JPH06181800A - リポソームを用いた核酸の検出方法 - Google Patents
リポソームを用いた核酸の検出方法Info
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- JPH06181800A JPH06181800A JP33611392A JP33611392A JPH06181800A JP H06181800 A JPH06181800 A JP H06181800A JP 33611392 A JP33611392 A JP 33611392A JP 33611392 A JP33611392 A JP 33611392A JP H06181800 A JPH06181800 A JP H06181800A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明の目的は、リポソームの膜を破壊させる
工程の不要な、核酸及び蛋白質の検出方法を提供するこ
とである。 【構成】特異的結合物質の一方が結合された遺伝子プロ
ーブを検体である核酸にハイブリダイズさせる第１の工
程と、該特異的結合物質の他方が表面に固定化されホス
ファターゼ、β−ガラクトシターゼあるいはパーオキシ
ターゼのうちの少なくとも１つの酵素が入ったリポソー
ムを前記特異的結合物質の一方に結合させる第２の工程
と、前記酵素を検出する第３の工程を有することを特徴
とするリポソームを用いた核酸の検出方法である。
工程の不要な、核酸及び蛋白質の検出方法を提供するこ
とである。 【構成】特異的結合物質の一方が結合された遺伝子プロ
ーブを検体である核酸にハイブリダイズさせる第１の工
程と、該特異的結合物質の他方が表面に固定化されホス
ファターゼ、β−ガラクトシターゼあるいはパーオキシ
ターゼのうちの少なくとも１つの酵素が入ったリポソー
ムを前記特異的結合物質の一方に結合させる第２の工程
と、前記酵素を検出する第３の工程を有することを特徴
とするリポソームを用いた核酸の検出方法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リポソームを用いた核
酸の検出方法に関するものである。
酸の検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来より、核酸の塩基配列を検定する方
法として、塩基配列のわかっている遺伝子プローブに標
識物質を付け、この標識された遺伝子プローブに被検体
ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせた後、２本鎖となった
被検体ＤＮＡの標識物質を検出する方法が知られてい
る。
法として、塩基配列のわかっている遺伝子プローブに標
識物質を付け、この標識された遺伝子プローブに被検体
ＤＮＡ断片をハイブリダイズさせた後、２本鎖となった
被検体ＤＮＡの標識物質を検出する方法が知られてい
る。
【０００３】この標識物質として放射性同位元素を用い
る方法が古くから知られているが、放射性同位元素は検
出感度が高く安定した診断結果を得られる反面、放射線
を扱う特別な実験室内でしか行うことができず、実験者
にとっても危険が伴うものである。
る方法が古くから知られているが、放射性同位元素は検
出感度が高く安定した診断結果を得られる反面、放射線
を扱う特別な実験室内でしか行うことができず、実験者
にとっても危険が伴うものである。
【０００４】このため、放射性同位元素に代わる標識物
質として、近年、蛍光物質、発色物質、化学発光物質等
を用いた方法が考案されている。例えば、特開平２−３
０８８００号公報に開示される方法は、リポソーム内に
蛍光物質あるいは酵素等の標識物質を封入し、このリポ
ソームでＤＮＡをラベルするというものである。
質として、近年、蛍光物質、発色物質、化学発光物質等
を用いた方法が考案されている。例えば、特開平２−３
０８８００号公報に開示される方法は、リポソーム内に
蛍光物質あるいは酵素等の標識物質を封入し、このリポ
ソームでＤＮＡをラベルするというものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た方法では、リポソームでＤＮＡをラベルした後、リポ
ソームを界面活性剤等で破壊して標識物質を露出させな
ければならず、従来よりも余分な工程が必要となってい
た。
た方法では、リポソームでＤＮＡをラベルした後、リポ
ソームを界面活性剤等で破壊して標識物質を露出させな
ければならず、従来よりも余分な工程が必要となってい
た。
【０００６】そこで、本発明はリポソームの膜を破壊さ
