ワクチン前駆体
を調製するためにヒト／動物ロータウイルス組換体で遺
伝子供与体として計画的に用いられた。研究が示すとこ
ろによれば、アカゲザルロータウイルスの２種の主要表
面タンパクの１つと反応する３６種のモノクローナル抗
体のうち３種が利用され、８番目または９番目の遺伝子
産物である３８Ｋｄの外面にあるキャップシドの糖タン
パクと特異的に免疫沈降反応を起こした。
ザルロータウイルスの２つの表面タンパクに結合するモ
ノクローナル抗体の産生と予備検定」，J.Virology，４
７，２６７−２７５，１９８３。アカゲザルロータウイ
ルスの血清型は３種の主要ヒトロータウイルスの血清型
の１つと同一性があるため、ＲＲＶも、ワクチン前駆体
を調製するためにヒト／動物ロータウイルス組換体で遺
伝子供与体として計画的に用いられた。研究が示すとこ
ろによれば、アカゲザルロータウイルスの２種の主要表
面タンパクの１つと反応する３６種のモノクローナル抗
体のうち３種が利用され、８番目または９番目の遺伝子
産物である３８Ｋｄの外面にあるキャップシドの糖タン
パクと特異的に免疫沈降反応を起こした。
【００１４】米国特許第３，９９２，５２２号 チャ
ノクら 米国特許第４，３４１，８７０号 ウィアットら 上記関連文献において注目すべきことは、ウシロータウ
イルスＵＫ株の突然変異体と培養不可能なヒトロータウ
イルスＷＡ株との混合感染に関して、９番目の遺伝子に
対応するＲＮＡ断片が中和抗体を誘導しそれと反応する
タンパクの遺伝情報を指定していることが示されたこと
である。さらに、４番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片
が原因で細胞培養においてロータウイルスの増殖が制限
されるようである。様々な部位からの５０種の培養不可
能なヒトロータウイルスのうち３３種が遺伝的組換えに
より見事に分離されることが明らかになったと同様に、
１９種の株は予め血清学的に性質の分っているヒトロー
タウイルスＷＡ株と似ており、３種の株はＤＳ−１と血
清学的に相関があった。一方１１種の株はＷＡおよびＤ
Ｓ−１株と血清学的に区別され、１つ以上の新しいヒト
ロータウイルス血清型を表わしていることが明らかとな
った。
ノクら 米国特許第４，３４１，８７０号 ウィアットら 上記関連文献において注目すべきことは、ウシロータウ
イルスＵＫ株の突然変異体と培養不可能なヒトロータウ
イルスＷＡ株との混合感染に関して、９番目の遺伝子に
対応するＲＮＡ断片が中和抗体を誘導しそれと反応する
タンパクの遺伝情報を指定していることが示されたこと
である。さらに、４番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片
が原因で細胞培養においてロータウイルスの増殖が制限
されるようである。様々な部位からの５０種の培養不可
能なヒトロータウイルスのうち３３種が遺伝的組換えに
より見事に分離されることが明らかになったと同様に、
１９種の株は予め血清学的に性質の分っているヒトロー
タウイルスＷＡ株と似ており、３種の株はＤＳ−１と血
清学的に相関があった。一方１１種の株はＷＡおよびＤ
Ｓ−１株と血清学的に区別され、１つ以上の新しいヒト
ロータウイルス血清型を表わしていることが明らかとな
った。
【００１５】発明の開示 この発明の組換体調製方法および産物は、現在ヒトロー
タウイルス病に対するワクチン前駆体およびワクチンを
製造するために有効である。
タウイルス病に対するワクチン前駆体およびワクチンを
製造するために有効である。
【００１６】遺伝子供与体として用いられ得る動物ロー
タウイルスには、ウシ（ＵＫ）、サル（ＭＭＵ１８００
６）、イヌ（ＣＵ−１）、マウス、およびトリのウイル
スがある。この発明に用いるに適したヒトロータウイル
スは、ノトバイオートの子ウシ排泄物、ヒトの糞便懸濁
液の型で用いられるか、またはアフリカミドリザル腎
（ＡＧＭＫ）の消化管を通過したものとして用いられ
る。
タウイルスには、ウシ（ＵＫ）、サル（ＭＭＵ１８００
６）、イヌ（ＣＵ−１）、マウス、およびトリのウイル
スがある。この発明に用いるに適したヒトロータウイル
スは、ノトバイオートの子ウシ排泄物、ヒトの糞便懸濁
液の型で用いられるか、またはアフリカミドリザル腎
（ＡＧＭＫ）の消化管を通過したものとして用いられ
る。
【００１７】方法は最初にヒトおよび動物ロータウイル
スをトリプシンで前処理することを含む。ヒトロータウ
イルスは全く培養不可能かまたはほとんど培養不可能で
あるため、それを単層のＡＧＭＫ細胞の上に遠心させ
る。この段階によって細胞に入るウイルスの量が増え
る、換言すると、感染の多様性が増す。続いてＡＧＭＫ
細胞をある種の動物ロータウイルス株で同時感染させ、
約３６時間増殖させて、ウイルスを回収し凍結する。同
時感染させたこれらの細胞から得られたウイルスを続い
て高い特異性をもつ抗血清で処理し、動物ロータウイル
スの親株を効果的に中和する。組換えの条件を確立する
過程において、超免疫抗体またはモノクローナル抗体は
動物ウイルス親株の４番目の遺伝子産物に指向される活
性を持つべきでないことが判明した。この段階が最も重
要である。というのはこの方法において組換体の混合物
は、選択されたヒト表現型を含む組換体ウイルスだけに
なるからである。それぞれのウイルスのプラークは４か
ら７日後に採取され、続いて均質な製剤となるまで精製
され、そしてワクチン前駆体またはワクチンを製造する
ために供される。
スをトリプシンで前処理することを含む。ヒトロータウ
イルスは全く培養不可能かまたはほとんど培養不可能で
あるため、それを単層のＡＧＭＫ細胞の上に遠心させ
る。この段階によって細胞に入るウイルスの量が増え
る、換言すると、感染の多様性が増す。続いてＡＧＭＫ
細胞をある種の動物ロータウイルス株で同時感染させ、
約３６時間増殖させて、ウイルスを回収し凍結する。同
時感染させたこれらの細胞から得られたウイルスを続い
て高い特異性をもつ抗血清で処理し、動物ロータウイル
スの親株を効果的に中和する。組換えの条件を確立する
過程において、超免疫抗体またはモノクローナル抗体は
動物ウイルス親株の４番目の遺伝子産物に指向される活
性を持つべきでないことが判明した。この段階が最も重
要である。というのはこの方法において組換体の混合物
は、選択されたヒト表現型を含む組換体ウイルスだけに
なるからである。それぞれのウイルスのプラークは４か
ら７日後に採取され、続いて均質な製剤となるまで精製
され、そしてワクチン前駆体またはワクチンを製造する
ために供される。
【００１８】この発明の重要な特徴は組換体を分離する
ために用いられる選択技術にある。現在まで、所望の組
換体ロータウイルスの選択法を開発することに問題が集
中していた。この発明に先立って、最も最近の方法とし
てウシロータウイルスの温度感受性突然変異体を用いる
ことが考えられていた。さらに詳しい考察のためには、
ＰＮＡＳ，７８巻，４２０頁，およびInfection and Im
munity，３７巻，１０４頁を参照のこと。
ために用いられる選択技術にある。現在まで、所望の組
換体ロータウイルスの選択法を開発することに問題が集
中していた。この発明に先立って、最も最近の方法とし
てウシロータウイルスの温度感受性突然変異体を用いる
ことが考えられていた。さらに詳しい考察のためには、
ＰＮＡＳ，７８巻，４２０頁，およびInfection and Im
munity，３７巻，１０４頁を参照のこと。
【００１９】端的に言うと、温度感受性突然変異体を用
いる手法は、培養可能なウシロータウイルスと培養不可
能なヒトロータウイルスとを許容温度で同時感染させ、
同時感染により得られたウイルス組換体をウシウイルス
の増殖には非許容的（制限的）温度で培養することから
