JPH0585525B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の詳細な発明］ 本発明は、治療に用いるための新規な組成物に
関する。本発明の更なる目的は以下の記述から明
らかになるであろう。なお本明細書において部及
びパーセントは断らない限り重量によるものとす
る。 フイブロネクチン（fibronectin）又は冷不溶
性グロブリンは、いくつかの最近の総説、雑誌及
び臨床研究の主題であつた（Mossessonら、
Blood，56，145−158，1980；Sa−baら、Amer.
J.Med.，68，577−594，1980；Grause，J.A.M.
A.，244，173，1980；Robbinsら、The Amer，
Surg.，663−673，December 1980；Scoville
ら、Ann.Surg.，188，521−528，1979）． 内皮細胞、上皮細胞及び腹膜大食細胞を含む
種々の細胞によつて生産されるこの物質は細胞内
マトリツクスの主成分として多分必須である。循
環フイブロネクチンは分子量約450000の糖蛋白分
子であり、ジスルフイド結合で連結された凡そ等
しい大きさの２本の分子鎖からなつている
（Mossessonら、同上）。フイブロネクチンは細胞
と細胞の合着を中介する、細胞を基質へ固定し且
つ拡散させる、細胞の移動を調節する、フイブリ
ノーゲン及び大食細胞のコラーゲンへの付加を中
介する及びある種の粒子に対してオプソニン
（opsonin）又は付加因子（attachment factor）
として作用する点において重要であると考えられ
る（上記参考文献）。ひどい外傷又は大きな火傷
は、血漿フイブロネクチンを減少させ、またフイ
ブロネクチンを含有するクリロプレシピテートの
注入によつて正常にすることのできるオプソニン
欠陥（opsonic defect）を随伴する（Robbins
ら、同上、及びScovilleら、同上）。そのような
治療は、心肺機能、シヨツクの補正、及び他の血
液学的因子の正常化に著るしい改善をもたらし、
フイブロネクチンの器官及び微小血管統合性にお
ける重要な役割を示唆した（Scovilleら、同上）。 細胞内皮系（RES）とは、身体中に散在する
が、血液に含まれる微粒子物をエンガルフする
（engulf；食作用する）普通の能力を有する単核
細胞の系に関して使用される。これらの細胞は、
すべてが循環単核細胞に由来し、多くの器官系に
見出されるが、特に脾、リンパ線及び肝臓におけ
る固定組織細胞要素として濃縮されている。
RESはフイブリン、フイブリンモノマー、内生
毒素、血小板凝縮物、損傷された細胞要素、バク
テリヤ、ウイルス及び抗体−抗原複合体を含む微
粒子物の血液を清浄し且つ解毒するために、身体
の１次宿主防禦機構の１つとして機能する。この
重要な宿主防御系の血管は潜在的に有害な微粒子
物を血液中に保持することに通じ、この結果血管
の透過及び浮腫又は微小血管の閉塞が起こり、最
終的に機能障害をもたらしうる。 RESに帰せられる他の機能は、１）抗原−抗
原過程及びリンパ細胞との相互作用、正常な抗体
生産に必要とされる過程、及び正常な細胞免疫の
発現、２）一時的に隆起する腫瘍に対する宿主防
御、３）骨髄の造血の制御、４）傷の治癒、及び
５）骨の再生、を含む。 RESの中介する宿主防御機構の抑圧は、手術
後の外科の患者に、ひどい火傷又は傷をもつ患者
に、バクテリヤ感染、新形成、伝染型血管内凝集
（DIC）、及び他の変質免疫の病気の患者に見られ
る。このような宿主防御の欠陥は、敗血症及び多
器官の不全をもたらしうる。RES機能における
不全は、一部これらの状態において抑圧されるこ
とがわかつている血漿フイブロネクチンの不足に
基づくと考えられる。フイブロネクチンは傷の治
癒の過程に含まれることも公知である。 フイブロネクチンはIgG、IgM、C3b及びC5b
と一緒に、種々の異なる粒子物に対するオプソニ
ン（付加又は摂取因子）として作用する（オプソ
ニン活性）。このオプソニン活性に対する初期の
分析は、ラツトの肝臓の薄片及び放射性元素で標
識したゼラチン被覆の脂質乳化液を使用した。こ
の系においてヘパリンは必須成分であることがわ
かり、フイブロネクチン分子の、β−メルカプト
エタノールの添加によるアルコール変性の防止が
必要であつた。後に、Molnarら（Fed.Proc.，
38，303（1979））は、トリプシンで処置した及び