せる工程の不要な、核酸及び蛋白質の検出方法を提供す
ることを技術的課題とする。
せる工程の不要な、核酸及び蛋白質の検出方法を提供す
ることを技術的課題とする。
【０００７】
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、特異的結合物
質の一方が結合された遺伝子プローブを検体である核酸
にハイブリダイズさせる第１の工程と、該特異的結合物
質の他方が表面に固定化されホスファターゼ、β−ガラ
クトシターゼあるいはパーオキシダーゼのうちの少なく
とも１つの酵素が入ったリポソームを前記特異的結合物
質の一方に結合させる第２の工程と、前記酵素を検出す
る第３の工程を有することを特徴とするリポソームを用
いた核酸の検出方法である。
質の一方が結合された遺伝子プローブを検体である核酸
にハイブリダイズさせる第１の工程と、該特異的結合物
質の他方が表面に固定化されホスファターゼ、β−ガラ
クトシターゼあるいはパーオキシダーゼのうちの少なく
とも１つの酵素が入ったリポソームを前記特異的結合物
質の一方に結合させる第２の工程と、前記酵素を検出す
る第３の工程を有することを特徴とするリポソームを用
いた核酸の検出方法である。
【０００９】ここで述べる核酸とは、塩基配列を求めた
い検体となる核酸のことであり、ＤＮＡあるいはＲＮＡ
を意味する。核酸がＤＮＡで２本鎖である場合には、変
性させて１本鎖のＤＮＡとし、遺伝子プローブをハイブ
リダイズさせる。
い検体となる核酸のことであり、ＤＮＡあるいはＲＮＡ
を意味する。核酸がＤＮＡで２本鎖である場合には、変
性させて１本鎖のＤＮＡとし、遺伝子プローブをハイブ
リダイズさせる。
【００１０】本発明の遺伝子プローブは、検体である核
酸と相補的なポリヌクレオチド配列を持つＤＮＡまたは
ＲＮＡであり、この遺伝子プローブに結合される特異的
結合物質としては、ディゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の抗
原やハプテン等を用いることができる。
酸と相補的なポリヌクレオチド配列を持つＤＮＡまたは
ＲＮＡであり、この遺伝子プローブに結合される特異的
結合物質としては、ディゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の抗
原やハプテン等を用いることができる。
【００１１】また、本発明にかかるリポソームの主要構
成成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくとも
一方が用いられ、例えば、ジバルミトイルフォスファチ
ジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジバルミトイルフォスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルフォ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリス
トイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰ
Ｅ）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミ
ン（ＤＳＰＥ）等を挙げられる。また、必要に応じてリ
ン脂質、糖脂質にに対してコレステロールを加えてもよ
く、これによってより安定なリポソーム試薬を調整する
ことができる。
成成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくとも
一方が用いられ、例えば、ジバルミトイルフォスファチ
ジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジバルミトイルフォスファチ
ジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルフォ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリス
トイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰ
Ｅ）、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミ
ン（ＤＳＰＥ）等を挙げられる。また、必要に応じてリ
ン脂質、糖脂質にに対してコレステロールを加えてもよ
く、これによってより安定なリポソーム試薬を調整する
ことができる。
