JPH05509230A - ライグラスの花粉のアレルゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ライグラス、ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ） Ｌ、の花粉からの主要なアレルゲン性タンパク質、およびその誘導体および相同 体、およびそれに免疫学的に関係するアレルゲン性タンパク質に関係する。本発 明は、また、組み換えＬｏｌ　ｐｒａおよびＬｏｌ　ｐＩｂおよびそれらの誘導 体、およびそれらの合成を指令することができる発現ベクターに関係する。なお とくに、本発明は、ＬＯＩ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐＩｂを別々にエンコードす るｃＤＮＡ、およびそれからなる発現ベクターに関係する。

発明の背景 アレルゲンは、温和な気候におけるアレルゲン性疾患の大部分原因である、草の 花粉（ｇｒａｓｓ　ｐｏｌｌｅｎ）の最も豊富なタンパク質を構成する（Ｍａｒ ｓｈ　（１９７５）アレルギーのアレルゲンおよび遺伝学（Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ 　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆａｌ　Ｉｅｒｇｙ：Ｍ、５ｅｌａ　 （編）、抗原（Ｔｈｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ）、Ｖｏｌ、３、ｐｐ、２７１−３５ ９、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、ｏンドン、ニューヨーク）　、 Ｈｉ　Ｉ　ｌら（１９７９）メディカル・ジャー六ル・オブ・オーストラリア（ Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｕ５ｔｒａ１ｉａ）１．４２６−４ ２９）、ライグラスにおけるアレルゲン性タンパク質の最初の記載は、それらが 免疫化学的に明確であり、そして群■、ＩＩ、ＩＩＩおよび［Ｖとして知られて いることを示した０ｏｈｎｓｏｎおよびＭａｒｃｈ　（１９６５）免疫化学（Ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）３．９ｌ−１００）。免疫学学会の国際 的二ニオ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌＵｎｉｏｎｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ）（ＩＵＩＳ）の名称を使用して、これらのアレ ルゲンはＬｏｌ　ｐｌ、Ｌｏｔ　ｐｉＩＳＬｏｌ　ｐｌＩＩおよびＬｏｌ　ｐｌ Ｖと表示された。

これらの４つのタンパク質は花粉ライグラス、ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌ　ｉ ｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）Ｌ、において同定され、これらは感受性のヒトにおける 直ちの（１型）過敏症をトリガーする抗原として作用する。

Ｌｏｌ　ｐｉは、ライグラス感受性壱者の血清の中の特異的１ｇＥに結合し、Ｉ ｇＧの応答において抗原として作用し、そしてＴ−細胞の応答をトリガーする能 力をもつために、アレルゲンとして定義される。アレルゲンの性質は草の花粉に 感受性の患者の直接の皮膚の試験により評価された。結果は８４％はがＬｏｌ　 ｐｌに対する皮膚の感受性を有することを示しくＦｒｅｉｄｈｏｆｆら（１９８ ６）ジャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロシー（Ｊ、 　Ａｌ　］　ｅ　ｒｇｙＣｌ　ｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）７８：１１９０−１２ ０１）　、アレルゲンとしてのこのタンパク質の大部分重要性を証明した。さら に、草の花粉に感受性であると証明された壱者の９５％は、イムノブロッティン グにより証明されるように（ＦｏｒｄおよびＢａ　Ｉｄｏ　（１９８６）インタ ーナショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド拳イムノ ロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ 　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｇｙ）８↓：１９３−２０３）、Ｌｏｌ　ｐＴに結合する特異的１ｇＥ抗体を有 した。

草の花粉の間の実質的なアレルゲン性交差反応性は、ＩｇＥ結合アッセイ、ラジ オアレグロ収着試験（ＲＡ　Ｓ　Ｔ）を使用して、例えば、Ｍａｒｓｈら（１９ ７０）ジャーナル・オブ・アレルギー（Ｊ、ＡＩＩｅｒｇｙ）↓旦、１０７−１ ２１、およびＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ　（１９７８）Ｐｒｏｇ、ＡＩ　Ｉｅｒｔｙ 、２５．１−６２　（バーゼル、カーガー）に記載されているように、証明され た。