処置してないラツトの肝臓の薄片を用いることに
より、ゼラチンで被覆したラテツクス粒子がフイ
ブロネクチンによつて肝臓細胞に結合するが、消
化されないということを見出した。Bevilacqua
ら（J.Exp.Med.，153，42〜60（1981））は、続い
てフイブロネクチンがゼラチンで被覆した赤血球
細胞の、人間の単核細胞又は腹膜の大食細胞への
付加を中介するが、これを消化しないことを発見
した。この系の場合の活性には、フイブロネクチ
ンは変質コラーゲン又はゼラチンとの相互作用及
びマグネシウムイオンの存在を必要とする。フイ
ブロネクチン−ゼラチン基質に付加した単核細胞
は、プラスチツク表面に付加された単核細胞より
も、IgG、IgM又はC3bで増感された赤血球を４
倍程多く結合した。このように付加された単核細
胞は、Fc及びC3b受付の数の増加を示す。即ち、
フイブロネクチンは、それ自体消化を促進しない
けれど、Ig及びC3bの介在した内部移行を促進し
うる（Bevilacquaら、同上）。 Kuusela（Nature，276，718〜720（1978））に
よる更なる研究は、標識したフイブロネクチンが
黄色ブドウ球菌に強く結合することを示してい
る。この効果は標識してないフイブロネクチン、
フイブロネクチンを含有する血漿、Ｄ−グルコサ
ミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−リシン、塩化ナ
トリウム及び尿素によつて妨害された。フイブロ
ネクチンのこの有機体への結合には、２価のカチ
オンが必要でなかつた。続くProctorらの報告
（Clin.Res.，27，650A（1979））は、標識したフイ
ブロネクチンが黄色ブドウ球菌及びミクロコツカ
ス・ルテウス（Microccus luteus）に強く結合
するが、大腸菌に結合しないことを示した。これ
は高められた黄色ブドウ球菌及びミクロコツカ
ス・ルテウス誘導の好中球の化学発光及び殺バク
テリヤ性活性と関係があつた。これらの初期の報
告以来、２つの相反する報告が提出された。
Doranら（Inf，and Immun.，33，683〜689
（1981））による１つの報告は、標識したフイブロ
ネクチンの結合がいくつかの菌種の細胞蛋白Ａの
含量に直接比例するから、フイブロネクチンが多
分黄色ブドウ球菌の表面上の蛋白Ａに結合すると
いうことを示した。更に、結合は可溶性蛋白Ａの
添加によつて禁止された（50％まで）。しかしな
がら、これらのデータは、Kuusela，同上及び
Verbrughら、Inf.and Immun.，33，811〜819
（1981）の報告と早退するものであつた。
Kuusela及びVerbrughらは、フイブロネクチン
の結合と蛋白Ａの含量との間に関連を見出せず、
この蛋白の100μg／mlまでとの結合を抑制するこ
とができなかつた。後者のグループは、更に人間
のポリモルホヌクレア（polymorphonuclear）白
血球（PMN）の単核細胞（MN）或いは脆状の
大食細胞による、人間の抗体含有血清の存在又は
不存在下における、放射性標識の黄色ブドウ球菌
の実際の捕捉に関して、フイブロネクチンがその
捕捉の促進に重要な役割をしていることを示すこ
ともできなかつた。しかしながら、これらの後者
の研究は、フイブロネクチンの粒子付加に及ぼす
影響を調べることが意図されていなかつたことを
指摘しなければならない。即ちフイブロネクチン
が宿主防御機構において示す実際の役割には論争
が存在している。Proctorら（Blood，59，681〜
687（1982））は、フイブロネクチンが黄色ブドウ
球菌の人間のPMNへの付加を中介するが、バク
テリヤのPMN食作用を促進しないことを示し
た。 今回、フイブロネクチン及び免疫グロブリンを
含んでなる組成物は、フイブロネクチン或いは免
疫グロブリンのいずれか単独よりも大きいオプソ
ニン又は粒子食作用活性における相乗効果を有す
ることが発見された。結果として、これらの２つ
の個々の試剤の治療能力及び効果は本組成物で使
用しときに著るしく且つ相乗的に高められる。そ
れ故に本発明は免疫治療で使用するための新規な
組合せ生成物に関する。本発明の調製剤は、例え
ば非感染性及び感染性の病気であり、生体内オプ
ソニン作用の絶対的又は相対的欠陥の存在する状
態の及び細網内皮系
（reticuloendothelialsystem）の異常が存在する