【００１２】また、リポソームに入れられるホスファタ
ーゼとは、有機リン酸エステルを加水分解する酵素であ
り、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼといっ
たリン酸モノエステルを加水分解するホスホモノエステ
ラーゼ等を挙げることができる。ホスファターゼ、β−
ガラクトシターゼ及びパーオキシターゼの分子は大きい
ためリポソーム内には完全に封入されず、一部がリポソ
ームに入った形でリポソームと結合する。このようにホ
スファターゼはリポソームから一部が露出しているた
め、ホスファターゼを検出するとき、あるいはホスファ
ターゼの酵素としての働きを活用させてリン酸エステル
の分解を行うとき、リポソームの膜を破壊させるような
工程は不要である。
ーゼとは、有機リン酸エステルを加水分解する酵素であ
り、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼといっ
たリン酸モノエステルを加水分解するホスホモノエステ
ラーゼ等を挙げることができる。ホスファターゼ、β−
ガラクトシターゼ及びパーオキシターゼの分子は大きい
ためリポソーム内には完全に封入されず、一部がリポソ
ームに入った形でリポソームと結合する。このようにホ
スファターゼはリポソームから一部が露出しているた
め、ホスファターゼを検出するとき、あるいはホスファ
ターゼの酵素としての働きを活用させてリン酸エステル
の分解を行うとき、リポソームの膜を破壊させるような
工程は不要である。
【００１３】ホスファターゼを検出する方法としては、
ホスファターゼによって分解される蛍光基質（リン酸エ
ステル）を用い、蛍光基質が分解されて生じた蛍光物質
を検出することによって、ホスファターゼを検出するこ
とができる。この蛍光基質としては、３−ヒドロキシ−
２−ナフトエ酸−３’，５’−ジメチルアニリドリン酸
体などのナフトールＡＳリン酸体、２−アリル〔２’−
（３，４−ジメチルフェニル）〕３−ナフトールホスフ
ェートなどのナフトール誘導体ホスフェート、３−ヒド
ロキシ−２−アントラセンカルボン酸−２−メチルアニ
リドリン酸体などのアントラセン誘導体ホスフェートを
用いることができる。
ホスファターゼによって分解される蛍光基質（リン酸エ
ステル）を用い、蛍光基質が分解されて生じた蛍光物質
を検出することによって、ホスファターゼを検出するこ
とができる。この蛍光基質としては、３−ヒドロキシ−
２−ナフトエ酸−３’，５’−ジメチルアニリドリン酸
体などのナフトールＡＳリン酸体、２−アリル〔２’−
（３，４−ジメチルフェニル）〕３−ナフトールホスフ
ェートなどのナフトール誘導体ホスフェート、３−ヒド
ロキシ−２−アントラセンカルボン酸−２−メチルアニ
リドリン酸体などのアントラセン誘導体ホスフェートを
用いることができる。
【００１４】また、上記した蛍光基質が分解して生じる
蛍光物質蛍光物質に、２−ビフェニルジアゾニウムクロ
ライドや、２−トルエンジアゾニウムクロライドなどの
アゾ色素を結合させ、該アゾ色素の発色を検出すること
も可能である。このようにアゾ色素を結合させた場合に
は、インサイチュハイブリダイゼーションでゲノム解析
のための遺伝子の染色体マッピングをホスファターゼを
利用して作成する場合や、組織細胞中のホスファターゼ
を検出する場合に、極めて有用である。
蛍光物質蛍光物質に、２−ビフェニルジアゾニウムクロ
ライドや、２−トルエンジアゾニウムクロライドなどの
アゾ色素を結合させ、該アゾ色素の発色を検出すること
も可能である。このようにアゾ色素を結合させた場合に
は、インサイチュハイブリダイゼーションでゲノム解析
のための遺伝子の染色体マッピングをホスファターゼを
利用して作成する場合や、組織細胞中のホスファターゼ
を検出する場合に、極めて有用である。
【００１５】β−ガラクトシダーゼを検出する方法とし
ては、β−ガラクトシダーゼによって加水分解されるラ
クトースを用い、ラクトースが分解された生じるＤ−ガ
ラクトースを検出することによって、β−ガラクトシダ
ーゼを検出することができる。
ては、β−ガラクトシダーゼによって加水分解されるラ
クトースを用い、ラクトースが分解された生じるＤ−ガ
ラクトースを検出することによって、β−ガラクトシダ
ーゼを検出することができる。
【００１６】
【実施例】本発明の一例を示す実施例を以下に説明す
る。
る。
【００１７】（実施例１） （１）Ｎ−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオニル］
ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＤＰ−ＰＥ
