JPH06192265A - ４，１５−ジヒドロベルノダリン - Google Patents

４，１５−ジヒドロベルノダリン

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JPH06192265A
JPH06192265A JP4357979A JP35797992A JPH06192265A JP H06192265 A JPH06192265 A JP H06192265A JP 4357979 A JP4357979 A JP 4357979A JP 35797992 A JP35797992 A JP 35797992A JP H06192265 A JPH06192265 A JP H06192265A
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JP
Japan
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present
cells
substance
cell
vernodaline
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JP4357979A
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English (en)
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Hiroaki Takaoka
博昭 高岡
Naohiro Washida
尚洋 鷲田
Noriko Yoshida
紀子 吉田
Koichi Koshimizu
弘一 小清水
Hajime Daito
肇 大東
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 次の構造式： 【化１】 で示される４，15−ジヒドロベルノダリン。 【効果】 本発明により新規４，15−ジヒドロベルノダ
リンが提供される。本発明物質は抗腫瘍剤、免疫抑制剤
として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ベルノニア・アミグダ
リナより分離されるベルノダリンの温和な還元によって
合成することが可能である新規な４，15−ジヒドロベル
ノダリン（4,15-Dihydrovernodalin)に関する。本物質
は抗腫瘍剤や免疫抑制剤として有用である。
【０００２】
【従来の技術】近年、植物由来の抗癌剤の研究が進み、
新規な抗癌剤が提供されるようになり顕著な治療効果を
あげている。例えば、ニチニチソウ由来のビンクリスチ
ンやその誘導体であるビンブラスチンなどはその代表的
な例である。植物由来の抗腫瘍剤は、その熱帯地域の植
物から種々の物質が探索されているが、さらに新しい化
合物の探索が進められている。
【０００３】本発明者らは熱帯アフリカの薬用植物に関
する研究を進める過程で、霊長類が本能的に疾病時に特
定の植物を選択していることを観察し、これらの植物か
ら生理活性成分を抽出し、その薬理活性を確認してき
た。これらの植物のうち、熱帯アフリカに広く自生する
キク科灌木ベルノニア・アミグダリナ (Vernonia amygd
alina)は、野生チンパンジーが疾病時に採食し、やがて
病状の回復につながったことが明確に観察されている。
この観察に着目し、本発明者らは、その生理活性成分の
研究を行った。これらの生理活性成分のうち次の構造式
（II) ：
【０００４】
【化２】
【０００５】を有するセキステルペンの一種であるベル
ノダリンはクプチャン（Kupchan)らにより、ＫＢ細胞に
対するインビトロ抗腫瘍効果が確認されている (J. M.
Kupchan, et.al., The Journal of Organic Chemistry,
Vol. 34, 3908-3911(1969))。本発明者らは、すでにベ
ルノダリンがＫＢ細胞の他に、Ｐ−388 細胞、Ｌ−1210
細胞などに強い抗腫瘍効果を示すことを確認している。
このキク科灌木ベルノニア・アミグダリナは、西アフリ
カにおいては、その独特の苦味が好まれ、伝統的な民族
料理の材料として用いられており、安全性も高いと考え
られる。