場合の病気の予防及び処置に適用できる。 本発明のある具体例は、免疫グロブリン及びフ
イブロネクチンを、個々の薬剤単独のオプソニン
活性の和よりも大きい組成物のオプソニン活性を
与えるのに十分な量で、或いはフイブロネクチン
又は免疫グロブリン単独で中介されるものよりも
大きい食作用を与えるのに十分な量で含んでなる
治療に用いるための製薬学的組成物に関する。 例として、ひどい火傷の患者はフイブロネクチ
ン及び免疫グロブリン双方の量を抑制する。結果
としてのフイブロネクチン量の減少はRESの機
能を損い、ガンマグロブリン量の減少は感染性作
因のオプソニン作用を貧弱なものとする。フイブ
ロネクチン及び免疫グロブリンの抑制が組合され
ば、傷の治癒が損なわれ、オプソニン作用が抑圧
される。これらの双方は感染性作因
（infectiousagents）及び全身的侵入を伴なつて
傷の転移増殖を助長する。RES機能も損なわれ
るから、血液に入つた感染性作因は容易に清浄さ
れず、敗血及び多器官不全が起こる。そのような
患者の場合、本発明の組合せ生成物での代替治療
は、傷の治癒、オプソニン作用及びRES機能に
おいて相乗的に作用する成分を与えることによつ
て非常に有利であることが予期される。 第１図は本発明の組成物の、10^-6Mルミノール
の存在下における化学発光を示すグラフである。 上述のように、本発明の組成物は、精製された
免疫グロブリン及び精製されたフイブロネクチン
を、個々の薬剤単独のオプソニン活性よりも大き
いオプソニン活性を生成する或いは個々の薬剤単
独よりも大きい感染性作因（例えば微粒子物、バ
クテリヤ、免疫錯合体、ウイルスなど）の食作用
を与えるのに十分な量で含んでなる。一般に組成
物中の免疫グロブリンの量は、フイブロネクチン
１部当り約0.01〜1000部、好ましくは約0.01〜
500部、更に好ましくは約１〜100部であるであろ
う。 好適な精製された免疫グロブリン（IG）とし
ては、静脈内（IVIG）投与の意図された物質を
調製するのと同一の方法で調製した物質を用いる
ことができる。IVIGは良く知られており、公知
の手段例例えば超遠心法（Barandunら、Vox
Sang.，７，157−174［1962］），PH調節（Koblet
ら、Vox Sang.，13，93−102［1967］）、注意深
い分別（Schneiderら、Vox Sang.，31，141−
151［1976］）、酵素改変（Faheyら、J.Exper.
Med.，118，845−868［1963］；Kneaplerら、
Vox Sang.，32，159−164［1977］）、構造改変
（Barandunら、Monogr.Allergy，９，39−60
［1975］）、化学改変（Stephan，Vox Sang.，28，
422−437［1975］）；Masukoら、Vox Sang.，32，
175−181［1977］），and還元及びアルキル化
（Pappenhagenら、U.S.特許第3903262号）によ
つて調製することができる。他のIVIG生成物は
下記番号の米国特許3966906；4165370；
4168303；4186192；4272521；4276283；
3466368；3916026；3928580；4154819；
4216205；3607858；3745155；3763135；
3808189；4059571；4075193；4082734；
4093606；4118379；4124576；4126605；
4137222；4160763；4164495；及び4256631に記述
されている。 使用しうる他のIGの分別法は、多電解質親和
性吸着、米国特許第4246085号に開示されている
如き大規模な電気泳動、イオン交換吸着、ポリエ
チレングリコール分別などを含む。しかしなが
ら、IgG，IgM，IgM，IgE又はIgD或いはその亜
種を含んでなる免疫グロブリンを、人間又は人間
以外の起源から分別するいずれかの方法が本発明
において使用しうる。またIgの治療学的に活性な
断片、例えばFc，Fd又はFabフラグメントも本
発明の範囲内に包含される。上述のすべての刊行
物及び特許の開示は本明細書に参考文献として引
用される。 生物工学的技法、即ちモノクロナル
（monoclonal）抗体又は組変えDNA技術を用い
て製造される精製IG生成物も意図される。 精製されたフイブロネクチンの製造に対しては
多くの方法が開示されている：Engvallら、Int.J.