と略）の合成 ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略）50
μmol を50μmol のトリエチルアミンを含んだ無水メタ
ノール3ml に溶かしてＮ−スクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、ＳＰＤＰと
略）を25mg加える。反応は、２５℃の窒素雰囲気下で４
時間行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）板で反応
終了を確認後、メタノールを減圧吸引によって除き、再
度クロロホルムに溶解してカラムクロマトグラフィーに
て目的物を回収し、再度減圧吸引で濃縮・乾燥させる。
目的物は密栓し窒素交換した後マイナス５０℃にて保存
した。
ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＤＰ−ＰＥ
と略）の合成 ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略）50
μmol を50μmol のトリエチルアミンを含んだ無水メタ
ノール3ml に溶かしてＮ−スクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、ＳＰＤＰと
略）を25mg加える。反応は、２５℃の窒素雰囲気下で４
時間行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）板で反応
終了を確認後、メタノールを減圧吸引によって除き、再
度クロロホルムに溶解してカラムクロマトグラフィーに
て目的物を回収し、再度減圧吸引で濃縮・乾燥させる。
目的物は密栓し窒素交換した後マイナス５０℃にて保存
した。
【００１８】（２）酵素（アルカリホスファターゼ）の
リポソームへの封入 （１）で生成したＰＤＰ−ＰＥ（1 μmol ）、レシチン
（13μmol ）、コレステロール（13μmol ）をクロロホ
ルム／メタノール (9/1)混合溶媒に溶解してナスフラス
コに入れ、更にクロロホルムを５ml加えて、よく撹拌し
た後エバポレーターで溶媒を除去した。再び、このナス
フラスコにクロロホルムを３ml入れ、再度ロータリーエ
バポレーターで溶媒を除去する。これを３〜５回繰り返
す。するとフラスコ壁面にリポソームの薄膜が形成され
るので、真空デシケーターに移して真空ポンプで真空吸
引し完全に除去した。
リポソームへの封入 （１）で生成したＰＤＰ−ＰＥ（1 μmol ）、レシチン
（13μmol ）、コレステロール（13μmol ）をクロロホ
ルム／メタノール (9/1)混合溶媒に溶解してナスフラス
コに入れ、更にクロロホルムを５ml加えて、よく撹拌し
た後エバポレーターで溶媒を除去した。再び、このナス
フラスコにクロロホルムを３ml入れ、再度ロータリーエ
バポレーターで溶媒を除去する。これを３〜５回繰り返
す。するとフラスコ壁面にリポソームの薄膜が形成され
るので、真空デシケーターに移して真空ポンプで真空吸
引し完全に除去した。
【００１９】次いで、500unitsのアルカリホスファター
ゼ（ベーリンガー社製）200 μl を加え、フラスコ内部
を窒素で置換した後、密栓後約60℃の温水漕に浸し、ボ
ルテックスミキサーにより激しく撹拌する事でナスフラ
スコの壁面に形成された薄膜を完全にはがし、酵素が入
った多重層リポソームとした。このとき、酵素であるア
ルカリホスファターゼは比較的大きな酵素であるため、
リポソーム内に完全に封入されず、リポソームには隙間
ができた状態となっている。更に、0.1mol Tris-HCl(p
H:7.5), 0.15mol NaCl （以下、Buffer 2と略）を少量
加え、遠心チューブに移した後、４℃において15,000rp
m で20分間遠心を繰り返し、リポソーム内に入らなかっ
たフリーのアルカリホスファターゼを除いた。
ゼ（ベーリンガー社製）200 μl を加え、フラスコ内部
を窒素で置換した後、密栓後約60℃の温水漕に浸し、ボ
ルテックスミキサーにより激しく撹拌する事でナスフラ
スコの壁面に形成された薄膜を完全にはがし、酵素が入
った多重層リポソームとした。このとき、酵素であるア
ルカリホスファターゼは比較的大きな酵素であるため、
リポソーム内に完全に封入されず、リポソームには隙間
ができた状態となっている。更に、0.1mol Tris-HCl(p
H:7.5), 0.15mol NaCl （以下、Buffer 2と略）を少量
