JPH0584073A - 酵素の利用 - Google Patents
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- JPH0584073A JPH0584073A JP3130821A JP13082191A JPH0584073A JP H0584073 A JPH0584073 A JP H0584073A JP 3130821 A JP3130821 A JP 3130821A JP 13082191 A JP13082191 A JP 13082191A JP H0584073 A JPH0584073 A JP H0584073A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 酵素を利用して所望の機能を発揮させる技術
およびその目的に適う製品に係る。そのような機能の一
例は口内微生物相に存在する微生物種を攻撃（殺傷、ａ
ｔｔａｃｋ）することである。もうひとつ別の例は腫瘍
細胞を攻撃することである。 【構成】 口内に入ることが許容され得る１つ以上のビ
ヒクルが２つの共働する酵素と、これらを互いに連結す
る手段とを含有している。１つの酵素は他の酵素によっ
て利用される中間体を発生させ、他の酵素はこれにより
標的部位に作用する物質、好ましくは次亜ハロゲン酸塩
を発生させる。このとき、連結手段は、中間体を利用す
る酵素の近くでこの中間体が発生するようにする。
およびその目的に適う製品に係る。そのような機能の一
例は口内微生物相に存在する微生物種を攻撃（殺傷、ａ
ｔｔａｃｋ）することである。もうひとつ別の例は腫瘍
細胞を攻撃することである。 【構成】 口内に入ることが許容され得る１つ以上のビ
ヒクルが２つの共働する酵素と、これらを互いに連結す
る手段とを含有している。１つの酵素は他の酵素によっ
て利用される中間体を発生させ、他の酵素はこれにより
標的部位に作用する物質、好ましくは次亜ハロゲン酸塩
を発生させる。このとき、連結手段は、中間体を利用す
る酵素の近くでこの中間体が発生するようにする。
Description
【産業上の利用分野】本発明は酵素を利用して所望の機
能を発揮させる技術およびその目的に適う製品に係る。
そのような機能の一例は口内微生物相に存在する微生物
種を攻撃（殺傷、ａｔｔａｃｋ）することである。もう
ひとつ別の例は腫瘍細胞を攻撃することである。本発明
では２種の酵素を利用するが、そのうちの一方はもう一
方の酵素に対する基質となる中間物質を発生させる酵素
である。もう一方の酵素は、この中間体を、ある標的に
対して活性をもつ物質に変換する。この一方の酵素とし
て可能なひとつの例はグルコースオキシダーゼである。
この酵素は、グルコースが分子状酸素によってグルコン
酸に酸化される過程を触媒し、この過程で過酸化水素が
生成する。この場合もう一方の酵素はペルオキシダーゼ
とすることができ、これは、たとえば、ヨウ化物イオン
などのようなハロゲン化物との反応により次亜ヨウ素酸
塩を生成させる過程、またはチオシアン酸塩との反応に
よりハイポチオシアン酸塩を生成させる過程によって、
過酸化水素をより強力な酸化状態の分子種に変換する機
能を果たす。過酸化水素は細胞障害活性を示すがインビ
ボでは急速に分解する。ペルオキシダーゼの作用によっ
て生成する酸化種はさらに強い活性をもっているが、イ
ンビボでの寿命が過酸化水素より短い。
能を発揮させる技術およびその目的に適う製品に係る。
そのような機能の一例は口内微生物相に存在する微生物
種を攻撃（殺傷、ａｔｔａｃｋ）することである。もう
ひとつ別の例は腫瘍細胞を攻撃することである。本発明
では２種の酵素を利用するが、そのうちの一方はもう一
方の酵素に対する基質となる中間物質を発生させる酵素
である。もう一方の酵素は、この中間体を、ある標的に
対して活性をもつ物質に変換する。この一方の酵素とし
て可能なひとつの例はグルコースオキシダーゼである。
この酵素は、グルコースが分子状酸素によってグルコン
酸に酸化される過程を触媒し、この過程で過酸化水素が
生成する。この場合もう一方の酵素はペルオキシダーゼ
とすることができ、これは、たとえば、ヨウ化物イオン
などのようなハロゲン化物との反応により次亜ヨウ素酸
塩を生成させる過程、またはチオシアン酸塩との反応に
よりハイポチオシアン酸塩を生成させる過程によって、
過酸化水素をより強力な酸化状態の分子種に変換する機
能を果たす。過酸化水素は細胞障害活性を示すがインビ
ボでは急速に分解する。ペルオキシダーゼの作用によっ
て生成する酸化種はさらに強い活性をもっているが、イ
ンビボでの寿命が過酸化水素より短い。
【従来技術の概要】細胞を殺傷するために酵素を利用す
ることはすでに提案されており、中には２種類の酵素を
利用しようとしたものもある。Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ
ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎ
ｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，５２，１４４３（１９７３）
には、標的細胞に結合することができる抗体と化学的に
結合したグルコースオキシダーゼを利用することによっ
て、これら選択的に除去したい細胞に対する細胞殺傷活
性を選択的に標的に作用させる（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）
ことが記載されている。ペルオキシダーゼとハロゲン化
物の溶液を使用して細菌細胞を殺傷できることが示され
ている。Ｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２７，６９０（１９８
０）には、標的細胞に結合することができる抗体と化学
的に結合したラクトペルオキシダーゼおよびキサンチン
オキシダーゼ（これは、少なくとも主として、過酸化物
より超酸化物を生成する）を利用することが記載されて
いる。９０分にわたるインビトロ実験ではＣａｎｄｉｄ
ａ ａｌｂｉｃａｎｓの生菌細胞を減少させることがで
きた。これは、ラクトペルオキシダーゼの溶液で得られ
た結果より１〜２のオーダーだけ優れていた。
ることはすでに提案されており、中には２種類の酵素を
利用しようとしたものもある。Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ
ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎ
ｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，５２，１４４３（１９７３）
には、標的細胞に結合することができる抗体と化学的に
結合したグルコースオキシダーゼを利用することによっ
て、これら選択的に除去したい細胞に対する細胞殺傷活
性を選択的に標的に作用させる（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）
ことが記載されている。ペルオキシダーゼとハロゲン化
物の溶液を使用して細菌細胞を殺傷できることが示され
ている。Ｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２７，６９０（１９８
０）には、標的細胞に結合することができる抗体と化学
的に結合したラクトペルオキシダーゼおよびキサンチン
オキシダーゼ（これは、少なくとも主として、過酸化物
より超酸化物を生成する）を利用することが記載されて
いる。９０分にわたるインビトロ実験ではＣａｎｄｉｄ
ａ ａｌｂｉｃａｎｓの生菌細胞を減少させることがで
きた。これは、ラクトペルオキシダーゼの溶液で得られ
た結果より１〜２のオーダーだけ優れていた。
【発明の概要】本発明においては、１種以上のビヒクル
（媒体としての賦形剤）が、 ｉ） ある標的に対して活性を有する物質を発生させる
ひとつの酵素と、この第一の酵素に対する基質となる中
間体を発生させる第二の酵素とからなる２種類の酵素の
うちの少なくとも１種と、 ｉｉ） 少なくとも使用時に前記酵素を互いにカップル
させる連結手段（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅａｎｓ）とを、 同一のビヒクル中に、あるいは複数のビヒクル間に分配
された形で含有している。２種類の酵素を連結すること
により、一方の酵素が他方の酵素によって生成される中
間体をより容易に使用することができ、そのためこれら
の酵素の効力が高まる。本発明のひとつの局面は上記ビ
ヒクルを含む製品にある。もうひとつの局面はビヒクル
の投与による細胞の攻撃方法である。連結手段が標的
（もちろんこれは本発明の製品の成分ではない）に前記
酵素をカップルさせることによって機能することは本発
明の範囲内のひとつの可能性である。しかし、別の可能
性は、本発明の製品中に含まれている連結手段が、前記
酵素に結合することができるかまたはすでに結合してい
てこれらの間の結合（ｌｉｎｋ）を形成することであ
り、このとき前記製品中にはこの結合の一部となる外的
な手段をなんら含ませる必要がない。この場合、連結手
段は、両方の酵素と単一の全抗体との化学結合以外のも
のであるのが好ましい。酵素は両方が１つのビヒクル中
に含まれていてもよいし、または複数のビヒクル（同じ
である必要はない）中に含まれていてもよい。あるい
は、一方の酵素が、たとえば目標とする標的部位の近傍
にインビボで存在する物質であってもよく、連結手段は
その酵素を他方の酵素にカップルさせるように機能す
る。こうすると、この酵素が他方の酵素に近接した位置
に濃縮されることになる。本発明で使用する酵素は、過
酸化水素を発生させるオキシダーゼと、過酸化水素を基
質として利用して、たとえば次亜ハロゲン酸塩を生成す
るペルオキシダーゼとの組合せとすることができる。ま
た、ペルオキシダーゼは、過酸化物を利用してチオシア
ン酸塩をハイポチオシアン酸塩に変換することもでき
る。本発明では、特にグルコースオキシダーゼが考えら
れる。別の可能な酵素はガラクトースオキシダーゼであ
り、これを使用するとヨーグルト中に天然に存在するガ
ラクトースを基質として利用することができる。ホース
ラディッシュペルオキシダーゼは市販されており、上記
のオキシダーゼのいずれとも組合せて使用することがで
きる。さらに別の可能性はラクトペルオキシダーゼであ
る。本発明にはさまざまな応用が考えられ、特定の用途
に限定されることはない。特に考えられるひとつの応用
は歯肉の口内微生物相の菌種を攻撃することである。こ
の応用やその他の応用では、ビヒクルが両酵素を標的部
位に結合する手段を含んでいるのが好ましい。口内微生
物相は、広範な微生物種を含む複雑な生態系である。こ
れらの微生物種のひとつを標的部位として選択すること
ができる。しかし、ひとつの種を標的とすると、その効
果として、この種とこれに近接して存在する他の種の両
方が攻撃される。したがって、歯垢内に存在するひとつ
の種に向けて搬送（デリバリー）することによって、細
胞障害剤がこの歯垢に搬送され、歯垢の形成に関与する
種を含めて歯垢中に共に存在する種すべてに対して作用
することになる。これらの微生物によって産生される細
胞外デキストラン自体も標的部位として利用できるであ
ろう。ひとつの可能な標的部位はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｍｕｔａｎｓである。これは歯垢の重大な一因
