JPH0587731A

JPH0587731A - 遺伝子構造解析装置

Info

Publication number: JPH0587731A
Application number: JP24606591A
Authority: JP
Inventors: Teruo Hiruma; 輝夫晝馬; Ee Risuko Nooman; エーリスコノーマン; Tsutomu Hara; 勉原; Mitsuo Hiramatsu; 光夫平松; Masayuki Masuko; 正行増子
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1991-09-25
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1993-04-06

Abstract

(57)【要約】【目的】より単純で迅速な遺伝子構造解析手段を提供
する。【構成】この遺伝子構造解析装置のステージ１１０に
は、引き伸ばされたＤＮＡ１０１がのせられている。こ
の遺伝子構造解析装置は、ステージ１１０の駆動制御系
として、ピエゾアクチュエータ１１１，アクチュエータ
駆動用アンプ１１３，ストレインゲージセンサ１１２及
びコントローラ１１４を備え、これらでフィードバック
ループが形成されている。また、ＤＮＡ検出系として、
光源１２１，集光レンズ１２１ａ，分光素子１２３ａ，
光検出器１２３，ロックインアンプ１２５，制御回路１
２６及び記録計１２７を有している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子構造解析装置に
関するもので、例えば、遺伝子を構成する核酸塩基につ
いてのデータを得るのに好適に使用できるものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子構造解析（１次構造解析）の方法
として、「マルキサム−ギルバート法」及び「サンガー
法」が知られている。「マルキサム−ギルバート法」
は、図５に示すような原理に基づいたものである。これ
を簡単に説明すると、遺伝子（以下、ＤＮＡ）試料の端
にラベルを施す（図５（ａ）、この場合ラベルは
³²Ｐ）。このＤＮＡを引き離し（図５（ｂ））、ＤＮＡ
を構成する核酸塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃそれぞれについて、
その塩基が端になるようにあらゆるサイズの断片にする
（図５（ｃ）、また、図５（ｄ）は塩基Ｃについて示
す。）。これらをゲル電気泳動にかけて断片を長さ（重
さ）の違いに分離し、オートラジオグラフィでその分離
された状態を記録する（図５（ｅ））。この分離された
結果から塩基配列を決める。この方法は現在世界中の研
究室で採用されており、この方法の変形も登場してい
る。例えば、アイソトープラベル³²Ｐにかえて螢光色素
を使用したり、ゲル電気泳動にかえてキャピラリー電気
泳動法や液体クロマトグラフィーで分離している。

【０００３】これに対して、「サンガー法」は、図６に
示すような原理に基づいたものである。これを簡単に説
明すると、ＤＮＡ試料に相補的なプライマーとdNTPを添
加してDNA ポリメラーゼを作用させ、試料に相補的な断
片を形成させる（図６（ａ））。この時、ラベルされて
いるddNTP を添加してＤＮＡ伸長を阻害し、それらが末
端になるあらゆる長さの断片を得る。この操作を各塩基
について行ない、「マキサムーギルバート法」と同様に
分離して（図６（ｃ））、この分離結果から塩基配列を
決める。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述の「マルキサム−
ギルバート法」及び「サンガー法」では、決定できる塩
基数が数百と限られていること、操作に相当の時間を要
すること、多量のサンプルが必要なことなどが欠点とさ
れている。これは、ヒトゲノムのような巨大分子の１次
構造を決定する際には特にマイナスになる。