なる。ウシウイルス株の非温度感受性の遺伝子断片を含
む組換体だけが生残る。
いる手法は、培養可能なウシロータウイルスと培養不可
能なヒトロータウイルスとを許容温度で同時感染させ、
同時感染により得られたウイルス組換体をウシウイルス
の増殖には非許容的（制限的）温度で培養することから
なる。ウシウイルス株の非温度感受性の遺伝子断片を含
む組換体だけが生残る。
【００２０】この発明の系では、非温度感受性の動物ロ
ータウイルスの親株を用いるが、これには２つの利点が
ある。すなわち（１）動物ロータウイルスには化学物質
による突然変異は起きないため、しばしば遺伝的に不安
定で不活動な点突然変異は、組換体に存在する動物ロー
タウイルスの遺伝子には存在しない、および（２）温度
感受性動物ロータウイルス親株を用いるよりも非温度感
受性動物ロータウイルス親株用いて調製される組換体の
中にはヒトロータウイルスの遺伝子はあまり存在しな
い、点である。
ータウイルスの親株を用いるが、これには２つの利点が
ある。すなわち（１）動物ロータウイルスには化学物質
による突然変異は起きないため、しばしば遺伝的に不安
定で不活動な点突然変異は、組換体に存在する動物ロー
タウイルスの遺伝子には存在しない、および（２）温度
感受性動物ロータウイルス親株を用いるよりも非温度感
受性動物ロータウイルス親株用いて調製される組換体の
中にはヒトロータウイルスの遺伝子はあまり存在しな
い、点である。
【００２１】この発明は非温度感受性ウイルスを用いる
ことによる温度感受性選択技術とは異なる。所望のウイ
ルス組換体の選択は、動物およびヒトロータウイルスの
混合感染から得られる子株を、動物ウイルス親株を中和
する強力で特異的な動物ロータウイルスの抗血清にさら
すことによって可能となる。この方法によって、（１）
組織培養において増殖が速く、（２）非常に効率よくプ
ラークを形成し、（３）血清型が特異的なヒトロータウ
イルスの抗血清による中和によって、表現型ではヒトで
あると特徴付けられ、および（４）ヒトロータウイルス
の遺伝子を少ししか含まないウイルス組換体を回収し
た。
ことによる温度感受性選択技術とは異なる。所望のウイ
ルス組換体の選択は、動物およびヒトロータウイルスの
混合感染から得られる子株を、動物ウイルス親株を中和
する強力で特異的な動物ロータウイルスの抗血清にさら
すことによって可能となる。この方法によって、（１）
組織培養において増殖が速く、（２）非常に効率よくプ
ラークを形成し、（３）血清型が特異的なヒトロータウ
イルスの抗血清による中和によって、表現型ではヒトで
あると特徴付けられ、および（４）ヒトロータウイルス
の遺伝子を少ししか含まないウイルス組換体を回収し
た。
【００２２】発明を実施するための最良の形態 ４種の動物ロータウイルス株がその培養可能な遺伝子断
片を組換体株に供与する。
片を組換体株に供与する。
【００２３】１）ウシ：ＵＫ株，子ウシ腎細胞中で増
殖。
殖。
【００２４】２）サル：ＭＭＵ１８００６（アカゲザ
ル）株、アフリカミドリザル腎細胞中で増殖、続いてＤ
ＢＳ−ＦＲｈＬ−２細胞（米国特許第４，０４０，９０
５号）中で増殖。
ル）株、アフリカミドリザル腎細胞中で増殖、続いてＤ
ＢＳ−ＦＲｈＬ−２細胞（米国特許第４，０４０，９０
５号）中で増殖。
【００２５】３）イヌ：ＣＵ−１株，ＡＧＭＫ細胞中で
増殖。
増殖。
【００２６】４）ネズミ：ＥＷ２２３４８株，ＡＧＭＫ
細胞中で増殖。
細胞中で増殖。
【００２７】トリロータウイルスは上記ウイルスの特性
を備えているが、このことはトリロータウイルスもまた
遺伝子を供与することを示している。
を備えているが、このことはトリロータウイルスもまた
遺伝子を供与することを示している。
【００２８】この発明の教示するところは、これら４種
の動物ロータウイルスに限定されるものではない。それ
というのも病気の主因として付随的な血清型が連続的に
現われるため、ワクチンの最終的な型を予測することは
不可能だからである。
の動物ロータウイルスに限定されるものではない。それ
というのも病気の主因として付随的な血清型が連続的に
現われるため、ワクチンの最終的な型を予測することは
不可能だからである。
【００２９】４株のヒトロータウイルスが用いられる
が、それらはプラーク半減中和アッセイによって定義さ
れる４種の異なった血清型を表わしている。すなわち、 ａ）Ｄ株，血清型１，ノトバイオートの子ウシ排泄物の
型で用いられる。
が、それらはプラーク半減中和アッセイによって定義さ
れる４種の異なった血清型を表わしている。すなわち、 ａ）Ｄ株，血清型１，ノトバイオートの子ウシ排泄物の
型で用いられる。
【００３０】ｂ）ＤＳ−１株，血清型２，ノトバイオー
トの子ウシ排泄物の型で用いられる。 ｃ）Ｐ株，血清
型３，約２％のヒト糞便懸濁液の型で用いられる。注目
すべきことに、アカゲザルロータウイルス（ＭＭＵ１８
００６）およびイヌロータウイルス（ＣＵ−１）も同様
に血清型３のロータウイルスである。
トの子ウシ排泄物の型で用いられる。 ｃ）Ｐ株，血清
型３，約２％のヒト糞便懸濁液の型で用いられる。注目
すべきことに、アカゲザルロータウイルス（ＭＭＵ１８
００６）およびイヌロータウイルス（ＣＵ−１）も同様
に血清型３のロータウイルスである。
【００３１】ｄ）ＳＴ４株，血清型４，約２％の糞便懸
濁液の型で用いられるか、ＡＧＭＫ細胞の中で増殖させ
る。
濁液の型で用いられるか、ＡＧＭＫ細胞の中で増殖させ
る。
【００３２】動物ロータウイルスの場合と同様に、ヒト
の株を揚げたことはこの発明の範囲を限定するためのも
のではない。ロータウイルスの新しい血清型が同定され
るにつれ、この発明の方法を用いて新しいワクチンを開
発することは容易である。
の株を揚げたことはこの発明の範囲を限定するためのも
のではない。ロータウイルスの新しい血清型が同定され
るにつれ、この発明の方法を用いて新しいワクチンを開
発することは容易である。
【００３３】ヒト／ウシ組換体ロータウイルスはヒトロ
ータウイルスの血清型１を示すとともに、ウシロータウ
イルスのＵＫ遺伝子も含んでいる。それはＨＤ／ＢＲＶ
−１，クローン４７−１−１，１９８３年６月１６日と
呼称される。
ータウイルスの血清型１を示すとともに、ウシロータウ
イルスのＵＫ遺伝子も含んでいる。それはＨＤ／ＢＲＶ
−１，クローン４７−１−１，１９８３年６月１６日と
呼称される。
【００３４】組換えに用いられる動物およびヒト双方の
ロータウイルスは、培養細胞への接種に先立って約０．
５μｇ／ｍｌのトリプシンを用いて前処理される。培養
不可能かほとんど培養不可能なヒトロータウイルスは単
層培養のＡＧＭＫ細胞の上へと遠心される。この操作に
より細胞に入るウイルスの量が増す、換言すると感染の
多様化が促進される。続いてＡＧＭＫ細胞は適当な動物
ロータウイルス株によって同時感染を受ける。混合した
ウイルスを増殖させ、３７℃で約３６時間かけて組換え
を行なう。１日半から２日の後に感染させた細胞を回収
し、凍結する。感染させた培養細胞から回収するウイル
スは、続いて３７℃で１時間トリプシン（１０μｇ／ｍ
ｌ）と共に培養する。次に動物ロータウイルスを標的と
して、１：１００または１：５００に希釈した高い特異
性のある超免疫抗体と共に３７℃で１時間の培養を追加
して行なう。抗体を用いた処理は最も重要な段階である
ので、次の段落でさらに詳細に考察する。個々のウイル
スプラークを４ないし７日後採取し、続いてウイルスを
精製して、均質な懸濁液を調製する。プラークで精製し
たロータウイルス組換体において、遺伝子型（どの遺伝
子がどの親株から由来するかで定義される）および表現
型（プラーク半減アッセイで血清型が定義される）を決
定する。精製したウイルス調製物を種の懸濁液として増
殖させ、ワクチン前駆体または弱毒化生ワクチンを製造