【０００６】本発明者らはこのベルノダリンの生理活性
について研究を進めた結果、ベルノダリンの誘導体には
強い抗腫瘍活性が存在することを見い出した。特に本発
明により提供される新規化合物である４，15−ジヒドロ
ベルノダリンは、一連のベルノダリン誘導体と比較して
も強い抗腫瘍活性と免疫抑制活性を示すことを初めて見
い出した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
知見に基づいてなされたもので、新規な４，15−ジヒド
ロベルノダリンの提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、次の構造式
（Ｉ）：
【０００９】
【化３】
【００１０】で示される４，15−ジヒドロベルノダリン
に関する。本発明で提供される４，15−ジヒドロベルノ
ダリンは、上記クプチャンらの文献に基づいて、ベルノ
ニア・アミグダリナから抽出したベルノダリンから得る
ことができる。これを詳述すると、ベルノニア・アミグ
ダリナ乾燥葉からクロロホルム抽出、ｎ−ヘキサン・メ
タノール抽出、シリカゲルクロマトグラフィー、ＨＰＬ
Ｃ等により精製し、ベルノダリンを得る。このようにし
て精製されたベルノダリンは、無色の油状物質として得
られ、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸
エチル、ジメチルスルフォキシドなどの有機溶媒に溶解
し、水に不溶性の、前記構造式（II）を有する物質であ
る。
【００１１】本発明の４，15−ジヒドロベルノダリン
は、このベルノダリンを合成の出発物質として使用する
ことができる。ベルノダリンの４位、15位に選択的に水
素を導入することにより、本発明物質である４，15−ジ
ヒドロベルノダリンを合成することができる。水素化ホ
ウ素ナトリウム（NaBH4)を用いて温和な条件で反応させ
ることにより選択的に４位、15位の炭素間の二重結合部
位に水素が導入される。反応は、通常、メタノールなど
の有機溶媒に溶解させたベルノダリンに、還元剤NaBH4
を加え、室温〜０℃以下で緩やかに攪拌し反応させる。
反応終了後、酢酸などの酸を加え、反応溶液のpHを弱酸
性とした後、濾過後、逆相ＨＰＬＣにより分離精製を行
い、本発明物質を回収することができる。また溶媒抽出
などの手段を用いることもできる。
【００１２】本発明物質は下記の物理化学的特性を有す
る。 一般名；4, 15-Dihydrovernodalin 正式名；3aβ, 4, 5, 5a, 6, 9, 9aβ, 9bα-octahydro
-9-methyl-3-methylene-4β-(2-methylenehydracryloyl
oxy)5aβ-vinyl-2H-furo〔2, 3-f〕〔2〕benzopyran-2,
8(3H)-dione. 分子式：Ｃ19Ｈ22Ｏ7 色; 無色 性状; 油状、強い苦味を呈する。 旋光度; 〔α〕25 D ＋189.8°(C=2.74mg/ml, CHCl3) UV吸収; λmax (MeOH) nm (ε) :210 (ε29000) 赤外吸収; νmax (KBr) cm-1: 3350, 1780-1720 br, 16
40 FAB-MS; m/z: 363 ( 〔M+H〕+, NBA, C19H22O7 ＋H)1 H-NMR;δ (400MHz, CDCl3) ppm : 1.44 (3H, d, J=6.
7, H3-15),1.75 (1H, dd, J=15.3, 5.8Hz, H-9), 1.86
(1H, br.s, OH), 2.13 (1H, dd, J=15.0, 5.8Hz, H-9),
2.20 (1H, dd, J=10.6, 7.2Hz, H-5), 2.68 (1H, quin
tet,J= 7.0Hz, H-4), 3.06 (1H, ddt, J=11.6, 10.1,
3.2, 3.2Hz, H-7),4.01 (1H, dd, J=11.3, 11.0Hz, H-
6), 4.12 (1H, d, J=11.6, H-14),4.22 (1H, d, J=12.4
Hz, H-14), 4.35 (2H, s, H2-4'), 5.26 (1H, dt, J=1
0.1,5.8, 5.8Hz, H-8), 5.30 (1H, d, J=17.7Hz, H-2),