Ｌｏｌ　ｐＩと他の草の花粉の抗原との免疫化学的関係は、ポリクローナル抗体 およびモノクローナル抗体を使用して証明された（例えば、Ｓｍａｒ　ｔおよび Ｋｎｏｘ　（１９７９）インターナショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー ・アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈ ｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ）６２：１７３−１８７：ＳｉｎｇｈおよびＫｎｏｘ　（１９８５）インタ ーナショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノ ロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇ ｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）ヱ旦；３００−３０４） 。

精製されたタンパク質およびＩｇＥ結合性成分の両者に対する抗体調製された。

これらのデータは、密接に関係する草の花粉の中に存在する主要なアレルゲンが Ｌｏｌ　ｐｉに免疫化学的に類似することを証明した（Ｓｍａｒ　ｔおよびＫｎ ｏｘ、前掲）。

本発明によれば、Ｌｏｌ　ｐｌは２つのタンパク質、ここにおいてＬｏｌ　ｐＩ ａおよびＬｏｌ　ｐｌｂと表示する、からなることが発見された。これらのタン パク質をエンコードする遺伝子は、今回、クローニングされ、組み換えアレルゲ ンの大規模の生産を可能とした。こうして、本発明の１つの面は、Ｌｏｔ　ｐｌ ａおよびＬｏｌ　ｐｌｂをコードする核酸配列を提供する。

本発明の他の面は、草の種の花粉からのアレルゲン性活性を表すタンパク質をエ ンコードするＤＮＡ配列からなる組み換えベクターに関する。

よりとくに、草の種はボアセフ−ｒ−（Ｐｏａｘｅａｅ）（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ ）族、なおとくにロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）属に属する。なおさらにとくに、ア レルゲン性タンパク質はロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ） の花粉のＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂのタンパク質に対する抗体と免疫 学的に交差反応性であるとして特性決定された、すなわち。

ブーイド（Ｐｏｏｉｄ）（フェスツコイド（ｆｅｓｔｕｃｏｉｄ））草。群１： トリチカネア（Ｔｒｉｔｉｃａｎｅａ）：Ｂｒｏｍｕｓｕｉｎｅｒｍｉｓ、スム ースブロウム（ｓｍｍｔｈ　ｂｒｏｍｅ）；Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｒｅｅｎｓ、 イングリッシュコウチ（Ｅｎｇｌｉｓｈｃｏｕｃｈ）：。群２：ボアナエ（Ｐｏ ａｎａｅ）＋Ｄａｃｔｙｌ　ｉｓ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ、コックスフート（ｃｏ ｃｋｓｆｏｏｔ）のカブガヤ；Ｆｅ５ｔｕｃａ　ｅｌａｔｏｒ、メドウフエスキ ュ（ｍｅａｄｏｗ　ｆｅｓｃｕｒｅ）；Ｌｏｌｊｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ、ペレニ アルライグラス；Ｌ、ｍｕｌｔ　ｉｆ　Ｉｏｒｕｍ、イタリアンライグラス：Ｐ ｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ、ナカハグサ；Ｐ、ｃｏｍｐｒｅｓｓａ、フラットン ド（ｆ　Ｉ　ａ　ｔ　ｔ　ｅｎｅｄ）ナカハグサ；Ａｖｅｎａ　５ａｔｉｖａ、 カラスムギ；Ｈｏ１ｃｕｓ　Ｉａｎａｔｒｕｓ、ベルベットグラス；Ａｒｒｈｅ ｎａｔｈｅｒｕｍ　ｅｌａｔｉｕｓ１オオカニツリ：Ａｇｒｏｓｔｉｓ　ａｌｂ ａ、コヌカグサ；Ｐｈｌｅｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ、チモシー；Ｐｈａｌａｒｉ ｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、フサヨシ。Ｐａｎ１ｃｏｉｄ草、ｐａｓｐａｌｕ ｍ　ｎｏｔａｔｕｍ１バヒアグラス（Ｂａｈｉａ　ｇｒａｓｓ）、アンドロボゴ ノイド（Ａｎｄｏｒｏｐｏｇｏｎｏｉｄ）草：Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｈａｌｅｐｅｎ ｓｉｓ、セイバンモロコシ。