Cancer，Vol.20，２（1977），Molnarら、
Biochemistry，Vol.18，3909（1979），Chenら、
Analytical Biochmistry，Vol.79，144−151
（1977），Mossessonら、J.Biol.Chem.，Vol.245，
No.21，5728−5736（1970），Viantoら、
Biochem.J.，Vol.183，331−337（1979），U.S.特
許第4210580号及び第4315906号及び米国特許願第
127340号。フイブロネクチンの治療上活性なフラ
グメントも本発明の範囲内に含まれる。 普通精製されたフイブロネクチン及び免疫グロ
ブリンを含む本発明の組成物は、血漿中に通常見
出される他の蛋白質を実質的に含有しない、即ち
そのような蛋白質を15％又はそれ以下、好ましく
は10％又はそれ以下でしか含有しない。しかしな
がら、組成物に他の蛋白質例えばフイブリノーゲ
ン又はClqを、特別な環境のもとで必要とされる
如き量で混入することができる。 本発明の好適な生成物は、静脈内投与に適当で
ある治療に用いるための無菌の製薬学的組成物で
ある。生成物は、凍結乾燥の形で適当な希釈剤で
再組成化して使用することができ、或いは水溶液
の形であつてもよい。 本発明に従つて凍結乾燥した生成物を再組成化
する場合には、凡その生理学的条件に対して一般
に認められている及び／又は政府の規制で要求さ
れている如き物質を含有していてもよい無菌の希
釈剤を用いることもできる。この観点において、
無菌の希釈剤は、生理学的に許容しうるPHを得る
ための緩衝剤、塩化ナトリウム、及び／又は生理
学的に許容できる及び／又は人間に用いて安全で
ある他の物質を含有することができる。一般に、
静脈内注射に対する物質は、食品及び薬品の関連
省庁で確立された規制に適合すべきである。本発
明の生成物の蛋白質の濃度は重量／容量基準にお
いて約0.1〜30％、好ましくは約１〜15％である
べきである。 本発明の製薬学的組成物は、凍結乾燥した生成
物の再組成化に関して上述したものと同一の物質
の多くを含有する水溶液の形のものであつてもよ
い。免疫グロブリン又はフイブロネクチンに対す
る安定剤を必要に応じて含有することも本発明の
範囲に含まれる。例えば、本組成物は米国特許第
4186192号又は第4089944号に記述されている如く
糖又は糖アルコールのような炭水化物も含有しう
る。必要ならば、本発明の組成物は第4186192号
（参考文献として引用される）の教示に従つてマ
ルトースを含有しうる。 感染性の肝炎ウイルスを含まない生成物を投与
することが好適である。この観点において、本発
明の組成物又はフイブロネクチン単独は、肝炎の
感染性を減ずるために、例えば滅菌により、即ち
約60℃又はそれ以上の如き温度に約10時間又はそ
れ以上加熱することによつて処置してもよい。本
組成物中の蛋白質を熱に対して安定化させるに
は、炭水化物を単独で或いはアミノ酸又は他の公
知の安定剤と組合せて使用するとよい。この目的
に対しては、単、二又は三糖類例えばアラビノー
ス、グルコース、ガラクトース、マルトース、フ
ルクトース、フイボース、マンノース、ラモー
ス、クスロースなど、或いは糖アルコール例えば
ソルビトール及びマンニトールなどを、0.1〜10
％蛋白質含有の溶液１ml当り約0.5〜2.4gの量で、
炭水化物として使用することができる。 上述のように、本発明の生成物は治療の目的に
使用しうる製薬学的調製剤に混入しうる。しかし
ながら、「製薬学的調製剤」は、本明細書の場合
に広い意味において、治療の目的に対してばかり
でなく、技術的に公知の薬剤又は診断に対して或
いは組織培養に対して使用される本発明の蛋白質
組成物を含む調製剤を包含することが意図され
る。治療の用途が意図される製薬学的調製物はフ
イブロネクチン及び免疫グロブリンを、治療学的
量で、即ち予防的又は治癒的な健康の尺度に必要
な量で含有すべきである。製薬学的調製剤を試薬