として認められており、無菌動物において単一菌感染と
した場合臨床的に齲食病巣を引き起こし得ることが示さ
れている。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは食餌の炭水化物を利用し
て不溶性の多糖マトリックスを合成する能力をもってお
り、このため、歯の硬質表面への付着および定着（コロ
ニー形成）が容易になると共にエナメル質の溶解を引き
起こし得る酸が生成する。これらの特徴は重要な毒性決
定因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）
として認識されている。他の種および属も酸とプラーク
（歯垢）の両方を生成することが可能であり、さらには
無菌動物において齲食を発生させ得ることが立証されて
いるが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓはその酸と多糖の産生量が多
いために齲食の重大原因の少なくともひとつとして広く
認められている。標的種として選択できるその他の種は
Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓおよびＡ．
ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉである。これらの菌種はすべて歯
垢中に通常認められる種のかなりの割合として存在して
いる。これら３種は出現頻度が高いので標的部位として
好ましいと思われる。他の応用は、歯周疾患の原因であ
る歯肉下の微生物相の種を攻撃することである。この標
的種はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
とすることができるであろう。可能な美容用途は歯の染
み・着色の低下である。この応用では、次亜ハロゲン酸
塩イオンなどのような漂白作用をもつ物質を生じる酵素
を使用する。標的部位は染みが存在し得る歯の表面であ
る。口内（歯）に応用する場合はいずれも、本発明の製
品中に使用するビヒクルは口内での使用が許容できるも
のである必要があろう。たとえば、口内局所使用に適し
たビヒクルを使用する。さらに別の応用は、ヒトの腫瘍
細胞、特に、放射線療法を受けている患者の身体から一
時的に取り出された骨髄中の腫瘍細胞の攻撃である。
（媒体としての賦形剤）が、 ｉ） ある標的に対して活性を有する物質を発生させる
ひとつの酵素と、この第一の酵素に対する基質となる中
間体を発生させる第二の酵素とからなる２種類の酵素の
うちの少なくとも１種と、 ｉｉ） 少なくとも使用時に前記酵素を互いにカップル
させる連結手段（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｅａｎｓ）とを、 同一のビヒクル中に、あるいは複数のビヒクル間に分配
された形で含有している。２種類の酵素を連結すること
により、一方の酵素が他方の酵素によって生成される中
間体をより容易に使用することができ、そのためこれら
の酵素の効力が高まる。本発明のひとつの局面は上記ビ
ヒクルを含む製品にある。もうひとつの局面はビヒクル
の投与による細胞の攻撃方法である。連結手段が標的
（もちろんこれは本発明の製品の成分ではない）に前記
酵素をカップルさせることによって機能することは本発
明の範囲内のひとつの可能性である。しかし、別の可能
性は、本発明の製品中に含まれている連結手段が、前記
酵素に結合することができるかまたはすでに結合してい
てこれらの間の結合（ｌｉｎｋ）を形成することであ
り、このとき前記製品中にはこの結合の一部となる外的
な手段をなんら含ませる必要がない。この場合、連結手
段は、両方の酵素と単一の全抗体との化学結合以外のも
のであるのが好ましい。酵素は両方が１つのビヒクル中
に含まれていてもよいし、または複数のビヒクル（同じ
である必要はない）中に含まれていてもよい。あるい
は、一方の酵素が、たとえば目標とする標的部位の近傍
にインビボで存在する物質であってもよく、連結手段は
その酵素を他方の酵素にカップルさせるように機能す
る。こうすると、この酵素が他方の酵素に近接した位置
に濃縮されることになる。本発明で使用する酵素は、過
酸化水素を発生させるオキシダーゼと、過酸化水素を基
質として利用して、たとえば次亜ハロゲン酸塩を生成す
るペルオキシダーゼとの組合せとすることができる。ま
た、ペルオキシダーゼは、過酸化物を利用してチオシア
ン酸塩をハイポチオシアン酸塩に変換することもでき
る。本発明では、特にグルコースオキシダーゼが考えら
れる。別の可能な酵素はガラクトースオキシダーゼであ
り、これを使用するとヨーグルト中に天然に存在するガ
ラクトースを基質として利用することができる。ホース
ラディッシュペルオキシダーゼは市販されており、上記
のオキシダーゼのいずれとも組合せて使用することがで
きる。さらに別の可能性はラクトペルオキシダーゼであ
る。本発明にはさまざまな応用が考えられ、特定の用途
に限定されることはない。特に考えられるひとつの応用
は歯肉の口内微生物相の菌種を攻撃することである。こ
の応用やその他の応用では、ビヒクルが両酵素を標的部
位に結合する手段を含んでいるのが好ましい。口内微生
物相は、広範な微生物種を含む複雑な生態系である。こ
れらの微生物種のひとつを標的部位として選択すること
ができる。しかし、ひとつの種を標的とすると、その効
果として、この種とこれに近接して存在する他の種の両
方が攻撃される。したがって、歯垢内に存在するひとつ
の種に向けて搬送（デリバリー）することによって、細
胞障害剤がこの歯垢に搬送され、歯垢の形成に関与する
種を含めて歯垢中に共に存在する種すべてに対して作用
することになる。これらの微生物によって産生される細
胞外デキストラン自体も標的部位として利用できるであ
ろう。ひとつの可能な標的部位はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｍｕｔａｎｓである。これは歯垢の重大な一因
として認められており、無菌動物において単一菌感染と
した場合臨床的に齲食病巣を引き起こし得ることが示さ
れている。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは食餌の炭水化物を利用し
て不溶性の多糖マトリックスを合成する能力をもってお
り、このため、歯の硬質表面への付着および定着（コロ
ニー形成）が容易になると共にエナメル質の溶解を引き
起こし得る酸が生成する。これらの特徴は重要な毒性決
定因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）
として認識されている。他の種および属も酸とプラーク
（歯垢）の両方を生成することが可能であり、さらには
無菌動物において齲食を発生させ得ることが立証されて
いるが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓはその酸と多糖の産生量が多
いために齲食の重大原因の少なくともひとつとして広く
認められている。標的種として選択できるその他の種は
Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓおよびＡ．
ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉである。これらの菌種はすべて歯
垢中に通常認められる種のかなりの割合として存在して
いる。これら３種は出現頻度が高いので標的部位として
好ましいと思われる。他の応用は、歯周疾患の原因であ
る歯肉下の微生物相の種を攻撃することである。この標
的種はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
とすることができるであろう。可能な美容用途は歯の染
み・着色の低下である。この応用では、次亜ハロゲン酸
塩イオンなどのような漂白作用をもつ物質を生じる酵素
を使用する。標的部位は染みが存在し得る歯の表面であ
る。口内（歯）に応用する場合はいずれも、本発明の製
品中に使用するビヒクルは口内での使用が許容できるも
のである必要があろう。たとえば、口内局所使用に適し
たビヒクルを使用する。さらに別の応用は、ヒトの腫瘍
細胞、特に、放射線療法を受けている患者の身体から一
時的に取り出された骨髄中の腫瘍細胞の攻撃である。
【具体例の詳細な説明】本発明はさまさまな態様で実施
できる。そのうちのいくつかを添付の図面に例示した。
これらの図はすべて連結の様子を概略的に示したもので
ある。図中で、Ｇ．Ｏｘはグルコースオキシダーゼ、Ｈ
ＲＰはホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＰＥＩは
ポリエチレンイミンを表わしている。本発明では互いに
連結された２つの酵素を必要とする。連結された酵素は
標的に結合させることができる。この結合は、標的部位
に結合する抗体または抗体断片を介するのが好ましい。
本発明のいくつかの有意義な形態においては、連結手段
が前記酵素間に渡って伸びており、標的部位（これは細
胞であってもよい）を介するかまたは標的部位に直接結
合する単一の全抗体を介する以外の方法で前記酵素を互
いにカップルさせる。こうすると、標的特異的抗体を、
共有結合の形成を介して酵素と抗体を結合するために使
用される人工的な化学反応にかけなくて済む。また、標
的部位または標的特異的抗体を介する以外の方法で酵素
を連結すると、酵素の分配の制御が容易にできると共に
２種類の酵素を互いに近接して配置させるのが容易にで
きるようになるため、一方の酵素の生成物である中間体
が他方の酵素に近接して発生する。ひとつの可能性は、
連結手段が、両方の酵素が共有結合の形成によって化学
的に結合しているキャリヤ物質である。このキャリヤ物
質は、化学反応により酵素の結合を可能にする化学的官
能性を備えた合成ポリマーであることができる。これを
図１に例示する。適切なポリマーはポリエチレンイミン
（ＰＥＩ）であり、これは分枝鎖の末端にアミノ基を有
する分枝ポリマーである。これは本発明のさらに別の一
面となる。すなわち本発明のひとつの局面は、一方の酵
素が他方の酵素に対する基質を生成する２種の酵素であ
って、これら２種の酵素は両方とも、共有結合を介して
合成ポリマーに結合されている。グルコースオキシダー
ゼとホースラディッシュペルオキシダーゼはいずれも、
グリコシル側鎖（ｐｅｎｄａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌ
ｃｈａｉｎ）を有する酵素である。このような酵素はポ
リエチレンイミンと共有結合させることができる。その
ためには、まず最初に水溶液中で過ヨウ素酸塩を用いて
酵素を酸化してグリコシル側鎖中にアルデヒド基を発生
させる。これらの基は次に、アルカリ性ｐＨ（たとえば
ｐＨ９．５）でポリエチレンイミン上のアミノ基と共に
シッフ塩基を形成する。その後、水素化ホウ酸塩（ｂｏ
ｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）による還元反応を用いて、未反応
のアルデヒド基を還元すると共に、シッフ塩基の還元に
よって安定性を増大させることができる。これらの酵素
はまた同じ技法によって抗体に結合することもできる。
連結手段は、酵素が結合している少なくとも１つの抗体