するために薬剤として適当な培地に混合させる。精製し
たワクチンを連続的に継代接種し、その結果、行きたま
まの弱毒化ワクチンからワクチン前駆体が製造される。
ロータウイルスは、培養細胞への接種に先立って約０．
５μｇ／ｍｌのトリプシンを用いて前処理される。培養
不可能かほとんど培養不可能なヒトロータウイルスは単
層培養のＡＧＭＫ細胞の上へと遠心される。この操作に
より細胞に入るウイルスの量が増す、換言すると感染の
多様化が促進される。続いてＡＧＭＫ細胞は適当な動物
ロータウイルス株によって同時感染を受ける。混合した
ウイルスを増殖させ、３７℃で約３６時間かけて組換え
を行なう。１日半から２日の後に感染させた細胞を回収
し、凍結する。感染させた培養細胞から回収するウイル
スは、続いて３７℃で１時間トリプシン（１０μｇ／ｍ
ｌ）と共に培養する。次に動物ロータウイルスを標的と
して、１：１００または１：５００に希釈した高い特異
性のある超免疫抗体と共に３７℃で１時間の培養を追加
して行なう。抗体を用いた処理は最も重要な段階である
ので、次の段落でさらに詳細に考察する。個々のウイル
スプラークを４ないし７日後採取し、続いてウイルスを
精製して、均質な懸濁液を調製する。プラークで精製し
たロータウイルス組換体において、遺伝子型（どの遺伝
子がどの親株から由来するかで定義される）および表現
型（プラーク半減アッセイで血清型が定義される）を決
定する。精製したウイルス調製物を種の懸濁液として増
殖させ、ワクチン前駆体または弱毒化生ワクチンを製造
するために薬剤として適当な培地に混合させる。精製し
たワクチンを連続的に継代接種し、その結果、行きたま
まの弱毒化ワクチンからワクチン前駆体が製造される。
【００３５】ウイルスの弱毒化は動物とヒトの遺伝子を
組換えることによって達成されるであろうし、さらに毒
力を弱めることはアフリカミドリザル腎の培養細胞へ繰
返し継代接種することによって可能となろう。ウイルス
の精製はプラークを形成させることによって行ない、そ
して形成されたプラークは生きたままのウイルスの無菌
製剤を調製するために、当該分野では公知の手法によ
り、適当な溶媒に溶解するか、加えることができる。同
じようなワクチンの実際の調製法は、Remington's Phar
maceutical Sciences (the Philadelphia College of P
harmacy and Science 出版、Mack Printing Co., Easta
n ，ＰＡ印刷），１６版，１９８０年，１３３１−１３
３５頁のウイルスワクチン（Virus Vaccine)に関する節
に示されている。
組換えることによって達成されるであろうし、さらに毒
力を弱めることはアフリカミドリザル腎の培養細胞へ繰
返し継代接種することによって可能となろう。ウイルス
の精製はプラークを形成させることによって行ない、そ
して形成されたプラークは生きたままのウイルスの無菌
製剤を調製するために、当該分野では公知の手法によ
り、適当な溶媒に溶解するか、加えることができる。同
じようなワクチンの実際の調製法は、Remington's Phar
maceutical Sciences (the Philadelphia College of P
harmacy and Science 出版、Mack Printing Co., Easta
n ，ＰＡ印刷），１６版，１９８０年，１３３１−１３
３５頁のウイルスワクチン（Virus Vaccine)に関する節
に示されている。
【００３６】モノクローナル抗体および超免疫抗血清 ヒトの培養不可能なロータウイルスの親株と動物のロー
タウイルスの親株から由来する組換体に関して、この発
明の重要な特徴は、混合感染させた子株を中和抗体で処
理することにある。これは高い特異性のある抗体を用い
て行なわれるが、この抗体は動物ロータウイルスの親株
を中和する。サル（ＲＲＶ）およびイヌ（ＣＵ−１）ロ
ータウイルスの場合、望ましい抗体はサルロータウイル
スの３８Ｋｄ糖タンパクに結合する３種の異なった抗体
の混合物から成っている。これらのモノクローナル抗体
は高力価であり、イヌロータウイルスおよび他の型の３
種のウイルスと明らかに交差反応をおこす。アカゲザル
に対するこれらのモノクローナル抗体を開発する過程に
おいて、３９種のモノクローナル抗体のうち３種のみ
が、血清型特異的に中和活性のある抗体を誘導しまたは
それと反応する８番目または９番目の遺伝子産物に相当
する重要な３８Ｋｄの外側にあるキャプシドの糖タンパ
クと沈降反応を起こすことが明らかになった。ウシロー
タウイルス（ＵＫ）の場合、ウシロータウイルスを使っ
て調製される交差反応陽性の抗血清が用いられる。この
抗血清は高力価でウシロータウイルスの３８Ｋｄ糖タン
パンと明らかに交差反応を起こすが、ウシロータウイル
ス（ＵＫ）の８２Ｋｄタンパクを標的とした中和活性を
ほとんどかまたは全く示さない。
タウイルスの親株から由来する組換体に関して、この発
明の重要な特徴は、混合感染させた子株を中和抗体で処
理することにある。これは高い特異性のある抗体を用い
て行なわれるが、この抗体は動物ロータウイルスの親株
を中和する。サル（ＲＲＶ）およびイヌ（ＣＵ−１）ロ
ータウイルスの場合、望ましい抗体はサルロータウイル
スの３８Ｋｄ糖タンパクに結合する３種の異なった抗体
の混合物から成っている。これらのモノクローナル抗体
は高力価であり、イヌロータウイルスおよび他の型の３
種のウイルスと明らかに交差反応をおこす。アカゲザル
に対するこれらのモノクローナル抗体を開発する過程に
おいて、３９種のモノクローナル抗体のうち３種のみ
が、血清型特異的に中和活性のある抗体を誘導しまたは
それと反応する８番目または９番目の遺伝子産物に相当
する重要な３８Ｋｄの外側にあるキャプシドの糖タンパ
クと沈降反応を起こすことが明らかになった。ウシロー
タウイルス（ＵＫ）の場合、ウシロータウイルスを使っ
て調製される交差反応陽性の抗血清が用いられる。この
抗血清は高力価でウシロータウイルスの３８Ｋｄ糖タン
パンと明らかに交差反応を起こすが、ウシロータウイル
ス（ＵＫ）の８２Ｋｄタンパクを標的とした中和活性を
ほとんどかまたは全く示さない。
【００３７】中和活性のあるモノクローナル抗体に関し
て、この発明では、９５４／１５９／３３，９５４／９
６／１８，および９５２／３／６８が利用されている。
これらのモノクローナル抗体を単独でまたは複数組合わ
せて利用することができる。それらはすべて重要な３８
Ｋｄの外側にあるキャプシドの糖タンパクを沈降させる
ことを目的とするが、その糖タンパクは、中和活性のあ
る抗体を誘導しまたはそれと反応するタンパクの遺伝情
報を指定する８番目または９番目の遺伝子産物に相当す
る。
て、この発明では、９５４／１５９／３３，９５４／９
６／１８，および９５２／３／６８が利用されている。
これらのモノクローナル抗体を単独でまたは複数組合わ
せて利用することができる。それらはすべて重要な３８
Ｋｄの外側にあるキャプシドの糖タンパクを沈降させる
ことを目的とするが、その糖タンパクは、中和活性のあ
る抗体を誘導しまたはそれと反応するタンパクの遺伝情
報を指定する８番目または９番目の遺伝子産物に相当す
る。
【００３８】同様にこの発明の高力価の超免疫抗体に関
して、これはテンジクネズミで調製される高力価の超免
疫抗体から選ばれる。注目すべきことに、上記のモノク
ローナル抗体はこの出願書を提出する時点で公知であり
利用されているモノクローナル抗体に由来する。さらに
注目すべきことは、従来この型のワクチン前駆体が、産
物が常に生きたまま弱毒化されたウイルスであるよう
に、既知のウイルスまたは既知の感染性ウイルスの遺伝
的組換えおよび連続的継代接種を必要とすることであ