又は診断に用いる場合には、それはフイブロネク
チン及び免疫グロブリンを試薬又は診断量で含有
すべきである。 実施例 次の実施例は上述の本発明を更に例示する。用
いた方法は現存の方法の改変法であつた。 確立されている放射性標識のバクテリヤ捕捉法
（Allredら、J.Immunol.Methods，26，355〜63
（1979））、ケミルミネツセンス法（Hemmingら、
J.Clin.Invest.，58，1379〜87（1976）、及び
Bryantら、Immunopharmacology、３，19〜29
（1981））、及びグループＢの連鎖球菌の食作用的
捕捉を評価するための肉眼顕微鏡検査法
（Hemmingら、同上）を用いた。これらの検討
で用いた材料は、IVIG（本明細書に参考文献で引
用される米国特許第3903262号及び第4186192号の
方法で調製）及びフイブロネクチン（本明細書に
参考文献として引用される米国特許願第127340号
の方法で調製）によつてオプソニン作用できる
型グループＢの連鎖球菌属（Rus）を含んだ。 すべての工程は、人間の食作用細胞（PMN）
を液体媒体に懸濁させて或いはこれをゼラチン被
覆のオーバースリツプ（overslip）に付加して行
なつた・ゼラチン被覆のガラス製オーバースリツ
プ（18×18mm、１番）は、暖ゼラチン（Si−gma
Chemical社）の２％溶液中に浸して調製した。
このオーバースリツプを、使用前に18時間、室温
で放置し、調製物を48時間以内に使用した。 放射性標識実験の場合、マツクコイ媒体中 ［³H］チミジン（５マイクロキユーリー／ml）
を添加し又は添加しないでバクテリヤ有機体を夜
通し生育させ、洗浄し、１×10⁹コロニー形成単
位／ml（620nmにおいてOD＝0.9）まで調製し
た。オプソニン作用前に、放射性標識有機体を60
℃下の熱で２時間に亘り死滅させた（Allredら、
同上）。 バクテリヤ有機体を、フイブロネクチン及び
IVIGと組合せ物中において並びにこれらの調製
物単独中において、37℃で60分間回転しながらオ
プソニン作用に供した（Allredら、同上；
Hemmigら、同上；Bryantら、同上）。オプソニ
ン作用混合物は3.4×10⁷有機体（コロニー形成単
位CFU）／mlの濃度でのグループＢの連鎖球菌
３ml、IVIG、フイブロネクチン、或いは両方の
組合せ物を、全容量４mlまでで含有した。フイブ
ロネクチンの、単独での及びIVIGとの組合せで
の量は100及び200μg／mlであり；IVIGを10μg／
mlの濃度で使用した。次いで有機体をPBS中に
おいて洗浄し、媒体199（Grand Island
Biologicals社）中に2.5×10⁷／mlの濃度で再懸濁
した。 成人のPMNを標準法（Allredら、同上及び
Hemmingら、同上）で分離し且つ上述の如く使
用して18mm×18mmのガラス製オーバースリツプ上
に単一層を調製した。前述したようにこのオーバ
ースリツプは２％のゼラチンで処理して又は処理
しないで使用した。付着してない細胞を30分間の
培養後に洗い出し、オプソニン作用せしめた標識
バクテリヤ0.5mlを添加した。90又は180分間の間
隔で、オーバースリツプを激しく洗浄して消化さ
れてないバクテリヤを除去し、６mlのアクアゾル
を含有する計数管ビン中に入れ、BeckmanLS−
8000シンチレーシヨン・カウンターで10分間計数
した。消化された夕固体からの付着物を微分する
他の研究では、シトカラシン（cytochalasin）−
Ｂ（Sigma Chemical社）を5μg／mlの濃度で使用
した。この試薬は、消化を防止するがバクテリヤ
の食細胞への付加に影響しないことが報告されて
いる（Zurierら、Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，
70：844−48，1973；Malawistaら、YaleJ.Biol.
