JPH0570369A - 避妊ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 避妊を効果的に達成することができる避妊ワ
クチンを提供する。 【構成】 ブタ卵透明帯ＰＺＰ−４抗原を免疫原として
含む避妊ワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト及び動物の避妊ワ
クチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】避妊ワクチンによる避妊法は従来の避妊
法であるピル、ＩＵＤ、コンドーム、リズム法、不妊手
術等による方法とは異なり免疫学的避妊法である。従来
より、卵透明帯は避妊ワクチンのワクチン抗原に成り得
る可能性があることが知られている。すなわち、卵透明
帯をワクチン抗原として投与すると該抗原に対する抗体
が生成されることにより受精が阻害されて避妊が可能と
なるものである。

【０００３】卵透明帯の中では一般的にブタの卵透明帯
がワクチン抗原として研究されている。ワクチンとして
は、ブタの卵透明帯の全成分（ＰＺＰ−１；M. W. 80 -
90K、ＰＺＰ−２；M. W. 60 - 65K、ＰＺＰ−３；M.
W. 55K 、 ＰＺＰ−４；M. W. 20 - 25K (Wassarman P
M. "ZONA PELLUCIDA GLYCOPROTEINS" Ann. Rev. Bioche
m. 1988, 57: 415 - 42))あるいはＰＺＰ−３成分のみ
を使用するものが研究されている（Sacco AG. "Zona Pe
llucida: Current Status as a CandidateAntigen for
Contraceptive Vaccine Development." AMERICAN JOURN
AL OFREPRODUCTIVE IMMUNOLOGY AND MICROBIOLOGY 198
7, 15: 122 - 130) 。

【０００４】しかしながら、いずれにせよ卵透明帯は卵
巣中にしか存在しないために、ワクチンを生産するため
に必要な抗原を得るためには大量の卵巣を必要とし、こ
のため十分な抗原及び抗体を産生することができないと
いう問題があった。また、卵透明帯を精製する上で、他
の卵巣組織が混在することも考えられ、他の卵巣組織の
混在はこれをワクチンとして用いた場合、副作用を強く
する原因となることも考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、避
妊を効果的に達成することができる新規な避妊ワクチン
を提供することである。さらにまた、本発明の目的は、
生体以外の供給源から大量に調製することができる避妊
ワクチンを提供することである。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研
究の結果、ブタ卵透明帯ＺＰ−４成分（以下、ＰＺＰ−
４ということがある）単独でも避妊ワクチンのワクチン
抗原となり得ることを見出した。さらにまた、ＰＺＰ−
４中に含まれる、特定のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドが避妊ワクチンの抗原として有用であることを見出
し本発明を完成した。すなわち、本発明は、ブタ卵透明
帯ＰＺＰ−４抗原を免疫原として含む避妊ワクチンを提
供する。 さらに、本発明は、式［Ｉ］ Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg Ｃ側 ［Ｉ］ で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを免疫原と
して含む避妊ワクチンを提供する。

【０００７】

【発明の効果】本発明により、ＰＺＰ−４を免疫原とし
て含む新規な避妊ワクチンが提供された。この避妊ワク
チンは、下記の実施例において動物実験により証明され
たように、有効に動物及びヒトの避妊を達成することが
できる。また、本発明により、アミノ酸配列が特定され
たポリペプチドを免疫原とする新規な避妊ワクチンが提
供された。この避妊ワクチンは、そのアミノ酸配列が決
定されているので、化学的ペプチド合成法により、又は
該ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成し、これ
を市販のベクターに組み込んで宿主微生物中で増幅させ
る遺伝子工学的手法により、ブタ卵巣を必要とすること
なく、大量に調製することができる。

【０００８】

【発明の具体的な説明】上述のように、本発明の第１の
避妊ワクチンは、ＰＺＰ−４を免疫原として含む。ＰＺ
Ｐ−４自体は公知であり、ブタの卵巣から、O'Farrell
の方法に準じた二次元電気泳動により調製することがで
きる。この調製方法は、下記実施例において詳述されて
いる。

