JPH06121690A - チロシンキナーゼ陰性ｔｒｋＢ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全
部または一部をコードするＤＮＡ配列、該配列を含有す
る発現ベクター、該ベクターを含有する宿主細胞および
該ＤＮＡ配列またはその対応ＲＮＡ配列の検出方法を提
供する。 【構成】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全
部または一部をコードする核酸配列を含むことを特徴と
する単離核酸分子および該配列の検出法、該配列を含有
する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換またはト
ランスフェクションされた宿主細胞、およびチロシンキ
ナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部からなる
ポリペプチド分子の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、チロシンキナーゼ陰性
trkＢタンパク質の全部または一部をコードする核酸配
列、とりわけＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含有する発現
ベクター、該発現ベクターを含有する宿主細胞、および
該ＤＮＡ配列またはその対応ＲＮＡ配列の検出方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、癌遺伝子の存在が知られている。癌遺伝子とは、あ
る種の宿主細胞中に存在したときに、そのタンパク質産
物により該細胞を癌発現型に形質転換し得る遺伝子とし
て広く定義されている。一方、癌原遺伝子とは、「活性
化」されて癌遺伝子を生じ得る正常遺伝子として広く定
義されている。最初に発見された癌遺伝子は、ある種の
癌ウイルスの形質転換遺伝子であった。その後、癌遺伝
子は種々の真核細胞中にも存在することが発見された。
これら癌遺伝子の中には、trkとして示されるものが含
まれる。

【０００３】trk遺伝子座は最初にヒト結腸癌腫におい
て同定され、経膜ドメインおよび触媒ドメインを非筋肉
トロポミオシン遺伝子に由来する配列の一部に融合させ
る染色体転移により癌遺伝子として活性化されたもので
あった[マーチン−ザンカ(Martin−Zanca)ら、Nature３
１９、７４３〜７４８(１９８６)]。トロポミオシン以
外の活性化配列を含む別のtrk癌遺伝子は、遺伝子導入
アッセイの間に得られた[コズマ(Kozma)ら、EMBO J.
９、１４７〜１５４(１９８８)；オスカム(Oskam)ら、P
roc.Natl.Acad.Sci.９、２９６４〜２９６８(１９８
８)]。trk癌原遺伝子はチロシンプロテインキナーゼ活
性を有する細胞表面レセプターをコードしており、三叉
神経の神経節およびある種の後根神経節で特に発現され
る。

【０００４】trk癌原遺伝子に関連する遺伝子であってt
rkＢと称される遺伝子は、マウスの脳ｃＤＮＡライブラ
リーから最近単離された[クライン(Klein,R.)ら、EMBO
J.８、３７０１〜３７０９(１９８８)]。このtrkＢ癌原
遺伝子もまた、チロシンプロテインキナーゼ活性を有す
る細胞表面レセプターをコードする。これら遺伝子の両
方の変異対立遺伝子(癌遺伝子)は、ともに悪性トランス
フォーメーションを引き起こし得る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、このtrkＢ遺
伝子が、触媒チロシンキナーゼドメインを欠いた第二の
細胞表面レセプターをコードしているという驚くべき発
見を包含している。このタンパク質を「チロシンキナー
ゼ陰性trkＢレセプター」と称する。

【０００６】本発明は、チロシンキナーゼ陰性trkＢタ
ンパク質の全部または一部をコードする核酸配列を含む
単離核酸分子に関する。好ましくは、核酸分子はＤＮＡ
(デオキシリボ核酸)分子であり、核酸配列はＤＮＡ配列
である。さらに好ましいのは、実質的に図２および図３
に示すヌクレオチド配列の全部または一部を有するＤＮ
Ａ配列である。

【０００７】本発明はさらに、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢタンパク質をコードするＤＮＡ配列の全部または一
部を含有する発現ベクターにも関する。本発明はさら
に、チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列の全部または一部を含有する発現ベクター
で形質転換またはトランスフェクションした原核または
真核宿主細胞にも関する。本発明はまた、チロシンキナ
ーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部をコードす
る核酸配列の検出方法に関する。本発明はまた、チロシ
ンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部を含
むポリペプチド分子に関する。

【０００８】本発明は、チロシンキナーゼ陰性trkＢタ
ンパク質の全部または一部をコードする核酸配列を含む
単離核酸分子に関する。好ましくは、核酸分子はＤＮＡ
分子であり、核酸配列はＤＮＡ配列である。さらに好ま
しいのは、実質的に図２および図３に示すヌクレオチド
配列の全部または一部を有するＤＮＡ配列、またはこの
ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列である。本明細書にお
いて「チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質」とは、チ
ロシンプロテインキナーゼ触媒ドメインを欠いたtrkＢ
タンパク質を意味する。

【０００９】本発明のＤＮＡ配列は、現在のところ好ま
しい配列がマウスのｃＤＮＡ(相補的ＤＮＡ)から単離さ
れているが、種々の採取源から単離することができる。
産生されたタンパク質分子の正確なアミノ酸配列は、最
初のＤＮＡ配列により変わる。

【００１０】本発明のＤＮＡ配列は、当業者によく知ら
れた種々の方法を用いて得ることができる。下記の少な
くとも３種の基本的な方法を用いることができる。 （１）所望の配列を含有するゲノムＤＮＡからの二本鎖
ＤＮＡ配列の単離； （２）ＤＮＡ配列の化学的合成；および （３）ＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡ(メッセ
ンジャーＲＮＡ)の酵素的逆転写により二本鎖ＤＮＡ配
列をインビトロ合成し、ついで該ＤＮＡ配列を単離する
こと。

【００１１】上記最後の方法にはｍＲＮＡに相補的なＤ
ＮＡの生成が関与しており、一般にｃＤＮＡ法と呼ばれ
ている。チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部
または一部をコードするｃＤＮＡ配列を単離するため、
ｍＲＮＡ(その幾つかはチロシンキナーゼ陰性trkＢタン
パク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列により
コードされている)の逆転写によりプラスミド−保持ｃ
ＤＮＡライブラリーを作製する。

【００１２】これらｃＤＮＡライブラリーは、当該技術
分野で公知の種々の方法を用いて作製することができ
る。たとえば、ｍＲＮＡの二本鎖ｃＤＮＡコピーは、ま
ず逆転写酵素を用いて得られる。「粘着」末端を生成した
後(たとえば、ＥｃｏＲＩなどの制限エンドヌクレアー
ゼで消化することにより)、この粘着末端を有する二本
鎖ｃＤＮＡを約２倍モル過剰のファージベクターＤＮ
Ａ、たとえばλｇｔ１０またはλｇｔ１１ＤＮＡ(該Ｄ
ＮＡもまたＥｃｏＲＩなどの制限エンドヌクレアーゼで
消化されていて粘着末端を有し、ｃＤＮＡが挿入される
ことなくライゲートされるのを防ぐためホスファターゼ
処理されている)にライゲートする。ついで、このライ
ゲーション混合物を感染性ファージ粒子中にインビトロ
パッケージングし、宿主細胞中に形質転換する。λｇｔ
１０によるライブラリーに対しては適当な宿主細菌は大
腸菌Ｃ６００ｈｆｌＡであり、λｇｔ１１によるライブ
ラリーに対しては適当な宿主細菌は大腸菌Ｙ１０８８で
ある。

【００１３】ｃＤＮＡライブラリーが得られたら、これ
をスクリーニングして、チロシンキナーゼ陰性trkＢタ
ンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を含
有するバクテリオファージプラークまたは細菌コロニー
を同定する。

【００１４】たとえば、チロシンキナーゼ陰性trkＢタ
ンパク質の全部または一部をコードする標的ｃＤＮＡ中
に存在する配列と重複する標識一本鎖ＤＮＡプローブ配
列を、変性して一本鎖にしたｃＤＮＡのクローニングコ
ピーに対して行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン法に用いることができる。ｃＤＮＡライブラリーをこ
のような方法でスクリーニングするならば、実質的にあ
らゆるベクター(たとえばλｇｔ１０)を用いることがで
きる。

【００１５】ｃＤＮＡライブラリーはまた、イムノブロ
ット法を用いてチロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質
の全部または一部をコードするｃＤＮＡについてスクリ
ーニングすることもできる。ライブラリーをこの方法で
スクリーニングする場合は、適当な大腸菌発現ベクター
を用いなければならない。そのような方法の一つとし
て、適当なベクターは、目的ペプチドの切片(すなわ
ち、チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部また
は一部)を高度発現性の安定な大腸菌タンパク質に融合
させた融合タンパク質の発現に基づいている。たとえ
ば、チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部また
は一部をコードするクローニング配列をβ−ガラクトシ
ダーゼのコード配列に融合させた発現ベクターであるλ
ｇｔ１１を用いることができる。

【００１６】イムノブロット法またはハイブリダイゼー
ション法のいずれかに適した典型的なスクリーニング法
の一つにおいては、ｃＤＮＡライブラリーをまずアガロ
ースプレート上に広げ、ついで、これらクローンをフィ
ルターメンブラン、たとえばニトロセルロースメンブラ
ンに移す。ついで、これらクローンにＤＮＡプローブを
ハイブリダイズさせるかまたは抗体を結合させて、チロ
シンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部を
コードするｃＤＮＡを含有するクローンを同定する。