5.34 (1H, d, J=11.0Hz,H-2), 5.66 (1H, d, J=3.1Hz,
H-13), 5.87 (1H, dd, J=17.6, 10.8Hz, H-1),5.96 (1
H, d, J=1.2Hz, H-3), 6.22 (1H, d, J=3.4Hz, H-13),
6.28 (1H, d,J=0.9Hz, H-3') 本発明物質は白血病細胞株であるP-388 やL-1210細胞に
対する抗腫瘍活性、バチルス・スブチリス(B.subtili
s)、ミクロコッカス・ルテア（M.lutea)に対する抗菌活
性を有している。また本発明物質は抗体産生応答などの
免疫反応を抑制する活性も有する。本発明物質の抗腫瘍
活性を既存のベルノダリン化合物と比較した結果を表１
に示す。尚、比較を行った各化合物の構造式を図１に示
した。
【００１３】
【表１】 本発明物質を抗腫瘍剤、免疫抑制剤として使用するため
には製剤化して投与することができる。製剤化する場合
は、注射剤、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などの形
態とすることができる。
【００１４】
【実施例】以下に実施例、実験例を示し、さらに本発明
を詳細に説明する。 実施例１ ４，15−ジヒドロベルノダリンの合成 上記クプチャンらの文献に基づいて、ベルノニア・アミ
グダリナから抽出したベルノダリン57.7mgをメタノール
２mlに溶解し、ついで、この溶液を０℃に冷却したの
ち、水素化ホウ素ナトリウム２mgを添加し、緩やかに攪
拌しながら８分間反応させた。反応終了後、酢酸を数滴
加え、pHを弱酸性にした後、反応液を濾過した。濾過液
を減圧濃縮し、ODS を充填したAQ-323カラム（ＹＭＣ
製) を接続したＨＰＬＣに濃縮液を注入し、アセトニト
リル−水(30:70) を溶出液として、３ml／分の溶出スピ
ードで溶出を行った。本発明物質である４，15−ジヒド
ロベルノダリンは約24分後に溶出された。この溶出画分
を回収し、溶出液を減圧濃縮により除去し、油状の４，
15−ジヒドロベルノダリン 7.5mgを得た。
【００１５】本物質の物理化学特性値を測定したとこ
ろ、上記の数値を示すことが確認できた。 実施例２ 抗腫瘍効果の確認 本実施例は、実施例１で得た、４，15−ジヒドロベルダ
リンを用い、マウス白血病細胞に対する抗腫瘍効果を確
認した。 （方法）４，15−ジヒドロベルノダリンを、0.5mg/mlと
なるように10％メタノールに溶解し、マイレスクHAフィ
ルター（ミリポア社製) を用いて濾過滅菌した。これを
滅菌生理的食塩水にて100 倍に希釈し、原液とした。マ
ウス白血病細胞としてはP-388 、L-1210の２種類を使用
し、10％牛胎児血清を含んだRPMI-1640 培地に、１×10
4 個／0.9ml となるように細胞を懸濁し、24穴マルチプ
レート（住友ベークライト製) に0.9ml ずつ分注した。
これに段階希釈した試料を0.1ml ずつ添加し、37℃で５
％CO2 雰囲気下で培養した。培養開始から３日後に細胞
濃度を計測し、抗腫瘍効果を判定した。効果の判定は、
４，15−ジヒドロベルノダリン添加ウエルの細胞濃度
（Ｔ) と陰性対照の細胞濃度（Ｃ) から、増殖抑制率
〔 100−（Ｔ／Ｃ×100)〕を算出し、50％抑制濃度ＩＣ
50を求めた。 （結果）４，15−ジヒドロベルノダリンの添加により、
顕著な細胞増殖抑制が観察された。表１に示すように、
本発明物質の抗腫瘍効果は特に強く、マウス白血病細胞
P-388 株に対するＩＣ50は0.07μg/ml、L-1210株に対す
るＩＣ50は0.15μg/mlであった。
【００１６】実施例３ 免疫抑制効果の確認 本実施例は実施例１で得た４，15−ジヒドロベルノダリ
ンを用いて、マウス抗体産生応答に対する免疫抑制効果
を確認した。 （方法） （１）Ｔ細胞依存性抗原に対する in vitro 二次抗体産
生応答 DBA/2 マウス（♀、６週令）を、50％羊赤血球（SRBC)
とフロイント完全アジュバントとを等量混合して作製し
たエマルジョン 0.2mlで腹腔内免疫した。免疫３〜８週
間後にマウスの脾臓を摘出し、単細胞浮遊液を無菌的に
調製した。10％FCS添加 RPMI-1640培地で洗浄した細胞