（標的特異的抗体以外のものが好ましい）からなること
ができる。これらの酵素はそれぞれ対応する抗体に結合
していてもよいしまたは結合することができ、一方、こ
れらの抗体は抗原−抗体結合によって互いに結合するこ
とができる。この態様の一例を図２に示す。図では、酵
素が、異なる種に由来するそれぞれの抗体と化学的に結
合しており、これらの抗体の一方は他方の抗体に対する
抗原となっている。図２で、符号１０は、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼが結合しているラビットの抗−
ウシイムノグロブリンを表わす。符号１２は、グルコー
スオキシダーゼと結合したヒツジの抗−ラビットイムノ
グロブリンを表わす。これは抗体１０に結合しており、
したがって酵素同士を連結している。変形例を図３に示
す。ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ヤギの抗
−ラビットイムノグロブリンに化学的に結合している。
ヤギの抗体１４はラビットの抗−グルコースオキシダー
ゼ抗体１６に結合し、この抗体１６はグルコースオキシ
ダーゼに結合する。したがって、２つの酵素は抗体１
４、１６を介して互いに連結される。本発明に従って互
いに接続された２つの連結酵素は、この連結酵素を標的
に結合するために特別な手段がない場合でも、標的に対
する細胞殺傷活性を示すことができる。この理由は、単
に、酵素を互いに組合せると活性が高まるためにほかな
らないと考えらることができる。また、酵素と連結手段
との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が標的に対して固有の親
和性を有していることもあり得ることである。しかし、
連結された酵素が標的の部位とカップルすると好まし
い。２つの酵素と連結手段とで構成される複合体は、標
的部位に結合することができる抗体に結合していてもよ
いしまたはそのような抗体に結合することができる。こ
の結合は抗原−抗体結合によるのが望ましい。これによ
り、標的特異的抗体に対する化学結合を回避することが
できる。連結手段が１つ以上の抗体を含んでいる場合、
これらの抗体のひとつが、ビヒクル中に含まれている標
的特異的抗体に結合することができる能力をもっている
ことが可能である。これを図４と５に例示する。図４で
符号２０は標的Ｓ．ｍｕｔａｎｓを示しており、符号２
２は細胞表面の抗原部位を示している。符号２４は、本
発明の製品中に含まれているウシの抗−Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ抗体を示している。これが標的に結合し、図２に示し
た複合体のラビット抗−ウシ抗体１０がウシの抗体２４
に結合する。同様に、図５では、図３の複合体の抗体１
４がラビット抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体２６に結合し、
これが標的２０に結合する。一連の抗体を介して標的に
結合することは、本出願と同日付の別出願の主題であ
る。連結手段が図１に示したような合成ポリマーである
場合、そのようなポリマーと、共有結合を介してこれに
結合している両酵素との複合体は、さまざまな方法で標
的部位に結合することができるであろう。ひとつの可能
性は、本発明の製品が、前記酵素の一方に対する抗体、
標的に対する抗体、および、さらに別の抗体を含んでい
る場合である。この別の抗体は、前記酵素に対する抗体
と前記標的部位に対する抗体との双方に結合することに
よってブリッジを形成することができる。これを図６に
例示する。図６で、さまざまな符号は図５と同じ意味を
もっており、符号２８はヤギの抗−ラビットイムノグロ
ブリンを表わす。もうひとつの可能性は、本発明の製品
が、酵素の一方に結合すると共に標的に結合する抗体に
も結合する能力を有する２つの特異性を備えた二重抗体
複合体（ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）を含んでいる場合である。二重抗体複合体そ
のものは公知である。この態様を図７に例示する。符号
２４はＳ．ｍｕｔａｎｓ標的２０に対するウシの抗体を
表わす。符号３０は抗−ウシ抗体と抗−グルコースオキ
シダーゼ抗体の二重抗体複合体を表わしている。さらに
別の可能性は、ポリマーが標的に特有の抗原部位をもっ
ている場合であり、この抗原部位はポリマーに共有結合
している。目的とする標的に結合することができる抗体
はポリマー上のこれら抗原部位にも結合し、そうしてポ
リマーを標的部位とカップルさせることになるであろ
う。この態様を図８に例示する。符号３２はポリエチレ
ンイミンに結合している抗原を意味し、符号３４は標的
２０をこの抗原３２に結合させる抗−標的抗体を意味す
る。両酵素の連結および標的に対する結合は、抗体断片
を用いて実施することもできる。好ましい態様では、ひ
とつの抗体断片を標的部位に結合させ、この第一の断片
に酵素を結合させるのに１種以上の別の断片を利用す
る。標的部位に結合する第一の抗体断片は所望の標的に
対する抗体のＦｖ断片とすることができる。そのような
断片は抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域のみを含んでい
る。断片は、２つの結合部位を提供するＦ（ａｂ）２断
片とすることも可能である。あるいは、ひとつの抗体の
一方の鎖の単一の可変領域ほどの小さな部分であっても
よい。生物学的に活性な抗体断片をＥ．ｃｏｌｉ中で効
率的に生産する技術は、Ａ．ＳｋｅｖｉａおよびＡ．Ｐ
ｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
０，１０３８；Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９
８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１；ならびに
Ｅ．Ｓ．Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９），Ｎａｔ
ｕｒｅ，３４１，５４４に記載されている。抗体断片を
コードしている遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中でクローニング
して発現させる技術もまた、ヨーロッパ特許出願公開第
３６８６８４号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されている。第一の抗体断片が
付加的なペプチド鎖をもっており、別の断片がこのペプ
チド鎖に酵素を結合させるようにするのが好ましい。Ｃ
末端にすでに結合した余分なペプチド鎖をもっている可
変領域を生産するような細菌を作成することができる。
これは標準的な遺伝子手法によって行なうことができ
る。たとえば、可変領域をコードしている遺伝子は、部
位特異的変異誘発法により、可変領域に結合させるべき
ペプチドをコードしているインビトロで合成したオリゴ
ヌクレオチドを用いて容易に延長することができる。部
位特異的変異誘発法はいまや広く使用されている手法で
あり、適切な手順は発行されたいくつかの単行本、たと
えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，（１９８９），Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉ
ｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記
載されている。付加した余分なペプチドは治療薬の結合
にとって極めて便利な「手段」となる。第一の断片に酵
素を結合させる別の抗体断片は、抗原−抗体結合によっ
て酵素に結合することができる第二の抗体断片、および
第一の抗体断片と第二の抗体断片とに結合することがで
き、特に第一および第二抗体断片に結合している抗原性
のペプチドに結合することができるＦ（ａｂ）２断片
（これは二価である）が好ましい。図９に、抗体断片を
利用する好ましい態様を例示する。抗原部位４２を有す
る標的４０に結合するにはＦｖ抗体断片４４を使用す
る。この抗体断片４４では、いくつか繰返されるペプチ
ド４６がＦｖ断片４４の２つの鎖のうちの一方の鎖の端
部（Ｃ末端）に結合している。グルコースオキシダーゼ
（Ｇ．Ｏｘ）とホースラディッシュペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）には、それぞれ対応するＦｖ断片４８、５０
が結合する。このＦｖ断片４８、５０はそれぞれの酵素
に対する特異性をもっており、かつ、同じペプチドの単
一の繰返し４６がこのＦｖ断片の一方の鎖に結合してい
る。抗−酵素Ｆｖ断片４８、５０に結合しているペプチ
ド４６はこれらのペプチドに特異的に結合するＦ（ａ
ｂ）２断片５２によって抗−標的Ｆｖ断片上のペプチド
４６に連結されるようになる。Ｆ（ａｂ）２断片は二価
であるので、酵素に結合した抗−酵素断片を抗−標的断
片４４に結合するブリッジを形成することができる。本
発明の範囲内で、両酵素はひとつの標的部位に結合し
て、互いに連結されるようになるがそれ以上直接には連
結されないようにすることが可能である。この種の態様
を図１０と１１に示す。図１０で、符号１０は、抗原部
位２２を有する標的Ｓ．ｍｕｔａｎｓを表わす。符号５
４は、グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）が結合して
いる抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体を表わす。符号５６は、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合
している抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体を表わす。図１１で
は、多重抗体を使用しているために化学結合の必要性が
回避されている。符号２６はラビットの抗−Ｓ．ｍｕｔ
ａｎｓ抗体を表わす。符号１６は酵素グルコースオキシ
ダーゼに結合するラビットの抗−グルコースオキシダー
ゼを表わす。符号５８は、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼに結合するラビットの抗−ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼを表わす。符号２８は、ヤギの抗−ラ
ビットイムノグロブリンを表わし、これは抗体１６と５
８を抗−標的抗体２６に結合させる働きをする。図１２
は、両方の酵素が単一の抗体（これは標的にも結合す
る）に化学的に結合している別の態様を示している。本
発明で使用する抗体はポリクローナルでもモノクローナ
ルでもよい。ある特異性をもった抗体とこれとは異なる
特異性をもった別の抗体とを共に使用する場合、一方の
抗体をモノクローナルとし、他方の抗体をポリクローナ
ルとすることが可能である。複数のポリクローナル抗体
を使用する場合、酵素と抗体を本発明の製品中の２つ以
上のビヒクル間に分配して、使用時まで酵素と抗体両方
の完全な複合体が形成しないようにするのが望ましいこ
とが分かるであろう。ポリクローナル抗体との大きな複
合体は貯蔵中、標的部位に結合する能力が低下し易いこ
とが判明している。モノクローナル抗体を使用すれば、