る。前記のごとく、前駆体は無菌的なワクチンを製造す
るための従来の方法により生じ得るプラークの形で得ら
れる。
して、これはテンジクネズミで調製される高力価の超免
疫抗体から選ばれる。注目すべきことに、上記のモノク
ローナル抗体はこの出願書を提出する時点で公知であり
利用されているモノクローナル抗体に由来する。さらに
注目すべきことは、従来この型のワクチン前駆体が、産
物が常に生きたまま弱毒化されたウイルスであるよう
に、既知のウイルスまたは既知の感染性ウイルスの遺伝
的組換えおよび連続的継代接種を必要とすることであ
る。前記のごとく、前駆体は無菌的なワクチンを製造す
るための従来の方法により生じ得るプラークの形で得ら
れる。
【００３９】１型のヒトロータウイルスのＤＳ−１株，
２型のヒトロータウイルスのＷＡ株およびウシロータウ
イルスのＮＣＤＶ（リンカン）株に対する超免疫抗体は
テンジクネズミで調製された。ウシおよびＤＳ−１ロー
タウイルスはショ糖勾配遠心法によって部分的に精製さ
れ、フロインド完全アジュバントの中に入れて注射され
た。ヒトロータウイルスの組織培養に適用したＷＡ突然
変異体はショ糖を通した遠心によって部分的に精製さ
れ、同様にフロインド完全アジュバントの中に入れて注
射された。三週間後ウイルスをフロインド不完全アジュ
バントの中に入れて注射し、さらに３週間後最後にアジ
ュバントなしでウイルスを接種した。１型ヒトウイルス
は感染されたノトバイオートの子ウシの糞便から精製さ
れ、一方２型のヒトウイルスはＡＧＭＫ培養細胞中で増
殖させた。ウシロータウイルスのＮＣＤＶ株はＡＧＭＫ
細胞の中で増殖させた。
２型のヒトロータウイルスのＷＡ株およびウシロータウ
イルスのＮＣＤＶ（リンカン）株に対する超免疫抗体は
テンジクネズミで調製された。ウシおよびＤＳ−１ロー
タウイルスはショ糖勾配遠心法によって部分的に精製さ
れ、フロインド完全アジュバントの中に入れて注射され
た。ヒトロータウイルスの組織培養に適用したＷＡ突然
変異体はショ糖を通した遠心によって部分的に精製さ
れ、同様にフロインド完全アジュバントの中に入れて注
射された。三週間後ウイルスをフロインド不完全アジュ
バントの中に入れて注射し、さらに３週間後最後にアジ
ュバントなしでウイルスを接種した。１型ヒトウイルス
は感染されたノトバイオートの子ウシの糞便から精製さ
れ、一方２型のヒトウイルスはＡＧＭＫ培養細胞中で増
殖させた。ウシロータウイルスのＮＣＤＶ株はＡＧＭＫ
細胞の中で増殖させた。
【００４０】試験法 動物ロータウイルスを中和し、３８Ｋｄの糖タンパク
（８番目または９番目の遺伝子産物）を免疫的に沈降さ
せるかもしれない抗体は免疫沈降および中和の試験によ
って、上記の必要事項を満たすようなモノクローンから
選択することができる。J.Virology. ，４７：２６５−
２７６，１９８３に見られるグリーンバーグの論文「ア
カゲザルの２種の表面タンパクに結合するモノクローナ
ル抗体の産生と予備試験」において、一群の３９種の抗
体が記載されているが、そのうち３６種は、４番目の遺
伝子の産物でありウイルスの血球凝集素でもある８２Ｋ
ｄの外側にあるキャプシドのタンパクを免疫的に沈降さ
せる。３９種のうち３種のモノクローナル抗体のみがア
カゲザルロータウイルスの中和反応に対し高力価を示し
得なかった。またその３種にはＨＩ活性があった。３６
種は血球の凝集阻害を示し、アカゲザルロータウイルス
の中和反応反応に対し中程度または高い力価を示した。
（８番目または９番目の遺伝子産物）を免疫的に沈降さ
せるかもしれない抗体は免疫沈降および中和の試験によ
って、上記の必要事項を満たすようなモノクローンから
選択することができる。J.Virology. ，４７：２６５−
２７６，１９８３に見られるグリーンバーグの論文「ア
カゲザルの２種の表面タンパクに結合するモノクローナ
ル抗体の産生と予備試験」において、一群の３９種の抗
体が記載されているが、そのうち３６種は、４番目の遺
伝子の産物でありウイルスの血球凝集素でもある８２Ｋ
ｄの外側にあるキャプシドのタンパクを免疫的に沈降さ
せる。３９種のうち３種のモノクローナル抗体のみがア
カゲザルロータウイルスの中和反応に対し高力価を示し
得なかった。またその３種にはＨＩ活性があった。３６
種は血球の凝集阻害を示し、アカゲザルロータウイルス
の中和反応反応に対し中程度または高い力価を示した。
【００４１】実施例１ 中和アッセイ：培養ハイブリドーマからの上澄液、選択
されたハイブリドーマを接種したマウスからの腹水およ
び前接種したマウスの血清の力価を標準６０％プラーク
半減法により測定した。トリプシンで活性化され、１５
ないし８０プラーク形成単位（ＰＦＵ）を表わす２００
μｌのウイルスを、２倍または４倍と逓減希釈（ＭＥＭ
により）したモノクローナル抗体２００μｌと混合し
た。３７℃で１時間培養したあと、その混合物をＭＡ１
０４単層細胞の上に接種し、そして１時間吸着させた。
続いてトレイの穴を一度洗い、ＥＭＥＭアガロースを重
層した。３ないし６日後、ニュートラルレッドを含むア
ガロース層を重層し、プラークの数を測定した。ネガテ
ィブ対照には、ＮＳ１上澄液とモノクローナル培養液
（ＨＡＴ）で培養したウイルスとを混合したウイルス、
および前培養したマウス血清と混合したウイルスが含ま
れた。
されたハイブリドーマを接種したマウスからの腹水およ
び前接種したマウスの血清の力価を標準６０％プラーク
半減法により測定した。トリプシンで活性化され、１５
ないし８０プラーク形成単位（ＰＦＵ）を表わす２００
μｌのウイルスを、２倍または４倍と逓減希釈（ＭＥＭ
により）したモノクローナル抗体２００μｌと混合し
た。３７℃で１時間培養したあと、その混合物をＭＡ１
０４単層細胞の上に接種し、そして１時間吸着させた。
続いてトレイの穴を一度洗い、ＥＭＥＭアガロースを重
層した。３ないし６日後、ニュートラルレッドを含むア
ガロース層を重層し、プラークの数を測定した。ネガテ
ィブ対照には、ＮＳ１上澄液とモノクローナル培養液
（ＨＡＴ）で培養したウイルスとを混合したウイルス、
および前培養したマウス血清と混合したウイルスが含ま
れた。
【００４２】結果。以前の研究が示すところによれば、
固相ＲＩＡによりモノクローンを篩分けたため、６番目
の遺伝子による４２Ｋｄの産物であるロータウイルスの
主要な内部構造タンパクを規定するハイブリドーマの優
先的選択が可能となった。それ故、ＨＩアッセイがＲＲ
Ｖの表面タンパクに結合するモノクローナル抗体を単離
するための第１の篩分け手法として選ばれた。最初に１
０００穴の中からＨＩにより篩分けられ、ＨＩ活性のあ
る３９種の異なったモノクローナル抗体が最終的にクロ
ーニングされ、そしてさらに解析をするために増殖させ
て量を増やした。
固相ＲＩＡによりモノクローンを篩分けたため、６番目
の遺伝子による４２Ｋｄの産物であるロータウイルスの
主要な内部構造タンパクを規定するハイブリドーマの優
先的選択が可能となった。それ故、ＨＩアッセイがＲＲ
Ｖの表面タンパクに結合するモノクローナル抗体を単離
するための第１の篩分け手法として選ばれた。最初に１
０００穴の中からＨＩにより篩分けられ、ＨＩ活性のあ
る３９種の異なったモノクローナル抗体が最終的にクロ
ーニングされ、そしてさらに解析をするために増殖させ
て量を増やした。
【００４３】ＨＩ活性のある３９種のモノクローナル抗
体のうち３６種がＲＲＶ細胞溶解質からの８２Ｋｄタン
パクを沈降させた。さらに、これらのモノクローナル抗
体は沈降反応において、７０ないし７５Ｋｄ範囲に相当
する１ないし３本のあまり強くない沈降線を示した。８
２Ｋｄタンパクを沈降させるこれらのモノクローナル抗
体の力価を血球を凝集させる様々なロータウイルスに対