液（２×106/ml) 0.5ml に羊赤血球５×106/mlを 0.5m
l、４，15−ジヒドロベルノダリンの10％メタノール溶
液を10μl加え、シリコンコートしたガラス試験管中で3
7℃、５％ＣＯ2 雰囲気下５日間培養した。培養終了後
FCS非添加 RPMI-1640培地 0.1mlに再浮遊し、抗体産生
細胞液とした。RPMI-1640-アガロース液 400μl 、25％
SRBC 液50μl 、抗体産生細胞液50μl 、モルモット補
体20μl を混合し、プラスチックシャーレに薄く層にし
て２時間のインキュベート後、プラーク(PFC) 数を測定
した。また、同時に培養上清を分離し、これに含まれる
IgM量をマウスモノクロナール IgM抗体を標準としたサ
ンドイッチ ELISA法を用いて測定した。さらに、培養終
了時の細胞懸濁液 0.2mlを96ウェルプレートに分取し、
これに〔3H〕−チミジン（TdR)１μCiずつ添加して24時
間パルスラベルし、脾細胞のＤＮＡ合成能を調べた。
【００１７】 （２）リポ多糖刺激によるＴ細胞非依存性抗体産生応答 未処置のDBA/2 マウス（♀、８週令）より脾臓の単細胞
浮遊液を無菌的に調製した。溶血後10％ FCS添加 RPMI-
1640培地で洗浄した細胞液（１×106 個) をリポ多糖
（LPS)20μg/ml存在下、試料を10μl 加え、３日間37
℃、５％ＣＯ2 雰囲気下培養した。（１）と同様に、脾
細胞を処理して PFC数を測定し、同時に培養上清中の I
gM抗体量を定量した。 （結果）Ｔ細胞依存性抗体産生応答に対する４，15−ジ
ヒドロベルノダリンの効果について調べた。その結果を
表２に示した。
【００１８】
【表２】 ４，15−ジヒドロベルノダリンの濃度に依存した抗原特
異的な抗体産生細胞数の低下が認められ、また産生され
る IgM抗体量の減少が認られた。特に、４，15−ジヒド
ロベルノダリンの濃度が10μg/ml以上で、非常に強い抑
制を示した。この時、脾細胞のＤＮＡ合成も抑制が認ら
れた。
【００１９】LPS 刺激したマウス脾細胞のＴ細胞非依存
性抗体産生応答に対する４，15−ジヒドロベルノダリン
の効果について調べ、その結果を表３に示した。
【００２０】
【表３】 Ｔ細胞非依存性の抗体産生応答に対して本物質は、１μ
g/ml以上の濃度で PFC数および産生 IgM量ともに完全な
抑制が認られた。
【００２１】
【発明の効果】本発明により新規４，15−ジヒドロベル
ノダリンが提供される。本発明物質は抗腫瘍剤、免疫抑
制剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベルノダリンの誘導体の構造式を示す線図であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ベルノニア・アミグダ
リナより分離されるベルノダリンの温和な還元によって
合成することが可能である新規な４，15−ジヒドロベル
ノダリン（4,15-Dihydrovernodalin)に関する。本物質
は抗腫瘍剤や免疫抑制剤として有用である。
【０００２】
【従来の技術】近年、植物由来の抗癌剤の研究が進み、
新規な抗癌剤が提供されるようになり顕著な治療効果を
あげている。例えば、ニチニチソウ由来のビンクリスチ
ンやその誘導体であるビンブラスチンなどはその代表的
な例である。植物由来の抗腫瘍剤は、その熱帯地域の植
物から種々の物質が探索されているが、さらに新しい化
合物の探索が進められている。
【０００３】本発明者らは熱帯アフリカの薬用植物に関
する研究を進める過程で、霊長類が本能的に疾病時に特
定の植物を選択していることを観察し、これらの植物か
ら生理活性成分を抽出し、その薬理活性を確認してき
た。これらの植物のうち、熱帯アフリカに広く自生する
キク科灌木ベルノニア・アミグダリナ (Vernonia amygd
alina)は、野生チンパンジーが疾病時に採食し、やがて
病状の回復につながったことが明確に観察されている。
この観察に着目し、本発明者らは、その生理活性成分の
研究を行った。これらの生理活性成分のうち次の構造式
（II) ：
【０００４】
【化２】
【０００５】を有するセキステルペンの一種であるベル
ノダリンはクプチャン（Kupchan)らにより、ＫＢ細胞に
対するインビトロ抗腫瘍効果が確認されている (J. M.