複合体の構成成分を複数のビヒクル間に分配する必要は
ないであろう。一般に、モノクローナル抗体は小さめの
複合体を形成し、貯蔵中ポリクローナル抗体との間で形
成される複合体より活性保持が良好であると期待され
る。これは、抗体断片を使用する場合にもいえることで
ある。抗体断片の利点は、抗原−抗体結合によって形成
される複合体がかなり小さくて全抗体との間で形成され
る複合体より安定であるということである。製品が２種
のビヒクル間に分配された両酵素と１種以上の抗体とを
有する場合、一方のビヒクルが標的に結合することがで
きる抗体を含み、他方のビヒクルが両酵素とそれらを互
いに連結する手段とを、おそらくは予備的に形成された
複合体として含むことができよう。両酵素、それらを連
結する手段、および／または１種以上の抗体もしくは抗
体断片を含む１つ以上のビヒクルからなる製品はいろい
ろな形態をとることができよう。標的部位が口の中であ
れば、うがい薬、練り歯磨および口の中で溶ける薬用ド
ロップが考えられる。これらの製品形態は複数のビヒク
ルが必要な場合にも使用することができよう。たとえ
ば、製品は、ユーザーが使用の直前に混合する２成分型
のうがい薬とすることができよう。製品は２つの成分を
有する練り歯磨とすることもできる。これは、別々に保
存するかまたは少なくとも混合しないでおくが、ユーザ
ーの口の中では一緒に分配されて混合するように、練り
歯磨容器中に貯蔵される。このような２成分型の練り歯
磨製品そのものは公知である。複数のビヒクルを使用す
る製品の別の可能な形態は口の中でなめる薬用ドロップ
であろう。このような薬用ドロップには別々の部分にい
ろいろな成分を含ませることができる。複数のビヒクル
を使用する方法として、２種のビヒクル形態を組合せて
使用することもできよう。たとえば、練り歯磨の後にう
がい薬または薬用ドロップを使用することができる。本
発明の製品は、酵素によって発生する中間体とは別に、
酵素に対する基質をいくつかまたはすべて含んでいても
よいし、あるいは標的部位に存在する酵素基質のいくつ
かまたはすべてを利用することもできる。したがって、
グルコースオキシダーゼを使用し、標的部位が口内であ
る場合、本発明の製品は酵素基質として食餌のグルコー
スを利用することもできるし、あるいはグルコースオキ
シダーゼとは別にグルコースを含んでいてもよい。
できる。そのうちのいくつかを添付の図面に例示した。
これらの図はすべて連結の様子を概略的に示したもので
ある。図中で、Ｇ．Ｏｘはグルコースオキシダーゼ、Ｈ
ＲＰはホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＰＥＩは
ポリエチレンイミンを表わしている。本発明では互いに
連結された２つの酵素を必要とする。連結された酵素は
標的に結合させることができる。この結合は、標的部位
に結合する抗体または抗体断片を介するのが好ましい。
本発明のいくつかの有意義な形態においては、連結手段
が前記酵素間に渡って伸びており、標的部位（これは細
胞であってもよい）を介するかまたは標的部位に直接結
合する単一の全抗体を介する以外の方法で前記酵素を互
いにカップルさせる。こうすると、標的特異的抗体を、
共有結合の形成を介して酵素と抗体を結合するために使
用される人工的な化学反応にかけなくて済む。また、標
的部位または標的特異的抗体を介する以外の方法で酵素
を連結すると、酵素の分配の制御が容易にできると共に
２種類の酵素を互いに近接して配置させるのが容易にで
きるようになるため、一方の酵素の生成物である中間体
が他方の酵素に近接して発生する。ひとつの可能性は、
連結手段が、両方の酵素が共有結合の形成によって化学
的に結合しているキャリヤ物質である。このキャリヤ物
質は、化学反応により酵素の結合を可能にする化学的官
能性を備えた合成ポリマーであることができる。これを
図１に例示する。適切なポリマーはポリエチレンイミン
（ＰＥＩ）であり、これは分枝鎖の末端にアミノ基を有
する分枝ポリマーである。これは本発明のさらに別の一
面となる。すなわち本発明のひとつの局面は、一方の酵
素が他方の酵素に対する基質を生成する２種の酵素であ
って、これら２種の酵素は両方とも、共有結合を介して
合成ポリマーに結合されている。グルコースオキシダー
ゼとホースラディッシュペルオキシダーゼはいずれも、
グリコシル側鎖（ｐｅｎｄａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌ
ｃｈａｉｎ）を有する酵素である。このような酵素はポ
リエチレンイミンと共有結合させることができる。その
ためには、まず最初に水溶液中で過ヨウ素酸塩を用いて
酵素を酸化してグリコシル側鎖中にアルデヒド基を発生
させる。これらの基は次に、アルカリ性ｐＨ（たとえば
ｐＨ９．５）でポリエチレンイミン上のアミノ基と共に
シッフ塩基を形成する。その後、水素化ホウ酸塩（ｂｏ
ｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）による還元反応を用いて、未反応
のアルデヒド基を還元すると共に、シッフ塩基の還元に
よって安定性を増大させることができる。これらの酵素
はまた同じ技法によって抗体に結合することもできる。
連結手段は、酵素が結合している少なくとも１つの抗体
（標的特異的抗体以外のものが好ましい）からなること
ができる。これらの酵素はそれぞれ対応する抗体に結合
していてもよいしまたは結合することができ、一方、こ
れらの抗体は抗原−抗体結合によって互いに結合するこ
とができる。この態様の一例を図２に示す。図では、酵
素が、異なる種に由来するそれぞれの抗体と化学的に結
合しており、これらの抗体の一方は他方の抗体に対する
抗原となっている。図２で、符号１０は、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼが結合しているラビットの抗−
ウシイムノグロブリンを表わす。符号１２は、グルコー
スオキシダーゼと結合したヒツジの抗−ラビットイムノ
グロブリンを表わす。これは抗体１０に結合しており、
したがって酵素同士を連結している。変形例を図３に示
す。ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ヤギの抗
−ラビットイムノグロブリンに化学的に結合している。
ヤギの抗体１４はラビットの抗−グルコースオキシダー
ゼ抗体１６に結合し、この抗体１６はグルコースオキシ
ダーゼに結合する。したがって、２つの酵素は抗体１
４、１６を介して互いに連結される。本発明に従って互
いに接続された２つの連結酵素は、この連結酵素を標的
に結合するために特別な手段がない場合でも、標的に対
する細胞殺傷活性を示すことができる。この理由は、単
に、酵素を互いに組合せると活性が高まるためにほかな
らないと考えらることができる。また、酵素と連結手段
との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が標的に対して固有の親
和性を有していることもあり得ることである。しかし、
連結された酵素が標的の部位とカップルすると好まし
い。２つの酵素と連結手段とで構成される複合体は、標
的部位に結合することができる抗体に結合していてもよ
いしまたはそのような抗体に結合することができる。こ
の結合は抗原−抗体結合によるのが望ましい。これによ
り、標的特異的抗体に対する化学結合を回避することが
できる。連結手段が１つ以上の抗体を含んでいる場合、
これらの抗体のひとつが、ビヒクル中に含まれている標
的特異的抗体に結合することができる能力をもっている
ことが可能である。これを図４と５に例示する。図４で
符号２０は標的Ｓ．ｍｕｔａｎｓを示しており、符号２
２は細胞表面の抗原部位を示している。符号２４は、本
発明の製品中に含まれているウシの抗−Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ抗体を示している。これが標的に結合し、図２に示し
た複合体のラビット抗−ウシ抗体１０がウシの抗体２４
に結合する。同様に、図５では、図３の複合体の抗体１
４がラビット抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体２６に結合し、
これが標的２０に結合する。一連の抗体を介して標的に
結合することは、本出願と同日付の別出願の主題であ
る。連結手段が図１に示したような合成ポリマーである
場合、そのようなポリマーと、共有結合を介してこれに
結合している両酵素との複合体は、さまざまな方法で標
的部位に結合することができるであろう。ひとつの可能
性は、本発明の製品が、前記酵素の一方に対する抗体、
標的に対する抗体、および、さらに別の抗体を含んでい
る場合である。この別の抗体は、前記酵素に対する抗体
と前記標的部位に対する抗体との双方に結合することに
よってブリッジを形成することができる。これを図６に
例示する。図６で、さまざまな符号は図５と同じ意味を
もっており、符号２８はヤギの抗−ラビットイムノグロ
ブリンを表わす。もうひとつの可能性は、本発明の製品
が、酵素の一方に結合すると共に標的に結合する抗体に
も結合する能力を有する２つの特異性を備えた二重抗体
複合体（ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）を含んでいる場合である。二重抗体複合体そ
のものは公知である。この態様を図７に例示する。符号
２４はＳ．ｍｕｔａｎｓ標的２０に対するウシの抗体を
表わす。符号３０は抗−ウシ抗体と抗−グルコースオキ
シダーゼ抗体の二重抗体複合体を表わしている。さらに
別の可能性は、ポリマーが標的に特有の抗原部位をもっ
ている場合であり、この抗原部位はポリマーに共有結合
している。目的とする標的に結合することができる抗体
はポリマー上のこれら抗原部位にも結合し、そうしてポ
リマーを標的部位とカップルさせることになるであろ
う。この態様を図８に例示する。符号３２はポリエチレ
ンイミンに結合している抗原を意味し、符号３４は標的
２０をこの抗原３２に結合させる抗−標的抗体を意味す
る。両酵素の連結および標的に対する結合は、抗体断片
を用いて実施することもできる。好ましい態様では、ひ
とつの抗体断片を標的部位に結合させ、この第一の断片
に酵素を結合させるのに１種以上の別の断片を利用す
る。標的部位に結合する第一の抗体断片は所望の標的に
対する抗体のＦｖ断片とすることができる。そのような
断片は抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域のみを含んでい
る。断片は、２つの結合部位を提供するＦ（ａｂ）２断
片とすることも可能である。あるいは、ひとつの抗体の
一方の鎖の単一の可変領域ほどの小さな部分であっても
よい。生物学的に活性な抗体断片をＥ．ｃｏｌｉ中で効
率的に生産する技術は、Ａ．ＳｋｅｖｉａおよびＡ．Ｐ
ｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４
０，１０３８；Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９
８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１；ならびに
Ｅ．Ｓ．Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９），Ｎａｔ