本発明の他の面は、ライグラス、ロリウム・ペレンネ（Ｌｏ　Ｉ　ｉ　ｕｍｐｅ ｒｅｎｎｅ）Ｌ、の花粉のアレルゲン性タンパク質Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ 　ｐＩｂ、またはその誘導体または相同体からなる組み換えベクターに関係する 。より詳しくは、本発明は、真核生物または原核生物の複製由来、検出可能なマ ーカー、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌｐＩｂのアレルゲン性タンパク質またはそ の誘導体または相同体または前記Ｌｏｌ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐＩｂ）ランス ジェニック植物またはそれらの誘導体または相同体に対する抗体と交差反応性の アレルゲン性タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、および必要に応じて前記 アレルゲン性タンパク質の転写を指令することができるプロモーター配列からな る組み換えＤＮＡ分子に関係する。

本発明のなお他の面は、組み換えＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｉｂまたはそ の誘導体または相同体、あるいはＬｏｌ　ｐｌａまたはり。

Ｉ　ｐｌｂまたはその誘導体または相同体に対する抗体と免疫学的に反応性のア レルゲン性タンパク質を生産する方法を包含し、この方法は、復製可能な組み換 えＤＮＡ分子を含有する有機体を、前記組み換えＤＮＡ分子が安定に維持されか つ■、ｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、その少なくとも１つの断片、または その誘導体または相同体の合成を指令する条件下にかつ十分な時間の間培養する ことからなり、前記組み換えＤＮＡ分子は、前記有機体の中で発現することがで きるプロモーター、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、またはその少な（と も１つの断片、またはその誘導体または相同体、またはＬｏｌ　ｐｌａまたはＬ ＯＩ　ｐｌｂの免疫学的に関係するタンパク質をエンコードし、前記プロモータ ーから下流に位置しかつそれから転写された遺伝子、選抜可能なマーカーおよび 原核生物の複製由来を含有するＤＮＡベヒクルからなる。

本発明のなお他の面において、天然以外の（すなわち、組み換え体または化学的 に合成された）Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬＯｌ　ｐｌｂまたはそれらの誘導体また は相同体、あるいはＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌｐｌｂまたはそれらの誘導体ま たは相同体に対する抗体と免疫学的に交差反応性の天然以外のアレルゲン性タン パク質が提供される。

Ｌｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐｌｂのタンパク質、およびそれらから誘導され た断片または一部分（ペプチド）を、ライグラスの花粉に対するアレルギー性反 応の診断、処置および予防の方法において使用することができる。

本発明のなおしかも他の面は、天然以外のＬｏｌ　ｐｌａまたはＬＯＩ　ｐｌｂ またはそれらの誘導体または相同体に対する抗体に関係する。

本発明のなおしかも他の面において、血清または池の生物学的流体の中のポアセ アエ（Ｐｏａｘｅａｅ）（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）族の花粉からのアレルゲン性タ ンパク質に対する抗体を検出する方法が提供され、−口 この方法は前記血清または流体を組み換えＬｏｌ　ｐｅａまたはＬｏｌｐｔｂま たはそれらの抗原性誘導体と、抗体−Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ複合 体が形成するために十分な時間の間かつ条件下に、接触させ、そして前記複合体 を検出することからなる。

本発明の他の面は、組み換えＤＮＡ分子上に位置するライグラスの花粉のプロモ ーター配列またはその相同体またはその同義性の形態からなり、そしてさらに前 記プロモーターより下流に１または２以上の制限部位を有し、こうしてこれらの 部位の１または２以上のの中に挿入されたヌクレオチド配列が正しいリーディン グフレームで転写可能である。

１つの実施態様において、組み換えＤＮＡ分子は、ライグラス、ロリウム・ペレ ンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）Ｌ、の花粉からＬＯｌ　ｐｌａまたはＬ ｏｌ　ｐｌｂの合成を指令するプロモーターからなり、これにより発育的に調節 された、花粉特異的、発現ベクターである。

本発明のそれ以上の面は、工程： ａ）組み換えＤＮＡ分子を有する植物を発育させ、前記組み換えＤＮＡ分子はそ の上に位置するライグラスの花粉のプロモーター配列またはその相同体または同 義性の形態、およびポアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）族から誘導された細胞の中で 有害な機能を有するポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列からなり、 前記ヌクレオチド配列は前記プロモーターから転写可能であり、そして前記組み 換えＤＮＡ分子は花粉を生産する細胞を安定に含有し、そして ｂ）植物の発育段階について、前記プロモーターから前記ヌクレオチド配列を発 現させ、これにより前記花粉を生産する細胞に対して有害な機能を有するポリペ プチドを生産し、こうして花粉の形成が阻害されるか、あるいは前記花粉が不活 性であるために十分な条件下にかつ時間の間、前記植物を成長させる、 からなる、ポアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）族の植物において核の雄性不稔性を誘 発する方法を包含する。