Kupchan, et.al., The Journal of Organic Chemistry,
Vol. 34, 3908-3911(1969))。本発明者らは、すでにベ
ルノダリンがＫＢ細胞の他に、Ｐ−388 細胞、Ｌ−1210
細胞などに強い抗腫瘍効果を示すことを確認している。
このキク科灌木ベルノニア・アミグダリナは、西アフリ
カにおいては、その独特の苦味が好まれ、伝統的な民族
料理の材料として用いられており、安全性も高いと考え
られる。
【０００６】本発明者らはこのベルノダリンの生理活性
について研究を進めた結果、ベルノダリンの誘導体には
強い抗腫瘍活性が存在することを見い出した。特に本発
明により提供される新規化合物である４，15−ジヒドロ
ベルノダリンは、一連のベルノダリン誘導体と比較して
も強い抗腫瘍活性と免疫抑制活性を示すことを初めて見
い出した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
知見に基づいてなされたもので、新規な４，15−ジヒド
ロベルノダリンの提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、次の構造式
（Ｉ）：
【０００９】
【化３】
【００１０】で示される４，15−ジヒドロベルノダリン
に関する。本発明で提供される４，15−ジヒドロベルノ
ダリンは、上記クプチャンらの文献に基づいて、ベルノ
ニア・アミグダリナから抽出したベルノダリンから得る
ことができる。これを詳述すると、ベルノニア・アミグ
ダリナ乾燥葉からクロロホルム抽出、ｎ−ヘキサン・メ
タノール抽出、シリカゲルクロマトグラフィー、ＨＰＬ
Ｃ等により精製し、ベルノダリンを得る。このようにし
て精製されたベルノダリンは、無色の油状物質として得
られ、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸
エチル、ジメチルスルフォキシドなどの有機溶媒に溶解
し、水に不溶性の、前記構造式（II）を有する物質であ
る。
【００１１】本発明の４，15−ジヒドロベルノダリン
は、このベルノダリンを合成の出発物質として使用する
ことができる。ベルノダリンの４位、15位に選択的に水
素を導入することにより、本発明物質である４，15−ジ
ヒドロベルノダリンを合成することができる。水素化ホ
ウ素ナトリウム（NaBH4)を用いて温和な条件で反応させ
ることにより選択的に４位、15位の炭素間の二重結合部
位に水素が導入される。反応は、通常、メタノールなど
の有機溶媒に溶解させたベルノダリンに、還元剤NaBH4
を加え、室温〜０℃以下で緩やかに攪拌し反応させる。
反応終了後、酢酸などの酸を加え、反応溶液のpHを弱酸
性とした後、濾過後、逆相ＨＰＬＣにより分離精製を行
い、本発明物質を回収することができる。また溶媒抽出
などの手段を用いることもできる。
【００１２】 本発明物質は下記の物理化学的特性を有す
る。 一般名；4, 15-Dihydrovernodalin 正式名；3aβ, 4, 5, 5a, 6, 9, 9aβ, 9bα-octahydro
-9-methyl-3-methylene-4β-(2-methylenehydracryloyl
oxy)5aβ-vinyl-2H-furo〔2, 3-f〕〔2〕benzopyran-2,
8(3H)-dione. 分子式：Ｃ19Ｈ22Ｏ7 色; 無色 性状; 油状、強い苦味を呈する。
【００１３】 旋光度; 〔α〕25 D ＋189.8°(C=2.74mg/ml, CHCl3) UV吸収; λmax (MeOH) nm (ε) :210 (ε29000) 赤外吸収; νmax (KBr) cm-1: 3350, 1780-1720 br, 16
40 FAB-MS; m/z: 363 ( 〔M+H〕+, NBA, C19H22O7 ＋H)1 H-NMR;δ (400MHz, CDCl3) ppm : 1.44 (3H, d, J=6.
7, H3-15),1.75 (1H, dd, J=15.3, 5.8Hz, H-9), 1.86
(1H, br.s, OH), 2.13 (1H, dd, J=15.0, 5.8Hz, H-9),
2.20 (1H, dd, J=10.6, 7.2Hz, H-5), 2.68 (1H, quin
tet,J= 7.0Hz, H-4), 3.06 (1H, ddt, J=11.6, 10.1,
3.2, 3.2Hz, H-7),4.01 (1H, dd, J=11.3, 11.0Hz, H-
6), 4.12 (1H, d, J=11.6, H-14),4.22 (1H, d, J=12.4
Hz, H-14), 4.35 (2H, s, H2-4'), 5.26 (1H, dt, J=1
0.1,5.8, 5.8Hz, H-8), 5.30 (1H, d, J=17.7Hz, H-2),
5.34 (1H, d, J=11.0Hz,H-2), 5.66 (1H, d, J=3.1Hz,
H-13), 5.87 (1H, dd, J=17.6, 10.8Hz, H-1),5.96 (1
H, d, J=1.2Hz, H-3), 6.22 (1H, d, J=3.4Hz, H-13),
6.28 (1H, d,J=0.9Hz, H-3')
【００１４】 ４，15−ジヒドロベルノダリンの絶対配置
決定法については、NMR (250 MHz、測定溶媒、重クロロ
ホルム小量＋重ピリジン）におけるNOEをNOESYPH法で測
定した。 新たに生じた15位メチル(1.43ppm)と５位のα−水素(2.