ｕｒｅ，３４１，５４４に記載されている。抗体断片を
コードしている遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中でクローニング
して発現させる技術もまた、ヨーロッパ特許出願公開第
３６８６８４号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されている。第一の抗体断片が
付加的なペプチド鎖をもっており、別の断片がこのペプ
チド鎖に酵素を結合させるようにするのが好ましい。Ｃ
末端にすでに結合した余分なペプチド鎖をもっている可
変領域を生産するような細菌を作成することができる。
これは標準的な遺伝子手法によって行なうことができ
る。たとえば、可変領域をコードしている遺伝子は、部
位特異的変異誘発法により、可変領域に結合させるべき
ペプチドをコードしているインビトロで合成したオリゴ
ヌクレオチドを用いて容易に延長することができる。部
位特異的変異誘発法はいまや広く使用されている手法で
あり、適切な手順は発行されたいくつかの単行本、たと
えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，（１９８９），Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉ
ｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記
載されている。付加した余分なペプチドは治療薬の結合
にとって極めて便利な「手段」となる。第一の断片に酵
素を結合させる別の抗体断片は、抗原−抗体結合によっ
て酵素に結合することができる第二の抗体断片、および
第一の抗体断片と第二の抗体断片とに結合することがで
き、特に第一および第二抗体断片に結合している抗原性
のペプチドに結合することができるＦ（ａｂ）２断片
（これは二価である）が好ましい。図９に、抗体断片を
利用する好ましい態様を例示する。抗原部位４２を有す
る標的４０に結合するにはＦｖ抗体断片４４を使用す
る。この抗体断片４４では、いくつか繰返されるペプチ
ド４６がＦｖ断片４４の２つの鎖のうちの一方の鎖の端
部（Ｃ末端）に結合している。グルコースオキシダーゼ
（Ｇ．Ｏｘ）とホースラディッシュペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）には、それぞれ対応するＦｖ断片４８、５０
が結合する。このＦｖ断片４８、５０はそれぞれの酵素
に対する特異性をもっており、かつ、同じペプチドの単
一の繰返し４６がこのＦｖ断片の一方の鎖に結合してい
る。抗−酵素Ｆｖ断片４８、５０に結合しているペプチ
ド４６はこれらのペプチドに特異的に結合するＦ（ａ
ｂ）２断片５２によって抗−標的Ｆｖ断片上のペプチド
４６に連結されるようになる。Ｆ（ａｂ）２断片は二価
であるので、酵素に結合した抗−酵素断片を抗−標的断
片４４に結合するブリッジを形成することができる。本
発明の範囲内で、両酵素はひとつの標的部位に結合し
て、互いに連結されるようになるがそれ以上直接には連
結されないようにすることが可能である。この種の態様
を図１０と１１に示す。図１０で、符号１０は、抗原部
位２２を有する標的Ｓ．ｍｕｔａｎｓを表わす。符号５
４は、グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）が結合して
いる抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体を表わす。符号５６は、
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合
している抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体を表わす。図１１で
は、多重抗体を使用しているために化学結合の必要性が
回避されている。符号２６はラビットの抗−Ｓ．ｍｕｔ
ａｎｓ抗体を表わす。符号１６は酵素グルコースオキシ
ダーゼに結合するラビットの抗−グルコースオキシダー
ゼを表わす。符号５８は、ホースラディッシュペルオキ
シダーゼに結合するラビットの抗−ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼを表わす。符号２８は、ヤギの抗−ラ
ビットイムノグロブリンを表わし、これは抗体１６と５
８を抗−標的抗体２６に結合させる働きをする。図１２
は、両方の酵素が単一の抗体（これは標的にも結合す
る）に化学的に結合している別の態様を示している。本
発明で使用する抗体はポリクローナルでもモノクローナ
ルでもよい。ある特異性をもった抗体とこれとは異なる
特異性をもった別の抗体とを共に使用する場合、一方の
抗体をモノクローナルとし、他方の抗体をポリクローナ
ルとすることが可能である。複数のポリクローナル抗体
を使用する場合、酵素と抗体を本発明の製品中の２つ以
上のビヒクル間に分配して、使用時まで酵素と抗体両方
の完全な複合体が形成しないようにするのが望ましいこ
とが分かるであろう。ポリクローナル抗体との大きな複
合体は貯蔵中、標的部位に結合する能力が低下し易いこ
とが判明している。モノクローナル抗体を使用すれば、
複合体の構成成分を複数のビヒクル間に分配する必要は
ないであろう。一般に、モノクローナル抗体は小さめの
複合体を形成し、貯蔵中ポリクローナル抗体との間で形
成される複合体より活性保持が良好であると期待され
る。これは、抗体断片を使用する場合にもいえることで
ある。抗体断片の利点は、抗原−抗体結合によって形成
される複合体がかなり小さくて全抗体との間で形成され
る複合体より安定であるということである。製品が２種
のビヒクル間に分配された両酵素と１種以上の抗体とを
有する場合、一方のビヒクルが標的に結合することがで
きる抗体を含み、他方のビヒクルが両酵素とそれらを互
いに連結する手段とを、おそらくは予備的に形成された
複合体として含むことができよう。両酵素、それらを連
結する手段、および／または１種以上の抗体もしくは抗
体断片を含む１つ以上のビヒクルからなる製品はいろい
ろな形態をとることができよう。標的部位が口の中であ
れば、うがい薬、練り歯磨および口の中で溶ける薬用ド
ロップが考えられる。これらの製品形態は複数のビヒク
ルが必要な場合にも使用することができよう。たとえ
ば、製品は、ユーザーが使用の直前に混合する２成分型
のうがい薬とすることができよう。製品は２つの成分を
有する練り歯磨とすることもできる。これは、別々に保
存するかまたは少なくとも混合しないでおくが、ユーザ
ーの口の中では一緒に分配されて混合するように、練り
歯磨容器中に貯蔵される。このような２成分型の練り歯
磨製品そのものは公知である。複数のビヒクルを使用す
る製品の別の可能な形態は口の中でなめる薬用ドロップ
であろう。このような薬用ドロップには別々の部分にい
ろいろな成分を含ませることができる。複数のビヒクル
を使用する方法として、２種のビヒクル形態を組合せて
使用することもできよう。たとえば、練り歯磨の後にう
がい薬または薬用ドロップを使用することができる。本
発明の製品は、酵素によって発生する中間体とは別に、
酵素に対する基質をいくつかまたはすべて含んでいても
よいし、あるいは標的部位に存在する酵素基質のいくつ
かまたはすべてを利用することもできる。したがって、
グルコースオキシダーゼを使用し、標的部位が口内であ
る場合、本発明の製品は酵素基質として食餌のグルコー
スを利用することもできるし、あるいはグルコースオキ
シダーゼとは別にグルコースを含んでいてもよい。
【実施例】本発明の系のインビトロでの有効性を立証す
る以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明す
る。以下の実施例で「ＰＢＳ」は特に断わらない限りｐ
Ｈが８のリン酸塩緩衝生理食塩水を意味する。希釈度は
「１／ｎ」の形で表わすが、これはある量の出発溶液を
希釈剤と混合して、濃度が出発溶液のｎ分の１になった
溶液を得たことを意味する。実施例１ ：第１部─使用した材料 ラビット抗−ウシイムノグロブリンに結合（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）したホースラディッシュペルオキシダーゼは
市販品である（Ｓｉｇｍａ）。ヒツジ抗−ラビットイム
ノグロブリンに結合したグルコースオキシダーゼも市販
品である（Ｓｅｒｏｔｅｃ）。ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓは以下のようにして調製した。すなわち、Ｓ．ｍｕｔ
ａｎｓをＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで一晩培養し、
培養細胞を熱で殺し、無菌生理食塩水およびヒュームド
シリカ（Ｇａｓｉｌ）アジュバントと混合して、１ｍｌ
中にＧａｓｉｌを０．１ｇと細胞を１０８個含む溶液を
作成し、この溶液２ｍｌをコウシの筋肉内に注射し、３
週間後同様な注射をし、さらに２週間後全血から抗血清
を抽出した。ラビット抗−ウシイムノグロブリン（比較
のために使用）も市販品である（Ｓｉｇｍａ）。試薬溶
液と洗浄用に使用したＰＢＳはすべて、界面活性剤Ｔｗ
ｅｅｎ２０（すなわちポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート）を０．１５％ｖ／ｖ含んでい
た。実施例１ ：第２部─手順Ｓ．ｍｕｔａｎｓ をウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓに暴露し
た後、このウシ抗体を介してＳ．ｍｕｔａｎｓに結合す
る細胞殺傷性複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する材料
に暴露するという実験手順を実施した。コントロール
は、以下の手順の適当なステップを省くかまたは変更し
て実施した。手順は次の一連のステップからなる。 １． Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで培養したＳ．ｍ
ｕｔａｎｓの細胞試料１０ｍｌを無菌のＭｃＣａｒｔｎ
ｅｙボトルに移した。細菌を遠心にかけてペレットと
し、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸
濁した。 ２． ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液１ｍｌを加え
た。この懸濁液は、ｐＨ９のＰＢＳ中で全血清濃度１／
１０に希釈し、▲ろ▼過により滅菌したものである。コ
ントロールでは、ｐＨ８のＰＢＳを１ｍｌ加えた。 ３． この懸濁液を室温で１時間インキュベートした
後、前と同様にして細胞を遠心にかけてペレットとし、
ＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。 ４． ▲ろ▼過滅菌したホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ／ラビット抗−ウシ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）（ｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈）を１ｍｌ加え
て、最終希釈度を１／１００とした。室温で２０分イン
キュベートした後、前と同様にして細胞を遠心してペレ
ットにし、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳ
に再懸濁した。コントロールでは、複合体の代わりにＰ
ＢＳを１ｍｌ加えた。比較実験では、複合体の代わりに
ラビット抗−ウシイムノグロブリンを使用した。 ５． ここで、▲ろ▼過滅菌したグルコースオキシダー
ゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体（ｐＨ８のＰＢＳで１／
１０に希釈）を１ｍｌ加えて、添加後の最終希釈度を１
／１００とした。懸濁液を再度室温で２０分インキュベ
ートした後、細胞を遠心してペレットにし、ＰＢＳで三
回洗った。 ６． 細胞を、ヨウ化カリウム１５μｇ／ｍｌとＤ−グ
ルコース５％ｗ／ｖとを含有する▲ろ▼過滅菌したＰＢ
Ｓ（ｐＨ６．５）１０ｍｌに再懸濁した。 ７． 得られた懸濁液を３７℃で２４時間インキュベー
トした。混合直後およびその後一定間隔で０．５ｍｌの
サンプルを採取した。各サンプルを遠心してペレットに
することによって細菌を分離し、このペレットをＰＢＳ
で三回洗った。各サンプル中で生存する細胞をＭｉｌｅ
ｓ，Ｍｉｓｒａ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ，Ｊ．Ｈｙｇｉｅ
ｎｅ，３８，７３２−７４９（１９３８）の方法で分析
した。加えた材料の組合せと生存細胞のカウント数を下
記表に示す。 ８． 双方の酵素が同時に細胞に結合しているかどうか
確認するために、ステップ６で得られた懸濁液のサンプ
ルを比色法で分析した。すなわち、細胞を４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心した後、３ｍｌのＰＢＳにペレットを再
懸濁して再度遠心することによって三回洗浄した。最後
の遠心の後、グルコース１００ｍＭとテトラメチルベン
ジジン１μｇ／ｍｌとを含有する０．５ｍｌのＰＢＳに
細胞を再懸濁した。この系では、グルコースオキシダー
ゼとペルオキシダーゼが共に存在する場合のみ発色す
る。５分間発色させた後、０．２ＭのＨＣｌを５０μｌ
添加して発色を停止させた。光学密度を測定した。これ
も表１に示す。
る以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明す
る。以下の実施例で「ＰＢＳ」は特に断わらない限りｐ
Ｈが８のリン酸塩緩衝生理食塩水を意味する。希釈度は
「１／ｎ」の形で表わすが、これはある量の出発溶液を
希釈剤と混合して、濃度が出発溶液のｎ分の１になった
溶液を得たことを意味する。実施例１ ：第１部─使用した材料 ラビット抗−ウシイムノグロブリンに結合（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）したホースラディッシュペルオキシダーゼは
市販品である（Ｓｉｇｍａ）。ヒツジ抗−ラビットイム
ノグロブリンに結合したグルコースオキシダーゼも市販
品である（Ｓｅｒｏｔｅｃ）。ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓは以下のようにして調製した。すなわち、Ｓ．ｍｕｔ
ａｎｓをＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで一晩培養し、
培養細胞を熱で殺し、無菌生理食塩水およびヒュームド
シリカ（Ｇａｓｉｌ）アジュバントと混合して、１ｍｌ
中にＧａｓｉｌを０．１ｇと細胞を１０８個含む溶液を
作成し、この溶液２ｍｌをコウシの筋肉内に注射し、３
週間後同様な注射をし、さらに２週間後全血から抗血清
を抽出した。ラビット抗−ウシイムノグロブリン（比較
のために使用）も市販品である（Ｓｉｇｍａ）。試薬溶
液と洗浄用に使用したＰＢＳはすべて、界面活性剤Ｔｗ
ｅｅｎ２０（すなわちポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート）を０．１５％ｖ／ｖ含んでい
た。実施例１ ：第２部─手順Ｓ．ｍｕｔａｎｓ をウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓに暴露し
た後、このウシ抗体を介してＳ．ｍｕｔａｎｓに結合す
る細胞殺傷性複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する材料
に暴露するという実験手順を実施した。コントロール
は、以下の手順の適当なステップを省くかまたは変更し
て実施した。手順は次の一連のステップからなる。 １． Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで培養したＳ．ｍ
ｕｔａｎｓの細胞試料１０ｍｌを無菌のＭｃＣａｒｔｎ
ｅｙボトルに移した。細菌を遠心にかけてペレットと
し、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸
濁した。 ２． ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液１ｍｌを加え
た。この懸濁液は、ｐＨ９のＰＢＳ中で全血清濃度１／
１０に希釈し、▲ろ▼過により滅菌したものである。コ
ントロールでは、ｐＨ８のＰＢＳを１ｍｌ加えた。 ３． この懸濁液を室温で１時間インキュベートした
後、前と同様にして細胞を遠心にかけてペレットとし、
ＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。 ４． ▲ろ▼過滅菌したホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ／ラビット抗−ウシ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）（ｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈）を１ｍｌ加え
て、最終希釈度を１／１００とした。室温で２０分イン
キュベートした後、前と同様にして細胞を遠心してペレ
ットにし、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳ
に再懸濁した。コントロールでは、複合体の代わりにＰ
ＢＳを１ｍｌ加えた。比較実験では、複合体の代わりに
ラビット抗−ウシイムノグロブリンを使用した。 ５． ここで、▲ろ▼過滅菌したグルコースオキシダー
ゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体（ｐＨ８のＰＢＳで１／
１０に希釈）を１ｍｌ加えて、添加後の最終希釈度を１
／１００とした。懸濁液を再度室温で２０分インキュベ
ートした後、細胞を遠心してペレットにし、ＰＢＳで三
回洗った。 ６． 細胞を、ヨウ化カリウム１５μｇ／ｍｌとＤ−グ
ルコース５％ｗ／ｖとを含有する▲ろ▼過滅菌したＰＢ
Ｓ（ｐＨ６．５）１０ｍｌに再懸濁した。 ７． 得られた懸濁液を３７℃で２４時間インキュベー
トした。混合直後およびその後一定間隔で０．５ｍｌの
サンプルを採取した。各サンプルを遠心してペレットに
することによって細菌を分離し、このペレットをＰＢＳ
で三回洗った。各サンプル中で生存する細胞をＭｉｌｅ
ｓ，Ｍｉｓｒａ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ，Ｊ．Ｈｙｇｉｅ
ｎｅ，３８，７３２−７４９（１９３８）の方法で分析
した。加えた材料の組合せと生存細胞のカウント数を下
記表に示す。 ８． 双方の酵素が同時に細胞に結合しているかどうか
確認するために、ステップ６で得られた懸濁液のサンプ
ルを比色法で分析した。すなわち、細胞を４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心した後、３ｍｌのＰＢＳにペレットを再
懸濁して再度遠心することによって三回洗浄した。最後
の遠心の後、グルコース１００ｍＭとテトラメチルベン
ジジン１μｇ／ｍｌとを含有する０．５ｍｌのＰＢＳに
細胞を再懸濁した。この系では、グルコースオキシダー
ゼとペルオキシダーゼが共に存在する場合のみ発色す
る。５分間発色させた後、０．２ＭのＨＣｌを５０μｌ
添加して発色を停止させた。光学密度を測定した。これ
も表１に示す。
【表１】 表から明らかなように、細胞は通常それに対する抗体の
存在下で生存する（実験Ａ）。グルコースオキシダーゼ
複合体が存在すると（実験Ｇ。ただし、Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ細胞に結合できない）細胞殺傷効果を示す。この複合
体は、標的であるＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞に結合すると
（実験Ｄ）それより大きい細胞殺傷効果を示す。驚くべ
きことに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体
はグルコースオキシダーゼなしでも多少の細胞殺傷効果
を示した（実験Ｆ）。実験Ｃでは、両方の複合体が存在
しており、一緒に複合体を形成することができた。実験
Ｃは、両方の複合体が存在しており、一緒に複合体を形
成することができたことを示している。したがってこの
実験では、両方の複合体が存在しており、一緒に連結さ
れていた。細胞の殺傷がみられ、その細胞殺傷効果は、
結合していないグルコースオキシダーゼ複合体が存在す
る場合（実験Ｇ）またはホースラディッシュペルオキシ
ダーゼが単独で標的に結合している場合（実験Ｆ）より
も高かった。両方の複合体が互いに結合できると共に標
的細胞にも結合できるように必要なすべての成分を含ん
でいる実験Ｂでは、さらに高い細胞殺傷効果が得られ
る。生存細胞の数は２時間以内に劇的に低下し、最終的
にはゼロになった。実施例２ 実施例１の手順を繰返した。ただし、グルコースオキシ
ダーゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体の希釈度を２種類に
変えた。すなわち、いくつかの実験では、使用した複合
体はｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈し、添加後の最終
希釈度が１／１００となるようにした。他の実験では、
複合体は１／１６０の希釈度で使用して、添加後の最終
希釈が１／１６００となるようにした。添加した材料の
組合せと生存細胞のカウントならびに比色法による光学
密度を下記表に示す。
存在下で生存する（実験Ａ）。グルコースオキシダーゼ
複合体が存在すると（実験Ｇ。ただし、Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ細胞に結合できない）細胞殺傷効果を示す。この複合
体は、標的であるＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞に結合すると
（実験Ｄ）それより大きい細胞殺傷効果を示す。驚くべ
きことに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体
はグルコースオキシダーゼなしでも多少の細胞殺傷効果
を示した（実験Ｆ）。実験Ｃでは、両方の複合体が存在
しており、一緒に複合体を形成することができた。実験
Ｃは、両方の複合体が存在しており、一緒に複合体を形
成することができたことを示している。したがってこの
実験では、両方の複合体が存在しており、一緒に連結さ
れていた。細胞の殺傷がみられ、その細胞殺傷効果は、
結合していないグルコースオキシダーゼ複合体が存在す
る場合（実験Ｇ）またはホースラディッシュペルオキシ
ダーゼが単独で標的に結合している場合（実験Ｆ）より
も高かった。両方の複合体が互いに結合できると共に標
的細胞にも結合できるように必要なすべての成分を含ん
でいる実験Ｂでは、さらに高い細胞殺傷効果が得られ
る。生存細胞の数は２時間以内に劇的に低下し、最終的
にはゼロになった。実施例２ 実施例１の手順を繰返した。ただし、グルコースオキシ
ダーゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体の希釈度を２種類に
変えた。すなわち、いくつかの実験では、使用した複合
体はｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈し、添加後の最終
希釈度が１／１００となるようにした。他の実験では、
複合体は１／１６０の希釈度で使用して、添加後の最終
希釈が１／１６００となるようにした。添加した材料の
組合せと生存細胞のカウントならびに比色法による光学
密度を下記表に示す。
【表２】 表２から明らかなように、細胞はそれに対する抗体の存
在下で生存し（実験Ａ）、ペルオキシダーゼが存在しな
い場合希釈度の高い（すなわち濃度が低い）グルコース
オキシダーゼ複合体は細胞殺傷活性がほとんどない（実
験ＦとＧ）。実験ＣとＥでは、ペルオキシダーゼ複合体
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とグルコースオキシダーゼ複合
体との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が存在しているので、
いずれも連結された酵素を使用した。どちらの実験でも
細胞殺傷は見られたが、希釈されたグルコースオキシダ
ーゼ複合体を用いた実験Ｅでは、それより濃度の高いグ
ルコースオキシダーゼ複合体を使用した実験Ｃより細胞
殺傷力がずっと弱かった。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ細胞に結合
した複合体（実験ＢとＤ）では細胞殺傷がずっと速かっ
た。稀薄なグルコースオキシダーゼ複合体との複合体が
結合していると（実験Ｄ）極めて有効であることは注目
に値する。実施例３ 本実施例では、グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）と
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とを分
子量５０，０００〜６０，０００のポリエチレンイミン
（Ａｌｄｒｉｃｈ製）に共有結合させた例を示す。共有
結合させるには、酵素のグリコシル側鎖を過ヨウ素酸塩
で酸化してアルデヒド基を発生させ、これをＰＥＩのア
ミノ基と反応させる。次に、これらの化学的結合体（シ
ッフ塩基）をホウ水素化ナトリウムで還元して安定化す
る。これにより、同時に未使用の反応性アルデビド基が
（アルコールに酸化されて）除去されてそれ以後の化学
カップリングが防止される。 第１部：二元酵素／ＰＥＩ複合体の調製 １．酵素の酸化 Ｇ．Ｏｘ（１０ｍｇ）を２．０ｍｌの蒸溜水に溶かした
後、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの新たに調製した０．１
Ｍ蒸溜水溶液０．２ｍｌと混合した。この混合物を室温
の暗所で２０分間撹拌した後、１ｍＭの酢酸ナトリウム
／酢酸緩衝液（ｐＨ４．４、１リットル）に対して４℃
で一晩透析した。同様な方法でＨＲＰを酸化した。ただ
し、蒸溜水２ｍｌ中で２．５ｍｇの濃度とした。 ２．酸化された酵素とＰＥＩとの結合 酸化された酵素の各溶液に０．２Ｍの炭酸ナトリウム／
重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）を０．０５ｍｌ添加する
ことによって、酵素溶液のｐＨを上昇させた。この時点
で、酸化されたＧ．Ｏｘ溶液０．２ｍｌを、０．０１Ｍ
炭酸ナトリウム／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に溶
かしたＰＥＩの１００μｇ／ｍｌ溶液０．２ｍｌと混合
した。この混合物を暗所で周囲温度に３０分間保った。
そこで、酸化されたＨＲＰを０．２ｍｌ加え、反応をさ
らに２時間続けた（暗所中で）。この段階の終了時にホ
ウ水素化ナトリウムの５ｍｇ／ｍｌ蒸溜水溶液を０．０
３ｍｌ加えて反応を停止させた。 第２部：ＤＥＰＥＩ複合体がＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞を攻
撃することが立証された。 （先の実施例に記載したようにして）培養したＳ．ｍｕ
ｔａｎｓ細胞を遠心とＰＢＳへの再懸濁により洗浄（４
回）し、最後に最初の容積のＰＢＳに再懸濁した。この
細菌懸濁液のサンプル（０．２ｍｌ）を、１％ウシ血清
アルブミンと０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する等容
積のＰＢＳ（ＰＢＳＴ／ＢＳＡ）と混合し、周囲温度に
３０分保ち、遠心により沈降させた後、ＰＢＳＴ／ＢＳ
Ａ（ｐＨ８．０）中で１／５０に希釈したＤＥＰＥＩ複
合体溶液に再懸濁した。このＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞とＤ
ＥＰＥＩ複合体を周囲温度で３０分接触させておいた
後、細胞を沈降させ、ＰＢＳＴ／ＢＳＡに３回再懸濁し
た。同等のコントロールサンプルを同じ手順にかけた。
しかし、ＤＥＰＥＩ複合体はまったく添加しなかった。
細胞の表面に結合したＤＥＰＥＩの存在を立証するため
に、沈降したペレットを、０．１Ｍリン酸塩／クエン酸
塩緩衝液（ｐＨ６．５）中にテトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）とグルコースを含む溶液０．５
ｍｌ（ＴＭＢは１００μｇ／ｍｌ、グルコースは２７ｍ
ｇ／ｍｌ）に再懸濁した。この混合物を周囲温度に５分
間維持した後、細胞を遠心してペレットにし、上清液の
サンプル０．２ｍｌをマイクロタイタープレートに移し
た。２Ｍ塩酸を０．０５ｍｌ加えた後、上清液の光学密
度を測定した。光学密度は、次の通りであった。 実験サンプル １．０７ コントロール（ＤＥＰＥＩなし） ０．０１ ＤＥＰＥＩ複合体の溶液のｐＨを変えてこの実験を繰り
返した。５．５〜７．５のｐＨを使用すると、光学密度
が多少上昇することが判明した。これは結合が多くなっ
ていることを示している。ｐＨが８．５以上になると、
光学密度は急激に低下した。塩化ナトリウムを添加して
イオン強度を変化させても結合の程度に影響が出た。こ
れは、ＤＥＰＥＩのＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞に対する結合
がイオン性の相互作用であることを示している。
在下で生存し（実験Ａ）、ペルオキシダーゼが存在しな
い場合希釈度の高い（すなわち濃度が低い）グルコース
オキシダーゼ複合体は細胞殺傷活性がほとんどない（実
験ＦとＧ）。実験ＣとＥでは、ペルオキシダーゼ複合体
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とグルコースオキシダーゼ複合
体との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）が存在しているので、
いずれも連結された酵素を使用した。どちらの実験でも
細胞殺傷は見られたが、希釈されたグルコースオキシダ
ーゼ複合体を用いた実験Ｅでは、それより濃度の高いグ
ルコースオキシダーゼ複合体を使用した実験Ｃより細胞
殺傷力がずっと弱かった。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ細胞に結合
した複合体（実験ＢとＤ）では細胞殺傷がずっと速かっ
た。稀薄なグルコースオキシダーゼ複合体との複合体が
結合していると（実験Ｄ）極めて有効であることは注目
に値する。実施例３ 本実施例では、グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）と
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とを分
子量５０，０００〜６０，０００のポリエチレンイミン
（Ａｌｄｒｉｃｈ製）に共有結合させた例を示す。共有
結合させるには、酵素のグリコシル側鎖を過ヨウ素酸塩
で酸化してアルデヒド基を発生させ、これをＰＥＩのア
ミノ基と反応させる。次に、これらの化学的結合体（シ
ッフ塩基）をホウ水素化ナトリウムで還元して安定化す
る。これにより、同時に未使用の反応性アルデビド基が
（アルコールに酸化されて）除去されてそれ以後の化学
カップリングが防止される。 第１部：二元酵素／ＰＥＩ複合体の調製 １．酵素の酸化 Ｇ．Ｏｘ（１０ｍｇ）を２．０ｍｌの蒸溜水に溶かした
後、メタ過ヨウ素酸ナトリウムの新たに調製した０．１
Ｍ蒸溜水溶液０．２ｍｌと混合した。この混合物を室温
の暗所で２０分間撹拌した後、１ｍＭの酢酸ナトリウム
／酢酸緩衝液（ｐＨ４．４、１リットル）に対して４℃
で一晩透析した。同様な方法でＨＲＰを酸化した。ただ
し、蒸溜水２ｍｌ中で２．５ｍｇの濃度とした。 ２．酸化された酵素とＰＥＩとの結合 酸化された酵素の各溶液に０．２Ｍの炭酸ナトリウム／
重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）を０．０５ｍｌ添加する
ことによって、酵素溶液のｐＨを上昇させた。この時点
で、酸化されたＧ．Ｏｘ溶液０．２ｍｌを、０．０１Ｍ
炭酸ナトリウム／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に溶
かしたＰＥＩの１００μｇ／ｍｌ溶液０．２ｍｌと混合
した。この混合物を暗所で周囲温度に３０分間保った。
そこで、酸化されたＨＲＰを０．２ｍｌ加え、反応をさ
らに２時間続けた（暗所中で）。この段階の終了時にホ
ウ水素化ナトリウムの５ｍｇ／ｍｌ蒸溜水溶液を０．０
３ｍｌ加えて反応を停止させた。 第２部：ＤＥＰＥＩ複合体がＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞を攻
撃することが立証された。 （先の実施例に記載したようにして）培養したＳ．ｍｕ
ｔａｎｓ細胞を遠心とＰＢＳへの再懸濁により洗浄（４
回）し、最後に最初の容積のＰＢＳに再懸濁した。この
細菌懸濁液のサンプル（０．２ｍｌ）を、１％ウシ血清
アルブミンと０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する等容
積のＰＢＳ（ＰＢＳＴ／ＢＳＡ）と混合し、周囲温度に
３０分保ち、遠心により沈降させた後、ＰＢＳＴ／ＢＳ
Ａ（ｐＨ８．０）中で１／５０に希釈したＤＥＰＥＩ複
合体溶液に再懸濁した。このＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞とＤ
ＥＰＥＩ複合体を周囲温度で３０分接触させておいた
後、細胞を沈降させ、ＰＢＳＴ／ＢＳＡに３回再懸濁し
た。同等のコントロールサンプルを同じ手順にかけた。
しかし、ＤＥＰＥＩ複合体はまったく添加しなかった。
細胞の表面に結合したＤＥＰＥＩの存在を立証するため
に、沈降したペレットを、０．１Ｍリン酸塩／クエン酸
塩緩衝液（ｐＨ６．５）中にテトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ）とグルコースを含む溶液０．５
ｍｌ（ＴＭＢは１００μｇ／ｍｌ、グルコースは２７ｍ
ｇ／ｍｌ）に再懸濁した。この混合物を周囲温度に５分
間維持した後、細胞を遠心してペレットにし、上清液の
サンプル０．２ｍｌをマイクロタイタープレートに移し
た。２Ｍ塩酸を０．０５ｍｌ加えた後、上清液の光学密
度を測定した。光学密度は、次の通りであった。 実験サンプル １．０７ コントロール（ＤＥＰＥＩなし） ０．０１ ＤＥＰＥＩ複合体の溶液のｐＨを変えてこの実験を繰り
返した。５．５〜７．５のｐＨを使用すると、光学密度
が多少上昇することが判明した。これは結合が多くなっ
ていることを示している。ｐＨが８．５以上になると、
光学密度は急激に低下した。塩化ナトリウムを添加して
イオン強度を変化させても結合の程度に影響が出た。こ
れは、ＤＥＰＥＩのＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞に対する結合
がイオン性の相互作用であることを示している。
【図１】ポリエチレンイミンによって連結された２つの
酵素を示している。
酵素を示している。
【図２】および
【図３】それぞれ、抗体によって互いに連結された２つ
の酵素を示している。
の酵素を示している。
【図４】〜
【図８】それぞれ、標的に結合している上記複合体のひ
とつを示している。
とつを示している。
【図９】互いに連結されており、抗体断片によって標的
に結合している２つの酵素を示している。
に結合している２つの酵素を示している。
【図１０】および
【図１１】それぞれ、標的を介して連結されている酵素
を示している。
を示している。
【図１２】標的特異的抗体によって連結された酵素を示
している。
している。
Ｇ．Ｏｘ グルコースオキシダーゼ、 ＨＲＰ ホースラディッシュペルオキシダーゼ、 ＰＥＩ ポリエチレンイミン、 １０ ラビット抗−ウシイムノグロブリン、 １２ ヒツジ抗−ラビットイムノグロブリン、 １４ ヤギ抗−ラビットイムノグロブリン、 １６ ラビット抗−グルコースオキシダーゼ抗体、 ２０ 標的（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、 ２２ 抗原部位、 ２４ ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、 ２６ ラビット抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、 ２８ ヤギ抗−ラビットイムノグロブリン、 ３０ 抗−ウシ抗体／抗−グルコースオキシダーゼ抗体
二重抗体複合体、 ３２ 抗原、 ３４ 抗−標的抗体、 ４０ 標的、 ４２ 抗原部位、 ４４ 抗−標的Ｆｖ断片、 ４６ ペプチド、 ４８、５０ 抗−酵素Ｆｖ断片、 ５２ Ｆ（ａｂ）２断片。 ５４、５６ 抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、 ５８ ラビット抗−ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ抗体。
二重抗体複合体、 ３２ 抗原、 ３４ 抗−標的抗体、 ４０ 標的、 ４２ 抗原部位、 ４４ 抗−標的Ｆｖ断片、 ４６ ペプチド、 ４８、５０ 抗−酵素Ｆｖ断片、 ５２ Ｆ（ａｂ）２断片。 ５４、５６ 抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、 ５８ ラビット抗−ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ抗体。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/08 7823−4Ｂ
Claims (17)
- 【請求項１】 １つ以上のビヒクルを含む製品であっ
て、 ｉ） 標的に対して活性をもつ物質を発生させる酵素
と、この第一の酵素に対する基質となる中間体を発生さ
せる第二の酵素とからなる２種類の酵素のうちの少なく
とも１種、および ｉｉ） 少なくとも使用時に前記酵素を互いにカップル
させる連結手段が、前記ビヒクルの１つに含まれている
か、または複数のビヒクル間に分配されている製品。 - 【請求項２】 第一の酵素が過酸化水素を発生させるオ
キシダーゼであり、第二の酵素がペルオキシダーゼであ
る、請求項１に記載の製品。 - 【請求項３】 前記酵素を両方とも含んでいる、請求項
１または２に記載の製品。 - 【請求項４】 連結手段が両方の酵素に結合しているか
または結合することができて、この連結手段自体が両酵
素間を接続する役割を果たす、請求項１〜３のいずれか
に記載の製品。 - 【請求項５】 連結手段が、標的細胞を介するかまたは
標的細胞に直接結合する単一の抗体を介する以外の方法
で酵素を互いにカップルさせる、請求項１〜４のいずれ
かに記載の製品。 - 【請求項６】 連結手段が、酵素が結合している１つ以
上の抗体からなる、請求項４または５に記載の製品。 - 【請求項７】 各酵素がそれぞれの抗体に結合してお
り、これらの抗体が抗原−抗体結合によって互いに結合
している、請求項６に記載の製品。 - 【請求項８】 少なくとも１種の酵素がそれに対応する
抗体に化学的に結合している、請求項７に記載の製品。 - 【請求項９】 連結手段が、両方の酵素が化学的に結合
しているキャリヤ物質である、請求項４または５に記載
の製品。 - 【請求項１０】 キャリヤ物質がポリエチレンイミンで
ある、請求項９に記載の製品。 - 【請求項１１】 連結手段と２種の酵素からなる複合体
が、標的部位に結合することができる抗体または抗体断
片に結合しているかまたは結合することができる、請求
項４〜１０のいずれかに記載の製品。 - 【請求項１２】 前記複合体と、標的部位に結合するこ
とができる抗体または抗体断片との結合が、抗原−抗体
結合を介して行なわれる、請求項１１に記載の製品。 - 【請求項１３】 標的が口内細菌種である、請求項１〜
１２のいずれかに記載の製品。 - 【請求項１４】 前記１つまたは複数のビヒクルが口内
で使用可能である、請求項１〜１３のいずれかに記載の
製品。 - 【請求項１５】 練り歯磨、うがい薬もしくは薬用ドロ
ップであるか、または少なくとも１つのビヒクルが練り
歯磨、うがい薬もしくは薬用ドロップによって提供され
る、請求項１４に記載の製品。 - 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれかに記載の製
品を標的の付近に搬送することからなる、標的を攻撃す
る方法。 - 【請求項１７】 標的を攻撃する方法であって、 ｉ） 標的に対して活性のある物質を発生させる酵素
と、この第一の酵素に対する基質となる中間体を発生さ
せる第二の酵素とからなる２種類の酵素のうちの少なく
とも１種、および ｉｉ） 少なくとも使用時に酵素を互いにカップルさせ
る連結手段を標的の付近に搬送することからなる方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909006329A GB9006329D0 (en) | 1990-03-21 | 1990-03-21 | Cell killing |
| GB9006329.8 | 1990-03-21 | ||
| GB9021671.4 | 1990-10-05 | ||
| GB909021671A GB9021671D0 (en) | 1990-10-05 | 1990-10-05 | Delivery of agents |
Publications (1)
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| ES2366100T3 (es) | 1999-02-22 | 2011-10-17 | Georgetown University | Inmunoliposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo para la administración sistémica de genes. |
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|---|---|---|---|---|
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| AU4402589A (en) * | 1988-09-28 | 1990-04-18 | Ideon Corporation | Combination enzyme immunotherapeutics |
| WO1991000112A1 (en) * | 1989-06-30 | 1991-01-10 | Brunswick Corporation | Antibody-lactate oxidase conjugates |
| FR2651433B1 (fr) * | 1989-09-07 | 1994-01-14 | Dominique Dana | Complexe enzymatique a activite sur le tartre et la carie dentaire. |
| AU642979B2 (en) * | 1990-03-21 | 1993-11-04 | Quest International B.V. | Utilization and delivery of enzymes |
| AU5544090A (en) * | 1990-04-26 | 1991-11-11 | Ringdal Patenter A/S | Activating unit for weapon |
-
1991
- 1991-03-18 AU AU72997/91A patent/AU642980B2/en not_active Ceased
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- 1991-03-20 AT AT91302396T patent/ATE138579T1/de active
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- 1991-03-21 IN IN85BO1991 patent/IN172887B/en unknown
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|---|---|---|---|---|
| JP2003509438A (ja) * | 1999-09-16 | 2003-03-11 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 抗フケ剤の送達システム |
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| CA2038579C (en) | 1998-06-23 |
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