本発明の他の特徴は、添付図面と組み合わせて本発明の好ましい実施態様の以下 の詳細な説明から、いっそうよく理解されるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、ボアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）の群■アレルゲンに対して特異的なｃ ＤＮＡクローンの単離を示す。第１ａ図は、３つの異なるＭａｂ　ＦＭＣ−ＡＩ 　（４０，１）　、ＦＭＣ−Ａ７　（１２，３）　、３．２（ＫａｈｎおよびＭ ａｒｓｈ　（１９８６）モレキュラー・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、）２３：１２８１−１２８８；ＳｉｎｇｈおよびＫｎｏｘ　（１ ９８５）インターナショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・アプ ライド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ 　Ａｌｌｅｒｇｙａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）７旦：３０ ０−３０４　：　Ｓｍａ　ｒ　ｔら（１９８３）インターナショナル・アーチー ブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｊｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉ ｅｄ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＹ）７２：２４３−２４８）およびアレルゲン性患者 の血清からのＩｇＥによる、陽性のクローン（１２Ｒ）の認識を示す。Ｃは一次 Ｍａｂが省略された対照である。第１ｂ図は、ライグラスの花粉からの群■抗原 に属するＭａｂおよびＩｇＥのイムノプロット分析を示す。レーン１は全体のタ ンパク質のプロフィル（クーマツシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ） の染色）：シーン２：Ｍａｂ４Ｑ、ｌ；レーン３：Ｍａｂ２１．３：レーン４： Ｍａｂ１２゜３、レーン５；ＩｇＥ抗体。

第２図は、群Ｉのアレルゲンの転写の組織型および細胞型特異的の発現を示す。

第２ａ図はＲＮＡのプロットハイプリダイゼーシコンを示す。

ポリ（Ａ）＋ＲＮＡが異なる植物の組織から単離された二種子、葉、根および花 粉。第２ｂ図は、群■の抗原の組織型および細胞型特異的分布を示す。可溶性タ ンパク質を異なる植物組織から抽出した：花、葉、根および花粉、そしてＭａｂ ４０．１．１２．３およびＩｇＥ抗体を使用してイムノプロットにかけた。

第３図は、ライグラスの花粉のクローン１２ＲのｃＤＮＡ配列、予測されたアミ ノ酸配列および親水性プロフィルを示す。第３ａ図はラムダ−１２ＲのｃＤＮＡ の概略的制限地図を示す。ハツチングを施したボックスは予測された翻訳のオー プンリーディングフレームを表す。第３ｂ図は、１２４２ヌクレオチドのＥ、ｃ ｏｌｉのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａインサートのラムダ−１２Ｒのヌクレオチド配列および 推定されたアミノ酸配列を示す。

単一の文字のコードにより表される推定されたアミノ酸配列は、第３ｂ図におい てＤＮＡ配列の上に示されており、そしてヌクレオチド４０における最初の潜在 的なインフレームの開始コドンで開始する。１つの中断されないオープンリーデ ィングフレームは、３０８アミノ酸（第３ｂ図においてＤＮＡ配列より上の番号 ）の間連続し、そして星印で司滅すＴＧＡ停止コドンで終わる。推定上のシグナ ルペプチドはアミノ酸残基１−９．１２−１７、および１９がＮ−末端の配列決 定により同定された。第３ｃ図は、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ　（１９８１）プ ロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ 。

ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７８：３８２４−３８２８の方 法に基づいて、７つのアミノ酸のウィンドウを使用した、親水性プロフィルを示 す。

第４図は、イムノブロッティングを使用するＬｏｌ　ｐＩｂのクローン１２Ｒの 中のＩｇＥおよびＭａｂ反応性エピトープの描写を示す：第４ａ図＋ＩｇＥ抗体 ：第４ｂ図：Ｍａｂ４０．１；および第４Ｃ図：Ｍａ　ｂ　１２．　３ｏ第４ａ 図〜第４Ｃ図についての対照は、非組み換えプラスミドで形質転換されたバクテ リアにより提供される。