するＨＩによって測定した。どれもＨＩアッセイにおい
て、同じように高い特異性を示した。サルＳＡＬＬロー
タウイルスとブタＯＳＵロータウイルスとの低いレベル
の交差反応がいくつかの例で観察された。８２Ｋｄのタ
ンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体も、ＲＲＶ
に対する標準プラーク半減中和アッセイにより検定し
た。中和活性は、１：２０の希釈で試験したこれらのモ
ノクローナル培養細胞の上澄液では検出されなかった。
ハイブリドーマ細胞培養の上澄液には中和活性は検出さ
れなかったため、８２Ｋｄタンパクに対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を接種したマウ
スから採取した腹水液がプラーク半減中和法により試験
された。ＲＲＶに対する腹水液のＨＩ力価は培養液上澄
の力価より１０２から１０３．５倍高かった。プラーク
半減中和アッセイで試験したとき、中程度から高度のレ
ベルの中和活性が腹水液で検出された。それぞれのマウ
スの前培養した血清のＲＲＶに対する中和抗体の力価は
１：５００よりも低かった。異種のウイルスに対する限
定した中和試験において、中和活性はＲＲＶ株を免疫に
用いた場合、高い特異性が見られた。これらのモノクロ
ーナル抗体の中和活性は、感染力を高める濃度でＲＲＶ
をトリプシン処理することでは影響をうけなかった。抗
血球抗体を産生するハイブリドーマを使ったプラーク半
減アッセイの特異的な特徴は、ウイルスの一部の分画
（１０ないし２０％）が試験に用いられた腹水液のいか
なる濃度でも中和されなかったということであった。
体のうち３６種がＲＲＶ細胞溶解質からの８２Ｋｄタン
パクを沈降させた。さらに、これらのモノクローナル抗
体は沈降反応において、７０ないし７５Ｋｄ範囲に相当
する１ないし３本のあまり強くない沈降線を示した。８
２Ｋｄタンパクを沈降させるこれらのモノクローナル抗
体の力価を血球を凝集させる様々なロータウイルスに対
するＨＩによって測定した。どれもＨＩアッセイにおい
て、同じように高い特異性を示した。サルＳＡＬＬロー
タウイルスとブタＯＳＵロータウイルスとの低いレベル
の交差反応がいくつかの例で観察された。８２Ｋｄのタ
ンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体も、ＲＲＶ
に対する標準プラーク半減中和アッセイにより検定し
た。中和活性は、１：２０の希釈で試験したこれらのモ
ノクローナル培養細胞の上澄液では検出されなかった。
ハイブリドーマ細胞培養の上澄液には中和活性は検出さ
れなかったため、８２Ｋｄタンパクに対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を接種したマウ
スから採取した腹水液がプラーク半減中和法により試験
された。ＲＲＶに対する腹水液のＨＩ力価は培養液上澄
の力価より１０２から１０３．５倍高かった。プラーク
半減中和アッセイで試験したとき、中程度から高度のレ
ベルの中和活性が腹水液で検出された。それぞれのマウ
スの前培養した血清のＲＲＶに対する中和抗体の力価は
１：５００よりも低かった。異種のウイルスに対する限
定した中和試験において、中和活性はＲＲＶ株を免疫に
用いた場合、高い特異性が見られた。これらのモノクロ
ーナル抗体の中和活性は、感染力を高める濃度でＲＲＶ
をトリプシン処理することでは影響をうけなかった。抗
血球抗体を産生するハイブリドーマを使ったプラーク半
減アッセイの特異的な特徴は、ウイルスの一部の分画
（１０ないし２０％）が試験に用いられた腹水液のいか
なる濃度でも中和されなかったということであった。
【００４４】ＲＲＶの４番目の遺伝子は、８２Ｋｄタン
パクの遺伝情報を指定する遺伝子であると同定された。
それは固相ＲＩＡにおいて、８２Ｋｄタンパクを沈降さ
せる選別されたモノクローナル抗体と、様々なＲＲＶと
ＵＫウシロータウイルスとの組換体とを反応させること
により同定された。これらのモノクローナル抗体は固相
ＲＩＡにおいてＲＲＶと特異的に反応したが、ＵＫウシ
ウイルスとは結合し得なかったので、組換体とそれらの
結合が８２Ｋｄタンパクの由来となる遺伝子を決定する
ために用いられ得た。組換体の遺伝型も表現型も双方と
も過去に研究されていた。ＵＫウシロータウイルス親株
は赤血球を凝集させないが、ＲＲＶは凝集させる。ＲＲ
Ｖ親株由来の４番目の遺伝子をもつ組換体は赤血球を凝
集させたが、４番目の遺伝子がＵＫウシロータウイルス
由来の組換体は赤血球凝集反応を示さなかった。８２Ｋ
ｄタンパクを沈降させたモノクローナル抗体は、ＲＩＡ
において赤血球凝集タンパクを含んだ組換体すなわち４
番目の遺伝子がアカゲザルロータウイルスから由来する
組換体のみと反応した。他のすべてのロータウイルスの
遺伝子は、これらのモノクローナル抗体と反応したタン
パクの遺伝情報を指定しているものではあり得なかっ
た。
パクの遺伝情報を指定する遺伝子であると同定された。
それは固相ＲＩＡにおいて、８２Ｋｄタンパクを沈降さ
せる選別されたモノクローナル抗体と、様々なＲＲＶと
ＵＫウシロータウイルスとの組換体とを反応させること
により同定された。これらのモノクローナル抗体は固相
ＲＩＡにおいてＲＲＶと特異的に反応したが、ＵＫウシ
ウイルスとは結合し得なかったので、組換体とそれらの
結合が８２Ｋｄタンパクの由来となる遺伝子を決定する
ために用いられ得た。組換体の遺伝型も表現型も双方と
も過去に研究されていた。ＵＫウシロータウイルス親株
は赤血球を凝集させないが、ＲＲＶは凝集させる。ＲＲ
Ｖ親株由来の４番目の遺伝子をもつ組換体は赤血球を凝
集させたが、４番目の遺伝子がＵＫウシロータウイルス
由来の組換体は赤血球凝集反応を示さなかった。８２Ｋ
ｄタンパクを沈降させたモノクローナル抗体は、ＲＩＡ
において赤血球凝集タンパクを含んだ組換体すなわち４
番目の遺伝子がアカゲザルロータウイルスから由来する
組換体のみと反応した。他のすべてのロータウイルスの
遺伝子は、これらのモノクローナル抗体と反応したタン
パクの遺伝情報を指定しているものではあり得なかっ
た。
【００４５】３９種のモノクローナル抗体のうち３種に
ＨＩ活性があったが、８２Ｋｄのタンパクは沈降させな
かった。これら３種のモノクローナル抗体は免疫沈降反
応を生じ、ＲＲＶの主要な内部構造タンパクである４２
Ｋｄの少し前に移動した３８Ｋｄのバンドを示した。ト
ウニカマイシン処理の細胞溶解質を使った実験により、
このバンドには糖鎖が結合してることが示され、また糖
鎖が結合していない前駆体タンパクはトウニカマイシン
処理の溶解質の中でモノクローナル抗体によって沈降反
応を起こすことが示された。これら３種のモノクローナ
ル抗体から得られる細胞培養上澄液の赤血球凝集反応
は、ＲＲＶ、イヌロータウイルスおよび程度は低いもの
のＳＡ−１１によって阻害された。８２Ｋｄタンパクを
標的としたハイブリドーマとは異なって、これら３種の
ハイブリドーマからのモノクローナル細胞培養上澄液は
ＲＲＶ（力価，１：１６０または１：３２０）に対して
中和活性を示した。３種のモノクローナル抗体由来のマ
ウス腹水液は対応のアカゲザルロータウイルスに対して
高力価の中和活性を示した。８２Ｋｄタンパクに対する
モノクローナル抗体とは異なって、これらのモノクロー
ナル抗体は同様に血清学的に相関のあるイヌロータウイ
ルスおよびＳＡ−１１ロータウイルスを効果的に中和し
た。同様に血清学的にＲＲＶと相関のあるヒトロータウ
イルスのＰ株も３種のモノクローナル抗体のうちの２種
によって中和された。血清学的に異なっているウシＵＫ
株およびヒトＷＡ株は中和されなかった。１：２０００
以下の希釈度で３８Ｋｄ糖タンパクに対するこれら３種
のモノクローンはＲＲＶを完全に中和した（１００％プ
