JPH0568595A - ビフイドバクテリウム・ブレーベ同定用ｄｎａプローブ及びそれを用いた同定法 - Google Patents
ビフイドバクテリウム・ブレーベ同定用ｄｎａプローブ及びそれを用いた同定法Info
- Publication number
- JPH0568595A JPH0568595A JP3191261A JP19126191A JPH0568595A JP H0568595 A JPH0568595 A JP H0568595A JP 3191261 A JP3191261 A JP 3191261A JP 19126191 A JP19126191 A JP 19126191A JP H0568595 A JPH0568595 A JP H0568595A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- breve
- dna
- probe
- strains
- bifidobacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡便でかつ、検査結果の判定が容易で有るよ
うな、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.ブレーベ）
を検出、同定、定量するB.ブレーベ同定用ＤＮＡプロー
ブ及びそれを用いた同定法を提供する。 【構成】 B.ブレーベ染色体の種特異的ＤＮＡ部位に相
補的なものであり、更に詳しくは、B.ブレーベ染色体Ｄ
ＮＡから制限酵素HindIIIによる切断によって得られた
1.8 Kbp の染色体ＤＮＡ断片又は該ＤＮＡ断片と同様の
塩基配列を備えたものである。また、B.ブレーベ同定用
核酸プローブを用いた同定法では、前記核酸プローブに
標識マーカを施し、該標識マーカを施した核酸プローブ
と被同定物の核酸とをハイブリダイズし、ハイブリダイ
ズした被同定物を検出するものである。
うな、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.ブレーベ）
を検出、同定、定量するB.ブレーベ同定用ＤＮＡプロー
ブ及びそれを用いた同定法を提供する。 【構成】 B.ブレーベ染色体の種特異的ＤＮＡ部位に相
補的なものであり、更に詳しくは、B.ブレーベ染色体Ｄ
ＮＡから制限酵素HindIIIによる切断によって得られた
1.8 Kbp の染色体ＤＮＡ断片又は該ＤＮＡ断片と同様の
塩基配列を備えたものである。また、B.ブレーベ同定用
核酸プローブを用いた同定法では、前記核酸プローブに
標識マーカを施し、該標識マーカを施した核酸プローブ
と被同定物の核酸とをハイブリダイズし、ハイブリダイ
ズした被同定物を検出するものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビフィドバクテリウム
・ブレーベ（Bifidobacterium breve 以下、B.ブレーベ
と記す）を検出、同定、定量するためのB.ブレーベに種
特異的なプローブに関するものである。
・ブレーベ（Bifidobacterium breve 以下、B.ブレーベ
と記す）を検出、同定、定量するためのB.ブレーベに種
特異的なプローブに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】B.ブレーベの同定には、従来、グラム染
色性、形態、ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸の分
析、糖発酵試験等の７０項目にも及ぶ検査が必要とされ
ており、B.ブレーベの認識には、上記に示したような表
現形質による方法が用いられている。
色性、形態、ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸の分
析、糖発酵試験等の７０項目にも及ぶ検査が必要とされ
ており、B.ブレーベの認識には、上記に示したような表
現形質による方法が用いられている。
【０００３】しかし、B.ブレーベが偏性嫌気性菌である
ことから、培養操作が容易でなく、同定には１か月以上
を必要とする。また、これには、多大の労力と試験者に
熟練を必要とする(Holdman,L.V.,E.PP.Cato and W.E.C.
Moore(ed.) 1977. Anaerobelaboratory manual, 4th e
d. Virginia Pplytechnic Institute and State Univer
sity, Blacksburg, Va.)。
ことから、培養操作が容易でなく、同定には１か月以上
を必要とする。また、これには、多大の労力と試験者に
熟練を必要とする(Holdman,L.V.,E.PP.Cato and W.E.C.
Moore(ed.) 1977. Anaerobelaboratory manual, 4th e
d. Virginia Pplytechnic Institute and State Univer
sity, Blacksburg, Va.)。
【０００４】また、嫌気性菌同定用の種々の簡易同定キ
ットが市販されているが、高価であり、しかも同定の信
頼性が低く、ビフィドバクテリウムの種々の菌種を同定
するものはない。
ットが市販されているが、高価であり、しかも同定の信
頼性が低く、ビフィドバクテリウムの種々の菌種を同定
するものはない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところで、ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡホモロジーを用いた菌種同定法が様々な菌種で行わ
れているが、ビフィドバクテリウムの場合は菌種間のホ
モロジーが高く、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの検査のみ
では同定できない菌種があり、特にB.ロンガム(B. long
um) ，B.インファンティス(B. infantis) ，B.ブレーベ
はホモロジーが高く、容易に同定することができなかっ
た(Biabiti, B., V.Scardovi and W.E.C.Moor.1982. El
ectrophoretic jpatterns of proteins in the genus B
ifidobacterium and proposal of four new species. I
nt. J. Syst. Bacteriol. 32:358-373）。
ＮＡホモロジーを用いた菌種同定法が様々な菌種で行わ
れているが、ビフィドバクテリウムの場合は菌種間のホ
モロジーが高く、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの検査のみ
では同定できない菌種があり、特にB.ロンガム(B. long
um) ，B.インファンティス(B. infantis) ，B.ブレーベ
はホモロジーが高く、容易に同定することができなかっ
た(Biabiti, B., V.Scardovi and W.E.C.Moor.1982. El
ectrophoretic jpatterns of proteins in the genus B
ifidobacterium and proposal of four new species. I
nt. J. Syst. Bacteriol. 32:358-373）。
【０００６】上述したごとく、従来の表現形質によるB.