18ppm)、また４位水素(2.69ppm)と６位のβ−水素(4.04
ppm)間にクロスピークが認められた。この結果は、次の
構造式に示すように、15位メチルがα配置，４位水素が
β配置であることを明白に物語っているものである。
【００１５】
【化４】
【００１６】本発明物質は白血病細胞株であるP-388 や
L-1210細胞に対する抗腫瘍活性、バチルス・スブチリス
(B.subtilis)、ミクロコッカス・ルテア（M.lutea)に対
する抗菌活性を有している。また本発明物質は抗体産生
応答などの免疫反応を抑制する活性も有する。本発明物
質の抗腫瘍活性を既存のベルノダリン化合物と比較した
結果を表１に示す。尚、比較を行った各化合物の構造式
を図１に示した。
【００１７】
【表１】 本発明物質を抗腫瘍剤、免疫抑制剤として使用するため
には製剤化して投与することができる。製剤化する場合
は、注射剤、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などの形
態とすることができる。
【００１８】
【実施例】以下に実施例、実験例を示し、さらに本発明
を詳細に説明する。 実施例１ ４，15−ジヒドロベルノダリンの合成 上記クプチャンらの文献に基づいて、ベルノニア・アミ
グダリナから抽出したベルノダリン57.7mgをメタノール
２mlに溶解し、ついで、この溶液を０℃に冷却したの
ち、水素化ホウ素ナトリウム２mgを添加し、緩やかに攪
拌しながら８分間反応させた。反応終了後、酢酸を数滴
加え、pHを弱酸性にした後、反応液を濾過した。濾過液
を減圧濃縮し、ODS を充填したAQ-323カラム（ＹＭＣ
製) を接続したＨＰＬＣに濃縮液を注入し、アセトニト
リル−水(30:70) を溶出液として、３ml／分の溶出スピ
ードで溶出を行った。本発明物質である４，15−ジヒド
ロベルノダリンは約24分後に溶出された。この溶出画分
を回収し、溶出液を減圧濃縮により除去し、油状の４，
15−ジヒドロベルノダリン 7.5mgを得た。
【００１９】 本物質の物理化学特性値を測定したとこ
ろ、上記の数値を示すことが確認できた。 実施例２ 抗腫瘍効果の確認 本実施例は、実施例１で得た、４，15−ジヒドロベルダ
リンを用い、マウス白血病細胞に対する抗腫瘍効果を確
認した。 （方法）４，15−ジヒドロベルノダリンを、0.5mg/mlと
なるように10％メタノールに溶解し、マイレスクHAフィ
ルター（ミリポア社製) を用いて濾過滅菌した。これを
滅菌生理的食塩水にて100 倍に希釈し、原液とした。マ
ウス白血病細胞としてはP-388 、L-1210の２種類を使用
し、10％牛胎児血清を含んだRPMI-1640 培地に、１×10
4 個／0.9ml となるように細胞を懸濁し、24穴マルチプ
レート（住友ベークライト製) に0.9ml ずつ分注した。
これに段階希釈した試料を0.1ml ずつ添加し、37℃で５
％CO2 雰囲気下で培養した。培養開始から３日後に細胞
濃度を計測し、抗腫瘍効果を判定した。効果の判定は、
４，15−ジヒドロベルノダリン添加ウエルの細胞濃度
（Ｔ) と陰性対照の細胞濃度（Ｃ) から、増殖抑制率
〔 100−（Ｔ／Ｃ×100)〕を算出し、50％抑制濃度ＩＣ
50を求めた。 （結果）４，15−ジヒドロベルノダリンの添加により、
顕著な細胞増殖抑制が観察された。表１に示すように、
本発明物質の抗腫瘍効果は特に強く、マウス白血病細胞
P-388 株に対するＩＣ50は0.07μg/ml、L-1210株に対す
るＩＣ50は0.15μg/mlであった。
【００２０】 実施例３ 免疫抑制効果の確認 本実施例は実施例１で得た４，15−ジヒドロベルノダリ
ンを用いて、マウス抗体産生応答に対する免疫抑制効果