【００１７】本発明のＤＮＡ配列は、本発明に従って種
々の仕方で用いることができる。たとえば、本発明のＤ
ＮＡ配列は、他のｃＤＮＡをスクリーニングするための
ＤＮＡプローブとして、またはチロシンキナーゼ陰性tr
kＢに関連するタンパク質をコードする他のＤＮＡ配列
をハイブリダイゼーションにより選択するためのゲノム
ＤＮＡライブラリーとして用いることができる。

【００１８】本発明のＤＮＡ配列はまた、種々の変異を
調製するのに用いることもできる。そのような変異は、
縮重しているか(すなわち、変異の結果、変異コドンに
よってアミノ酸配列が変化しない)、または縮重してい
ない(すなわち、変異の結果、変異コドンによってアミ
ノ酸配列が変化する)。本発明のポリペプチドを調製ま
たは使用するに際して両タイプの変異が有利である。た
とえば、これら変異により、高レベルの産生、容易な精
製が可能となり、また別の制限エンドヌクレアーゼ認識
部位が得られる。そのような変異は本発明の範囲に包含
される。

【００１９】本発明はさらに、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配
列を含有する発現ベクターに関する。これら発現ベクタ
ーは、実質的に図２および図３に示すヌクレオチド配列
を有するＤＮＡ配列の全部または一部を含有するのが好
ましい。さらに好ましいのは、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配
列に機能的に連結した１または２以上の制御ＤＮＡ配列
を含有する発現ベクターである。本明細書において「機
能的に連結した」とは、制御ＤＮＡ配列が、チロシンキ
ナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部をコード
するＤＮＡ配列の複製および／または発現を指令するこ
とができることをいう。

【００２０】本発明に利用できる発現ベクターは、しば
しば「プラスミド」の形態にあり、これは、そのベクター
形において染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮＡル
ープをいう。しかしながら、本発明は、同等の機能を有
し、その後に当該技術分野で知られるようになった他の
形態の発現ベクターも包含する。

【００２１】本発明に有用な発現ベクターは、一般に、
複製開始部位、所定ＤＮＡ配列の前部(すなわち、上流)
に位置するプロモーター、およびそれに続いてチロシン
キナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部をコー
ドするＤＮＡ配列、複製終止配列および残りのベクター
を含んでいる。発現ベクターにはまた、当該技術分野で
知られた他のＤＮＡ配列、たとえば、発現産物の安定性
を付与する安定性リーダー配列、発現産物を分泌させる
分泌リーダー配列、構造遺伝子の発現を調節する(たと
えば、生育培地中に栄養物を存在させるまたは存在させ
ないことによって)制御配列、形質転換宿主細胞中での
表現型選択を可能にするマーキング配列、および制限エ
ンドヌクレアーゼによる開裂部位を提供する配列なども
含んでいてよい。

【００２２】使用した実際の発現ベクターの特性は、使
用しようとする宿主細胞と適合するものでなければなら
ない。たとえば、哺乳動物の細胞系でクローニングを行
う場合には、発現ベクターは哺乳動物細胞のゲノムから
単離したプロモーター(たとえば、マウスメタロチオネ
インプロモーターなど)、またはこれら哺乳動物細胞中
で生育するウイルスから単離したプロモーター(たとえ
ば、ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーターなど)を含
有していなければならない。

【００２３】本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡ
配列の複製を少なくとも指令することができなければな
らず、該ＤＮＡ配列の発現も指令できるのが好ましい。
適当な複製開始部位としては、たとえば、大腸菌ベクタ
ーｐＢＲ３２２の複製開始部位などが挙げられる。適当
なプロモーターとしては、たとえば、トリレトロウイル
ス(たとえば、ラウス肉腫ウイルスなど)または哺乳動物
レトロウイルス(たとえば、モロニー肉腫ウイルスなど)
のＬＴＲ、ＤＮＡウイルスＳＶ４０の初期領域、および
メタロチオネインやチミジンキナーゼなどのある種の細
胞遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。

【００２４】適当な終止配列としては、たとえば、ＤＮ
ＡウイルスＳＶ４０などのポリ(Ａ)配列が挙げられる。
選択マーカーとしては、細菌のｎｅｏ遺伝子およびｇｐ
ｔ遺伝子が最も適している。一般に、ｐＢＲ３２２に由
来するベクター、たとえば、ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１
９を用いることができる。これらはすべて当該技術分野
で知られており、市販されている。

【００２５】特に好ましいのは、下記で記載するｐＦＲ
Ｋ４２と称する発現ベクター(チロシンキナーゼ陰性trk
Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する)、ま
たはｐＦＲＫ４２の同定特性を有する発現ベクターであ
る。ｐＦＲＫ４２を含有する宿主細胞(大腸菌株ＤＨ５)
は、ブダペスト条約の下、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション(ロックビル、メリーランド)に１９
９０年４月１８日に受託番号６８３０９で寄託してあ
る。

【００２６】所望コード配列および制御配列を含有する
適当な発現ベクターは、当該技術分野で知られた標準的
な組換えＤＮＡ法[該技術の多くはマニアチス(Maniati
s,T.)らの「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル(MolecularCloning:A Laboratory Man
ual)」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ(１９８２)に記
載されている]を用いて構築することができる。単離し
たプラスミドまたはＤＮＡ断片は、開裂し、調整し、再
ライゲートして所望の発現ベクターを形成する。

【００２７】プラスミドまたはＤＮＡ断片の開裂は、た
とえば、適当な反応条件下で１種または２種以上の制限
酵素で処理することにより行うことができる。適当な制
限酵素は市販されており、その例としては、たとえば、
ＢａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩなど
が挙げられる。適当な緩衝液、基質の量および特定の制
限酵素に対する反応時間および温度などの適当な反応条
件は当該技術分野で知られており、一般に該酵素の製造
業者により指定される。一般に、約１μｇのプラスミド
またはＤＮＡ断片を約２０μｌの緩衝液中の約１単位の
酵素とともに用いる。３７℃で約１時間のインキュベー
ション時間が一般的である。

【００２８】プラスミドまたはＤＮＡ断片の調整は、当
該技術分野で知られた種々の方法で行うことができる。
たとえば、平滑末端を有するＤＮＡ分子が必要な場合
は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用
いることができる。この酵素は市販されており、適当な
反応条件は当該技術分野で知られており、通常、製造業
者により指定される。ＤＮＡ調製物を約１０単位のクレ
ノウフラグメントで約１５℃にて約１５分間処理するの
が一般的である。

【００２９】プラスミドまたはＤＮＡ断片のライゲーシ
ョンもまた、当該技術分野で知られた種々の方法により
行うことができる。たとえば、バクテリオファージＴ₄
からのＤＮＡリガーゼを用いることができる。この酵素
は市販されており、適当な反応条件は当該技術分野で知
られており、通常、製造業者により指定される。一般
に、等モル量の所望のＤＮＡ分子を、ＤＮＡ０.５μｇ
当たり約１０単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼで処理する。

【００３０】本発明はさらに、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配
列を含有する発現ベクターを包含する宿主細胞にも関す
る。この宿主細胞は、好ましくは、実質的に図２および
図３に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の全部
または一部を含有する発現ベクターを包含する。さらに
好ましいのは、チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質
の全部または一部をコードするＤＮＡ配列の複製および
／または発現を指令することができ、該ＤＮＡ配列に機
能的に連結した、１種または２種以上の制御ＤＮＡ配列
を含有する発現ベクターを包含する宿主細胞である。適
当な宿主細胞としては、原核細胞および真核細胞の両方
が含まれる。適当な原核細胞としては、たとえば、大腸
菌細胞が挙げられる。適当な真核細胞としては、たとえ
ば、マウスのＢＡＬＢ３Ｔ３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細
胞、ラットのＲＡＴ−２細胞およびＲＡＴ−４細胞、ハ
ムスターのＣＨＯ細胞、およびヒトのＨｅＬａ細胞およ
びＨＯＳ細胞などが挙げられる。

【００３１】宿主細胞として特に好ましいのは、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞などのマウス細胞である。発現ベクターの宿
主細胞中への導入は、当該技術分野で知られた種々の方
法により行うことができる。たとえば、宿主細胞の発現
ベクターでのトランスフェクションは、リン酸カルシウ
ム沈殿法により行うことができる。しかしながら、宿主
細胞中へ発現ベクターを導入するための他の方法、たと
えば、エレクトロポレーション、核注入法またはプロト
プラスト融合法などを用いることもできる。

【００３２】発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入さ
れたら、所望のポリペプチド(本発明の場合はチロシン
キナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部を含有
するポリペプチド分子)の大量の発現が可能な条件下で
宿主細胞を培養する。そのようなポリペプチドは、チロ
シンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の特性、たとえば悪
性トランスフォーメーションに果す役割などの研究に有
用である。

【００３３】チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の
全部または一部をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベ
クターを含有する宿主細胞は、下記４つの一般的方法の
１または２以上により同定することができる。(ａ)ＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション；(ｂ)マーカー遺伝
子機能の存在または不在；(ｃ)宿主細胞中のチロシンキ
ナーゼ陰性trkＢ ｍＲＮＡ転写物の産生により測定され
る転写レベルの評価；および(ｄ)免疫学的な遺伝子産物
の検出。

【００３４】上記第一の方法では、チロシンキナーゼ陰
性trkＢタンパク質の全部または一部をコードするＤＮ
Ａ配列の存在は、該ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用
いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出
することができる。