ラーク半減）。
ＨＩ活性があったが、８２Ｋｄのタンパクは沈降させな
かった。これら３種のモノクローナル抗体は免疫沈降反
応を生じ、ＲＲＶの主要な内部構造タンパクである４２
Ｋｄの少し前に移動した３８Ｋｄのバンドを示した。ト
ウニカマイシン処理の細胞溶解質を使った実験により、
このバンドには糖鎖が結合してることが示され、また糖
鎖が結合していない前駆体タンパクはトウニカマイシン
処理の溶解質の中でモノクローナル抗体によって沈降反
応を起こすことが示された。これら３種のモノクローナ
ル抗体から得られる細胞培養上澄液の赤血球凝集反応
は、ＲＲＶ、イヌロータウイルスおよび程度は低いもの
のＳＡ−１１によって阻害された。８２Ｋｄタンパクを
標的としたハイブリドーマとは異なって、これら３種の
ハイブリドーマからのモノクローナル細胞培養上澄液は
ＲＲＶ（力価，１：１６０または１：３２０）に対して
中和活性を示した。３種のモノクローナル抗体由来のマ
ウス腹水液は対応のアカゲザルロータウイルスに対して
高力価の中和活性を示した。８２Ｋｄタンパクに対する
モノクローナル抗体とは異なって、これらのモノクロー
ナル抗体は同様に血清学的に相関のあるイヌロータウイ
ルスおよびＳＡ−１１ロータウイルスを効果的に中和し
た。同様に血清学的にＲＲＶと相関のあるヒトロータウ
イルスのＰ株も３種のモノクローナル抗体のうちの２種
によって中和された。血清学的に異なっているウシＵＫ
株およびヒトＷＡ株は中和されなかった。１：２０００
以下の希釈度で３８Ｋｄ糖タンパクに対するこれら３種
のモノクローンはＲＲＶを完全に中和した（１００％プ
ラーク半減）。
【００４６】３８Ｋｄ糖タンパクを免疫沈降させるモノ
クローナル抗体は、固相ＲＩＡにおいてＲＲＶと特異的
に反応しＵＫロータウイルスとは反応しないので、８２
Ｋｄタンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体に対
して用いたように同じような技術を用いることができ
た。過去の研究において示されたことは、血清型は一次
的に８番目または９番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片
の情報が発現したものであるが、ウイルスの赤血球凝集
素の遺伝情報は４番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片に
よって指定されているということであった。固相ＲＩＡ
で試験したとき、ＲＲＶとＵＫウシロータウイルスの組
換体が赤血球凝集反応を起こさせたか起こさせなかった
かにかかわらず、３８Ｋｄ糖タンパクに対するモノクロ
ーナル抗体は、血清型としてアカゲザルロータウイルス
であるその組換体にのみ結合した。組換体の遺伝子型が
固相放射免疫アッセイにおいてモノクローナル結合と相
関していたので、モノクローナル抗体の結合は、組換体
においてアカゲザルロータウイルスに由来する８番目ま
たは９番目の遺伝子が存在することと関係があることが
明らかとなった。これら２つの遺伝子は組換体の中で分
化することはあり得なかった。これらのデータは３８Ｋ
ｄ糖タンパクがこれら２つの遺伝子断片の１つからの産
物であることを示していた。
クローナル抗体は、固相ＲＩＡにおいてＲＲＶと特異的
に反応しＵＫロータウイルスとは反応しないので、８２
Ｋｄタンパクを免疫沈降させるモノクローナル抗体に対
して用いたように同じような技術を用いることができ
た。過去の研究において示されたことは、血清型は一次
的に８番目または９番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片
の情報が発現したものであるが、ウイルスの赤血球凝集
素の遺伝情報は４番目の遺伝子に対応するＲＮＡ断片に
よって指定されているということであった。固相ＲＩＡ
で試験したとき、ＲＲＶとＵＫウシロータウイルスの組
換体が赤血球凝集反応を起こさせたか起こさせなかった
かにかかわらず、３８Ｋｄ糖タンパクに対するモノクロ
ーナル抗体は、血清型としてアカゲザルロータウイルス
であるその組換体にのみ結合した。組換体の遺伝子型が
固相放射免疫アッセイにおいてモノクローナル結合と相
関していたので、モノクローナル抗体の結合は、組換体
においてアカゲザルロータウイルスに由来する８番目ま
たは９番目の遺伝子が存在することと関係があることが
明らかとなった。これら２つの遺伝子は組換体の中で分
化することはあり得なかった。これらのデータは３８Ｋ
ｄ糖タンパクがこれら２つの遺伝子断片の１つからの産
物であることを示していた。
【００４７】３８Ｋｄ糖タンパクを標的とするモノクロ
ーナル抗体にはＨＩ活性はあるが、35Ｓでラベルした細
胞溶解質でまたは固相ＲＩＡでウイルスの赤血球凝集素
と結合しなかったようなので、モノクローナル抗体を使
って、選択された組換体による赤血球凝集反応をその抗
体がどのくらい阻害する力があるかを調べる試験を行な
った。３８Ｋｄタンパクを沈降させ、８番目または９番
目のＲＲＶの遺伝子産物に結合したモノクローナル抗体
９５４／１５９／３３および９５２／３／６８は、組換
体がアカゲザルロータウイルス中和血清型を示したとき
のみＨＩ活性を発揮した。
ーナル抗体にはＨＩ活性はあるが、35Ｓでラベルした細
胞溶解質でまたは固相ＲＩＡでウイルスの赤血球凝集素
と結合しなかったようなので、モノクローナル抗体を使
って、選択された組換体による赤血球凝集反応をその抗
体がどのくらい阻害する力があるかを調べる試験を行な
った。３８Ｋｄタンパクを沈降させ、８番目または９番
目のＲＲＶの遺伝子産物に結合したモノクローナル抗体
９５４／１５９／３３および９５２／３／６８は、組換
体がアカゲザルロータウイルス中和血清型を示したとき
のみＨＩ活性を発揮した。
【００４８】実施例２ 超免疫テンジクネズミ抗血清：ウシロータウイルスおよ
びヒトロータウイルス（１型および２型）に対して調製
された抗血清は、プラーク半減法によって検定されたと
き非常に特異的であった。ウシウイルス血清の対応の力
価は、１型の組織培養に適応したＷＡヒトロータウイル
スに対するその力価よりも少なくとも１０００倍高かっ
た。これが意味することは、この抗血清が同一の懸濁液
に存在するかもしれない１型ヒトロータウイルス特異性
のあるウイルスに影響を与えずにウシ抗原特異性のある
ウイルスを選択的に中和するために用いられ得ることで
あった。１型および２型ヒトロータウイルス抗血清も強
力かつ特異的であった。注目すべきことに、強力な抗ウ
シ（ＮＣＤＶ）抗血清のみが、８２−８８Ｋｄ表面タン
パクとではなく３４−３８Ｋｄタンパクと相互作用する
ことによってウシロータウイルス（ＵＫ）を中和する。
実際、２種のウイルスの８２−８８Ｋｄタンパクは、中
和によって検定されると、抗原としては異なっている。
びヒトロータウイルス（１型および２型）に対して調製
された抗血清は、プラーク半減法によって検定されたと
き非常に特異的であった。ウシウイルス血清の対応の力
価は、１型の組織培養に適応したＷＡヒトロータウイル
スに対するその力価よりも少なくとも１０００倍高かっ
た。これが意味することは、この抗血清が同一の懸濁液
に存在するかもしれない１型ヒトロータウイルス特異性
のあるウイルスに影響を与えずにウシ抗原特異性のある
ウイルスを選択的に中和するために用いられ得ることで
あった。１型および２型ヒトロータウイルス抗血清も強
力かつ特異的であった。注目すべきことに、強力な抗ウ
シ（ＮＣＤＶ）抗血清のみが、８２−８８Ｋｄ表面タン
パクとではなく３４−３８Ｋｄタンパクと相互作用する
ことによってウシロータウイルス（ＵＫ）を中和する。
実際、２種のウイルスの８２−８８Ｋｄタンパクは、中
和によって検定されると、抗原としては異なっている。