【０００９】本発明の第１の避妊ワクチンは、上記ＰＺ
Ｐ−４をワクチン抗原とするものであり、常法に基づき
ワクチンに製剤することができる。例えば、ＰＺＰ−４
をフロインド完全アジュバントに例えば10μg/mlないし
100 μg/ml程度の濃度に懸濁することにより避妊ワクチ
ンを製剤することができる。また、ワクチンの投与量、
投与回数及び投与時期は１０μg ないし100 μg のＰＺ
Ｐ−４を１回の投与量とし、初回は完全フロイントアジ
ュバントに、また２回目以降は不完全フロイントアジュ
バントに懸濁して２週間ないし４週間の間隔で数回投与
することにより、抗体を産生することが可能である。な
お、投与の時期は問わない。

【００１０】本発明の第２の避妊ワクチンは、上記式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（以下、簡単のため「ポリペプチドＩ」ということがあ
る）を免疫原として含む。ポリペプチドＩは、後述の実
施例において詳細に示されるように、ＰＺＰ−４をエン
ドプロテイナーゼLys-C で消化して得られた断片のうち
高いワクチン抗原活性を有する断片のＮ側の１番から１
１番目までのアミノ酸領域であり、ＰＺＰ−４をトリプ
シン及びエンドプロテイナーゼAsp-N 処理して得られる
フラグメントのアミノ酸配列とモノクローナル抗体５Ｈ
４に対する反応性から、この断片のポリペプチドＩの部
分がモノクローナル抗体５Ｈ４の対応エピトープと考え
られる。

【００１１】なお、ワクチン抗原として用いられるポリ
ペプチドは、上記式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列から
なるポリペプチド（すなわちポリペプチドＩ）であって
もよいが、上記式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列をその
一部として含むポリペプチドであってもよい。例えば、
下記実施例において確認されたように、Ｎ側 Arg-Val-
Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-As
p-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu Ｃ側で示されるアミノ
酸配列を含むポリペプチド及びＮ側 Arg-Val-Arg-Gly-
His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Al
a-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-
Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln Ｃ側で
示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明にお
けるワクチン抗原として用いることができ、これらのア
ミノ酸配列から成るポリペプチドも本発明におけるワク
チン抗原として用いることができる。さらに、一般に何
らかの生理活性を有するポリペプチドは、そのアミノ酸
配列に少数のアミノ酸の付加、欠失又は置換が起きたも
のであっても同様な生理活性を有することがあることは
当業者において広く認識されているところである。従っ
て、上記式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列に少数のアミ
ノ酸が付加され、少数のアミノ酸が欠失し又は少数のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであっても、ポ
リペプチドＩと同様な避妊ワクチン抗原性を有するもの
は、式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列と実質的に同一で
あり、特許請求の範囲における「アミノ酸配列」という
語は、このような実質的に同一のアミノ酸配列をも包含
するものとして解釈されなければならない。

【００１２】本発明の第２の避妊ワクチンは常法に基づ
きワクチンに製剤することができる。例えば、ポリペプ
チドＩをフロインド完全アジュバントに例えば１０μg/
mlないし100 μg/ml程度の濃度に懸濁することにより避
妊ワクチンを製剤することができる。また、ワクチンの
投与量、投与回数及び投与時期は１０μg ないし100 μ
g のＰＺＰ−４を１回の投与量とし、初回は完全フロイ
ントアジュバントに、また２回目以降は不完全フロイン
トアジュバントに懸濁して２週間ないし４週間の間隔で
数回投与することにより、抗体を産生することが可能で
ある。なお、投与の時期は問わない。