【００３５】上記第二の方法では、組換え発現ベクター
宿主系は、ある種のマーカー遺伝子機能(たとえば、チ
ミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など)の存在または
不在に基づいて同定および選択することができる。マー
カー遺伝子は、チロシンキナーゼ陰性trkＢコード配列
を制御するのに使用したプロモーターと同じまたは異な
るプロモーターの制御下に、チロシンキナーゼ陰性trk
Ｂタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列
と同じプラスミド中に置くことができる。誘導または選
択に応答してマーカー遺伝子が発現されれば、チロシン
キナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部をコー
ドするＤＮＡ配列が発現されたことを示している。

【００３６】第三の方法では、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢ ｍＲＮＡ転写物の産生は、ハイブリダイゼーション
アッセイにより評価することができる。たとえば、該Ｒ
ＮＡ配列に相補的なプローブを用いたノーザンブロッテ
ィング法によりポリアデニル化ＲＮＡを単離分析するこ
とができる。別法として、全核酸を宿主細胞から抽出
し、そのようなプローブに対するハイブリダイゼーショ
ンについてアッセイすることもできる。

【００３７】第四の方法では、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢタンパク質の全部または一部の発現は、たとえばウ
エスタンブロッティング法により免疫学的に評価するこ
とができる。本発明の発現ベクター、プラスミドまたは
ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られた種
々の方法により決定することができる。たとえば、サン
ガー(Sanger)らのProc.Natl.Acad.Sci.USA７４、５４６
３〜５４６７(１９７７)に記載されたチェインターミネ
ーター法、またはProc.Natl.Acad.Sci.USA７４、５６０
〜５６４(１９７７)に記載されたマクサム−ギルバート
法などを用いることができる。

【００３８】もちろん、すべての発現ベクターおよびＤ
ＮＡ制御配列が本発明のＤＮＡ配列を同じように首尾よ
く発現できるわけではないことを理解すべきである。宿
主細胞についても、すべての宿主細胞が同じ発現系に対
して同じように首尾よく機能するわけではない。しかし
ながら、当業者であれば、不当な実験を行うことなく、
また本発明の範囲から離れることなく、発現ベクター、
ＤＮＡ制御配列および宿主細胞を選択することができる
であろう。

【００３９】本発明はまた、チロシンキナーゼ陰性trk
Ｂタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列の
検出法にも関し、該方法は、該核酸配列の少なくとも一
部に特異的に結合する検出可能なマーカーに該核酸配列
を接触させ、ついで、かくして結合したマーカーを検出
することを特徴とする。結合マーカーの存在は目的核酸
配列の存在を示す。

【００４０】好ましくは、目的核酸配列は、実質的に図
２および図３に示すヌクレオチド配列の全部または一部
を有するＤＮＡ配列である。また、該ＤＮＡ配列がゲノ
ムＤＮＡ配列である方法が好ましい。該ＤＮＡ配列を含
有するＤＮＡ試料は、当業者によく知られた種々のＤＮ
Ａ単離法を用いて単離することができる。たとえば、組
織からゲノムＤＮＡ試料を単離するには、該ＤＮＡを単
離しようとする組織を迅速に凍結乾燥し、この組織を破
砕して容易に消化可能な小片とし、破砕した組織をプロ
テイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウムの溶液中に入
れ、ついで殆どの細胞タンパク質が変性するまで、得ら
れた溶液をインキュベートする。ついで、この消化物を
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで連
続抽出することにより脱タンパクし、エタノール沈殿に
より回収し、ついで乾燥し緩衝液中に再懸濁する。

【００４１】核酸配列がＲＮＡ配列である方法も好まし
い。好ましくは、ＲＮＡ配列はｍＲＮＡ配列である。Ｒ
ＮＡ配列が組織試料の細胞中に位置している方法もまた
好ましい。該ＲＮＡ配列を含有するＲＮＡ試料は、当業
者によく知られた種々のＲＮＡ単離法を用いて単離する
ことができる。たとえば、培養細胞からＲＮＡ試料を単
離するには、培地を含まない細胞を洗浄し、ついで該細
胞を４Ｍグアニジニウム溶液中に入れて溶解する。この
溶解液を２０ゲージの針で吸い取ることにより、得られ
た溶液の粘度を下げる。ＣｓＣｌ₂段階密度勾配により
ＲＮＡをペレット化し、この密度勾配から上澄み液を注
意深く除き、ＤＮＡおよびタンパク質による汚染から目
的ＲＮＡ(ペレット中に含まれる)を完全に分離させる。

【００４２】チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の
全部または一部をコードする核酸配列を検出するのに有
用な検出可能なマーカーとしてはチロシンキナーゼ陰性
trkＢタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ
配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有
する標識ＤＮＡ配列(標識ｃＤＮＡ配列を含む)が挙げら
れる。

【００４３】上記検出可能なマーカーはまた、チロシン
キナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部または一部をコー
ドするＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオ
チド配列を有する標識センスＲＮＡ配列または標識アン
チセンスＲＮＡ配列であってよい。

【００４４】本発明の検出可能なマーカーは、³²Ｐや³⁵
Ｓなどの一般に用いられる放射性標識で標識してあって
よいが、ビオチンなどの他の標識を用いることもでき
る。これら検出可能なマーカーを標識するため、当業者
によく知られた種々の方法を用いることができる。たと
えば、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列は、ランダムプライ
マー法を用い³²Ｐまたは³⁵Ｓで標識することができる。

【００４５】適当な検出可能なマーカーが得られたら、
当業者によく知られた種々の方法を用いて検出可能なマ
ーカーを目的試料に接触させることができる。たとえ
ば、当該技術分野で知られた標準的な方法を用いてＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼーションおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダ
イゼーションを行うことができる。チロシンキナーゼ陰
性trkＢタンパク質の全部または一部をコードするＤＮ
Ａ配列をゲノムＤＮＡ中に検出するための典型的なＤＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法においては、まず
ゲノムＤＮＡを公知方法を用いて単離し、ついで１種ま
たは２種以上の制限酵素で消化する。得られたＤＮＡ断
片をアガロースゲル上で分離し、その場で変性させる。
プレハイブリダイゼーションを行って非特異的なハイブ
リダイゼーションを減少させた後、上記固定化ＤＮＡ断
片に放射性標識核酸プローブをハイブリダイズさせる。
ついで、フィルターを洗浄して未結合または弱く結合し
たプローブを除去し、ついでオートラジオグラフィーに
かけて該プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を同
定する。

【００４６】結合した検出可能なマーカーの存在は、当
業者によく知られた種々の方法を用いて検出することが
できる。たとえば、検出可能なマーカーが放射性標識さ
れている場合はオートラジオグラフィーを用いることが
できる。使用した標識に応じて、分光測定法などの他の
検出法を用いることもできる。

【００４７】本発明はさらに、チロシンキナーゼ陰性tr
kＢタンパク質の全部または一部を含むポリペプチド分
子に関し、該ポリペプチド分子は実質的に図２および図
３に示すアミノ酸配列の全部または一部を有するのが好
ましい。さらに好ましいのは、実質的に図２および図３
に示すアミノ酸の全部または一部に対する相同性が少な
くとも９０％であるアミノ酸配列を有するポリペプチド
である。糖付加されたチロシンキナーゼ陰性trkＢタン
パク質の全部または一部を含むポリペプチド分子もまた
好ましい。

【００４８】本明細書において同定されるアミノ酸は、
ずべて天然のＬ体である。標準的なポリペプチド命名法
[J.Biol.Chem.２４３、３５５７〜３５５９(１９６９)]
に従い、アミノ酸の略語は下記対応表に示す通りであ
る。

【００４９】

【００５０】

【００５１】本明細書中のアミノ酸配列は、すべて左か
ら右への方向が通常のアミノ末端からカルボキシル末端
への方向である式によって示してある。

【００５２】本発明のポリペプチドは、当業者に知られ
た方法により、合成手段、すなわちその成分アミノ酸か
らの化学合成により得ることができる。たとえば、ヒュ
ートン(Houghton)らのProc.Natl.Acad.Sci.８２、５１
３５(１９８５)に記載された固相法を用いることができ
る。チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質の全部また
は一部をコードするＤＮＡ配列を発現する原核または真
核宿主細胞中で産生させるか、またはチロシンキナーゼ
陰性trkＢタンパク質の全部または一部をコードするＤ
ＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡをインビトロ翻訳
することによりポリペプチドを得るのが好ましい。

【００５３】たとえば、図２および図３に示すＤＮＡ配
列を化学的に合成し、適当な発現ベクター中に挿入し、
今度は該発現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転
換することができる。ついで、得られた組換え体宿主細
胞を培養してチロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質を
産生させることができる。これら手段によるポリペプチ
ドの製造法は当該技術分野で知られており、本明細書中
に記載する。

【００５４】上記で得られたポリペプチドは、種々のタ
ンパク質精製法を用い、ある程度まで単離精製すること
ができる。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティ
ークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用
いることができる。

【００５５】本発明のポリペプチドは、広範囲の種々の
用途に使用することができる。たとえば、本発明のポリ
ペプチドは、該ポリペプチドに結合するポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体を公知方法で調製するの
に用いることができる。これら抗体は、今度は、イムノ
アッセイ法、たとえばラジオイムノアッセイ法や酵素イ
ムノアッセイを用い、試料(たとえば、細胞試料や組織
試料など)中の本発明のポリペプチドを検出するのに用
いることができる。これら抗体はまた、本発明のポリペ
プチドを精製するためのアフィニティークロマトグラフ
ィーに使用し、種々の採取源から単離することができ
る。