Med.，44：286−300，1971；Zigmondら、Exp.
Cell Res.，73：383−39，1972；Proctorら、同
上）．汚れたオーバースリツプを検査もし、オー
バースリツプ当りの付着した食作用細胞の数を接
眼鏡マイクロメーターで決定した（Allredら、同
上）。次いで消化された有機体のパーセントを、
放射性カウントにより及び関連するバクテリヤに
関するPMNのパーセントの肉眼での評価により
決定した。 放射性標識の捕捉実験に加えて、上述の如く調
製した予備オプソニン作用された生きている無標
識バクテリヤに露呈した人間のPMNにおるケミ
ルミネツセンスの発生も評価した。これらの検討
では、分離した人間のPMN（約５×10⁶）を、暗
色の適した計数管ビン中において予備オプソニン
作用された生きているバクテリヤ（１×10⁹／ml）
0.5mlと混合した（Hemmingら）。この検討は細
胞をCaCl₂含むDulbeccoのPBS3.5mlの全容器中
に懸濁させて行なつた。ビンを直ぐにシンチレー
シヨンカウンター中に置き、10分間隔で240分ま
での全期間計数した。 結果を下表及び第１図に要約する。 【表】 【表】 【表】 【表】 第１図は、10^-5Mルミノールの存在下におけ
る、分単位の時間に対する種々の組合せ物のケミ
ルミネツセンス（CPM×10^-3）をグラフ的に示
す。線は次の通り意味を有する。 線 組 成 10 PMN単独 12 PMN＋バクテリア 14 do.＋FN 16 do.＋シトカラシンＢ（cytoB） 18 do.＋cytoB＋FN 20 do.＋IVIG 22 do.＋FN＋IVIG 24 do.＋IVIG＋cytoB 26 do.＋IVIG＋FN＋cytoB FN及びIVIGの組合せ物は、理解されるよう
に、FN（線15）及びEVEG（線20）単独のケミル
ミネツンスの総和よりも大きい白血球ケミルミネ
ツセンス（食作用の間接測定）（線22）を与えた。
付加してない消化は線22と24を比較することによ
つて示される。FN及びIVIGの組合せ物は、
cytoBの存在において、実質的に減少したケミル
ミネツセンスを示し、従つてバクテリヤの、単な
る付加ではなくて消化を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の組成物の、10^-6Mルミノール
の存在下における化学発光を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 精製された免疫グロブリン及びフイブロネク
   チンを、免疫グロブリン及びフイブロネクチン単
   独のオプソニン活性の和よりも大きいオプソニン
   活性の組成物に生じさせるのに十分な量で含有す
   ることを特徴とする免疫的増強組成物。 ２ 無菌水溶液である特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 ３ 免疫グロブリン及びフイブロネクチンの濃度
   が約１〜30重量／容量％である特許請求の範囲第
   ２項記載の組成物。 ４ 免疫グロブリンが静脈内免疫グロブリンであ
   り、免疫グロブリン及びフイブロネクチンの濃度
   が約５〜15重量／容量％である特許請求の範囲第
   ２項記載の組成物。 ５ 免疫グロブリンが筋肉内免疫グロブリンであ
   り、免疫グロブリン及びフイブロネクチンの濃度
   が約10〜20重量／容量％である特許請求の範囲第
   ２項記載の組成物。 ６ フイブロネクチン１重量部当り免疫グロブリ
   ン0.01〜1000重量部を含有する特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 ７ フイブロネクチン１重量部当り免疫グロブリ
   ン0.1〜500重量部を含有する特許請求の範囲第６
   項記載の組成物。 ８ フイブロネクチン１重量部当り免疫グロブリ
   ン１−100重量部を含有する特許請求の範囲第７
   項記載の組成物。 ９ 免疫グロブリンが免疫血清グロブリンである
   特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １０ 免疫血清グロブリンが静脈内投与に適する
   ものである特許請求の範囲第９項記載の組成物。