【００１３】本発明の避妊ワクチンを接種して得られる
抗体は、精子と卵との結合を妨げることによって妊娠を
防止するものであるから、他の作用機序に基づく避妊方
法よりも安全性が高いと考えられる。また、後述の実施
例において明らかになるように、本発明の避妊ワクチン
を接種して誘導された抗体は、ブタのみならず、ヒト、
ウサギ、ネコ及びイヌの卵透明帯とも交叉反応性を有す
ることから、ヒト及びこれらの動物の避妊ワクチンとし
ても有効に機能するものと考えられる。特に、ヒトに関
しては、後述の実施例において、本発明の避妊ワクチン
を接種して得られた抗体によるヒト精子の受精阻害が確
認されている。従って、本発明の避妊ワクチンは、ヒト
の避妊手段として、また、ペットや家畜の増殖を抑制す
るための避妊手段として有効に用いることができる。

【００１３】

【実施例】本発明を実施例により具体的に説明するが、
本発明の実施例はこれらに限定されるものではない。可溶化ブタ透明帯（ＳＰＺＰ）の調製 ブタ卵巣を電動カッターで破砕したものを200 μm メッ
シュ、150 μm メッシュ、75μm メッシュの各ナイロン
スクリーンをこの順番で用いて順次バッファー（ＰＢＳ
（−）＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ クエン酸ナトリウ
ム）で洗いながら通した。７５μm メッシュ上に残った
卵はバッファーで洗い落し回収した。次に、3000rpm で
５分間遠心し、沈殿した卵を集め少量（５ml程度）のバ
ッファーに懸濁した後、ダウンスホモジナイザーで５ス
トロークして卵より卵透明帯を分離した。卵透明帯は、
150 μm メッシュ、続いて40μm メッシュに通し、40μ
mメッシュ上に残った透明帯を回収した後、3000rpm で
５分間遠心して沈殿した卵透明帯を集めた。得られた卵
透明帯に可溶化バッファー（５０mM NaHCO₃ - Na₂CO₃(p
H9.6))を加えて７０℃で３０分間インキュベートして卵
透明帯を可溶化した。可溶化後、10,000rpm で２０分間
遠心し、上清を回収した。得られた上清（可溶化ブタ卵
透明帯；ＳＰＺＰ）は５mM NH₄HCO₃に透析した後、凍結
乾燥して保存した。

【００１４】ＰＺＰ−４の調製 上記で得られたＳＰＺＰを二次元電気泳動にかけた。泳
動条件は、O'Farrellの方法に準じて下記の条件で行な
った。 一次元目ゲル組成 アクリルアミド（ビス） ４％（0.2 ％） 尿素 8.5 M 両性担体（ファルマライト） ２％（pH 3-10) (NH₄)₂S₂O₈ 0.01％ ＴＥＭＥＤ 0.056 ％ 一次元目電極液 陽極； 0.01N H₃PO₄ 陰極； 0.02N NaOH 一次元目通電条件 予備通電；200V 15 分、300V 30 分、400V 30 分 本通電； 300V 15時間、 600V １時間 二次元目の泳動条件は、Laemmli のＳＤＳ電気泳動法に
従って下記の条件で行なった。 二次元目ゲル組成 濃縮ゲル アクリルアミド（ビス） ５％ (0.133%) トリス塩酸緩衝液(pH 6.8) 0.125 M ＳＤＳ 0.1 ％ (NH₄)₂S₂O₈ 0.08％ ＴＥＭＥＤ 0.05％ 分離ゲル アクリルアミド（ビス） 10％ (0.0665%) トリス塩酸緩衝液(pH 8.8) 0.375 M ＳＤＳ 0.1 ％ (NH₄)₂S₂O₈ 0.08％ ＴＥＭＥＤ 0.05％ 二次元目電極液 0.1 ％ＳＤＳ含有0.192 M トリスグリシン(pH 8.3) 二次元目通電条件 濃縮ゲル内；１５mA ２時間 分離ゲル内；３０−４０mA ３時間 二次元目平衡化緩衝液 トリス塩酸緩衝液（pH 6.8) 0.0625 M ２−メルカプトエタノール ５％ ＳＤＳ ２％ ＳＰＺＰを8.5M尿素、２％ファルマライト（pH３〜１
０) 、５％メルカプトエタノールに可溶化後、二次元電
気泳動にかけた。その結果を図１ａに示す。次に、分離
したＰＺＰ−４画分のゲルを切り出し電気抽出法を用い
てゲルからＰＺＰ−４のみを抽出した。抽出したＰＺＰ
−４は５mM NH₄HCO₃に透析した後、凍結乾燥した。ＰＺ
Ｐ−４の二次元電気泳動の結果を図１ｂに示す。ＰＺＰ
−１、ＰＺＰ−２及びＰＺＰ−３の混在は認められなか
った。

【００１５】免疫及び細胞融合 上記のようにして得られたPZP-4 10μg を完全フロイン
トアジュバントでエマルジョン化したものを雄Ｂａｌｂ
／ｃマウスに２週間間隔で２回背部皮下免疫した。さら
に２週間後から１０μg のＰＺＰ−４のみを緩衝液中に
含む溶液を隔日に３回腹腔内投与した。最終免疫から４
日後にマウス脾臓を摘出し、脾細胞をポリエチレングリ
コール1000を用いて、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１
（文献：Kohler, G and MilsteinC, Eur. J. Immunol.,
6, 511 (1976))と常法（J. Reprod.Immunol. 7:187-19
8, 1985 Koyama, K., Hasegawa, A., Tsuji, Y., and I
sojima, S., "Productionand Characterization of Mon
oclonal Antibody to Cross-reactive Antigens of Hum
an and Porcine Zonae Pellucidae."）に基づき細胞融
合した。増殖してきたハイブリドーマ培養上清の抗体の
検索はＥＬＩＳＡ法により行なった。抗体陽性のものは
ブタ卵を用いた間接抗体法により抗ブタ卵抗体陽性を示
すものをピックアップした。得られたハイブリドーマは
限界希釈法を用いてクローニングを行ない安定なハイブ
リドーマ５Ｈ４を樹立した。ハイブリドーマ５Ｈ４が産
生するモノクローナル抗体５Ｈ４の抗体クラス検定をオ
クタロニー法により行なったところIgG_2b であった。

【００１６】モノクローナル抗体５Ｈ４によるＳＰＺＰ
のウェスタンブロッティング ＳＰＺＰを上記と同様にして二次元電気泳動を行ない泳
動終了後、ゲルに現われたパターンをエレクトロトラン
スブロッターを使ってニトロセルロース膜にトランスブ
ロットした。ＳＰＺＰのブロッティングされたニトロセ
ルロース膜は３％ＢＳＡでブロッキングを行ないモノク
ローナル抗体５Ｈ４と反応させた。洗浄後、パーオキシ
ダーゼ標識抗マウス抗体で反応させ、４−クロロ−１−
ナフトールで発色させた。その結果を図２に示す。モノ
クローナル抗体５Ｈ４はＰＺＰ−４だけでなくＰＺＰ−
１の一部（−極側）とも反応することが分かった。ま
た、ＰＺＰ−２及びＰＺＰ−３とは反応しない。

【００１７】５Ｈ４抗原の蛋白質分解酵素処理及び脱糖
鎖処理による変化 ５０μg/mlのＳＰＺＰをそれぞれ１μg/mlのトリプシ
ン、キモトリプシン（３７℃、６０分間）１０Ｕ/ml Ｎ
−グリカナーゼ（３７℃、１５時間）、トリフルオロメ
タンスルホン酸（ＴＦＭＳ）／アニソール（２／１）溶
液（４℃、８時間）で処理した後、ニトロセルロース膜
にスポットした。膜を乾燥させた後、上述のウエスタン
ブロッティングと同様に発色させた。その結果を図３に
示す。モノクローナル抗体５Ｈ４と反応する物質はＮ−
グリカナーゼやＴＦＭＳといった脱糖鎖処理によっては
その抗原性は破壊されない。しかし、キモトリプシンの
ような蛋白質分解酵素処理ではその抗原性が破壊され
た。これよりこの抗体は、糖鎖ではなく蛋白を認識して
いると考えられる。

【００１８】モノクローナル抗体５Ｈ４の他種卵透明帯
との反応性 ブタ、ハムスター、ウサギ、イヌ（卵ではなく卵巣の凍
結切片を使用）、ネコ、ヒト（手術摘出卵巣より採取し
た）の卵巣よりそれぞれの卵を採取し、その採取した卵
とモノクローナル抗体５Ｈ４とを反応させた。反応終了
後、ＰＢＳ（−）で５回洗浄し、さらにフルオレッセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体と
反応させた。反応終了後洗浄操作を行ない蛍光顕微鏡で
検鏡した。イヌの場合は卵ではなくイヌ卵巣の凍結切片
上で卵の場合と同様な間接蛍光抗体法を行なった。その
結果、ブタ、ウサギ、ネコ、ヒト、イヌ（イヌの場合で
は卵巣中の卵透明帯がリング状に蛍光染色で染まってい
るのが認められた）で蛍光染色が認められ、モノクロー
ナル抗体５Ｈ４がこれらの種の卵透明帯とも結合するこ
とが明らかとなった。

【００１９】モノクローナル抗体５Ｈ４の組織特異性 各組織のパラフィン切片をVECTASTAIN ABCキット（フナ
コシより市販）で染色した。以下の手順で処理すること
により脱パラフィンと染色を行なった。 (1) キシレン（３分間） (2) キシレン（３分間） (3) １００％エタノール (4) 0.3% H₂O₂−メタノール（３０分間） (5) 水（３分間×３回） (6) ＰＢＳ（１０分間） (7) ２％正常ウマ血清−ＰＢＳでブロッキング（３０分
間） (8) モノクローナル抗体５Ｈ４の培養上清（６０分間、
室温） (9) ＰＢＳ（５分間×３回） 以後、第２抗体での反応から発色、ヘマトキシリン対比
染色、封入までの操作は上記キットのマニュアルに従っ
た。その結果、ブタ卵巣を染めたものでは、リング状の
透明帯のみが茶色く染まった。同様な方法でヒト−副
腎、肝臓、唾液線、脾臓、肺、腎臓を染めたものである
が染色は認められなかった。このように、モノクローナ
ル抗体５Ｈ４が特異的に結合する物質は今回調べた範囲
内では唯一卵透明帯だけで他の組織中には存在が確認さ
れなかった。

【００２０】モノクローナル抗体５Ｈ４によるヒト精子
のヒト卵透明帯への結合阻害試験 手術摘出卵巣より患者の承諾を得て採取した卵を１０％
ヒト血清を含むHam'sF10 で４８時間成熟培養した後、
モノクローナル抗体５Ｈ４を加え３７℃、６０分間処理
した。その後、１×10⁶ ／mlに数を調製した精子浮遊液
を加え１５時間後、卵に結合している精子の数をカウン
トした。表１に示す通り、卵一個当たりの結合精子数は
対照の５５前後から１３前後へと減少が認められた。

【００２１】ＰＺＰ−４のフラグメント化とその精製、
アミノ酸配列の決定 (1) エンドプロテイナーゼLys-C 処理 上記のようにして得られたＰＺＰ−４を２５mM Tris-HC
l (pH8.5)及び１mMＥＤＴＡに溶解した後、エンドプロ
テイナーゼ Lys-CをＰＺＰ−４の１/40 量を加え、３７
℃、１時間反応させた。反応終了後、逆相ＨＰＬＣ（μ
Bondapak Ｃ１８（ウォーターズ社製）にかけて分離精
製した。ＨＰＬＣで用いた溶媒は、0.1% TFA水溶液と0.
1% TFAのアセトニトリル溶液の１５％〜６０％直線勾配
（１２０分）であり、流速は0.85 ml/分であった。分離
された各フラクションはコーティングバッファー（0.05
M 重炭酸緩衝液 pH 9.6)で１００倍希釈して９６穴プレ
ートに加え４℃、一晩放置して吸着させた。ＰＢＳ
（−）でプレートを洗浄後、１％ＢＳＡで室温、１時間
ブロッキングした。洗浄操作後、モノクローナル抗体５
Ｈ４を加え室温で２時間反応させた。洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識抗マウス抗体を加え室温で３０分間反応さ
せた後、再度洗浄した。これに0.2mg/mlオルトフェニレ
ンジアミン、0.02% H₂O₂、0.15M クエン酸−リン酸緩衝
液pH 5.0を加えて発色させた。定量はマイクロプレート
光度計で492nm の吸光度を測定することにより行なっ
た。図４ａに逆相ＨＰＬＣの分離パターンと各フラクシ
ョンの５Ｈ４−ＥＬＩＳＡの結果を示す。４０分あたり
に溶出されてくるフラクションの＃６３〜＃７１のピー
クに抗原性が認められた。この抗原ポジティブ・フラク
ションの＃６４〜＃７１を再度逆相ＨＰＣにかけた時の
分離パターンを図４ｂに示す。さらにフラクション＃１
４〜＃１６を逆相ＨＰＬＣにかけた時の分離パターンが
図４ｃである。最終的にこの２回のリクロマトグラム操
作を行なって得られたピークフラクションをアミノ酸シ
ークエンサー(Applied Biosystem 477A)でシークエンス
を行ない、アミノ酸配列を決定した。その結果、このポ
リペプチド断片は以下に示すアミノ酸配列を有してい
た。 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-
Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu Ｃ側 さらに、同じ実験を試料の量を増やして追試したとこ
ろ、上記の配列よりも７アミノ酸長い、下記配列が決定
された。 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-
Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Le
u-Met-Tyr-His-Ile-Ser Ｃ側

【００２２】(2) トリプシン処理 上記のようにして得られたＰＺＰ−４ １００μg に対
してＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社製；＃Ｔ−８６
４２）0.5 μg を 500μｌのＰＢＳ（−）で１時間反応
させた。反応終了後、逆相ＨＰＬＣ（μBondapak Ｃ−
１８（ウォーターズ社製）にかけて分画した。ＨＰＬＣ
で用いた溶媒は0.1% TFA水溶液と0.1% TFAのアセトニト
リル溶液の２５％−４５％直線勾配（１２０分）であ
り、検出は波長２２０ｎｍの吸光度を測定することによ
り行った。図５に逆相ＨＰＬＣの分離パターンを示す。
分離されたフラクションのアミノ酸配列をアミノ酸シー
クエンサーでシークエンスを行ない決定した。その結
果、フラクション＃７６、７７（Ｍ．Ｗ．５０００）よ
りLeu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln のアミノ
酸配列を有するフラグメントが得られた。この配列は先
にエンドプロテイナーゼLys- Ｃ処理によって得られた
モノクローナル抗体５Ｈ４陽性フラグメント（Ｍ．Ｗ．
7000）の１２番目から２１番目までのアミノ酸配列と一
致した。また、このトリプシン処理フラグメントにはモ
ノクローナル抗体５Ｈ４に対する反応性が認められなか
った。

【００２３】(3) エンドプロテイナーゼ Asp−Ｎ処理 上記で得られたＰＺＰ−４ １００μg を５０mMリン酸
緩衝液（pH 8.0) に溶解した後、エンドプトテイナーゼ
Asp−Ｎ（Behringer-Mannheim；＃１０５４５８９）を
２μｇ量加え、３７℃、６時間反応させた。反応終了
後、逆相ＨＰＬＣ（μ Bondapak Ｃ−１８（ウォーター
ズ社製）にかけて分画した。ＨＰＬＣで用いた溶媒は、
0.1% TFA水溶液と0.1% TFAのアセトニトリル溶液の５％
−４５％直線勾配（１２０分）であり、検出は、波長２
２０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。図６に
逆相ＨＰＬＣの分離パターンを示す。分離されたフラク
ションのアミノ酸配列をアミノ酸シークエンサーでシー
クエンスを行ない決定した。その結果、フラクション＃
６８、６９（Ｍ．Ｗ．２２００）よりGlu-Ala-Leu-Met-
Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pr
o-Asp-Gln のアミノ酸配列を有するフラグメントが得ら
れた。この配列のうちGlu からSer までの配列はエンド
プロテイナーゼ Lys−Ｃ処理で得られたフラグメントノ
Ｎ側２２番目から２９番目までのアミノ酸配列と一致し
た。また、このエンドプロテイナーゼ Asp−Ｎ処理によ
って得られたフラグメントにもモノクローナル抗体５Ｈ
４に対する反応性は認められなかった。 (1)、 (2)、 (3) の酵素処理フラグメントのアミノ酸配列
をつなぎ合わせることによりＰＺＰ−４内の下記４０個
のアミノ酸配列が明らかとなった。 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-
Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Le
u-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-
Gly-Pro-Asp-Gln Ｃ側 また、モノクローナル抗体５Ｈ４に対するこれらフラグ
メントの反応性からモノクローナル抗体５Ｈ４の認識領
域がエンドプロテイナーゼ Lys−Ｃ処理によって得られ
たフラグメントのＮ側の１番目から１１番目までのアミ
ノ酸領域内にあることがわかった。

【００２４】ＰＺＰ−４を用いたワクチン実験 エストラジオールを測定して正常な発情周期を示すこと
を確認したゴールデンハムスター（♀）を、フロインド
完全アジュバント中に２０μg のＰＺＰ−４を含むワク
チン（ＰＺＰ−４濃度：４０μg/ml）で免疫した。３週
間後から数回追加免疫注射を繰り返し、発情期に相当す
る日に採血を行ない発情周期を調べた。また、妊孕性を
確認した雄と同居させ妊娠の有無を検討した。免疫動物
の卵巣の組織学的検査を行なうと共に抗血清のＰＺＰ抗
原に対する反応性を間接抗体法、ウエスタンブロット法
により調べた。結果はＰＺＰ−４を免疫した雌ハムスタ
ー３匹を免疫開始後７週から１２週にかけて雄と同居さ
せたが妊娠には至らなかった。その後一匹は１３週目に
妊娠した。表２は免疫していない正常なハムスターの発
情周期と血中エストラジオール値を測定しグラフ化した
ものである。ハムスターの発情周期は４日周期である。
図７は、免疫したハムスターより第４日に相当する日に
採血を行ない抗透明帯抗体価とエスタジオール値を測定
しグラフ化したものである。抗透明帯抗体価の上昇に従
いエストラジオール値の低下が認められ発情周期の乱れ
が観察された。なお、図７において、抗体価は４９２nm
における吸光度がプラトーを示す最大希釈倍数で表わし
た。また、エストラジオール濃度は、ハムスターが最高
値を示す発情期に採血して測定した。なお、１２週及び
４８週におけるＰＺＰ−４免疫ハムスターのエストラジ
オール濃度は測定しなかった。

【００２５】卵巣の組織検査では、免疫開始７週後の卵
巣をアジュバントのみで免疫したもの（コントロール）
とＰＺＰ−４で免疫したものとを比較すると卵胞の発育
状況及び顆粒膜細胞層の状態に大きな違いが認められ
た。すなわち、対照の卵巣は顆粒膜細胞層の形成を伴っ
た卵胞の発育が認められるのに対して免疫したハムスタ
ーの卵巣には発育過程にあるべき卵胞が見当たらなかっ
た。免疫開始３週目の卵巣では発育卵胞が認められてい
たことから３週目以降に卵胞の発育に障害が生じたもの
と考えられる。また、免疫抗血清を用いてブタの卵とハ
ムスターの卵を間接蛍光抗体法で染めてみたところ、ブ
タの卵、ハムスターの卵ともよく染まりっており、抗透
明帯抗体が作られていることが確認された。同じ抗血清
を用いてウエスタンブロットを行なった結果が図８であ
る。ＰＺＰ−４に対する抗体が強く作られていることが
見てとれる（図８ｂ）。一方、ＰＺＰ−２、ＰＺＰ−３
に対しては全く反応が認められない（図８ｂ）。ＰＺＰ
−１には弱いながらも反応が認められる。なお、図８ａ
は対照として抗ＳＰＺＰハムスター血清を用いて行なっ
たウェスタンブロッティングの結果を示す図である。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】ＳＰＺＰの二次元電気泳動の結果を示す図。

【図１ｂ】図１ａに示す二次元電気泳動により分離され
たＺＰ−４画分を再度二次元電気泳動にかけた結果を示
す図。

【図２】モノクローナル抗体５Ｈ４によるＳＰＺＰのウ
ェスタンブロッティングの結果を示す図。

【図３】ＳＰＺＰをタンパク質分解酵素処理又は脱糖鎖
処理した後、モノクローナル抗体５Ｈ４との反応をドッ
トイムノアッセイで調べた結果を示す図。

【図４ａ】ＰＺＰ−４のエンドプロテイナーゼLys-C の
消化物を逆相ＨＰＬＣにかけて得られた画分のモノクロ
ーナル抗体５Ｈ４との反応性を示す図。

【図４ｂ】図４ａで得られた＃６４〜＃７１のピーク画
分を再度逆相ＨＰＬＣにかけて得られた結果を示す図。

【図４ｃ】図４ａで得られた＃１４〜＃１６の画分を再
度逆相ＨＰＬＣにかけて得られた結果を示す図。

【図５】ＰＺＰ−４のトリプシンの消化物を逆相ＨＰＬ
Ｃにかけて得られた結果を示す図。

【図６】ＰＺＰ−４のエンドプロテイナーゼ Asp−Ｎの
消化物を逆相ＨＰＬＣにかけて得られた結果を示す図。

【図７】本発明の避妊ワクチンで免疫したハムスターよ
り第４日に相当する日に採血を行ない抗透明抗体価とエ
スタジオール値を測定しグラフ化した図。

【図８ａ】は、抗ＳＰＺＰハムスター血清を用いて行な
ったウェスタンブロッティングの結果を示す図。

【図８ｂ】抗ＰＺＰ−４ハムスター血清を用いて行なっ
たウェスタンブロッティングの結果を示す図。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブタ卵透明帯ＰＺＰ−４成分を免疫原と
   して含む避妊ワクチン。
2. 【請求項２】 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Me
   t-Thr-Ile-Arg Ｃ側で示されるアミノ酸配列を含むポリ
   ペプチドを免疫原として含む避妊ワクチン。
3. 【請求項３】 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Me
   t-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-
   Gln-Glu Ｃ側で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチ
   ドを免疫原として含む請求項２記載の避妊ワクチン。
4. 【請求項４】 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Me
   t-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-
   Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Me
   t-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln Ｃ側で示されるアミノ
   酸配列を含むポリペプチドを免疫原として含む請求項３
   記載の避妊ワクチン。
5. 【請求項５】 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Me
   t-Thr-Ile-Arg Ｃ側で示されるアミノ酸配列から成るポ
   リペプチドを免疫原として含む請求項２記載の避妊ワク
   チン。
6. 【請求項６】 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Me
   t-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-
   Gln-Glu Ｃ側で示されるアミノ酸配列から成るポリペプ
   チドを免疫原として含む請求項３記載の避妊ワクチン。
7. 【請求項７】 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Me
   t-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-
   Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Me
   t-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln Ｃ側で示されるアミノ
   酸配列から成るポリペプチドを免疫原として含む請求項
   ４記載の避妊ワクチン。