【０００５】一方、順次酵素で切断して１次構造を決定
する必要性，構造決定の工程の迅速性の要求から、その
ほかの方法が考えられている。例えば、「ＤＮＡ試料の
断片を鋳型として、蛍光ラベルが付いた相補的な断片を
形成させ、これらの断片を試料にして、エクソヌクレア
ーゼと呼ばれる酵素で末端から順次塩基を解離させ、生
ずるヌクレオチドの蛍光ラベルを決定する。」という方
法である。この方法では、理論的には迅速で、末端から
順次塩基を解離させることから自動化が可能であるとい
われている。しかし、同一試料が複数ある場合には適用
が困難であり、単一分子検出に限定される。また、酵素
のような生体成分が使用されていることや、４種の人工
塩基が使われているなど複雑な工程が含まれている。現
在のところトータルシステムとしては実用化されておら
ず、より単純な方法が望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明の遺伝子構造解析装置は、引き伸ばされたＤ
ＮＡを支持するステージと、ＤＮＡの一部の領域に光を
照射する光源と、この領域からの光を検出し出力する光
検出器と、ＤＮＡが引き伸ばされた方向に上記領域を移
動させる駆動手段とを備えたことを特徴とする。

【０００７】また、駆動手段が、ステージの位置を移動
させるアクチュエータ（ピエゾアクチュエータ、ステッ
プモータのアクチュエータなど）と、ステージの位置を
検出する位置センサと、入力される設定値に基づき位置
センサの信号によりアクチュエータを制御するコントロ
ーラとで構成されていることを特徴としても良い。

【０００８】さらに、光源が、所定の変動周期でその波
長を変動させた光を上記領域に照射することを特徴とし
ても良い。

【０００９】そして、光検出器の出力を、変動周期に同
期した同期信号と積算（掛け算）して出力するロックイ
ンアンプをさらに備えたことを特徴としても良い。

【００１０】また、同期信号の周期が、変動周期の２分
の１であることを特徴としても良い。

【００１１】そして、ＤＮＡの核酸塩基が、予め特定の
蛍光色素でラベル化されていることを特徴としても良
い。

【００１２】

【作用】本発明の遺伝子構造解析装置では、引き伸ばさ
れたＤＮＡの一部の領域に光源から光が照射される。上
記領域において、ＤＮＡを構成する核酸塩基Ａ，Ｇ，
Ｔ，Ｃの違いに応じて、光が反射・吸収され、或いは、
その光によって蛍光が発生する。上記領域からの光が光
検出器で検出され出力される。上記領域は、駆動手段に
よってＤＮＡ上を引き伸ばされた方向に移動し、光検出
器からは上記領域に応じたＤＮＡからの光の検出信号が
出力される。この検出信号が、遺伝子構造解析用の信号
データとなる。

【００１３】駆動手段が、アクチュエータや位置センサ
などで構成されている場合、アクチュエータ，位置セン
サ（ストレインゲージセンサを使うこともある。），コ
ントローラでフィードバックループが形成され、入力さ
れる設定値に基づいてステージの位置が精密にフィード
バック制御される。

【００１４】光源が所定の変動周期で変動させた光を出
力する場合、上記領域において、光が反射・吸収され、
或いは、その光によって蛍光が発生し、変動周期で繰り
返される。ノイズ成分の除去のため、光検出器からの検
出信号を累積加算若しくは平均化などの信号処理をする
ことが可能になる。

【００１５】ロックインアンプを設けることで光検出器
からの検出信号の高次微分成分が取り出せる。例えば、
同期信号の周期を変動周期の２分の１とすると、２次微
分成分が取り出せる。

【００１６】ＤＮＡの核酸塩基を予め各塩基類ごとに特
定の蛍光色素でラベル化した場合、その蛍光色素が発生
する特定波長の蛍光により、その核酸塩基について光検
出器からの検出信号が得られる。

【００１７】

【実施例】本発明の実施例を図面を参照して説明する。
図１には、本発明の遺伝子構造解析装置が示されてい
る。

【００１８】この遺伝子構造解析装置のステージ１１０
には、引き伸ばされたＤＮＡ１０１がのせられている。
この遺伝子構造解析装置は、ステージ１１０の駆動制御
系として、ピエゾアクチュエータ１１１，アクチュエー
タ駆動用アンプ１１３，ストレインゲージセンサ１１２
及びコントローラ１１４を備え、これらでフィードバッ
クループが形成されている。また、ＤＮＡ検出系とし
て、光源１２１，集光レンズ１２１ａ，分光素子１２３
ａ，光検出器１２３，ロックインアンプ１２５，制御回
路１２６及び記録計１２７を有している。

【００１９】駆動制御系は、図２乃至図３のフィードバ
ック系を有している。ピエゾアクチュエータ１１１は、
駆動用アンプ１１３の出力に応じて内蔵されたピエゾ素
子の圧電効果により、ステージ１１０を駆動しその位置
を変えるものである。ストレインゲージセンサ１１２
は、ステージ１１０の位置をその接触位置における圧力
変化として検出する。コントローラ１１４は、ストレイ
ンゲージセンサ１１２からの位置検出信号から設定値１
１４ｆに基づきピエゾアクチュエータ１１１駆動のため
の信号を駆動用アンプ１１３に出力する。コントローラ
１１４は、図３において、インスツルメントアンプ１１
４ａ，フィルタ１１４ｂ，エラーアンプ１１４ｃ，表示
パネル１１４ｄで構成されている。インスツルメントア
ンプ１１４ａはストレインゲージセンサ１１２からの検
出信号を増幅し、フィルタ１１４ｂはインスツルメント
アンプ１１４ａの出力の低周波成分を通過させる。ま
た、表示パネル１１４ｄはこの出力を表示し、エラーア
ンプ１１４ｃはフィルタ１１４ｂを通過した位置検出信
号と設定値１１４ｆとの差を増幅し出力する。また、符
号１１４ｅはインスツルメントアンプ１１４ａの零点調
節用ボリュウムである。駆動用アンプ１１３は、コント
ローラ１１４（エラーアンプ１１４ｃ）からの出力を増
幅しピエゾアクチュエータ１１１に出力して駆動する。

【００２０】ＤＮＡ検出系は、模式的には図４のように
あらわされる。ステージ１１０上のＤＮＡ１０１の一部
の領域に光スポット１３２が形成され、この光スポット
１３２からの光を計測している（図ではＤＮＡ１０１に
対し光スポット１３２は小さく示されている。実際はそ
の１０００倍ほど大きい。）。光源１２１は、波長可変
レーザ（例えば、光パラメトリック発振器を用いた波長
可変レーザあるいは色素レーザ）が用いられ、ロックイ
ンアンプ１２５からの信号によりその発振波長が変化す
る。集光レンズ１２１ａは、光源１２１からの光を集光
し光スポット１３２を形成するもので、光源１２１とあ
わせて光出力系をなしている。分光素子１２３ａは、光
スポット１３２からの光のうち所定の波長の光だけを通
すもので、光検出器１２３とあわせて光検出系をなして
いる。光検出器１２３には、例えば、光電子増倍管が用
いられている。ロックインアンプ１２５は、光検出器１
２３からの検出信号を増幅する。そして、内蔵した発振
器により、光源１２１への信号とこの信号の整数分の１
の周期を持つ同期信号を生成し、この同期信号と光検出
器１２３からの検出信号とを積算して検出信号の高次微
分成分を取り出す。制御回路１２６は、記録計１２７を
制御してロックインアンプ１２５の出力を表示させ、ロ
ックインアンプ１２５へ制御信号を出力する。

【００２１】つぎに、この装置の動作について説明す
る。ここで、ロックインアンプ１２５の同期信号は、光
源１２１への信号の１／２の周期であるものとする。

【００２２】まず、２本鎖のＤＮＡ試料を加熱（メルテ
ィング）し、１本鎖のＤＮＡにする。このＤＮＡにゲル
中でパルス電界を与え、徐々に絡まった状態をほぐして
直線状に引き伸ばす。この引き伸ばされたＤＮＡ１０１
を、ステージ１１０の移動する方向とほぼ平行になるよ
うにステージ１１０にのせる。このＤＮＡ１０１に光源
１２１から光を照射する。この光源からの光１３０は、
ロックインアンプ１２５からの信号によりその波長が変
化し、また、集光レンズ１２１ａで集光されてＤＮＡ１
０１の一部の領域に光スポット１３２を形成する。光ス
ポット１３２内において、ＤＮＡを構成する核酸塩基
Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃの違いに応じて、光が反射・吸収され、
或いは、その光によって蛍光が発生する。このときの吸
収波長，蛍光波長，蛍光寿命が核酸塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ
で異なっており、光スポット１３２内の核酸塩基の組成
に応じた吸収若しくは蛍光が生じる。

【００２３】これによって生じた光スポット１３２から
の光のうち所定の波長の光だけが分光素子１２３ａを通
過し光検出器１２３で検出される。この際、核酸塩基
Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃに各々対応する４対の分光素子および光
検出器あるいは１つの検出器の前面に４種類の分光特性
をもつフィルターを回転させるか、分光カーブを電圧で
コントロールする方法を用いる。光検出器１２３の検出
信号は、ロックインアンプ１２５で増幅され、光源１２
１への信号の１／２の周期即ち光源の波長変化の周期の
１／２の周期を持つ同期信号と積算（掛け算）され、２
次微分成分が取り出される。このロックインアンプ１２
５の出力は、制御回路１２６により記録計１２７に表示
される。ここで、記録計１２７は光源の波長変化と比較
して非常に応答速度が遅いため、記録計１２７の表示
は、ロックインアンプ１２５の出力を等価的に累積して
平均化したものになる。光検出器１２３の検出信号に
は、ノイズ成分が含まれており、このノイズ成分は累積
して加算若しくは平均化することで低減される（画像信
号処理においてフレーム相関を利用したノイズリダクシ
ョンと同じ原理）。これによって、記録計１２７に出力
される表示即ち光スポット１３２内の核酸塩基の検出信
号は、非常に精度の高いものになる。また、２次微分成
分が取り出されるため、核酸塩基の吸収スペクトルのピ
ーク形状がシャープでない時でも高感度に検出される。

【００２４】光スポット１３２の位置の移動は、コント
ローラ１１４の設定値１１４ｆを変え、ステージ１１０
を移動させてなされる。駆動制御系（ピエゾアクチュエ
ータ１１１，アクチュエータ駆動用アンプ１１３，スト
レインゲージセンサ１１２及びコントローラ１１４）で
フィードバック制御が行われ、設定値１１４ｆに応じた
位置にステージ１１０が正確に移動する。ここで、ピエ
ゾアクチュエータ１１１及びストレインゲージセンサ１
１２という精密な駆動手段及び位置検出手段が用られて
いるため、ステージ１１０の位置はおよそ１／１００ｎ
ｍ程度の精度がある。設定値１１４ｆによりこのような
高い精度で光スポット１３２の位置が移動する。このよ
うにして、光スポット１３２の位置を移動させ、その位
置に応じた光スポット１３２内の核酸塩基の検出信号を
記録計１２７に記録させて、ＤＮＡを構成する核酸塩基
の違いに応じた１次元データが得られている。

【００２５】本発明は前述の実施例に限らず様々な変形
が可能である。

【００２６】例えば、図ではステージにＤＮＡを１直線
状に引き伸ばす電界のための電極は記載していないが、
この電極をステージに設けても良い。また、ＤＮＡは、
予め各核酸塩基（Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ）それぞれに特定の蛍
光色素（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４）でラベル化されたも
のを用いても良い。

【００２７】光源について波長可変レーザを用いた例を
示したが、白色光源と分光素子を用いて波長可変の光源
としても良い。また、ステージの駆動制御系をピエゾア
クチュエータによる例を示したが、ステップモータのア
クチュエータを組み合わせても良い。また、光スポット
の移動については、ステージを移動させるものを示した
が、ステージを固定させて光源からの光を動かせうるよ
うな光学系を設けても良い。この場合、光源からの光を
動かす手段として、例えば、ミラー付きのボイスコイル
アクチュエータ，音響光学結晶，電気光学結晶などを用
い得る。

【００２８】さらに、光スポットの検出位置の分解能を
あげるために、拡大装置（例えば、顕微鏡）の併用が有
効である。これにより、光スポット以外からの光をおさ
えて光検出器の検出精度が向上する。

【００２９】また、制御回路１２６及び記録計１２７に
かえて、所定のインターフェイス付きのパーソナルコン
ピュータなどの情報処理機器を用いても良い。この場
合、ロックインアンプ１２５をＧＰ−ＩＢバスなどを介
して制御することで、光検出器の検出信号や２次微分成
分だけでなく、たくさんの高次微分成分をもあわせて得
ることができ、それらすべてを用いたデータ処理が可能
になる。さらに、コントローラへの設定値を出力するよ
うにすると全自動化し得る。

【００３０】また、試料については、ＤＮＡに限らず、
蛋白質など天然高分子或いは合成樹脂など合成高分子で
鎖状構造をもつものを試料に用いることができる。

【００３１】

【発明の効果】以上の通り本発明によれば、ＤＮＡの光
の照射された領域の移動にしたがい、光検出器からの検
出信号によってＤＮＡを構成する核酸塩基の違いに応じ
たデータを得ることができる。また、駆動手段をフィー
ドバック制御とすることでステージの位置が精密に制御
され、光検出器からの検出信号をより精密なものにする
ことができ、光源の光を所定の変動周期で変動させる場
合、光検出器からの検出信号をよりローノイズにするこ
とができ、ロックインアンプを設け、高次微分成分が取
り出せすことで、ＤＮＡを構成する核酸塩基についてよ
り詳しいデータを得ることができる。さらに、核酸塩基
を特定の蛍光色素でラベルすると、その核酸塩基につい
てより詳しい光検出器からの検出信号を得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例の構成図。

【図２】実施例の制御系の構成図。

【図３】実施例の制御系の構成図。

【図４】実施例の検出系の概略図。

【図５】「マルキサム−ギルバート法」の説明図。

【図６】「サンガー法」の説明図。

【符号の説明】

１０１…ＤＮＡ１１０…ステージ１１１…ピエゾアクチュエータ１１２…ストレインゲージセンサ１１３…アクチュエータ駆動用アンプ１１４…コントローラ１２１…光源１２３…光検出器１２５…ロックインアンプ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者原勉静岡県浜松市市野町1126番地の１浜松ホトニクス株式会社内 (72)発明者平松光夫静岡県浜松市市野町1126番地の１浜松ホトニクス株式会社内 (72)発明者増子正行静岡県浜松市市野町1126番地の１浜松ホトニクス株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】引き伸ばされたＤＮＡを支持するステー
ジと、前記ＤＮＡの一部の領域に光を照射する光源と、
前記領域からの光を検出し出力する光検出器と、前記Ｄ
ＮＡが引き伸ばされた方向に前記領域を移動させる駆動
手段とを備えたことを特徴とする遺伝子構造解析装置。
【請求項２】前記駆動手段が、前記ステージの位置を
移動させるアクチュエータと、前記ステージの位置を検
出する位置センサと、入力される設定値に基づき前記位
置センサの信号により前記アクチュエータを制御するコ
ントローラとを含んで構成されていることを特徴とする
請求項１記載の遺伝子構造解析装置。
【請求項３】前記光源が、所定の変動周期でその波長
を変動させた光を前記領域に照射することを特徴とする
請求項１又は２記載の遺伝子構造解析装置。
【請求項４】前記光検出器の出力を、前記変動周期に
同期した同期信号と積算して出力するロックインアンプ
をさらに備えたことを特徴とする請求項３記載の遺伝子
構造解析装置。
【請求項５】前記同期信号の周期が、前記変動周期の
２分の１であることを特徴とする請求項４記載の遺伝子
構造解析装置。
【請求項６】前記ＤＮＡの核酸塩基が、予め特定の蛍
光色素でラベル化されていることを特徴とする請求項
１，２，３，４又は５記載の遺伝子構造解析装置。