第５図は、特異的Ｍａｂおよび免疫金のプローブを使用してライグラスの成熟花 粉の中のＬｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐｌｂの検出を示す。

第５ａ図は、走査型電子顕微鏡検査により可視化された全体の花粉粒を示し、単 一の胚の小孔を示す。目盛りのバーは３０μｍである。第５ｂ図は、免疫金の局 在化−二重標識つけによる、Ｌｏｌ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐｕｂの細胞の部位 の検出を示す。第５Ｃ図は、水に３０秒間、暗い場の照明に暴露した後の、新鮮 な、生存しうる花粉の外観を示す。

第６図は、Ｌｏｌ　ｐＩａの一部分をコードする配列を有する、クローン１３Ｒ のヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列を示す。

第７ａ図および第７ｂ図は、ｃＤＮＡクローン２６．ｊのヌクレオチド配列およ びそん予測されたアミノ酸配列を示す。クローン２６　ｊはＰＣＲ発生したＬｏ ｌ　ｐｅａの全長のクローンである。

発明の詳細な説明 本発明によれば、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ 　ｐＩｂをエンコードする遺伝子、宿主細胞の中のそれを発現する方法提供され 、これにより組み換えＬｏｌ　ｐｌａおよびＬｏｌｐｌｂ源およびＬｏｌ　ｐｌ ａおよびＬｏｌ　ｐｌｂのプロモーターまたはその下流に位置する任意の遺伝学 的配列が提供される。

ここにおけるデータは、ライグラスの花粉の主要なアレルゲン考えられるもの、 Ｌｏｌ　ｐＩ、が、実際に、２つの異なるタンパク質：ＬＯｌ　１）［ａ、３５ ｋＤのタンパク質、ｐＩ５．５およびＬｏｌ　ｐｌｂ。

３１／３３ｋＤのタンパク質、ｐＩ９．ｏ、からなることを示す。Ｌ。

Ｉ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐＩｂをエンコードする相補的ＤＮＡクローンを別々 に単離し、そして特性決定した。Ｌｏｌ　ｐｌｂは、ｃ　ＤＮＡのクローニング 、ＮＨ２−末端のアミノ酸配列およびアレルゲン性交差反応性の不存在から推定 された、Ｌｏｌ　ｐＩａと異なる一次構造および組成を有する。Ｌｏｌ　ｐＩｂ は、花粉の中で、アレルゲンをプラスチドヘターゲッティングする、２５アミノ 酸のシグナルペプチドをもつ前アレルゲンとして合成される。これに引き続いて ペプチドの切断が存在し、そして成熟花粉において、アレルゲンは澱粉粒の中に 主として存在する。

遺伝学的物質の本来の源は、オーストラリア国メルボルン付近の畑源から集めら れた、ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）Ｌ、からの新鮮な トランスジェニック植物、および供給会社（クローン・ラボラトリーズ（Ｇｒｅ ｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｊｅｓ）、ノースカロライナ州レノイア）からの大量 の集められた花粉である。これらの花粉源は、花粉の１つの便利な供給を表すだ けであるので、本発明の範囲を限定しない。本発明は、任意の位置からの花粉を 使用して実施することができる。

「遺伝子」は、本発明に関して、おの最も広い意味において使用し、そしてヌク レオチドの任意の隣接する配列、ｍＲＮＡ分子に導（転写を意味し、前記ｍＲＮ Ａ分子はタンパク質に翻訳されることができる。Ｌｏｌ　ｐＩｂをエンコードす る遺伝子は、タンパク質またはタンパク質の誘導体または相同体をエンコードす るヌクレオチド配列を意味し、これらはＬｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐｌｂの 間の共通の抗原性エピトープを含有する誘導体を包含する、単一または多数のア ミノ酸の置換、欠失または付加を含有することができる。同様に、Ｌｏｌ　ｐＩ ａの炭水化物に加えて、誘導体は前記炭水化物に対する単一または多数の置換、 希釈または付加を包含する。Ｌｏｌ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐｕｂの遺伝子は、 また、それぞれ、Ｌｏｔ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐｌｂのタンパク質の全長のま たは部分的長さに相当するｍＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡを意味する。