加え、遠心チューブに移した後、４℃において15,000rp
m で20分間遠心を繰り返し、リポソーム内に入らなかっ
たフリーのアルカリホスファターゼを除いた。
【００２０】（３）抗ビオチン抗体の修飾 ＤＮＡの検出を行うため、（２）で調製したアルカリホ
スファターゼ含有リポソームの表面に抗体を以下のよう
にして結合させた。
スファターゼ含有リポソームの表面に抗体を以下のよう
にして結合させた。
【００２１】まず、抗体の特異的結合を強化させるため
に、抗体をF(ab')2 フラグメントに修飾する。抗ビオチ
ン抗体（ベクター社製）3mg を0.1M 酢酸−NaOH緩衝液
(pH4.5)で透析し、ペプシン（シグマ社製）0.2mg を加
え、37℃で16時間静置した。
に、抗体をF(ab')2 フラグメントに修飾する。抗ビオチ
ン抗体（ベクター社製）3mg を0.1M 酢酸−NaOH緩衝液
(pH4.5)で透析し、ペプシン（シグマ社製）0.2mg を加
え、37℃で16時間静置した。
【００２２】沈澱を遠心分離により除去し、上精をゲル
ろ過（ウルトロゲルAcA44 、カラムサイズ：1.0 ×45c
m、緩衝液：0.1M リン酸−水酸化ナトリウム pH=7 ）
した。
ろ過（ウルトロゲルAcA44 、カラムサイズ：1.0 ×45c
m、緩衝液：0.1M リン酸−水酸化ナトリウム pH=7 ）
した。
【００２３】抗体蛋白の溶出画分を集め、硫酸アンモニ
ウムを濃度0.66g/mlになるように加え、抗体を沈澱させ
た（塩析）。遠心分離後、沈澱をリン酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液(0.1mol pH=6)0.4mlに溶解し、防腐のため0.
1g/ml アジ化ナトリウム4 μl 加え、F(ab')2 フラグメ
ントとした。 F(ab')2 溶液に、0.1M メルカプトエチ
ルアミン塩酸塩(0.1M リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
pH=6, 5mM EDTA) 50μl を加え、37℃で90分静置し
た。ゲルろ過後、可変部単体（Fab'）画分を集め、塩析
により0.4ml に濃縮した。
ウムを濃度0.66g/mlになるように加え、抗体を沈澱させ
た（塩析）。遠心分離後、沈澱をリン酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液(0.1mol pH=6)0.4mlに溶解し、防腐のため0.
1g/ml アジ化ナトリウム4 μl 加え、F(ab')2 フラグメ
ントとした。 F(ab')2 溶液に、0.1M メルカプトエチ
ルアミン塩酸塩(0.1M リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液
pH=6, 5mM EDTA) 50μl を加え、37℃で90分静置し
た。ゲルろ過後、可変部単体（Fab'）画分を集め、塩析
により0.4ml に濃縮した。
【００２４】（４）抗ビオチン抗体（F(ab')2 フラグメ
ント）とリポソームの結合 （２）の酵素含有リポソームと（３）の抗体F(ab')2 フ
ラグメントを緩衝液（0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH=
8）に溶解させ、外気を窒素ガスで置換した後、25℃で
２時間静置し、ゲルろ過する。次に、目的物の画分を取
り出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）でジチオス
レイトール（以下、ＤＴＴと称する。）により、反応の
終了を確認した。リポソームと抗体とが結合したこと
は、ＤＴＴを滴下したときにＴＣＬが黒く変色すること
により確認できる。
ント）とリポソームの結合 （２）の酵素含有リポソームと（３）の抗体F(ab')2 フ
ラグメントを緩衝液（0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH=
8）に溶解させ、外気を窒素ガスで置換した後、25℃で
２時間静置し、ゲルろ過する。次に、目的物の画分を取
り出し、薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）でジチオス
レイトール（以下、ＤＴＴと称する。）により、反応の
終了を確認した。リポソームと抗体とが結合したこと
は、ＤＴＴを滴下したときにＴＣＬが黒く変色すること
により確認できる。
【００２５】（５）ＤＮＡの検出 本発明の有用性を確認するため、ベ−リンガ−・マンハ