【００５６】本発明のポリペプチドは、決定されたＤＮ
Ａ配列およびそれから導き出されたアミノ酸配列により
定められる。遺伝コードの縮重のため、図２および図３
に示した同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列
を用いて本発明のポリペプチドを製造することもでき
る。加えて、これらＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の対
立遺伝子変異が天然に存在し、また当該技術分野で知ら
れた方法を用いて意図的に導入することができることも
理解すべきである。これら変異は、全配列中の１または
２以上のアミノ酸の相違により、すなわち該配列中の１
または２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位また
は付加により示される。そのようなアミノ酸置換は、た
とえば、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、
親水性および／または両親媒性などの類似性に基づいて
起こる。

【００５７】たとえば、負に荷電したアミノ酸としては
アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷
電したアミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが挙げ
られ、親水性値が類似の非電荷の極性ヘッド基または非
極性ヘッド基を有するアミノ酸としては以下のものが挙
げられる；ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシ
ン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、ス
レオニン；フェニルアラニン、チロシン。

【００５８】他の態様としては、上記ポリペプチドの塩
およびエステル、並びに上記ポリペプチドの前駆体、た
とえばメチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニンおよびリー
ダー配列などのＮ−末端置換を有する前駆体が挙げられ
る。そのような態様はすべて本発明の範囲に含まれる。

【００５９】つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ チロシンキナーゼ陰性trkＢ ｃＤＮＡクローンの単離：
チロシンキナーゼ陰性trkＢ ｃＤＮＡクローンの単離
は、成体マウスの脳ｃＤＮＡライブラリー[シトリ(Citr
i,Y.)ら、Nature３２６、４２〜４７(１９８７)]を、tr
kＢ遺伝子の細胞外領域の部分に対応するチロシンプロ
テインキナーゼ陽性trkＢ ｃＤＮＡクローンからゲル電
気泳動により精製した２０７ｂｐ ＤＮＡ断片[クライン
(Klein,R.)らのEMBO J.８、３７０１〜３７０９(１９８
９)に記載されたtrkＢ ｃＤＮＡクローンであるｐＦＲ
Ｋ４３のヌクレオチド１１８１〜１３８７]とハイブリ
ダイズさせることにより行った。ハイブリダイゼーショ
ンは、クラインらのEMBO J.８、３７０１〜３７０９(１
９８９)に記載の方法に従って行った。

【００６０】８つの組換えファージの５'末端および３'
末端のヌクレオチド配列を分析したところ、これらのう
ちの４つのファージの３'末端にはｐＦＲＫ４３とは関
係のない配列が含まれていることがわかった。これら新
規なｃＤＮＡクローンのうち最も長いもの(２.５ｋｂ
ｐ)を、マニアチスらの上記文献に記載された標準法に
従いpBluescript[ストラタジーン、ラジョラ(La Joll
a)、ＣＡ]中にサブクローニングした。

【００６１】簡単に説明すると、この組換えファージＤ
ＮＡ(６００ｎｇ)を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ
(６０単位；ベーリンガー・マンハイム、インディアナ
ポリス、ＩＮ)で３７℃にて２時間消化した。２.５ｋｂ
のＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片を、臭化エチジウム(０.５
μｇ／ｍｌ)を含有する１％アガロースゲルでの電気泳
動によりファージＤＮＡから分離した。この２.５ｋｂ
ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片を含むアガロースブロックを
ゲルから切り出し、このｃＤＮＡを透析管内での電気泳
動によりアガロースから電気溶離した(electroelute
d)。このｃＤＮＡ断片を透析管からピペットで移し、
「エルチップ(elutip)」カラムを通して清浄にし、エタノ
ール沈殿し、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁した。
種々のモル比のｃＤＮＡ断片およびＥｃｏＲＩ線状化pB
luescript ＫＳ Ｍ１３−プラスミドＤＮＡ(ストラタジ
ーン)をＴ４ＤＮＡリガーゼ(ベセスダ・リサーチ・ラブ
ズ、ガイセルスバーグ、ＭＤ)の存在下、１５℃で２０
時間インキュベートすることにより幾つかのライゲーシ
ョン反応を行った。

【００６２】ついで、得られたプラスミド(ｐＦＲＫ４
２と称する)をコーエン(Cohen,S.N.)らのProc.Natl.Aca
d.Sci.USA６９、２１１０(１９７２)に記載の方法に従
ってコンピテント大腸菌(菌株ＤＨ５)細胞を形質転換す
るのに用いた。ついで、形質転換細胞をアンピシリンコ
ーティングアガープレート上にプレーティングした。組
換えＤＨ５細胞から「ミニプレプ(Miniprep)」ＤＮＡを調
製し、ＥｃｏＲＩ制限分析に供した。アガロース電気泳
動後に上記２.５ｋｂ ｃＤＮＡの存在により視覚化され
るｐＦＲＫ４２を含有する陽性ＤＨ５細胞を、大スケー
ルのプラスミドＤＮＡを調製するため１リットルの液体
培地中で成育させた。二本鎖ＤＮＡ、合成オリゴヌクレ
オチドおよび修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ[シークエナ
ーゼ(Sequenase)、ユナイテッド・ステイツ・バイオケ
ミカルズ、クリーブランド、ＯＨ]を用い、チェインタ
ーミネーター法(サンガーら、上記文献参照)によりｐＦ
ＲＫ４２を完全なヌクレオチド配列分析に供した。

【００６３】図２および図３に示すように、このｃＤＮ
Ａクローンは２４８９ｂｐからなり、そのうちヌクレオ
チド１〜１３９４はｐＦＲＫ４３に存在するものと同一
である。これら配列は、ｇｐ１４５^trkB(ｐＦＲＫ４３
チロシンキナーゼ陽性ｃＤＮＡクローンによりコードさ
れるタンパク質に糖付加した形態のもの)の推定シグナ
ルペプチド(ヌクレオチド１〜９３)、細胞外ドメイン
(ヌクレオチド９４〜１２８７)、経膜領域(ヌクレオチ
ド１２８８〜１３５９)および細胞質ドメインの最初の
１２のアミノ酸残基に対応する。

【００６４】ｐＦＲＫ４２とｐＦＲＫ４３ ｃＤＮＡク
ローン間の相同性は、ヌクレオチド１３９５(ｐＦＲＫ
４３中のヌクレオチド１９０６)で突然に終了する。ｐ
ＦＲＫ４２の独特の配列は、ｐＦＲＫ４３との相違の開
始点からちょうど３３ヌクレオチド下流にあるインフレ
ームの終止コドン(ＴＡＧ)を示す。残りのヌクレオチド
(１４３２〜２４８４位)は、３'非コード配列を示す。
これらの配列には、３つの推定ポリアデニル化シグナル
(ヌクレオチド１８１５〜１８２１、２４１３〜２４１
８および２４４５〜２４５１)、および基本となるＴＣ
ＴＡＴＣＴＡ配列が何度も繰り返し現れる約２００ｂｐ
のストリーク(streak)が含まれる。

【００６５】これらの結果は、ｐＦＲＫ４２が４７６ア
ミノ酸の長さのポリペプチド(分子質量５３,１８５ダル
トン)のみをコードし得ることを示している。この推定
ポリペプチドの１〜４６５残基はｇｐ１４５^trkBのもの
と同一である。これらの残基は、全細胞外ドメインおよ
び経膜ドメインを包含している。しかしながら、ｐＦＲ
Ｋ４２の産物は２３残基の短い細胞質ドメインを有して
おり、そのうち少なくとも１１残基がこの分子に独特な
ものである。それゆえ、ｐＦＲＫ４２の予測される産物
には、ｇｐ１４５^trkB中に存在するチロシンプロテイン
キナーゼ触媒ドメインが欠けている。

【００６６】実施例２ 成体マウス組織中のtrkＢ転写物のノーザンブロッティ
ング分析：チロシンキナーゼ陰性ｐＦＲＫ４２ ｃＤＮ
ＡクローンがtrkＢ転写物の忠実なコピーであるかどう
かを決定するため、ポリＡ含有ＲＮＡを脳、肝臓および
肺組織から単離し、このクローンの特異的領域に対応す
る短い(２５０ｂｐ〜３７０ｂｐ)ＤＮＡ断片をプローブ
として用いたノーザンブロッティングに供した。

【００６７】ＲＮＡの単離およびノーザンブロッティン
グ分析は、マニアチスらの上記文献の記載に従って行っ
た。プローブは、複製連鎖反応(ＰＣＲ)法を用い、ｐＦ
ＲＫ４２またはｐＦＲＫ４３ ｃＤＮＡ配列の増幅によ
り得た。各ＰＣＲ反応混合物(１００μｌ)は、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭトリス(ｐＨ８.３)、１.５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂および０.１％ゼラチン(ｗ／ｖ)中に鋳型ＤＮＡ、
各２００μＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰ、
センスおよびアンチセンスアンプリマー(amplimers)お
よびTaq ＤＮＡポリメラーゼ(２.５単位)を含んでい
た。

【００６８】プローブＡについては、使用した鋳型はｐ
ＦＲＫ４３ＤＮＡ(２ｎｇ)であり、使用したセンスアン
プリマーは５'−ＣＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＴ
ＡＣＴＧＡＧＣＣＴＴＣＴＣ−３'の配列を有する＃Ｐ
０１０−１(３μＭ)であり、使用したアンチセンスアン
プリマーは５'−ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣ
ＣＡＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＣ−３'の配列を有する＃Ｐ
０１１−１(３μＭ)であった。