を確認した。 （方法） （１）Ｔ細胞依存性抗原に対する in vitro 二次抗体産
生応答 DBA/2 マウス（♀、６週令）を、50％羊赤血球（SRBC)
とフロイント完全アジュバントとを等量混合して作製し
たエマルジョン 0.2mlで腹腔内免疫した。免疫３〜８週
間後にマウスの脾臓を摘出し、単細胞浮遊液を無菌的に
調製した。10％FCS添加 RPMI-1640培地で洗浄した細胞
液（２×106/ml) 0.5ml に羊赤血球５×106/mlを 0.5m
l、４，15−ジヒドロベルノダリンの10％メタノール溶
液を10μl加え、シリコンコートしたガラス試験管中で3
7℃、５％ＣＯ2 雰囲気下５日間培養した。培養終了後
FCS非添加 RPMI-1640培地 0.1mlに再浮遊し、抗体産生
細胞液とした。RPMI-1640-アガロース液 400μl 、25％
SRBC 液50μl 、抗体産生細胞液50μl 、モルモット補
体20μl を混合し、プラスチックシャーレに薄く層にし
て２時間のインキュベート後、プラーク(PFC) 数を測定
した。また、同時に培養上清を分離し、これに含まれる
IgM量をマウスモノクロナール IgM抗体を標準としたサ
ンドイッチ ELISA法を用いて測定した。さらに、培養終
了時の細胞懸濁液 0.2mlを96ウェルプレートに分取し、
これに〔3H〕−チミジン（TdR)１μCiずつ添加して24時
間パルスラベルし、脾細胞のＤＮＡ合成能を調べた。
【００２１】 （２）リポ多糖刺激によるＴ細胞非依存性抗体産生応答 未処置のDBA/2 マウス（♀、８週令）より脾臓の単細胞
浮遊液を無菌的に調製した。溶血後10％ FCS添加 RPMI-
1640培地で洗浄した細胞液（１×106 個) をリポ多糖
（LPS)20μg/ml存在下、試料を10μl 加え、３日間37
℃、５％ＣＯ2 雰囲気下培養した。（１）と同様に、脾
細胞を処理して PFC数を測定し、同時に培養上清中の I
gM抗体量を定量した。 （結果）Ｔ細胞依存性抗体産生応答に対する４，15−ジ
ヒドロベルノダリンの効果について調べた。その結果を
表２に示した。
【００２２】
【表２】 ４，15−ジヒドロベルノダリンの濃度に依存した抗原特
異的な抗体産生細胞数の低下が認められ、また産生され
る IgM抗体量の減少が認られた。特に、４，15−ジヒド
ロベルノダリンの濃度が10μg/ml以上で、非常に強い抑
制を示した。この時、脾細胞のＤＮＡ合成も抑制が認ら
れた。
【００２３】 LPS 刺激したマウス脾細胞のＴ細胞非依存
性抗体産生応答に対する４，15−ジヒドロベルノダリン
の効果について調べ、その結果を表３に示した。
【００２４】
【表３】 Ｔ細胞非依存性の抗体産生応答に対して本物質は、１μ
g/ml以上の濃度で PFC数および産生 IgM量ともに完全な
抑制が認られた。
【００２５】
【発明の効果】本発明により新規４，15−ジヒドロベル
ノダリンが提供される。本発明物質は抗腫瘍剤、免疫抑
制剤として有用である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の構造式（Ｉ）： 【化１】 で示される４，15−ジヒドロベルノダリン。
JP4357979A 1992-12-25 1992-12-25 ４，１５−ジヒドロベルノダリン Pending JPH06192265A (ja)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6713098B2 (en) * 2001-01-24 2004-03-30 Jackson State University Phytochemotherapy for cancer
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