ブレーベ同定法は煩雑で時間がかかるため、大量の検体
をこなすことが不可能であった。
ブレーベ同定法は煩雑で時間がかかるため、大量の検体
をこなすことが不可能であった。
【０００７】本発明は、このような問題を解決するため
のB.ブレーベに特異的なＤＮＡプローブを提供し、試験
者が検査に関して熟練を必要とせず、大量の検体を一度
に処理することが可能であり、簡便でかつ、検査結果の
判定が容易で有るような、食品や糞便、消化管内容物中
に存在するB.ブレーベを検出、同定、定量するB.ブレー
ベ同定用ＤＮＡプローブ及びそれを用いた同定法を提供
するものである。
のB.ブレーベに特異的なＤＮＡプローブを提供し、試験
者が検査に関して熟練を必要とせず、大量の検体を一度
に処理することが可能であり、簡便でかつ、検査結果の
判定が容易で有るような、食品や糞便、消化管内容物中
に存在するB.ブレーベを検出、同定、定量するB.ブレー
ベ同定用ＤＮＡプローブ及びそれを用いた同定法を提供
するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載の発明
に係るB.ブレーベのＤＮＡプローブでは、B.ブレーベ染
色体の種特異的ＤＮＡ部位に相補的なものである。
に係るB.ブレーベのＤＮＡプローブでは、B.ブレーベ染
色体の種特異的ＤＮＡ部位に相補的なものである。
【０００９】本請求項２に記載の発明に係るB.ブレーベ
のＤＮＡプローブでは、B.ブレーベ染色体ＤＮＡから制
限酵素HindIII による切断によって得られた1.8 Kbp の
染色体ＤＮＡ断片又は該ＤＮＡ断片と同様の塩基配列を
備えたものである。
のＤＮＡプローブでは、B.ブレーベ染色体ＤＮＡから制
限酵素HindIII による切断によって得られた1.8 Kbp の
染色体ＤＮＡ断片又は該ＤＮＡ断片と同様の塩基配列を
備えたものである。
【００１０】本請求項３に記載の発明に係るB.ブレーベ
のＤＮＡプローブを用いた同定法では、前記ＤＮＡプロ
ーブに標識マーカを施し、該標識マーカを施したＤＮＡ
プローブと被同定物のＤＮＡとをハイブリダイズし、ハ
イブリダイズした被同定物を検出するものである。
のＤＮＡプローブを用いた同定法では、前記ＤＮＡプロ
ーブに標識マーカを施し、該標識マーカを施したＤＮＡ
プローブと被同定物のＤＮＡとをハイブリダイズし、ハ
イブリダイズした被同定物を検出するものである。
【００１１】
【作用】細菌類・菌類の分類には表現形質による分類が
歴史的に古くから利用されているが、現在では染色体Ｄ
ＮＡのＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる分類が重要な項
目になっており、細菌分類学上、必須の用件になってい
る。
歴史的に古くから利用されているが、現在では染色体Ｄ
ＮＡのＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーによる分類が重要な項
目になっており、細菌分類学上、必須の用件になってい
る。
【００１２】ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーの原理は、検査
する２菌種間の染色体ＤＮＡの相補性を評価することに
基づいている。即ち、70％以上のホモロジーのある菌株
を同一菌種としてみなしている。
する２菌種間の染色体ＤＮＡの相補性を評価することに
基づいている。即ち、70％以上のホモロジーのある菌株
を同一菌種としてみなしている。
【００１３】これは、菌種間に相同な領域と非相同な領
域のあることを示しており、この菌種に特異的な領域を
菌種同定用プローブとして利用することによって、ＤＮ
Ａ−ＤＮＡホモロジーで高い相補性を示し、同定が困難
な菌種をより明確に同定することが可能である。
域のあることを示しており、この菌種に特異的な領域を
菌種同定用プローブとして利用することによって、ＤＮ
Ａ−ＤＮＡホモロジーで高い相補性を示し、同定が困難
な菌種をより明確に同定することが可能である。
【００１４】本発明では、このような考えに基づき、B.
ブレーベ染色体ＤＮＡからB.ブレーベのみに特異的にハ
イブリダイズするＤＮＡ断片をクローニングし、適当な
マーカーで標識し、食品、糞便、消化管内容物中のB.ブ
レーベを検出し、同定することが可能であるようなB.ブ
レーベに特異的なＤＮＡプローブを作成するものであ
る。
ブレーベ染色体ＤＮＡからB.ブレーベのみに特異的にハ
イブリダイズするＤＮＡ断片をクローニングし、適当な
マーカーで標識し、食品、糞便、消化管内容物中のB.ブ
レーベを検出し、同定することが可能であるようなB.ブ
レーベに特異的なＤＮＡプローブを作成するものであ
る。
【００１５】B.ブレーベ菌種に特異的なＤＮＡプローブ
は以下の操作を行って得られた。即ち、B.ブレーベ染色
体ＤＮＡを制限酵素で切断し、プラスミド等のベクター
にランダムにクローニングした。得られた染色体ＤＮＡ
断片をアイソトープ等のマーカーで標識し、各種のビフ
ィドバクテリウム菌種とハイブリダイズするか否かを検
討した。この中から、B.ブレーベ菌種のみにハイブリダ
イズするＤＮＡ断片を選択し、更に、ビフィドバクテリ
ウム属以外の多種類の菌種とハイブリダイズしない染色
体ＤＮＡ断片を選択した。得られたＤＮＡ断片は異なる
場所から分離されたB.ブレーベ菌株の全てにハイブリダ
イズすることも確認した。
は以下の操作を行って得られた。即ち、B.ブレーベ染色
体ＤＮＡを制限酵素で切断し、プラスミド等のベクター
にランダムにクローニングした。得られた染色体ＤＮＡ
断片をアイソトープ等のマーカーで標識し、各種のビフ
ィドバクテリウム菌種とハイブリダイズするか否かを検
討した。この中から、B.ブレーベ菌種のみにハイブリダ
イズするＤＮＡ断片を選択し、更に、ビフィドバクテリ
ウム属以外の多種類の菌種とハイブリダイズしない染色
体ＤＮＡ断片を選択した。得られたＤＮＡ断片は異なる
場所から分離されたB.ブレーベ菌株の全てにハイブリダ
イズすることも確認した。
【００１６】このようにして得られたB.ブレーベに特異
的なＤＮＡプローブは、特異性が非常に高いことから、
糞便、食品等の多種類の菌種が混合されている検体中か
ら、B.ブレーベのみを選択的に検出、同定、定量するこ
とが可能である。
的なＤＮＡプローブは、特異性が非常に高いことから、
糞便、食品等の多種類の菌種が混合されている検体中か
ら、B.ブレーベのみを選択的に検出、同定、定量するこ
とが可能である。
【００１７】B.ブレーベの検出、同定、定量の概要は、
次の通りである。 (1) 検体を適当な緩衝液に懸濁し、溶菌酵素、界面活性
剤、蛋白分解酵素で溶菌させ、除蛋白を行って核酸を抽
出する。この核酸をメンブランフィルターにトラップ
し、適当なマーカーで標識したB.ブレーベに特異的なＤ
ＮＡプローブとハイブリダイズさせる。非特異的な反応
を除去し、反応の強さを測定し、B.ブレーベを検出し、
定量する。
次の通りである。 (1) 検体を適当な緩衝液に懸濁し、溶菌酵素、界面活性
剤、蛋白分解酵素で溶菌させ、除蛋白を行って核酸を抽