【００４９】この明細書および請求の範囲において、培
養不可能なヒトロータウイルスの定義にはほとんど培養
不可能なヒトロータウイルスも含まれる。
養不可能なヒトロータウイルスの定義にはほとんど培養
不可能なヒトロータウイルスも含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リチヤード・グレゴリイ・ウヤツト アメリカ合衆国 メリーランド 20854 ポトマツク、オールド・カナル・ロード 12333 (72)発明者 アルバート・ザアベン・カピキアン アメリカ合衆国 メリーランド 20852 ロツクビレ、マークリツフ・ロード 11201 (72)発明者 アンソニー・アール・カリカ アメリカ合衆国 メリーランド州 20852 ロツクビレ、ハーリントン・ロード 732 (72)発明者 カレン・ミドサン アメリカ合衆国 メリーランド州 21782 シヤープスバーグ、ボツクス 93 エ ー・ルート １ (72)発明者 ロバート・メリツト・チヤノツク アメリカ合衆国 メリーランド州 20817 ベセスダ、ロングウツド・ドライブ 7001
Claims (8)
- 【請求項１】培養不可能なヒトロータウイルス親株を培
養可能な動物ロータウイルス親株と共に同時感染させる
ことによりヒトロータウイルス／動物ロータウイルス組
換体の親株を得、 該組換体を有する親株を、動物ロータウイルスの38ｋｄ
糖タンパクに特異的に結合し、かつ動物ロータウイルス
親株を中和するモノクローナル抗体もしくは超免疫テン
ジクネズミ抗血清で中和し、およびプラークを経てワク
チンに適する形態に精製された、ヒトおよび動物の遺伝
子を含みかつヒトロータウイルスの抗原血清型を有する
組換体を調製する、ことを包含するワクチン前駆体とし
ての使用に適したロータウイルス組換体の調製方法。 - 【請求項２】抗体がモノクローナル抗体９５４／１５９
／３３、９５４／９６／１８および９５２／３／６８か
ら選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】培養不可能なヒトロータウイルス親株を培
養可能な動物ロータウイルス親株と共に同時感染させる
ことによりヒトロータウイルス／動物ロータウイルス組
換体の親株を得、 該組換体を有する親株を、動物ロータウイルスの38ｋｄ
糖タンパクに特異的に結合し、かつ動物ロータウイルス
親株を中和するモノクローナル抗体もしくは超免疫テン
ジクネズミ抗血清で中和し、およびプラークを経てワク
チンに適する形態に精製された、ヒトおよび動物の遺伝
子を含みかつヒトロータウイルスの抗原血清型を有する
組換体を調製する、ことを包含する方法により調製され
たワクチン前駆体としての使用に適したロータウイルス
組換体。 - 【請求項４】ヒトロータウイルス親株が、ヒトロータウ
イルスＤ株、血清型１；ＤＳ−１株、血清型２；Ｐ株、
血清型３；またはＳＴ４株、血清型４よりなる群の１種
から選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項５】動物ロータウイルスが、ウシ株ＵＫ、サル
株ＭＭＵ１８００６、またはイヌ株ＣＵ−１よりなる群
の１種から選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項６】培養不可能なヒトロータウイルス親株を培
養可能な動物ロータウイルス親株と共に同時感染させる
ことによりヒトロータウイルス／動物ロータウイルス組
換体の親株を得、 該組換体を有する親株を、動物ロータウイルスの38ｋｄ
糖タンパクに特異的に結合し、かつ動物ロータウイルス
親株を中和するモノクローナル抗体もしくは超免疫テン
ジクネズミ抗血清で中和し、およびプラークを経てワク
チンに適する形態に精製された、ヒトおよび動物の遺伝
子を含みかつヒトロータウイルスの抗原血清型を有する
組換体を調製する、ことを包含する方法により調製され
たワクチン前駆体としての使用に適したロータウイルス
組換体。 - 【請求項７】ヒトロータウイルス親株が、ヒトロータウ
イルスＤ株、血清型１；ＤＳ−１株、血清型２；Ｐ株、
血清型３；またはＳＴ４株、血清型４よりなる群の１種
から選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項８】動物ロータウイルスが、ウシ株ＵＫ、サル
株ＭＭＵ１８００６、またはイヌ株ＣＵ−１よりなる群
の１種から選ばれる請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US508323 | 1983-06-27 | ||
| US06/508,323 US4571385A (en) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59502691A Division JPH0757191B2 (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | ロータウイルス組換体の調製方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197761A true JPH06197761A (ja) | 1994-07-19 |
| JPH07112432B2 JPH07112432B2 (ja) | 1995-12-06 |
Family
ID=24022290
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59502691A Expired - Lifetime JPH0757191B2 (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | ロータウイルス組換体の調製方法 |
| JP5302103A Expired - Lifetime JPH07112432B2 (ja) | 1983-06-27 | 1993-12-01 | ロータウイルス組換体およびその調製方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59502691A Expired - Lifetime JPH0757191B2 (ja) | 1983-06-27 | 1984-06-27 | ロータウイルス組換体の調製方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4571385A (ja) |
| EP (1) | EP0130906B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0757191B2 (ja) |
| AT (1) | ATE65698T1 (ja) |
| AU (1) | AU584582B2 (ja) |
| CA (1) | CA1217422A (ja) |
| DE (2) | DE19975069I1 (ja) |
| FR (1) | FR99C0041I2 (ja) |
| LU (1) | LU90472I2 (ja) |
| NL (1) | NL990038I2 (ja) |
| WO (1) | WO1985000184A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| CA1339735C (en) * | 1984-04-27 | 1998-03-17 | Ian Hamilton Holmes. | Cloning and sequencing of the major outer capsid gylcoprotein gene of a human rotavirus |