【００６９】プローブＥについては、使用した鋳型はｐ
ＦＲＫ４２ＤＮＡ(２ｍｇ)であり、使用したセンスアン
プリマーは５'−ＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴ
ＴＧＴＴＧＣＣＴＧ−３'の配列を有する＃Ｐ００４−
０(３μＭ)であり、使用したアンチセンスアンプリマー
は５'−ＴＣＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＴＴＴＧＡ
ＡＣＴＡＴＴＧＴＡ−３'の配列を有する＃Ｐ００５−
１(３μＭ)であった。

【００７０】プローブＫについては、使用した鋳型はｐ
ＦＲＫ４２ＤＮＡ(２ｎｇ)であり、使用したセンスアン
プリマーは５'−ＧＴＣＡＴＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡ
ＧＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＡＡＧＴＣ−３'の配列を有す
る＃Ｐ０３３−０(３μＭ)であり、使用したアンチセン
スアンプリマーは５'−ＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡ
ＴＴＣＣＣＴＡＴＡＴＧＣＡＴＡＴＡＣ−３'の配列を
有する＃Ｐ０３４−０(３μＭ)であった。

【００７１】プローブＤについては、使用した鋳型はｐ
ＦＲＫ４３ＤＮＡ(５ｎｇ)であり、使用したセンスアン
プリマーは５'−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡ
ＡＣＡＡＴＧＡＧＧ−３'の配列を有する＃Ｐ００３−
１(４.５μＭ)であり、使用したアンチセンスアンプリ
マーは５'−ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧ
ＣＣＡＧＴＣＴＧ−３'の配列を有する＃Ｐ００２−０
(４.５μＭ)であった。

【００７２】プローブＨについては、使用した鋳型はｐ
ＦＲＫ４３ＤＮＡ(２ｎｇ)であり、使用したセンスアン
プリマーは５'−ＣＡＣＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡ
ＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡ−３'の配列を有する＃Ｐ
０１４−２(３μＭ)であり、使用したアンチセンスアン
プリマーは５'−ＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧ
ＡＣＡＣＣＧＴＡＧＡＡＣＴ−３'の配列を有する＃Ｐ
０１５−１(３μＭ)であった。

【００７３】プローブＧについては、使用した鋳型はｐ
ＦＲＫ４３ＤＮＡ(１ｎｇ)であり、使用したセンスアン
プリマーは５'−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＴＡ
ＴＣＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＣＣ−３'の配列を有する＃
Ｐ００８−１(３μＭ)であり、使用したアンチセンスア
ンプリマーは５'−ＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣ
ＡＧＴＣＧＧＡＧＴＧＣＧＴＧ−３'の配列を有する＃
Ｐ００９−０(３μＭ)であった。

【００７４】ついで、下記熱サイクルプログラムを用い
て複製連鎖反応を行った。 セグメント１：試料を９４℃に３０秒間以上加熱する。 セグメント２：試料を９４℃で１分間インキュベートす
る。 セグメント３：試料を４５℃に１分間以上冷却する。 セグメント４：試料を４５℃で２分間インキュベートす
る。 セグメント５：試料を７２℃に３０秒間以上加熱する。 セグメント６：試料を７２℃で５分間インキュベートす
る。

【００７５】セグメント１〜６からなる上記熱サイクル
を、各サイクルの後でセグメント６を自動的に１０秒間
延ばしながら２５回繰り返した。２５のすべてのサイク
ルを終了した後、試料を７２℃でさらに７分間インキュ
ベートし、ついでさらに分析するため４℃で保存した。
増幅させたＤＮＡを標準的な分子生物学的方法(マニア
チスらの上記文献参照)に従い、アガロースゲル電気泳
動により分析し、ゲル精製し、フェノール／クロロホル
ム抽出し、エタノール沈殿させた。

【００７６】³²Ｐ−標識αｄＣＴＰ(デュポン、ウイル
ミントン、ＤＥ)の存在下で「ニック」トランスレーショ
ンキット(アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ)を
用い、各ＤＮＡ(１００ｎｇ)を標識した。組み込まれな
かったヌクレオチドは、「エルチップ」カラム(シュライ
ヒャー＆シュエル)を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーによりプローブから分離した。ハイブリダイゼ
ーションは、高ストリンジェンシー(stringency)条件
(５×ＳＳＣ[ＳＳＣ＝３５.０６ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１
７.６５ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０]、５０
％ホルムアミド、１×デンハルト溶液および１０％デキ
ストランサルフェート中、４２℃)下で４８時間行っ
た。ハイブリダイズしたフィルターを６０℃にて３０分
間、２×ＳＳＣ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤ
Ｓ)(３回)中および０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ(１
回)中で洗浄し、増感スクリーンの助けを借りてコダッ
クＸ−ＯＭＡＴフィルムに１〜４日間暴露した。各レー
ンに負荷したＲＮＡの量は、[³²Ｐ]標識したβ−アクチ
ンプローブへのハイブリダイゼーションにより制御し
た。

【００７７】図４に示すように、trkＢ産物の細胞外ド
メインのアミノ末端をコードする配列に対応するＤＮＡ
断片(ヌクレオチド１１９〜４９０)であるプローブＡ
は、９.０ｋｂ、８.２ｋｂ、８.０ｋｂ、５.５ｋｂ、
２.５ｋｂおよび２.０ｋｂという少なくとも６つの別個
の脳ｍＲＮＡを認識した。これら転写物のうちの４つ
(８.２ｋｂ、８.０ｋｂ、２.５ｋｂおよび２.０ｋｂの
転写物を含む)はまた、低レベルではあるが肺組織にお
いても認められた。肝臓組織ではtrkＢ発現は認められ
なかった。

【００７８】上記各転写物は、ｇｐ１４５^trkBコード配
列のほとんどを含有するｐＦＲＫ４３由来ｃＤＮＡプロ
ーブを用いて以前に同定されている。対照的に、同じＲ
ＮＡブロットをプローブＥ(チロシンキナーゼ陰性ｐＦ
ＲＫ４２ｃＤＮＡ(ヌクレオチド１４５４〜１７１１)に
特異的な配列に由来するＤＮＡ断片)とハイブリダイズ
させた場合には、８.２ｋｂ、８.０ｋｂ、２.５ｋｂお
よび２.０ｋｂのtrkＢ転写物を同定することができた。
繰り返しモチーフ領域から下流に位置するｐＦＲＫ４２
特異的配列(ヌクレオチド２１１９〜２４６０)に由来す
る第二のＤＮＡ断片(プローブＫ)では、長い８.２ｋｂ
および８.０ｋｂの転写物のみが認識された。

【００７９】これらの観察結果は、ｐＦＲＫ４２ ｃＤ
ＮＡクローンがこれら２つの転写物の一つに由来してい
ること、および１８１５〜１８２１(図２および図３参
照)位に位置するＡＡＴＴＡＡＡ配列が、短いチロシン
キナーゼ陰性２.５ｋｂおよび２.０ｋｂ転写物を生成す
るのに利用されるポリアデニル化シグナルとして働くこ
とを示唆している。

【００８０】どのtrkＢ転写物がチロシンプロテインキ
ナーゼ触媒ドメイン(チロシンキナーゼ陽性転写物)をコ
ードする配列を含有しているかを決定するため、さらに
２つのプローブ、すなわちプローブＨ(ｐＦＲＫ４３中
のヌクレオチド２０８９〜２３４３)およびプローブＤ
(ｐＦＲＫ４３中のヌクレオチド２７６７〜３０５７)を
上記ＰＣＲ法により調製した。図４に示すように、これ
らｐＦＲＫ４３特異的プローブの両方とも９.０ｋｂお
よび５.５ｋｂ転写物(ｐＦＲＫ４２特異的なＥプローブ
にハイブリダイズしなかった２つのｍＲＮＡ種)を有効
に認識した。これらチロシンキナーゼ特異的プローブ
(ＨおよびＤ)の両方とも、ｐＦＲＫ４２に由来するプロ
ーブＥおよびＫにハイブリダイズした４つのチロシンキ
ナーゼ陰性転写物を認識することはできなかった。

【００８１】これらの結果は、trkＢ遺伝子座が２つの
クラスの転写物をコードし得ることを示している。その
うちの一つは古典的なチロシンプロテインキナーゼ細胞
表面レセプターであるｇｐ１４５^trkBをコードし、他の
一つは細胞質領域(チロシンキナーゼ触媒ドメインを含
む)の殆どを欠いた関連分子の合成を指令している。

【００８２】これらtrkＢ ｍＲＮＡをｐＦＲＫ４３中に
存在する５'非コード配列に由来するプローブ(プローブ
Ｇ、ｐＦＲＫ４３のヌクレオチド１７１〜５０６)を用
いてノーザンブロッティング分析したところ、チロシン
キナーゼ陰性trkＢ転写物における多様性がさらに明ら
かにされた。図４に示すように、プローブＧはチロシン
キナーゼ陽性の９.０ｋｂおよび５.５ｋｂ転写物並びに
チロシンキナーゼ陽性の８.２ｋｂおよび２.５ｋｂ ｍ
ＲＮＡを認識した。しかしながら、８.０ｋｂおよび２.
０ｋｂのチロシンキナーゼ陰性ｍＲＮＡはこのプローブ
にはハイブリダイズしなかった(図４参照)。

【００８３】これらの結果から、異なるアミノ末端配列
を有する第三のタイプのレセプター様分子もまたtrkＢ
遺伝子座によりコードされている可能性が提起される。
別の考え方として、異なるプロモーターが、単一タンパ
ク質欠失チロシンプロテインキナーゼ配列の発現を指令
しているのかもしれない(図４参照)。

【００８４】実施例３ チロシンキナーゼ陰性ｃＤＮＡクローンによりコードさ
れた産物の同定：これらチロシンキナーゼ陰性trkＢ転
写物によりコードされる産物を同定するため、ＭＳＶ
(モロニー肉腫ウイルス)ＬＴＲ制御配列とＳＶ４０のポ
リアデニル化シグナルによりフランキングされたマルチ
プルクローニング部位を含む哺乳動物発現ベクターであ
るｐＭＥＸｎｅｏ中にｐＦＲＫ４２ ｃＤＮＡをサブク
ローニングした[マーチン−ザンカら、Mol.Cell.Biol.
９：２４〜３３(１９８９)]。加えて、ｐＭＥＸｎｅｏ
は、ＳＶ４０初期プロモーターにより駆動される細菌ｎ
ｅｏ遺伝子(抗生物質のネオマイシンに対する耐性を生
じさせる)を含んでいる。得られたプラスミドｐＦＲＫ
４７を用いてＮＩＨ３Ｔ３をトランスフェクションし、
得られたＧ４１８耐性コロニー免疫沈降分析に供した。

【００８５】ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクショ
ン、Ｇ４１８耐性コロニーの選択、代謝標識、免疫沈
降、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)分析は、マーチン
−ザンカらのMol.Cell.Biol.９、２４〜３３(１９８９)
の記載に従って行った。増感スクリーンの助けを借り、
ゲルをコダックＸ−ＯＭＡＴフィルムに３日間に暴露し
た。ウエスタンブロッティング分析[ハーロウ(Harlow,
E.)ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュ
アル(Antibodies:A Laboratory Manual)、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー、コールドスプリン
グハーバー、ＮＹ(１９８８)参照]のため、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかける前に粗製の脳抽出物からtrkＢ特異的タ
ンパク質を免疫沈降させ、ニトロセルロースフィルター
上にブロッティングし、再びそれぞれの抗血清を用いて
インキュベートし、¹²⁵Ｉ−プロテインＡ(５.６μＣｉ
／μｇ；トリス緩衝食塩水１０ｍｌ当たり５μＣｉ)お
よびコダックＸ−ＯＭＡＴフィルム(６時間)を用いて視
覚化した。

【００８６】ウエスタンブロッティングは以下のように
して行った。脳１ｇを１％トリトンＸ−１００、０.１
％ドデシル硫酸ナトリウム、５０μＭ ＮａＰＯ₄(ｐＨ
７.０)、０.５％デオキシコール酸ナトリウムおよびプ
ロテアーゼインヒビターアプロチニンおよびフェニルメ
チルスルホニルフルオリドを含有する免疫沈降溶解緩衝
液(７.５ｍｌ)中でホモジナイズすることにより、成体
Ｂａｌｂ／ｃマウス脳抽出物を調製した。この溶解液を
３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離にかけ、つい
で２０,０００ｒｐｍ、４℃で４５分間高スピード遠心
分離にかけることにより有機堆積物から清澄化した。こ
の上澄み液(５００μｌ)を、チロシンキナーゼ陽性ｇｐ
１４５^trkBのチロシンキナーゼドメインかまたはチロシ
ンキナーゼ陰性ｇｐ１４５^trkB(ｐＦＲＫ４２チロシン
キナーゼ陰性ｃＤＮＡクローンによりコードされるタン
パク質に糖付加した形態のもの)のカルボキシ末端アミ
ノ酸残基のいずれかを認識する抗血清(１０μｌ)ととも
に０℃で一夜インキュベートした。

【００８７】抗原抗体複合体をプロテインＡ−セファロ
ースビーズにより沈殿させ、溶解緩衝液(プロテアーゼ
インヒビターを含まない)で３回洗浄し、免疫沈降した
タンパク質を８％スラブゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分離した。ついで、半乾燥ウエスタンブロッティ
ング装置[アメリカン・バイオメトリックス(American B
iometrics,Inc.)ヘイウオード、ＣＡ]を用い、タンパク
質をニトロセルロース紙上にブロッティングした。ニト
ロセルロースをtrkＢ特異的抗血清とインキュベートす
る前に、５％ウシ血清アルブミンおよび１％卵アルブミ
ン(チロシンキナーゼ陽性−特異的抗血清の場合)かまた
は０.２％ツイーン２０(チロシンキナーゼ陰性−特異的
抗血清の場合)のいずれかを含有するトリス緩衝食塩水
(ＴＢＳ)中でニトロセルロースをインキュベートするこ
とにより特異的結合部位をブロッキングした(試薬はす
べてシグマ・ケミカル、セントルイス、ＭＯより入
手)。

【００８８】ニトロセルロースをＴＢＳ中で１０分間、
４回洗浄し、ついでブロッキング溶液中の¹²⁵−標識プ
ロテインＡ(デュポン社製)(５.６μＣｉ／μｇ；ＴＢＳ
１０ｍｌ当たり５μＣｉ)とともに室温にて６０分間イ
ンキュベートし、再びＴＢＳ中で４回洗浄した。ニトロ
セルロースを乾燥し、コダックＸ−ＯＭＡＴフィルムに
６時間暴露した。

【００８９】図５に示すように、ｐＦＲＫ４２によりコ
ードされると予測されたポリペプチドのカルボキシ末端
に位置する１３のアミノ酸残基(４６４〜４７６位)に対
して向けられた抗体は、見かけの分子量が９５,０００
ダルトンの糖タンパク質(ｇｐ９５^trkB)を特異的に認識
した。この分子のポリペプチド骨格は、ツニカマイシン
処理細胞の免疫沈降により決定されるように５７,００
０ダルトンであった。このポリペプチドのサイズは、ｐ
ＦＲＫ４２産物の導き出されたアミノ酸配列から予測さ
れる分子質量(５３,１８５ダルトン)とよく対応する。

【００９０】この抗血清は、チロシンキナーゼ陽性ｇｐ
１４５^trkB分子を認識することができなかった。同様
に、ｇｐ１４５^trkBのカルボキシ末端ドメインに対して
産生された抗血清または全ｇｐ１４５^trkBチロシンキナ
ーゼドメインを包含する細菌により合成されたポリペプ
チド(残基５４７〜８２１)に対して産生された抗血清
は、チロシンキナーゼ陰性ｇｐ９５^trkB糖タンパク質を
沈殿させなかった。

【００９１】つぎに、チロシンキナーゼ陽性ｇｐ１４５
^trkBおよびチロシンキナーゼ陰性ｇｐ９５^trkBの両分子
の脳組織中の存在をウエスタンブロッティング分析によ
り調べた。ｇｐ１４５^trkBは、細菌により合成されたtr
kＢチロシンプロテインキナーゼドメインに対して産生
された抗血清により認識された。同様に、チロシンキナ
ーゼ陰性ｇｐ９５^trkB分子は、その１３アミノ酸カルボ
キシ末端ドメインに対して産生された抗血清を用いて脳
組織中に同定することができた。

【００９２】これらの結果は、trkＢ遺伝子座が２つの
異なる神経性の糖タンパク質をコードしており、これら
糖タンパク質はそれらの導き出されたアミノ酸配列に基
づいて同一の細胞外および経膜ドメインを有しているが
チロシンプロテインキナーゼ触媒領域が存在しているか
(ｇｐ１４５^trkB)存在していないか(ｇｐ９５^trkB)が異
なっているだけであることを示している。脳中で検出さ
れたチロシンキナーゼ陰性ｇｐ９５^trkBタンパク質は、
ＮＩＨ３Ｔ３細胞中で発現された同タンパク質よりもＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ中でわずかに速く移動した。この観察
は、生理環境中でのｇｐ９５^trkBの糖付加は繊維芽細胞
中における糖付加とは異なっていることを示唆してい
る。

【００９３】実施例４ インシチュハイブリダイゼーション：つぎに、成体マウ
ス脳におけるtrkＢレセプターの発現を調べた。この目
的のため、４週齢マウスの一連の冠状縫合切片のインシ
チュハイブリダイゼーション分析を下記の３つの独立の
プローブを用いて行った。(ｉ)チロシンキナーゼ陽性ｍ
ＲＮＡおよびチロシンキナーゼ陰性ｍＲＮＡの両方に存
在するｐＦＲＫ４２のヌクレオチド６７０〜１１５２か
らなるすべてのtrkＢ転写物(チロシンキナーゼ陽性およ
びチロシンキナーゼ陰性の両方)を同定するtrkＢ panプ
ローブ、(ii)チロシンキナーゼ陽性ｍＲＮＡ特異的プロ
ーブ(ｐＦＲＫ４３のヌクレオチド２７６７〜３０５７)
および(iii)チロシンキナーゼ陰性ｍＲＮＡ特異的プロ
ーブ(ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド１４５４〜１７１
１)。これらプローブは、上記ＰＣＲ法により調製し
た。

【００９４】インシチュハイブリダイゼーションは、本
質的にホーガン(Hogan,B.L.M.)らのマニピュレイティン
グ・ザ・マウス・エンブリオ(Manipulating the Mouse
Embryo)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ(１９８６)に
記載の方法に、クラインらのEMBO J.８、３７０１〜３
７０９(１９８９)に記載の変法を加味して行った。

【００９５】プローブＤおよびプローブＥを実施例２に
記載と同様にして得た。これらｃＤＮＡ断片を、マニア
チスらの上記文献の記載に従ってｐＧＥＭ−３Ｚベクタ
ー[プロメガ(Promega)、メジソン、ＷＩ]中にサブクロ
ーニングした。簡単に説明すると、上記ｃＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩで
線状にしたベクタープラスミドとライゲートした。ＤＨ
５細胞の形質転換、ミニプレプＤＮＡの分析および大ス
ケールのプラスミドＤＮＡの調製は、実施例１と同様の
方法で行った。ヌクレオチド配列の決定は、Ｔ７プライ
マーおよび修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(ユナイテッド
・ステイツ・バイオケミカルズ)を用い、実施例１と同
様にして行った。[³⁵Ｓ]標識一本鎖アンチセンスｃＲＮ
Ａプローブを合成するため、すべてのプラスミドをＨｉ
ｎｄＩＩＩ消化により線状にし、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼを用いてインビトロ転写した。

【００９６】図６ａは脳の切片であり、錐体細胞層およ
び歯状回を含む海馬のアンモン角を示している。この切
片をtrkＢ panプローブにハイブリダイズさせたとき、
錐体細胞層および歯状回を形成するニューロンの密充填
細胞体はtrkＢ転写物の高い発現を示した(図６ｂ)。こ
れら転写物の性質を確認するため、隣接切片をチロシン
キナーゼ陽性ｍＲＮＡ特異的プローブおよびチロシンキ
ナーゼ陰性ｍＲＮＡ特異的プローブとハイブリダイズさ
せた。図６ｃおよびｄに示すように、チロシンキナーゼ
陽性プローブのみが、成体マウスの脳のこの特定切片に
おいて特異的trkＢ転写物を認識することができた。

【００９７】海馬に加えて、trkＢ panプローブはまた
側脳室および第三脳室の脈絡膜そうにもハイブリダイズ
した。これらの切片にチロシンキナーゼ陽性ｍＲＮＡ特
異的プローブがハイブリダイズしたとき、発現は観察さ
れなかった(図７ｂおよびｆ参照)。これとは対照的に、
チロシンキナーゼ陰性プローブは強い陽性シグナルを示
した(図７ｄおよびｈ参照)。興味深いことに、脳室の輪
郭を描く組織(上衣)は検出可能なレベルのtrkＢ転写物
を発現しなかったので、チロシンキナーゼ陰性trkＢ転
写物は脈絡膜そう中に局在し隣接構造には存在しないも
のと思われる(図７Ｈ)。これらの結果は、２つのクラス
のtrkＢ転写物(チロシンキナーゼ陽性およびチロシンキ
ナーゼ陰性)が成体マウス脳内の機能的に識別される構
造中に異なって発現されていることを示している。

【００９８】図７に示すように、チロシンキナーゼ陰性
trkＢ転写物の発現は、脈絡膜そう構造に限定されてい
る(少なくとも前脳において)ように思われる。脈絡膜そ
うは、血液供給と脳脊髄液との間の活性関門(active ba
rrier)として重要な役割を果していることが知られてい
る。それゆえ、血液／脳関門中の推定リガンドの能動輸
送において非触媒ｇｐ９５^trkB分子が役割を果している
ことは可能である。そのようなリガンドは脳脊髄液中に
運ばれたときに、脳皮質のニューロンおよび海馬の錐体
細胞層で主として発現されるチロシンキナーゼ陽性ｇｐ
１４５^trkBレセプターを活性化するのかもしれない。

【００９９】つぎに、図面について説明を加える。図１
〜図３は、trkＢ遺伝子のチロシンキナーゼ陰性ｃＤＮ
ＡクローンであるｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列分析
を示す。図１は、模式図であり、太いバーは推定開始コ
ドン(ＡＴＧ)および終止コドン(ＴＡＧ)でフランキング
されたコード配列を表す。予測されたシグナルペプチド
(ＳＰ、ダブルハッチングした囲)ドメインおよび経膜
(ＴＭ、濃い囲)ドメインを示してある。以前に特徴付け
されたtrk ｃＤＮＡクローン中に存在しない配列につい
ては陰影をつけてある。他の記号は、システイン残基
(黒丸)および推定リガンド結合ドメインの共通Ｎ−グリ
コシル化部位(逆三角形)を示す。

【０１００】図２および図３は、ｐＦＲＫ４２ ｃＤＮ
Ａ挿入物のヌクレオチド配列およびそれから導かれるア
ミノ酸配列である。推定シグナルペプチド(アミノ酸残
基１〜３１)は囲みで強調してある。推定リガンド結合
ドメインのシステイン残基(アミノ酸残基３２〜４２９)
は丸で囲んである。共通Ｎ−グリコシル化部位は下に囲
みを引いてある。推定経膜領域(アミノ酸残基４３０〜
４５３)は下に無地の棒を引いてある。３'非コード領域
のポリアデニル化モチーフ[ＡＡＴ(Ｔ)ＡＡＡ]には下線
を引いてある。チロシンキナーゼ陽性trkＢ ｃＤＮＡク
ローンｐＦＲＫ４３と配列の相違する点は垂直の矢印で
示してある。

【０１０１】図４は、成体マウス組織におけるtrkＢ転
写物の分子分析である。上の図は、成体マウスの脳(Ｂ
ｒ)、肝臓(Ｌｉ)および肺(Ｌｕ)組織から単離したポリ
Ａ含有ＲＮＡのノーザンブロッティング分析を示す。[
³²Ｐ]標識プローブとして、プローブＡ(ｐＦＲＫ４２の
ヌクレオチド１１９〜４９０)；プローブＥ(ｐＦＲＫ４
２のヌクレオチド１４５４〜１７１１)；プローブＫ(ｐ
ＦＲＫ４２のヌクレオチド２１１９〜２４６０)；プロ
ーブＤ(ｐＦＲＫ４３のヌクレオチド２７６７〜３０５
７)；プローブＨ(ｐＦＲＫ４３のヌクレオチド２０８９
〜２３４３)；およびプローブＧ(ｐＦＲＫ４３のヌクレ
オチド１７１〜５０６)が含まれる。

【０１０２】それぞれのtrkＢ転写物の移動は矢印で示
してある。それらのサイズは、サッカロミセス・セレビ
シエ(S.cerebisiae)２８Ｓ(３.４ｋｂ)および１８Ｓ
(１.８ｋｂ)および大腸菌２３Ｓ(２.９ｋｂ)および１６
Ｓ(１.６ｋｂ)リボソームＲＮＡを含むＲＮＡサイズ標
準に関するそれらの相対的電気泳動移動度から計算し
た。下の図は、ノーザンブロッティング分析から導き出
された異なるtrkＢ ｍＲＮＡ種の模式図である。太い棒
はコード配列を表す。細い棒は５'および３'の非コード
配列を表す。推定シグナルペプチド(ＳＰ)ドメイン、経
膜(ＴＭ)ドメインおよびチロシンプロテインキナーゼ
(ＴＫ)ドメインは水平の矢印で示してある。チロシンキ
ナーゼ陽性trkＢ ｍＲＮＡ種に特異的な配列(右から左
へのハッチング)およびチロシンキナーゼ陰性trkＢ ｍ
ＲＮＡ種に特異的な配列(左から右へのハッチング)も示
してある。各プローブの位置および長さは水平の線で示
してある。垂直の矢印は、２.５ｋｂおよび２.０ｋｂの
チロシンキナーゼ陰性転写物の推定ポリアデニル化部位
を示す。

【０１０３】図５は、チロシンキナーゼ陽性trkＢ ｃＤ
ＮＡクローンおよびチロシンキナーゼ陰性trkＢ ｃＤＮ
ＡクローンでトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細
胞中で発現されたtrkＢタンパク質の同定を示す。左：
ｐＦＲＫ４４[ｐＦＲＫ４３(クラインらのEMBO J.８、
３７０１〜３７０９(１９８９)参照)のチロシンキナー
ゼ陽性ｃＤＮＡ挿入物を有するｐＭＥＸｎｅｏ由来発現
プラスミド]でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３
細胞(クローン３８〜９２３)の[³⁵Ｓ]−メチオニン標識
細胞抽出物を、(ａ)ペプチド(ＮＨ₂−ＫＧＦＶＬＦＨＫ
ＩＰＬＤＧ−ＣＯＯＨ)(抗血清を産生させるのに使用)
(１０μｇ)の存在下、または(ｂ)該ペプチドの不在下
で、チロシンキナーゼ陽性trkＢレセプター様タンパク
質[クラインらのEMBO J.８、３７０１〜３７０９(１９
８９)参照]のカルボキシ末端配列に対応するペプチドに
対して産生させたウサギ抗血清を用いて免疫沈殿させ
た。

【０１０４】右：ｐＦＲＫ４７[ｐＦＲＫ４チロシンキ
ナーゼ陰性ｃＤＮＡ挿入物を有するｐＭＥＸｎｅｏ誘導
体]でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(クロ
ーンＢ２４〜７６)の[³⁵Ｓ]−メチオニン標識細胞抽出
物を、(ｃ)競合ペプチド(１０μｇ)の存在下、または
(ｄ)該ペプチドの不在下で、推定チロシンキナーゼ陰性
trkＢタンパク質(図１)の１３カルボキシ末端アミノ酸
残基に対応するペプチドに対して産生させたウサギ抗血
清を用いて免疫沈殿させた。

【０１０５】平行培養は、ツニカマイシン(１０μｇ／
ｍｌ)の不在下で(−)、存在下で(＋)と代謝的に標識し
た。糖付加trkＢ産物(ｇｐ１４５およびｇｐ９５)およ
び糖付加していないtrkＢ産物(ｐ９３およびｐ５７)の
移動を矢印で示す。これらtrkＢタンパク質の分子量
は、ミオシン(２００,０００)、ホスホリラーゼＢ(９
２,５００)、アルブミン(６９,０００)および卵アルブ
ミン(４３,０００)を含む分子量標準に対する相対的電
気泳動移動度から導いた。

【０１０６】図６は、成体マウス脳の海馬領域でのtrk
Ｂ発現を示す。Ａは冠状縫合切片の明画面であり、アン
モン角(Ａｈ)および歯状回(ＤＧ)を示している。Ｂ、Ｃ
およびＤは、panプローブ(ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド
６７０〜１１５２)(ｂ)、チロシンキナーゼ陽性特異的
プローブＤ(ｐＦＲＫ４３のヌクレオチド２７６７〜３
０５７)(ｃ)およびチロシンキナーゼ陰性特異的プロー
ブＥ(ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド１４５４〜１７１１)
(ｄ)を含むtrkＢ特異的アンチセンスｃＲＮＡプローブ
に対してインシチュハイブリダイゼーションした後の、
パネル(ａ)に示した切片の暗画面(ｂ)および隣接する切
片の暗画面(ｃ)(ｄ)である。

【０１０７】図７は、成体マウス脳の脈絡膜そうでのtr
kＢ発現を示す。パネル(ａ)、(ｃ)、(ｅ)および(ｇ)は
冠状縫合切片の明画面であり、側脳室(ＬＶ)、第三脳室
(３Ｖ)、および第三脳室の乳頭様陥凹(ＭＲ３)を示して
いる。パネル(ｂ)、(ｄ)、(ｆ)および(ｈ)は、上記チロ
シンキナーゼ陽性特異的プローブＤ(パネル(ｂ)および
(ｆ))およびチロシンキナーゼ陰性特異的プローブＥ(パ
ネル(ｄ)およびパネル(ｈ))に対してインシチュハイブ
リダイゼーションした後の対応する暗画面を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列の模式図。

【図２】 ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列およびそれ
から導かれるアミノ酸配列。

【図３】 ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列およびそれ
から導かれるアミノ酸配列。

【図４】 成体マウス組織から単離したポリＡ含有ＲＮ
Ａのノーザンブロッティング分析結果を示す写真および
該結果から導かれた異なるtrkＢ ｍＲＮＡ種の模式図。

【図５】 チロシンキナーゼ陽性trkＢ ｃＤＮＡクロー
ンおよびチロシンキナーゼ陰性trkＢ ｃＤＮＡクローン
でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現さ
れたtrkＢタンパク質のウエスタンブロッティング分析
結果を示す写真。

【図６】 成体マウス脳の海馬領域でのtrkＢ発現を示
す組織写真。

【図７】 成体マウス脳の脈絡膜そうでのtrkＢ発現を
示す組織写真。

【手続補正書】

【提出日】平成５年１１月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０７】図７は、成体マウス脳の脈絡膜そうでのtr
kＢ発現を示す。パネル(ａ)、(ｃ)、(ｅ)および(ｇ)は
冠状縫合切片の明画面であり、側脳室(ＬＶ)、第三脳室
(３Ｖ)、および第三脳室の乳頭様陥凹(ＭＲ３)を示して
いる。パネル(ｂ)、(ｄ)、(ｆ)および(ｈ)は、上記チロ
シンキナーゼ陽性特異的プローブＤ(パネル(ｂ)および
(ｆ))およびチロシンキナーゼ陰性特異的プローブＥ(パ
ネル(ｄ)およびパネル(ｈ))に対してインシチュハイブ
リダイゼーションした後の対応する暗画面を示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列の模式図。

【図２】 ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列およびそれ
から導かれるアミノ酸配列。

【図３】 ｐＦＲＫ４２のヌクレオチド配列およびそれ
から導かれるアミノ酸配列。

【図４】 成体マウス組織から単離したポリＡ含有ＲＮ
Ａのノーザンブロッティング分析結果を示す電気泳動写
真および該結果から導かれた異なるtrkＢ ｍＲＮＡ種の
模式図。

【図５】 チロシンキナーゼ陽性trkＢ ｃＤＮＡクロー
ンおよびチロシンキナーゼ陰性trkＢ ｃＤＮＡクローン
でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現さ
れたtrkＢタンパク質のウエスタンブロッティング分析
結果を示す電気泳動写真。

【図６】 成体マウス脳の海馬領域でのtrkＢ発現を示
す生物の形態写真。

【図７】 成体マウス脳の脈絡膜そうでのtrkＢ発現を
示す生物の形態写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ルーディーガー・クレイン アメリカ合衆国ニュージャージー州プレイ ンズボロ、リンデン・レイン・サウス28番

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質
   の全部または一部をコードする核酸配列を含むことを特
   徴とする単離核酸分子。
2. 【請求項２】 該分子がＤＮＡ分子であり、核酸配列が
   ＤＮＡ配列である請求項１に記載の核酸分子。
3. 【請求項３】 ＤＮＡ配列が実質的に図２および図３に
   示すヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載のＤＮ
   Ａ分子。
4. 【請求項４】 ＤＮＡ配列が実質的に図２および図３に
   示すヌクレオチド配列の一部を有する、請求項２に記載
   のＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 ＤＮＡ配列が図２および図３に示すヌク
   レオチド１〜１４２９に対応するヌクレオチド配列を有
   する、請求項４に記載のＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 請求項３、４または５に記載のＤＮＡ配
   列に相補的なＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質
   の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を含有する発
   現ベクター。
8. 【請求項８】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質
   の全部または一部をコードするＤＮＡ配列の複製および
   ／または発現を指令することができ、該ＤＮＡ配列に機
   能的に連結した、１または２以上の制御ＤＮＡ配列を含
   有する、請求項７に記載の発現ベクター。
9. 【請求項９】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク質
   の全部または一部をコードするＤＮＡ配列が、実質的に
   図２および図３に示すヌクレオチド配列を有する、請求
   項７に記載の発現ベクター。
10. 【請求項１０】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク
    質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列が、実質的
    に図２および図３に示すヌクレオチド配列の一部を有す
    る、請求項７に記載の発現ベクター。
11. 【請求項１１】 ｐＦＲＫ４２と称する請求項９に記載
    の発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の発現ベクターの同
    定特性を有する発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項７に記載の発現ベクターで形質
    転換またはトランスフェクションされた原核または真核
    宿主細胞。
14. 【請求項１４】 請求項８、９、１０、１１または１２
    に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェク
    ションした原核または真核宿主細胞。
15. 【請求項１５】 哺乳動物細胞である請求項１３に記載
    の宿主細胞。
16. 【請求項１６】 哺乳動物細胞がＮＩＨ３Ｔ３細胞であ
    る請求項１５に記載の宿主細胞。
17. 【請求項１７】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク
    質の全部または一部を含むポリペプチド分子の製造方法
    であって、該ポリペプチドの発現が可能な条件下で請求
    項１３に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする方
    法。
18. 【請求項１８】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク
    質の全部または一部をコードする核酸配列の検出法であ
    って、該核酸配列の少なくとも一部に特異的に結合する
    検出可能なマーカーに該核酸配列を接触させ、ついで該
    結合したマーカーを検出することにより該核酸配列の存
    在を検出することを特徴とする方法。
19. 【請求項１９】 核酸配列がＤＮＡ配列である請求項１
    ８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 核酸配列がＲＮＡ配列である請求項１
    ８に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＤＮＡ配列が実質的に図２および図３
    に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１９に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 ＤＮＡ配列が実質的に図２および図３
    に示すヌクレオチド配列の一部を有する、請求項１９に
    記載の方法。
23. 【請求項２３】 検出可能なマーカーが、該核酸配列の
    少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列である、請
    求項１８に記載の方法。
24. 【請求項２４】 相補的ヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ
    配列、ＲＮＡ配列、センスＲＮＡ配列またはアンチセン
    スＲＮＡ配列から選ばれたものである、請求項２３に記
    載の方法。
25. 【請求項２５】 検出可能なマーカーが放射性同位元素
    で標識されたものである、請求項１８に記載の方法。
26. 【請求項２６】 オートラジオグラフィーで検出を行う
    請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ配列である
    請求項１９に記載の方法。
28. 【請求項２８】 ＲＮＡ配列がメッセンジャーＲＮＡ配
    列である請求項２０に記載の方法。
29. 【請求項２９】 ＲＮＡ配列が、組織試料の細胞中に位
    置する、請求項２０に記載の方法。
30. 【請求項３０】 チロシンキナーゼ陰性trkＢタンパク
    質の全部または一部を含むことを特徴とする、単離ポリ
    ペプチド分子。
31. 【請求項３１】 請求項２に記載のＤＮＡ配列によりコ
    ードされた単離ポリペプチド分子。
32. 【請求項３２】 実質的に図２および図３に示すアミノ
    酸配列を有する、請求項３０に記載のポリペプチド分
    子。
33. 【請求項３３】 実質的に図２および図３に示すアミノ
    酸配列の一部を有する、請求項３０に記載のポリペプチ
    ド分子。
34. 【請求項３４】 請求項３２または３３に記載のアミノ
    酸配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有するポ
    リペプチド分子。
35. 【請求項３５】 糖付加されている請求項３０に記載の
    ポリペプチド分子。