出する。この核酸をメンブランフィルターにトラップ
し、適当なマーカーで標識したB.ブレーベに特異的なＤ
ＮＡプローブとハイブリダイズさせる。非特異的な反応
を除去し、反応の強さを測定し、B.ブレーベを検出し、
定量する。
【００１８】(2) 検体を嫌気的に希釈、培養し、単一菌
分離を行い、菌株を分離する。得られた菌株の少量をフ
ィルターにトラップし、溶菌酵素、界面活性剤、蛋白分
解酵素で溶菌させ、除蛋白を行って核酸を抽出し、固定
する。これを標識したB.ブレーベに特異的なＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズさせ、非特異的な反応を除去し、
反応を測定し、陽性であればB.ブレーベと同定する。得
られたB.ブレーベの菌株数から、希釈率をかけ、元の検
体中に含まれるB.ブレーベ菌数を定量する。
分離を行い、菌株を分離する。得られた菌株の少量をフ
ィルターにトラップし、溶菌酵素、界面活性剤、蛋白分
解酵素で溶菌させ、除蛋白を行って核酸を抽出し、固定
する。これを標識したB.ブレーベに特異的なＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズさせ、非特異的な反応を除去し、
反応を測定し、陽性であればB.ブレーベと同定する。得
られたB.ブレーベの菌株数から、希釈率をかけ、元の検
体中に含まれるB.ブレーベ菌数を定量する。
【００１９】(3) 検体を嫌気的に希釈、栄養培地上に載
せたフィルターの上で培養する。培養後形成されたコロ
ニーを溶菌酵素、界面活性剤、蛋白分解酵素で溶菌、除
蛋白を行い核酸を抽出し、フィルターに固定する。この
フィルターを適当なマーカーで標識したB.ブレーベ菌種
特異的プローブとハイブリダイズさせる。非特異的な反
応を除去し、反応の強さを測定し、B.ブレーベを検出、
同定する。得られたB.ブレーベ菌種の菌株数から、希釈
率をかけ、元の検体中に含まれるB.ブレーベの菌数を定
量する。
せたフィルターの上で培養する。培養後形成されたコロ
ニーを溶菌酵素、界面活性剤、蛋白分解酵素で溶菌、除
蛋白を行い核酸を抽出し、フィルターに固定する。この
フィルターを適当なマーカーで標識したB.ブレーベ菌種
特異的プローブとハイブリダイズさせる。非特異的な反
応を除去し、反応の強さを測定し、B.ブレーベを検出、
同定する。得られたB.ブレーベ菌種の菌株数から、希釈
率をかけ、元の検体中に含まれるB.ブレーベの菌数を定
量する。
【００２０】プローブの標識にはアイソトープ、ビオチ
ン、酵素、ハプテン等様々なものが利用できる。アイソ
トープの場合は、オートラジオグラフィーやシンチレー
ションカウンチングによって検出される。ビオチン、酵
素、ハプテン等では、酵素抗体法等で、発色を利用して
検出される。
ン、酵素、ハプテン等様々なものが利用できる。アイソ
トープの場合は、オートラジオグラフィーやシンチレー
ションカウンチングによって検出される。ビオチン、酵
素、ハプテン等では、酵素抗体法等で、発色を利用して
検出される。
【００２１】尚、プローブの形態、標識法は様々なもの
が利用できる。例えば、ニックトランスレーション法、
マルチプライム法、ＰＣＲ法、ＲＮＡ転写法等を利用す
ることができる。即ち、種特異的な染色体ＤＮＡ断片と
同一の配列を有する一本鎖の核酸であればよい。
が利用できる。例えば、ニックトランスレーション法、
マルチプライム法、ＰＣＲ法、ＲＮＡ転写法等を利用す
ることができる。即ち、種特異的な染色体ＤＮＡ断片と
同一の配列を有する一本鎖の核酸であればよい。
【００２２】
【実施例】以下に、具体的な実験例を挙げて具体的に本
発明を説明する。(1) ビフィドバクテリウムからの染色体ＤＮＡの抽出、
生成 培養はビフィドバクテリウム前培養を１％の濃度でＶＬ
Ｍ培地 200mlに接種し、一晩（14時間）嫌気的に培養し
た。
発明を説明する。(1) ビフィドバクテリウムからの染色体ＤＮＡの抽出、
生成 培養はビフィドバクテリウム前培養を１％の濃度でＶＬ
Ｍ培地 200mlに接種し、一晩（14時間）嫌気的に培養し
た。
【００２３】溶菌、ＤＮＡの抽出は斉藤、三浦の方法(S
aito,H.,and K.Miura.1963.Preparation of transformi
ng deoxyribonucleic acid by phenol treated. Bioche
m.Biophys.Acta. 72:619-629) を改変して行った。
aito,H.,and K.Miura.1963.Preparation of transformi
ng deoxyribonucleic acid by phenol treated. Bioche
m.Biophys.Acta. 72:619-629) を改変して行った。
【００２４】菌体の洗浄と溶菌には、 50mM ＭＥＳ pH
6.5／ 0.5M シュークロース緩衝液を用いた。溶菌は、
Ｍ−１酵素(N-ACETYLMURAMIDASE SG、 生化学工業）を最
終濃度10μg/ml、リソザイム（Lysozyme シグマ社製）
を最終濃度 100μg/mlになるように添加し、37℃，１時
間反応させた。
6.5／ 0.5M シュークロース緩衝液を用いた。溶菌は、
Ｍ−１酵素(N-ACETYLMURAMIDASE SG、 生化学工業）を最
終濃度10μg/ml、リソザイム（Lysozyme シグマ社製）
を最終濃度 100μg/mlになるように添加し、37℃，１時
間反応させた。
【００２５】反応液は、遠心し、上清を除去後、ＴＥ緩
衝液（ 10mM トリス−塩酸 pH 8.0，１mM ＥＤＴＡ）
に再懸濁し、ＳＤＳを 0.5％、プロテイナーゼＫ(Prote
inase K)（メルク(MERCK) 社製）を 100μg/mlになるよ
うに添加し、37℃、１時間反応させた。
衝液（ 10mM トリス−塩酸 pH 8.0，１mM ＥＤＴＡ）
に再懸濁し、ＳＤＳを 0.5％、プロテイナーゼＫ(Prote
inase K)（メルク(MERCK) 社製）を 100μg/mlになるよ
うに添加し、37℃、１時間反応させた。
【００２６】常法により、フェノール処理、クロロホル
ム：イソアミルアルコール処理後、1/10量の３Ｍ 酢酸
ナトリウム pH 5.2 、等量の２−プロパノールを加え、
ガラス製マイクロピペットで高分子の染色体ＤＮＡを巻
き取り、抽出した。
ム：イソアミルアルコール処理後、1/10量の３Ｍ 酢酸
ナトリウム pH 5.2 、等量の２−プロパノールを加え、
ガラス製マイクロピペットで高分子の染色体ＤＮＡを巻
き取り、抽出した。
【００２７】このＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁し、ＲＮ
ａｓｅ（ウォルシントン(Worthinton)社製）を最終濃度
25 μg/mlに加え、37℃１時間反応させ、プロテイナー
ゼＫ処理後、上記と同様にしてＤＮＡを精製した。ＤＮ
Ａは、 230 nm ， 260 nm ，280 nm の吸光度を測定
し、ＤＮＡの濃度を測定するとともに、蛋白質の混入を
検定した。また、１％アガロース電気泳動によって高分
子ＤＮＡが精製分離されていることを確認した。
ａｓｅ（ウォルシントン(Worthinton)社製）を最終濃度
25 μg/mlに加え、37℃１時間反応させ、プロテイナー
ゼＫ処理後、上記と同様にしてＤＮＡを精製した。ＤＮ
Ａは、 230 nm ， 260 nm ，280 nm の吸光度を測定
し、ＤＮＡの濃度を測定するとともに、蛋白質の混入を
検定した。また、１％アガロース電気泳動によって高分
子ＤＮＡが精製分離されていることを確認した。
【００２８】(2) 腸内フローラ主要構成菌の染色体ＤＮ
Ａの抽出 菌株は後述する表５に記載の18属47菌種49株を用いた。
ＤＮＡの抽出と精製は、上記の方法により行った。尚、
スタフィロコッカス(Staphyloccus)には、リソスタフィ
ン(Lysostaphin) （シグマ社製）を、ガンディダ(Candi
da) にはジモラーゼ(Zymolase)（生化学工業製）を用い
た。
Ａの抽出 菌株は後述する表５に記載の18属47菌種49株を用いた。
ＤＮＡの抽出と精製は、上記の方法により行った。尚、
スタフィロコッカス(Staphyloccus)には、リソスタフィ
ン(Lysostaphin) （シグマ社製）を、ガンディダ(Candi
da) にはジモラーゼ(Zymolase)（生化学工業製）を用い
た。
【００２９】(3) ビフィドバクテリム・ブレーベに特異
的なＤＮＡプローブの作成 B.ブレーベに特異的なプローブの作成は染色体ＤＮＡシ
ョットガンクローニング法を用いた(Salyers,A.A.,S.P.
Lynn,and J.F.Gardner.1983.Use of randomlycloned DN
A fragments for identification of Bacteroides thet
aiotaomicron.J.Bacteriology.143:772-780.)。
的なＤＮＡプローブの作成 B.ブレーベに特異的なプローブの作成は染色体ＤＮＡシ
ョットガンクローニング法を用いた(Salyers,A.A.,S.P.
Lynn,and J.F.Gardner.1983.Use of randomlycloned DN
A fragments for identification of Bacteroides thet
aiotaomicron.J.Bacteriology.143:772-780.)。
【００３０】B.ブレーベYIT4006 の染色体ＤＮＡを、制
限酵素 HindIII（宝酒造株式会社製）で37℃一晩処理
し、切断した。断片化した染色体ＤＮＡを、プラスミド
ベクターｐＵＣ１２( 2.3 Kbp)に連結し、大腸菌 JM109
に形質転換した。
限酵素 HindIII（宝酒造株式会社製）で37℃一晩処理
し、切断した。断片化した染色体ＤＮＡを、プラスミド
ベクターｐＵＣ１２( 2.3 Kbp)に連結し、大腸菌 JM109
に形質転換した。
【００３１】ｐＵＣ１２は、予めHindIII で切断し、Ｂ
ＡＰ(Bacterial Alkaline Phosphatase 東洋紡（株）
製) で脱リン酸化処理した。
ＡＰ(Bacterial Alkaline Phosphatase 東洋紡（株）
製) で脱リン酸化処理した。
【００３２】断片化した染色体ＤＮＡを含む大腸菌 JM1
09をＸｇａｌ（ 0.004％ シグマ社製）−ＩＰＴＧ（0.
1 mM シグマ社製）−アンピシリン（25μg/ml シグマ
社製）を含むＬＢプレートで37℃、一晩培養した。
09をＸｇａｌ（ 0.004％ シグマ社製）−ＩＰＴＧ（0.
1 mM シグマ社製）−アンピシリン（25μg/ml シグマ
社製）を含むＬＢプレートで37℃、一晩培養した。
【００３３】(4) クローニングした染色体ＤＮＡ断片の
一次スクリーニング 組換え体クローンである白色コロニーから任意に25個を
スクリーニングに用いた。ミニライゼート法(Maniatis,
T., E.F.Fritsch, and J.Sambrok. 1982. Molecular cl
oning :a labolatory manual. Cold Spring Harbor Lab
olatory ,ColdSpring harbor,N.Y.) により、プラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素HindIII で切断して、１％
（wt/vol）低融点アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断
片を回収した。
一次スクリーニング 組換え体クローンである白色コロニーから任意に25個を
スクリーニングに用いた。ミニライゼート法(Maniatis,
T., E.F.Fritsch, and J.Sambrok. 1982. Molecular cl
oning :a labolatory manual. Cold Spring Harbor Lab
olatory ,ColdSpring harbor,N.Y.) により、プラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素HindIII で切断して、１％
（wt/vol）低融点アガロース電気泳動により、ＤＮＡ断
片を回収した。
【００３４】このＤＮＡ断片を32Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシ
ャム製）を用いて、ニックトランスレーション法（アマ
シャム製）又はマルチプライム法（アマシャム製）で放
射性ラベルした後、一次スクリーニングとしてコロニー
ドットハイブリダイゼーション法によって、表１に示し
たビフィドバクテリウム５菌種10菌株に対する特異性の
検討を行った。
ャム製）を用いて、ニックトランスレーション法（アマ
シャム製）又はマルチプライム法（アマシャム製）で放
射性ラベルした後、一次スクリーニングとしてコロニー
ドットハイブリダイゼーション法によって、表１に示し
たビフィドバクテリウム５菌種10菌株に対する特異性の
検討を行った。
【００３５】
【表１】
【００３６】(5) ターゲットフィルターの作製 ビフィドバクテリム10菌株をＶＬＭ培地３mMで37℃一晩
嫌気培養し、生理食塩水−ＥＤＴＡ（0.15Ｍ ＮａＣ
ｌ，10 mM ＥＤＴＡ）で遠心、洗浄後、ＯＤ660＝0.5
に調製した。この菌液の50μｌをジーン・スクリーン・
プラス・フィルター（商品名：Gene Screen Plus デュ
ポン製）にミニホールドII（商品名：Minifold II Ｓ＆
Ｓ社製）を用いてドットした。
嫌気培養し、生理食塩水−ＥＤＴＡ（0.15Ｍ ＮａＣ
ｌ，10 mM ＥＤＴＡ）で遠心、洗浄後、ＯＤ660＝0.5
に調製した。この菌液の50μｌをジーン・スクリーン・
プラス・フィルター（商品名：Gene Screen Plus デュ
ポン製）にミニホールドII（商品名：Minifold II Ｓ＆
Ｓ社製）を用いてドットした。
【００３７】ビフィドバクテリウムの溶菌、ＤＮＡの変
性、固定は、ジーン・スクリーン・プラスの指示書に準
拠し、 0.5Ｎ ＮａＯＨ ２分、２回、１Ｍトリス−塩
酸 pH 7.4 ２分、２回処理して行った。
性、固定は、ジーン・スクリーン・プラスの指示書に準
拠し、 0.5Ｎ ＮａＯＨ ２分、２回、１Ｍトリス−塩
酸 pH 7.4 ２分、２回処理して行った。
【００３８】(6) ハイブリダイゼーション クローン化した染色体ＤＮＡ断片をこのターゲットフィ
ルターの１０菌株のＤＮＡにハイブリダイズさせ、反応
特異性をオートラジオグラムによって調べた。ハイブリ
ダイゼーションはジーン・スクリーン・プラスの方法に
準拠して行った。尚、ハイブリダイゼーションバッファ
ーの組成は、50％ ホルムアミド，10％デキストラン硫
酸，１％ ＳＤＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，50mM トリス−塩
酸 pH7.4 ， 100μg/ml 変性サケ精子ＤＮＡ，10μg/m
l プローブＤＮＡとした。
ルターの１０菌株のＤＮＡにハイブリダイズさせ、反応
特異性をオートラジオグラムによって調べた。ハイブリ
ダイゼーションはジーン・スクリーン・プラスの方法に
準拠して行った。尚、ハイブリダイゼーションバッファ
ーの組成は、50％ ホルムアミド，10％デキストラン硫
酸，１％ ＳＤＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，50mM トリス−塩
酸 pH7.4 ， 100μg/ml 変性サケ精子ＤＮＡ，10μg/m
l プローブＤＮＡとした。
【００３９】プレハイブリダイゼーションは、42℃で、
30分の条件で行った。ハイブリダイゼーションは、42℃
で、一晩（12時間以上）の条件で行った。
30分の条件で行った。ハイブリダイゼーションは、42℃
で、一晩（12時間以上）の条件で行った。
【００４０】(7) ハイブリダイゼーション後のフィルタ
ーの洗浄 フィルターの洗浄はジーン・スクリーン・プラスの方法
で行った。即ち、２×ＳＳＣ（0.15Ｍ ＮａＣｌ− 0.0
15Ｍ クエン酸ナトリウム）溶液中に、室温で、５分放
置し、これを２回繰り返した。次に、２×ＳＳＣに１％
ＳＤＳを加えた溶液中に、65℃で、30分放置し、これを
２回繰り返し、更に 0.1×ＳＳＣ溶液中に、室温で、５
分放置し、これを２回繰り返し、洗浄した。
ーの洗浄 フィルターの洗浄はジーン・スクリーン・プラスの方法
で行った。即ち、２×ＳＳＣ（0.15Ｍ ＮａＣｌ− 0.0
15Ｍ クエン酸ナトリウム）溶液中に、室温で、５分放
置し、これを２回繰り返した。次に、２×ＳＳＣに１％
ＳＤＳを加えた溶液中に、65℃で、30分放置し、これを
２回繰り返し、更に 0.1×ＳＳＣ溶液中に、室温で、５
分放置し、これを２回繰り返し、洗浄した。
【００４１】(8) オートラジオグラフィー ハイスクリーン（商品名：HiScreen（フジフィルム社
製））を使用し、−70℃で、一晩、オートラジオグラフ
ィーを行った。得られたオートラジオグラムから、ＤＮ
Ａ断片の特異性を検討した。
製））を使用し、−70℃で、一晩、オートラジオグラフ
ィーを行った。得られたオートラジオグラムから、ＤＮ
Ａ断片の特異性を検討した。
【００４２】図１は組換え体クローンから任意に選ばれ
た25個の染色体ＤＮＡ断片の表１に示すビフィドバクテ
リウム５菌種10菌株に対するオートラジオグラムの結果
を示す説明図である。
た25個の染色体ＤＮＡ断片の表１に示すビフィドバクテ
リウム５菌種10菌株に対するオートラジオグラムの結果
を示す説明図である。
【００４３】５種類のビフィドバクテリウム菌種に対す
る反応の違いから、組換え体クローンから任意に選ばれ
た25個の染色体ＤＮＡ断片は、図１に示すように、以下
に示す３種類のオートラジオグラムパターンに別れた。
る反応の違いから、組換え体クローンから任意に選ばれ
た25個の染色体ＤＮＡ断片は、図１に示すように、以下
に示す３種類のオートラジオグラムパターンに別れた。
【００４４】パターン１：１９個。B.アドレセティス
(B. adolescetis)，B.ビフィダム(B. bfidum) ，B.ブレ
ーベ，B.インファンティス，B.ロンガムの５菌種全てに
反応した。しかし、B.アドレセティス，B.ビフィダムに
対する反応は、B.ブレーベの反応と同程度だった。これ
は、B.ブレーベの染色体ＤＮＡをプローブとして用いた
ときに得られる反応と同じパターンであった。
(B. adolescetis)，B.ビフィダム(B. bfidum) ，B.ブレ
ーベ，B.インファンティス，B.ロンガムの５菌種全てに
反応した。しかし、B.アドレセティス，B.ビフィダムに
対する反応は、B.ブレーベの反応と同程度だった。これ
は、B.ブレーベの染色体ＤＮＡをプローブとして用いた
ときに得られる反応と同じパターンであった。
【００４５】パターン２：５個。B.ブレーベ，B.インフ
ァンティス，B.ロンガムの３種類に反応し、B.アドレセ
ティス，B.ビフィダムには反応しなかった。また、B.イ
ンファンティス，B.ロンガムに対する反応は、B.ブレー
ベに対する反応に比べて弱かった。
ァンティス，B.ロンガムの３種類に反応し、B.アドレセ
ティス，B.ビフィダムには反応しなかった。また、B.イ
ンファンティス，B.ロンガムに対する反応は、B.ブレー
ベに対する反応に比べて弱かった。
【００４６】パターン３：２個。B.ブレーベ菌種のみに
反応した。B.ブレーベ菌種以外の４種類のビフィドバク
テリウムには、反応しなかった。
反応した。B.ブレーベ菌種以外の４種類のビフィドバク
テリウムには、反応しなかった。
【００４７】(9) ２次スクリーニング 一次スクリーニング終了時、B.ブレーベ菌種のみに反応
するＤＮＡ断片を用いて、表２に示すビフィドバクテリ
ウム15菌種31菌株に対する特異性を検討した。方法は一
次スクリーニングと同様にして行った。
するＤＮＡ断片を用いて、表２に示すビフィドバクテリ
ウム15菌種31菌株に対する特異性を検討した。方法は一
次スクリーニングと同様にして行った。
【００４８】
【表２】
【００４９】オートラジオグラフィ終了後、ターゲット
フィルターのＤＮＡスポット部分を切り出し、放射能活
性を測定した。測定はＬＳＣ−７００液体シンチレーシ
ョンカウンタ（Ａｌｏｋａ）で行い、シンチレーターに
はＡＣＳ II（商品名：アマシャム製）を用いた。B.ブ
レーベYIT4006 に対する反応を 100％として、％ホモロ
ジーを次式から算出した。
フィルターのＤＮＡスポット部分を切り出し、放射能活
性を測定した。測定はＬＳＣ−７００液体シンチレーシ
ョンカウンタ（Ａｌｏｋａ）で行い、シンチレーターに
はＡＣＳ II（商品名：アマシャム製）を用いた。B.ブ
レーベYIT4006 に対する反応を 100％として、％ホモロ
ジーを次式から算出した。
【００５０】
【００５１】尚、コントロールは、ＤＮＡを載せていな
いフィルターの測定値(C.P.M) を用いた。
いフィルターの測定値(C.P.M) を用いた。
【００５２】目的とするB.ブレーベに特異的なＤＮＡプ
ローブの候補として、パターン３を示した、 No.２と N
o.22の染色体ＤＮＡ断片を用いて、さらにビフィドバク
テリウム15菌種31菌株に対して２次のスクリーニングを
行った。
ローブの候補として、パターン３を示した、 No.２と N
o.22の染色体ＤＮＡ断片を用いて、さらにビフィドバク
テリウム15菌種31菌株に対して２次のスクリーニングを
行った。
【００５３】No.２染色体ＤＮＡ断片はB.ブレーベ以外
にもB.ロンガムUIT4037 ，B.インファンティスYIT4026
に交差反応することが解った。このことから No.22ＤＮ
Ａ断片をスクリーニングに用いた。
にもB.ロンガムUIT4037 ，B.インファンティスYIT4026
に交差反応することが解った。このことから No.22ＤＮ
Ａ断片をスクリーニングに用いた。
【００５４】図２は No.22の染色体ＤＮＡ断片の表２に
示す15菌種31菌株に対するオートラジオグラムの結果を
示す説明図であり、ａ図は15菌種31菌株の配置図、ｂ図
はオートラジオグラムのパターン図である。尚、図にお
いて各パターンのセクションは左に示した15菌種31菌株
の配置図のセクションと一致する。
示す15菌種31菌株に対するオートラジオグラムの結果を
示す説明図であり、ａ図は15菌種31菌株の配置図、ｂ図
はオートラジオグラムのパターン図である。尚、図にお
いて各パターンのセクションは左に示した15菌種31菌株
の配置図のセクションと一致する。
【００５５】図２に示す通り、 No.22は、B.ブレーベ６
株のみに反応し、B.ブレーベ以外の14菌種25菌株に対し
て、交差反応を示さなかった。
株のみに反応し、B.ブレーベ以外の14菌種25菌株に対し
て、交差反応を示さなかった。
【００５６】また、表３に示す通り、B.ブレーベ菌種６
株に対するホモロジーは47％− 100％であり、B.ブレー
ベ以外の菌株に対するホモロジーは３％以下であった。
λHindIII 分子量マーカーとの比較から、 No.22のＤＮ
Ａ断片の長さは 1.8 Kbpであることが解った。 No.22は
プラスミドベクターｐＵＣ１２に連結し、大腸菌に形質
転換した E.coli JM109 (pBB22) として、微工研に寄託
済み（微工研菌寄第１１９３２号）である。
株に対するホモロジーは47％− 100％であり、B.ブレー
ベ以外の菌株に対するホモロジーは３％以下であった。
λHindIII 分子量マーカーとの比較から、 No.22のＤＮ
Ａ断片の長さは 1.8 Kbpであることが解った。 No.22は
プラスミドベクターｐＵＣ１２に連結し、大腸菌に形質
転換した E.coli JM109 (pBB22) として、微工研に寄託
済み（微工研菌寄第１１９３２号）である。
【００５７】
【表３】
【００５８】(10)腸内フローラ主要構成菌種に対する特
異性の検討 ２次スクリーニング終了後、B.ブレーベのみに反応した
ＤＮＡ断片（ No.22）について、更に、表４に示す腸内
フローラの主要構成菌種である18属47菌種49株から抽出
した染色体ＤＮＡに対して特異性を検討した。
異性の検討 ２次スクリーニング終了後、B.ブレーベのみに反応した
ＤＮＡ断片（ No.22）について、更に、表４に示す腸内
フローラの主要構成菌種である18属47菌種49株から抽出
した染色体ＤＮＡに対して特異性を検討した。
【００５９】
【表４】
【００６０】ターゲットフィルターは、各染色体ＤＮＡ
を 0.125Ｎ ＮａＯＨ， 0.125×ＳＳＣの条件下で 100
℃、５分間変性させ、それぞれ 500ｎｇをミニホールド
IIを用いて、ジーン・スクリーン・プラスにドットし、
作製した。ハイブリダイゼーションは、一次スクリーニ
ングと同様に行った。
を 0.125Ｎ ＮａＯＨ， 0.125×ＳＳＣの条件下で 100
℃、５分間変性させ、それぞれ 500ｎｇをミニホールド
IIを用いて、ジーン・スクリーン・プラスにドットし、
作製した。ハイブリダイゼーションは、一次スクリーニ
ングと同様に行った。
【００６１】図３は No.22の染色体ＤＮＡ断片の表４に
示す18属47菌種49菌株に対するオートラジオグラムの結
果を示す説明図であり、ａ図は18属47菌種49菌株の配置
図、ｂ図はオートラジオグラムのパターン図である。
尚、図において各パターンのセクションは左に示した18
属47菌種49菌株の配置図のセクションと一致する。図３
に示す通り、 No.22はB.ブレーベ菌種のみに反応した。
示す18属47菌種49菌株に対するオートラジオグラムの結
果を示す説明図であり、ａ図は18属47菌種49菌株の配置
図、ｂ図はオートラジオグラムのパターン図である。
尚、図において各パターンのセクションは左に示した18
属47菌種49菌株の配置図のセクションと一致する。図３
に示す通り、 No.22はB.ブレーベ菌種のみに反応した。
【００６２】更に、腸内フローラの主要構成菌種である
18属47菌種49菌株の染色体ＤＮＡに対して特異性を検討
した。結果を次の表５に示す。
18属47菌種49菌株の染色体ＤＮＡに対して特異性を検討
した。結果を次の表５に示す。
【００６３】
【表５】
【００６４】表５に示す通り、B.ブレーベ以外の菌株に
対するホモロジーは５％以下であった。
対するホモロジーは５％以下であった。
【００６５】このようにして得られたB.ブレーベ染色体
ＤＮＡ断片 No.22はB.ブレーベの菌種検出、同定、定量
に使用する十分な特異性を示すことが判明した。
ＤＮＡ断片 No.22はB.ブレーベの菌種検出、同定、定量
に使用する十分な特異性を示すことが判明した。
【００６６】(11)B.ブレーベに特異的なＤＮＡプローブ
を用いた糞便中のB.ブレーベの同定 得られたプローブ No.22を用いて実際に、糞便中のB.ブ
レーベの同定を行った。人の糞便を嫌気的に緩衝液で１
０段階希釈し、ビフィドバクテリウムの選択培地である
ＭＰＮ培地(Tanaka R,Mutai M.1980.Inproved medium f
or selective isolation and enumeration of bifidoba
cterium.Applied and Invironmetal Microbiology 40:8
66-869.)に塗布し、３日間、37度で嫌気的に培養した。
単一なコロニーが形成されているプレートを選び、コロ
ニーをフィルターにレプリカした。
を用いた糞便中のB.ブレーベの同定 得られたプローブ No.22を用いて実際に、糞便中のB.ブ
レーベの同定を行った。人の糞便を嫌気的に緩衝液で１
０段階希釈し、ビフィドバクテリウムの選択培地である
ＭＰＮ培地(Tanaka R,Mutai M.1980.Inproved medium f
or selective isolation and enumeration of bifidoba
cterium.Applied and Invironmetal Microbiology 40:8
66-869.)に塗布し、３日間、37度で嫌気的に培養した。
単一なコロニーが形成されているプレートを選び、コロ
ニーをフィルターにレプリカした。
【００６７】フィルター上のコロニーを上記に示した方
法により、溶菌、ＤＮＡの変性、固定を行ない、マルチ
プライム法によって32Ｐで標識した No.22プローブとハ
イブリダイズさせた。非特異的な反応を洗浄して除去
し、オートラジオグラフィーを行なった。
法により、溶菌、ＤＮＡの変性、固定を行ない、マルチ
プライム法によって32Ｐで標識した No.22プローブとハ
イブリダイズさせた。非特異的な反応を洗浄して除去
し、オートラジオグラフィーを行なった。
【００６８】ＭＰＮ培地上には、B.ブレーベ以外にもB.
アドレセティス，B.ビフィダム，B.ロンガム，B.インフ
ァンティスなどのビフィドバクテリウムが増殖してくる
が、B.ブレーベに特異的なＤＮＡプローブ No.22はB.ブ
レーベのみに反応した。コロニーの位置に相当するオー
トラジオグラフィーの陽性に反応したスポットの数か
ら、B.ブレーベのコロニー数を求めた。 121個のコロニ
ー中、17個のコロニーがB.ブレーベであった。
アドレセティス，B.ビフィダム，B.ロンガム，B.インフ
ァンティスなどのビフィドバクテリウムが増殖してくる
が、B.ブレーベに特異的なＤＮＡプローブ No.22はB.ブ
レーベのみに反応した。コロニーの位置に相当するオー
トラジオグラフィーの陽性に反応したスポットの数か
ら、B.ブレーベのコロニー数を求めた。 121個のコロニ
ー中、17個のコロニーがB.ブレーベであった。
【００６９】希釈率を計算し、糞便中には、１ｇあたり
1.7×108 のB.ブレーベが存在することが解った。
1.7×108 のB.ブレーベが存在することが解った。
【００７０】
【発明の効果】上述した通り、B.ブレーベに特異的なＤ
ＮＡプローブはその特異性が非常に高く、食品中や糞便
中に存在する様々な細菌にたいして交差反応を示さな
い。これは、この様な検体中のB.ブレーベをその他細菌
に影響されずに、検出、同定、定量する事が可能である
事を示している。
ＮＡプローブはその特異性が非常に高く、食品中や糞便
中に存在する様々な細菌にたいして交差反応を示さな
い。これは、この様な検体中のB.ブレーベをその他細菌
に影響されずに、検出、同定、定量する事が可能である
事を示している。
【００７１】従って、本発明により作成された核酸プロ
ーブによって、従来用いられているグラム染色、形態観
察、ガスクロマトグラフィー、糖発酵試験などの70項目
に及び検査を行なわずにB.ブレーベを同定することが可
能である。これによって、大幅な労力の省力化と時間、
コストの削減が行なわれる。
ーブによって、従来用いられているグラム染色、形態観
察、ガスクロマトグラフィー、糖発酵試験などの70項目
に及び検査を行なわずにB.ブレーベを同定することが可
能である。これによって、大幅な労力の省力化と時間、
コストの削減が行なわれる。
【００７２】また、ビフィドバクテリウムの同定には熟
練を要するが、種特異的なＤＮＡプローブを用いた方法
は、操作が単純で、結果の判定が明確に行なえる事から
試験者に熟練を必要とせず、一度に大量の検体をこなす
事が可能である。
練を要するが、種特異的なＤＮＡプローブを用いた方法
は、操作が単純で、結果の判定が明確に行なえる事から
試験者に熟練を必要とせず、一度に大量の検体をこなす
事が可能である。
【００７３】以上のように、本発明により作成された核
酸プローブは、糞便、消化管、乳製品、乳酸菌飲料中に
存在するB.ブレーベを検出、同定、定量するために有用
である。
酸プローブは、糞便、消化管、乳製品、乳酸菌飲料中に
存在するB.ブレーベを検出、同定、定量するために有用
である。
【図１】組換え体クローンから任意に選ばれた25個の染
色体ＤＮＡ断片の表１に示すビフィドバクテリウム５菌
種10菌株に対するオートラジオグラムの結果を示す説明
図である。
色体ＤＮＡ断片の表１に示すビフィドバクテリウム５菌
種10菌株に対するオートラジオグラムの結果を示す説明
図である。
【図２】No.22の染色体ＤＮＡ断片の表２に示す15菌種3
1菌株に対するオートラジオグラムの結果を示す説明図
であり、ａ図は15菌種31菌株の配置図、ｂ図はオートラ
ジオグラムのパターン図である。
1菌株に対するオートラジオグラムの結果を示す説明図
であり、ａ図は15菌種31菌株の配置図、ｂ図はオートラ
ジオグラムのパターン図である。
【図３】No.22の染色体ＤＮＡ断片の表４に示す18属47
菌種49菌株に対するオートラジオグラムの結果を示す説
明図であり、ａ図は18属47菌種49菌株の配置図、ｂ図は
オートラジオグラムのパターン図である。
菌種49菌株に対するオートラジオグラムの結果を示す説
明図であり、ａ図は18属47菌種49菌株の配置図、ｂ図は
オートラジオグラムのパターン図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (3)
- 【請求項１】 ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifid
obacterium breve)染色体の種特異的ＤＮＡ部位に相補
的なビフィドバクテリウム・ブレーベのＤＮＡプロー
ブ。 - 【請求項２】 ビフィドバクテリウム・ブレーベ染色体
ＤＮＡから制限酵素HindIII による切断によって得られ
た1.8 Kbp の染色体ＤＮＡ断片又は該ＤＮＡ断片と同様
の塩基配列を備えたビフィドバクテリウム・ブレーベの
ＤＮＡプローブ。 - 【請求項３】 前記請求項１又は２に記載のビフィドバ
クテリウム・ブレーベのＤＮＡプローブを用いたビフィ
ドバクテリウム・ブレーベの同定法において、 前記ＤＮＡプローブに標識マーカを施し、 該標識マーカを施したＤＮＡプローブと被同定物のＤＮ
Ａとをハイブリダイズし、ハイブリダイズした被同定物
を検出することを特徴とするビフィドバクテリウム・ブ
レーベのＤＮＡプローブを用いた同定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3191261A JPH0568595A (ja) | 1991-07-05 | 1991-07-05 | ビフイドバクテリウム・ブレーベ同定用ｄｎａプローブ及びそれを用いた同定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3191261A JPH0568595A (ja) | 1991-07-05 | 1991-07-05 | ビフイドバクテリウム・ブレーベ同定用ｄｎａプローブ及びそれを用いた同定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568595A true JPH0568595A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=16271597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3191261A Pending JPH0568595A (ja) | 1991-07-05 | 1991-07-05 | ビフイドバクテリウム・ブレーベ同定用ｄｎａプローブ及びそれを用いた同定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0568595A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5443951A (en) * | 1992-07-20 | 1995-08-22 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
| CN118480615A (zh) * | 2024-05-14 | 2024-08-13 | 迪辅乐生物(上海)有限公司 | 基于比较基因组的双歧杆菌三重绝对定量荧光pcr核酸检测试剂盒 |
-
1991
- 1991-07-05 JP JP3191261A patent/JPH0568595A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5443951A (en) * | 1992-07-20 | 1995-08-22 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same |
| CN118480615A (zh) * | 2024-05-14 | 2024-08-13 | 迪辅乐生物(上海)有限公司 | 基于比较基因组的双歧杆菌三重绝对定量荧光pcr核酸检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hein et al. | Detection and quantification of the iap gene of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by a new real-time quantitative PCR assay | |
| JP3015462B2 (ja) | リステリア検出のためのプローブ類及び方法 | |
| US6723505B1 (en) | Method for identification of the indicators of contamination in liquid samples | |
| JP3097059B2 (ja) | 標的ヌクレオチド配列に対する特異的プローブの生成 | |
| Yamamoto et al. | Species-specific oligonucleotide probes for five Bifidobacterium species detected in human intestinal microflora | |
| US5443951A (en) | Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same | |
| JP3423597B2 (ja) | 細菌の同定方法 | |
| Jantzen et al. | Specific detection of Listeria monocytogenes in foods using commercial methods From chromogenic media to real-time PCR | |
| Ehrmann et al. | Reverse dot blot hybridization: a useful method for the direct identification of lactic acid bacteria in fermented food | |
| EP1311706A1 (en) | A method of detecting microorganisms | |
| Ward et al. | Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria | |
| Foster et al. | Cetobacterium ceti gen. nov., sp. nov., a new Gram‐negative obligate anaerobe from sea mammals | |
| US7183085B1 (en) | Method and nucleic acids for determining the presence of micro-organisms specific to the brewing process | |
| Laitinen et al. | PCR-ELISA: I: Application to simultaneous analysis of mixed bacterial samples composed of intestinal species | |
| US20040219574A1 (en) | Method for the specific fast detection of bacteria which are harmful to beer | |
| US5869642A (en) | Detection of the genus pectinatus | |
| Bartowsky et al. | Use of a polymerase chain reaction for specific detection of the malolactic fermentation bacterium Oenococcus oeni (formerly Leuconostoc oenos) in grape juice and wine samples | |
| JPH0568595A (ja) | ビフイドバクテリウム・ブレーベ同定用ｄｎａプローブ及びそれを用いた同定法 | |
| JPH02154700A (ja) | カンピロバクター属の異なる細菌種を特異的に検出するために有用な核酸プローブ | |
| KR20020089391A (ko) | 호산균의 핵산 프라이머 및 호산균의 동정 방법 | |
| EP0326989B1 (en) | Method and kit for bacterial identification using chromosomal DNA | |
| US7439022B2 (en) | Nucleic acids for detection of Listeria | |
| EP0826778A1 (en) | Oligonucleotide probes for the detection of bifidobacteria | |
| Klaubauf et al. | Research Tools and Methods for the Analysis of Microbiota in Dairy Products | |
| JP4427806B2 (ja) | 腸内細菌検出用オリゴヌクレオチド及び腸内細菌の検出方法 |