| US5374426A (en) * | 1986-09-03 | 1994-12-20 | University Of Saskatchewan | Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions |
| US4927628A (en) * | 1987-09-21 | 1990-05-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against rotavirus diseases and method of preparing same |
| AU618973B2 (en) * | 1987-11-30 | 1992-01-16 | Children's Hospital Foundation, The | Novel rotavirus reassortant vaccine |
| US5626851A (en) | 1987-11-30 | 1997-05-06 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Rotavirus reassortant vaccine |
| WO1989006971A1 (en) * | 1988-02-01 | 1989-08-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio | Conserved rotavirus gene segments and use in immunization and neutralization |
| US5215745A (en) * | 1988-04-27 | 1993-06-01 | United Cancer Research Institute | Method for treating viral diseases with attenuated virus |
| CA2065847C (en) * | 1990-07-26 | 2002-02-12 | Stanley A. Plotkin | Rotavirus reassortant vaccine |
| KR0171434B1 (ko) * | 1990-11-16 | 1999-02-01 | 윌리엄 케이. 슈버트 | 인체 로타바이러스, 백신 및 방법 |
| US5610049A (en) * | 1991-05-01 | 1997-03-11 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Human rotavirus HCR3A and method of growing said rotavirus |
| DK1486211T3 (da) | 1993-04-30 | 2009-01-19 | Wellstat Biologics Corp | Sammensætninger til behandling af cancer ved anvendelse af vira |
| US7150984B2 (en) * | 1994-07-11 | 2006-12-19 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated human rotavirus vaccine |
| US5646033A (en) * | 1994-11-30 | 1997-07-08 | Dyncorp | African green monkey kidney cell lines useful for maintaining viruses and for preparation of viral vaccines |
| CN101318016B (zh) | 1998-07-28 | 2013-06-19 | 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国 | 多价人-牛轮状病毒疫苗 |
| CA2338001A1 (en) * | 1998-07-30 | 2000-02-10 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Gastrointestinal bacterial antibody factories |
| GB9919468D0 (en) * | 1999-08-17 | 1999-10-20 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| AR029643A1 (es) * | 1999-08-17 | 2003-07-10 | Smithkline Beecham Biolog | Poblacion de rotavirus atenuados, variantes y recombinantes de dichos rotavirus atenuados, metodo para producir dichas poblaciones de rotavirus purificadas, composiciones de vacunas que comprenden dichos virus atenuados, vivos, metodo para obtener dichas vacunas y un metodo para prevenir en el hombr |
| ATE462446T1 (de) | 2000-01-28 | 2010-04-15 | Us Gov Health & Human Serv | Immunogenischen zusammensetzung von lebendigen rotaviren mit verringertem risiko von nebenwirkungen |
| KR102374547B1 (ko) | 2021-05-31 | 2022-03-14 | 에스케이바이오사이언스(주) | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4009258A (en) * | 1972-09-25 | 1977-02-22 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Influenza vaccine containing a recombinant, antigenically hybridized virus and method of using the same |
| US3992522A (en) * | 1973-01-24 | 1976-11-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare | Temperature-sensitive recombinant mutant viruses and a process for producing same |
| US4341870A (en) * | 1980-11-19 | 1982-07-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Cultivatable human rotavirus type 2 |
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1983
- 1983-06-27 US US06/508,323 patent/US4571385A/en not_active Expired - Lifetime
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |