JPH0614022B2 - フロー型濃度測定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、目的物質を含む試料を酵素電極に送液し、酵
素反応による生成物の電極反応より出力される電流から
目的物質の濃度を正確かつ迅速に検出するフロー型濃度
測定装置の改良に関するものである。

（従来の技術） 酵素電極を用いた各種化学物質の測定装置は、酵素反応
が有する高い選択性と電気化学分析が有する高速性、感
度の高さという特徴を合わせ持ち、近年臨床化学・食品
化学等の分野で広く利用されるようになってきた。酵素
電極による計測法は大別するとポテンシオメトリック
（電圧変化の検出）法とアンペロメトリック（電流変化
の検出）法に分けられる。一定電圧を酵素電極に印加し
ながら、反応生成物の電極反応に伴う電流値を計測する
アンペロメトリック法は前者と比べて、電極構成が簡単
で高感度化が容易であるため広く研究されている。また
酵素電極へ試料溶液を流しながら測定するフロー型の計
測装置が知られており、酵素電極を利用したフロー型計
測装置は計測を高速で、連続的、自動的に行えるという
利点を持っている。

例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いたグル
コース定量の場合、反応式(1)により生じた過酸化水素
は、白金、カーボン、金等の電極を用い飽和カロメル電
極に対して＋0.6Ｖ前後の電圧で反応式(2)の如く電極反
応を起こし、この時の電流を測定してグルコースの濃度
を測定することができる（アンペロメトリック法）。

特に、目的物質（基質）を緩衝液とともに酵素電極測定
部へ送液して測定するフロー型においては、出力される
電流が１つの山を有す波形を形成するため、通常はその
山の高さをピーク電流値と称し、これを濃度換算に用い
る。

しかしながら、目的物質の濃度が高いところでは、消費
される物質、例えば第(1)式における酵素が不足となる
状態が生じたり、酵素電極の固定化酵素膜内において目
的物質濃度が高くなり、拡散速度を極度に低下させるな
どの原因でピーク電流値が濃度に比例した値を示さなく
なるため（ピーク電流値の飽和現象）、これらの領域の
濃度は適正に測定することができず、実質的に計測可能
な濃度領域の上限を形成する。

従って、目的物質の濃度の適正な計測は、ピーク電流値
の飽和現象の起こる濃度以下において行われる必要があ
り、このためには予め各濃度毎のピーク電流を細かに測
定し、その様子をグラフに化して所望する精度内に収ま
る濃度領域を確認するという煩雑な操作が必要であっ
た。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、酵素電極を用いたフロー型濃度測定装置にお
いて、上記のような煩雑な操作を経ずに、その測定が適
正な濃度領域内でおこなわれたか否かを瞬時に判定し、
目的物質の計測を正確かつ迅速に行うことができるフロ
ー型濃度測定装置を提供することを目的とする。

（問題を解決するための手段） 本発明に係るフロー型濃度測定装置は、酵素電極を利用
したフロー型濃度測定装置において、出力される波形電
流のピーク位置を求めるピーク位置演算手段と、同波形
電流の半値幅の中心位置を求める半値幅中心位置演算手
段と、求められたピーク位置と半値幅中心位置の位置を
比較する比較手段と、前記比較手段において、半値幅中
心位置がピーク位置より後ろにあるという比較結果が得
られた場合に適正な計測が可能な濃度領域内で測定が行
われたことを表示し、半値幅中心位置がピーク位置と同
一又は前にあるという比較結果が得られた場合に適正な
計測が可能な濃度領域を越えて測定が行われたことを表
示する表示手段とを有する測定値判定機構を備えたこと
を特徴とするフロー型濃度測定装置である。

（作用） 本発明において半値幅の中心位置及びピーク位置の「位
置」とは横軸を時間、縦軸を電流値とした場合の、横軸
方向の波形取り込み開始時からの半値幅中心及びピーク
までの経過時間を意味する。

適正な計測領域内、即ちピーク電流値が飽和せずに出力
される時にはその波形電流は第１ａ図に示す様なほぼガ
ウス型の波形をしているが固定化酵素膜内の拡散が瞬時
に起こらないためピーク以降が後方に広がっている。そ
の為、半値幅の中心位置（時間）はピークの位置（時
間）よりも後方に位置する（遅れる）ことになる。

また目的物質濃度が高くなると、ピーク電流値の飽和現
象が起きて、適正な計測領域の上限を越える。この場合
には、第１ｂ図に示すように、半値幅中心位置（時間）
がピーク位置（時間）の前方に位置する（早くなる）様
になっている。この理由については必ずしも明らかでは
ないが、飽和現象を起こす場合、本来ピークを示すはず
の最も濃度の高い部分が通過した後、濃度が低下し始め
て暫くはそれまで酸素不足で酵素反応を受けなかった目
的物質が、固定化酵素膜から逆に拡散し、余裕の出来た
酸素と反応して出力電流が上昇するため、あるいは目的
物質の通過に伴い新しく送液された緩衝液によって酸素
が供給され、膜内に残留した高濃度の目的物質と反応す
るためと推定される。本発明はこの現象を利用して測定
が適正な計測が可能な濃度領域内で行われたか否かを判
定するものである。

而して本発明の構成において、出力される波形電流の半
値幅の中心位置がピーク位置より遅れた場合、すなわち
後にある場合に適正な計測が可能な濃度領域内で測定が
行われたことを示し、半値幅の中心位置がピーク位置と
同一又は早い場合、すなわち同一点又は前にある場合に
適正な計測が可能な濃度領域を越えて測定が行われたこ
とを示す測定値判定機構とは以下の各手段を有してい
る。

酵素電極より得られた出力電流の波形を電気的に処理
し、さらに通常マイクロコンピュータにより構成され
る、波形のピーク位置を求めるピーク位置演算手段、半
値幅の中心位置を求める半値幅中心位置演算手段及び両
者の位置関係を比較する比較手段並びにマイクロコンピ
ュータに接続される出力装置により構成されるその比較
結果を表示する表示手段である。以下に本発明の機構を
実施例に従って更に詳細に説明する。

白金電極表面に、グルコースオキシダーゼ、ウシ血清ア
ルブミン、グルタルアルデヒドを含む水溶液を滴下し、
４０℃で３０分間処理して固定化し、グルコース検出用
酵素電極を作成する。この酵素電極を第２図に示す測定
装置に組み込む。酵素電極測定部(1)は上記の酵素電極
を作用極とし、Ａｇ／ＡｇＣ参照電極をセルに取りつ
けて構成する。この酵素電極測定部(1)をテフロン管で
高速液クロ用インジェクター(2)と結合し、定量ポンプ
(3)で0.05Ｍ塩化カリウムを含むpH7.0の0.1Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液(4)を1.0ｍ／ｍｉｎで送液する。

次にグルコースを含む試料（５〜１００ｍＭ）をインジ
ェクター(2)より注入し、２電極ボルタンメトリーの形
式で作用極に対参照電極＋0.45Ｖの電圧を印加し、測定
を行う。

電流波形の処理は例えば、電極で生じた波形電流を、電
流／電圧変換回路(5)、電圧増幅回路(6)、フィルタ回路
(7)を通じ、Ａ／Ｄ変換回路(8)により一定時間間隔でＡ
／Ｄ変換して得られたディジタル値をマイクロコンピュ
ータ(9)へ送り、格納後演算することによって行うこと
ができる。このときディジタル化された波形電流は、目
的物質の注入に同期して、マイクロコンピューター(9)
に取り込みが開始されるようにする。このマイクロコン
ピュータ内での処理については後述する。

ここで、実際にグルコース濃度を適正な計測が可能な濃
度領域からその濃度領域を越えて変化させた場合にピー
ク位置、ピーク電流値、半値幅の中心位置等がどのよう
に変化するかを測定した例を示す。先ず、第３図は、グ
ルコース濃度を変化させた場合に、半値幅の中心位置
（時間）及びピーク位置（時間）がどのように変化する
かを測定した結果を示している。

第３図により、ある濃度以降では、ピーク位置（時
間）、半値幅の中心位置（時間）は、後方へ移動してい
るが、ピーク位置（時間）の後方への変位の方が大き
く、途中で両者の位置の前後関係が逆転していることが
分かる。

また第４ａ図には半値幅の中心位置（時間）からピーク
位置（時間）を減算した値（時間）とグルコース濃度と
の関係を示した。これから、波形電流の半値幅の中心位
置（時間）とピーク位置（時間）の相対位置関係が分か
る。

更に第４ｂ図にピーク電流値とグルコース濃度との関係
を示した。第４ｂ図においてピーク電流値が飽和して適
正な計測領域から外れた７０ｍＭ前付近では、丁度第４
ａ図において半値幅の中心位置（時間）からピーク位置
（時間）を減じた値がプラスからマイナスへと変化して
いる。すなわち、プラスの範囲ではピーク電流値が飽和
しておらず、適正な計測がその範囲内で可能であること
が分かる。又、ゼロ及びマイナスの領域ではピーク電流
値が飽和しており、適正な計測が可能な濃度領域を越え
ているという事が分かる。

従って、試料中のある目的物質の濃度測定をピーク電流
値によって行うと同時に上記の演算値を表示する装置を
内蔵することによって、その測定が適正な領域内で行わ
れたものであるか否かの判定が出来るフロー型計測装置
を提供することが出来る。

マイクロコンピュータ内での処理は以下のように行われ
る。取り込まれた波形のデータ群からピークを検出する
には、通常各点とその前後の値から微計数を調べる所謂
微分法が用いられるが、取り込むデータ群の中にピーク
（しかも最高値）が存在する場合には、単純な比較法に
よる最大値検出の方が、簡単で計算速度の点で有利であ
るため本実施例では以下の方法で波形電流のピーク電流
値Ｐ及びピーク位置ｔｐをマイクロコンピュータを用い
て決定する。このピーク位置ｔｐ（ｔ′ｐ）やピーク電
流値Ｐ、（Ｐ′）は、第１ａ図又は第１ｂ図を参照のこ
と。

(1)取り込んだ波形の全域を、データ取り込みの時間間
隔よりも大きなステップＳでとばしてゆき、とんだ位置
におけるデータと順次比較してゆき、その中で最も大き
な値を示す位置（時間）ｔ_１を決める（ただしＳは取り
込み時間間隔の整数倍）。

(2)位置ｔ_１の前後のステップ幅Ｓの範囲内から、最大
値を求め、その高さをピークＰとし、更にそのピーク位
置ｔｐを決定する。

その際ピーク部でピーク値が連続して続いた場合には、
最も前方のものが中央のもの或いは最も後方のもののい
ずれかを選びその位置（時間）をピーク位置とするよう
に予め決めておく。ただし後方側に選ぶほど、適正な計
測領域の上限を示す前述の演算値の正、負逆転の濃度は
わずかに低めに設定されることになる。

次に半値幅の中心位置（時間）は、先に求めたピーク値
Ｐ及びピーク位置ｔｐより、例えば以下の容量で決定す
ることが出来る。この半値幅や半値幅の中心位置ｔｃ
（ｔ′ｃ）も、第１ａ図又は第１ｂ図を参照のこと。

(1)ピーク値Ｐの１／２を半値とし、ピーク位置ｔｐよ
り前方及び後方に向けて半値と同じ値を見つけるか、半
値を通過するまで半値と比較を行う。

(2)半値と同じ値を見つけたときには、その位置を半値
幅を示す端点の位置とし、半値と同じ値が見つからず半
値を通過したときには、半値を上下に挟む隣り合う２値
から、半値を示すべき位置を推定演算する。

（効果） 本発明の酵素電極を用いたフロー型濃度測定装置は、目
的物質の計測を行うと同時に、その測定が適正な計測領
域内で行われたか否かを即座に知ることが可能である優
れた測定装置であった。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は適正な計測領域内で見られる波形電流を示し
たものであり、図中ｔｐ，ｔｃはそれぞれピーク位置
（時間），半値幅の中心位置（時間）を示す。又第１ｂ
図は、適正な計測領域を越えた濃度を計測した時に見ら
れる波形電流を示すものであり、ピーク位置（時間）
ｔ′ｐは半値幅の中心位置ｔ′ｃの後方に位置してい
る。第２図は本発明のフロー型濃度測定装置の一例を示
す系統図である。 第３図はグルコース濃度に対するピーク位置（時間）及
び半値幅の中心位置（時間）の動きを示したものであ
る。両者の位置（時間）は波形電流の開始時刻をグルコ
ースの注入時に合わせ、流速一定の条件下、それぞれ計
測したものである。 第４ａ図は半値幅の中心位置（時間）からピーク位置
（時間）を減じた値（時間）とグルコース濃度の関係を
示し、第４ｂ図はピーク電流値とグルコース濃度の関係
を示すものである。 (1)……酵素電極測定部、(2)……インジェクター (3)……定量ポンプ、(4)……緩衝液 (5)……電流／電圧変換回路、(6)……電圧増幅回路 (7)……フィルタ回路、(8)……Ａ／Ｄ変換回路 (9)……マイクロコンピュータ (10)……出力装置、(11)……排液溜 (12)ポテンシオスタット

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素電極を利用したフロー型濃度測定装置
   において、出力される波形電流のピーク位置を求めるピ
   ーク位置演算手段と、同波形電流の半値幅の中心位置を
   求める半値幅中心位置演算手段と、求められたピーク位
   置と半値幅中心位置の位置を比較する比較手段と、前記
   比較手段において、半値幅中心位置がピーク位置より後
   ろにあるという比較結果が得られた場合に適正な計測が
   可能な濃度領域内で測定が行われたことを表示し、半値
   幅中心位置がピーク位置と同一又は前にあるという比較
   結果が得られた場合に適正な計測が可能な濃度領域を越
   えて測定が行われたことを表示する表示手段とを有する
   測定値判定機構を備えたことを特徴とするフロー型濃度
   測定装置。