イム（Boehringer Mannheim ）社のランダムラベリング
キット（ビオチン標識用）を用い、ナイロンメンブレン
フィルタ−上でＤＮＡの検出を行った。即ち、ビオチン
によりλＤＮＡを標識し、0fg,2.5fg,5fg,10fg,20fg,40
fg,80fg,400fg,2000fgとなるように希釈を行い、ナイロ
ンメンブレンフィルタ−にスポットし、減圧下、80℃で
30分加熱することにより固定した。なおこの際全てのス
ポットが非特異的ＤＮＡとして100ng(100 ×10-9g)のニ
シン精子ＤＮＡを含むようにした。
イム（Boehringer Mannheim ）社のランダムラベリング
キット（ビオチン標識用）を用い、ナイロンメンブレン
フィルタ−上でＤＮＡの検出を行った。即ち、ビオチン
によりλＤＮＡを標識し、0fg,2.5fg,5fg,10fg,20fg,40
fg,80fg,400fg,2000fgとなるように希釈を行い、ナイロ
ンメンブレンフィルタ−にスポットし、減圧下、80℃で
30分加熱することにより固定した。なおこの際全てのス
ポットが非特異的ＤＮＡとして100ng(100 ×10-9g)のニ
シン精子ＤＮＡを含むようにした。
【００２６】次に、酵素含有リポソームに結合した抗ビ
オチンのナイロンメンブレンフィルターへの非特異的吸
着を防ぐために、ナイロンメンブレンフィルタ−をブロ
ック剤にてブロッキング処理した。そして、メンブレン
フィルターを洗った後、（４）にて作製した酵素含有リ
ポソーム溶液に浸し、30分間静置した後、0.1mol Tris-
HCl(pH=7.5), 0.15mol NaCl の緩衝溶液（以下、Buffer
1と略する。）で10分洗浄を３回繰り返す。次に0.1M T
ris-HCl(pH9.5),0.1M NaCl, 50mM MgCl2の緩衝液に、３
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸−２’−フェニルアニリ
ド・リン酸体（以下、ＨＮＰＰと称する。）を溶解さ
せ、終濃度１００μg/mlのＨＮＰＰ溶液とし、このＨＮ
ＰＰ溶液にナイロンメンブレンフィルターを浸して反応
させた。蛍光シグナルの検出は紫外線励起光源下でポラ
ロイドフィルム（ポラロイド社製）による写真撮影する
ことにより行った。
オチンのナイロンメンブレンフィルターへの非特異的吸
着を防ぐために、ナイロンメンブレンフィルタ−をブロ
ック剤にてブロッキング処理した。そして、メンブレン
フィルターを洗った後、（４）にて作製した酵素含有リ
ポソーム溶液に浸し、30分間静置した後、0.1mol Tris-
HCl(pH=7.5), 0.15mol NaCl の緩衝溶液（以下、Buffer
1と略する。）で10分洗浄を３回繰り返す。次に0.1M T
ris-HCl(pH9.5),0.1M NaCl, 50mM MgCl2の緩衝液に、３
−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸−２’−フェニルアニリ
ド・リン酸体（以下、ＨＮＰＰと称する。）を溶解さ
せ、終濃度１００μg/mlのＨＮＰＰ溶液とし、このＨＮ
ＰＰ溶液にナイロンメンブレンフィルターを浸して反応
させた。蛍光シグナルの検出は紫外線励起光源下でポラ
ロイドフィルム（ポラロイド社製）による写真撮影する
ことにより行った。
【００２７】上記実験は、図１に示すごとく、ビオチン
ラベルＤＮＡ量0 〜 2pg(2000fg)について行った。同図
において、１は核酸試料担体フィルタ−、２は蛍光感光
部分である。尚、表１における「＋」は検出可能を、
「±」は検出不明瞭を、「−」は検出不可能を示す。こ
のように、リポソームの膜を破壊する工程が不要である
とともに、40fgという極微小量でも十分検出することが
できた。
ラベルＤＮＡ量0 〜 2pg(2000fg)について行った。同図
において、１は核酸試料担体フィルタ−、２は蛍光感光
部分である。尚、表１における「＋」は検出可能を、
「±」は検出不明瞭を、「−」は検出不可能を示す。こ
のように、リポソームの膜を破壊する工程が不要である
とともに、40fgという極微小量でも十分検出することが
できた。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、リポソームにホスファ
ターゼ、β- ガラクトシターゼ、パーオキシダーゼの内
の少なくとも１つの酵素を入れ、酵素と特異的結合物質
の他方（抗体）との結合において検出のノイズとなる成
分が混入しないため、高感度に検体を検出できるだけで
なく、リポソーム内に入れるホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、パーオキシダーゼの酵素は分子が大きい
ため、酵素がリポソーム内に完全には封入されず、酵素
の一部が露出しリポソームに隙間ができた状態となる。
従って、核酸の検出の過程において、従来必要であった
リポソームの膜を破壊して中の物質を露出させる工程が
不要となり、より簡易な工程で核酸を検出することが可
能となる。
ターゼ、β- ガラクトシターゼ、パーオキシダーゼの内
の少なくとも１つの酵素を入れ、酵素と特異的結合物質
の他方（抗体）との結合において検出のノイズとなる成
分が混入しないため、高感度に検体を検出できるだけで
なく、リポソーム内に入れるホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、パーオキシダーゼの酵素は分子が大きい
ため、酵素がリポソーム内に完全には封入されず、酵素
の一部が露出しリポソームに隙間ができた状態となる。
従って、核酸の検出の過程において、従来必要であった
リポソームの膜を破壊して中の物質を露出させる工程が
不要となり、より簡易な工程で核酸を検出することが可
能となる。
【図１】本発明の実施例において、希釈したＤＮＡが濃
度別にスポットされたナイロンメンブレンフィルターを
示す。
度別にスポットされたナイロンメンブレンフィルターを
示す。
１ ナイロンメンブレンフィルター（核酸試料担体フィ
ルター） ２ 試料スポット部分
ルター） ２ 試料スポット部分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近 藤 恭 光 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内
Claims (1)
- 【請求項１】 特異的結合物質の一方が結合された遺伝
子プローブを検体である核酸にハイブリダイズさせる第
１の工程と、該特異的結合物質の他方が表面に固定化さ
れホスファターゼ、β−ガラクトシターゼあるいはパー
オキシターゼのうちの少なくとも１つの酵素が入ったリ
ポソームを前記特異的結合物質の一方に結合させる第２
の工程と、前記酵素を検出する第３の工程を有すること
を特徴とするリポソームを用いた核酸の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33611392A JPH06181800A (ja) | 1992-12-16 | 1992-12-16 | リポソームを用いた核酸の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33611392A JPH06181800A (ja) | 1992-12-16 | 1992-12-16 | リポソームを用いた核酸の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181800A true JPH06181800A (ja) | 1994-07-05 |
Family
ID=18295829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33611392A Pending JPH06181800A (ja) | 1992-12-16 | 1992-12-16 | リポソームを用いた核酸の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06181800A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018066713A1 (ja) * | 2016-10-07 | 2018-04-12 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 | 核酸の検出方法及びそのためのキット |
-
1992
- 1992-12-16 JP JP33611392A patent/JPH06181800A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018066713A1 (ja) * | 2016-10-07 | 2018-04-12 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 | 核酸の検出方法及びそのためのキット |
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