Ｌｏｌ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐｌｂをコードする核酸配列の中の配列の多形性 が存在ことが期待され、そして当業者は理解するように、Ｌｏｌ　ｐｅａおよび Ｌｏｌ　ｐｌｂをコードする核酸配列の中の１または２以上のヌクレオチドは、 自然のアルレの変異型のために、個々のロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐ ｅｒｅｎｎｅ）植物の間で変化することができる。任意のおよびすべてのこのよ うなヌクレオチドの変異型および生ずるアミノ酸の多形性は本発明の範囲内であ る。遺伝子の配列決定の間に発見されたＬｏｌ　ｐｌａをコードする遺伝子の多 形性は、実施例９に論じられている。また、当業者は理解するように、Ｌｏｌｐ ｌａおよびＬｏｌ　ｐｉｂの各々は高度に関係する遺伝子の別々の族の構成員で あることができ、それらのタンパク質はロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌ　ｉｕｍ　 ｐｅｒｅｎｎｅ）の花粉の中に存在する（例えば、Ｒａｆｎａｒら、（１９９１ ）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、）、２６６　：１２２９−１２３６　；Ｓｉ　Ｉ　ｖａｎｏｖｉ　ａｈら（１ ９９１）ジャーナル・オブ・ノくイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉｏ　 １．　Ｃｈｅｍ、　）　、λ６６　：　１２０４−１２１０）。任意のおよびす べての関係する族の構成員のヌクレオチド配列および対応する推定されたアミノ 酸配列は本発明の範囲内である。

したがって、本発明の範囲内に、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ、Ｌｏｌ 　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの少なくとも１つの断片（ペプチド）、およびそ れらのアミノ酸および／または炭水化物の誘導体が包含され、そしてＬｏｌ　ｐ ｅａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、前記Ｌ０１ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの断片、ま たはそれらの前記誘導体をエンコードする、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡお よびそれらの相同体または同義性の形態を包含する、ヌクレオチド配列が包含さ れる。さらに、本発明によれば、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、または 少なくとも１つのＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの断片、またはそれらの 誘導体に融合した、あるいはＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ。

Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの断片、および／またはヌクレオチド配列 をエンコードする誘導体に隣接するヌクレオチド配列に融合してた、分子、例え ば、ポリペプチドを包含する。例えば、本発明のいくつかの面について、Ｌｏｌ 　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたはＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの少な くとも１つの断片、またはそれらの誘導体およびオリゴヌクレオチドペプチドま たはタンパク質からのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を生産することを望 み、後者の例は酵素、例えば、ベーター−ガラクトノダーゼ、ホスファターゼ、 尿素などである。大部分の融合タンパク質は組み換え遺伝子の発現により形成さ れ、ここで２つの解読配列はそれらのリーディングフレームがインフェイズであ るように一緒にに接合される。あるいは、調製またはペプチドは化学的手段によ りｉｎ　ｖｉｔｒｏで連鎖することができる。ＬｏｔｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌ ｂまたはそれらのエンコードするヌクレオチド配列のこのような融合タンパク質 またはハイブリッドの遺伝学的誘導体は本発明に包含される。さらに、Ｌｏｌ　 ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの相同体および誘導体はそれらの合成誘導体を包含 する。ここにおいて解明されるようにヌクレオチド配列を使用して、エーテルの タンパク質を合成するか、あるいはある数の断片（ペプチド）を化学的合成によ りよく知られている方法（例えば、固相合成）により発生させることができる。

すべてのこのような化学的に合成されたペプチドは本発明に包含される。したが って、本発明は、単離されたＬｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐｌｂ、それらの断 片およびそれらの誘導体、相同体および組み換え手段によるか、あるいは化学的 手段により作られた免疫学的に関係するものを包含し、そしてＬｏｌ　ｐｌａお よびＬｏｌ　ｐｌｂの間で共通の抗原性エピトープを含有する誘導体を包含する ことができる。

用語の単離されたおよび精製されたは、ここにおいて互換的に使用され、そして ペプチド、タンパク質、タンパク質断片および核酸配列を意味し、これらは、組 み換えＤＮＡ技術により生産されるとき、細胞の物質または培地を含まないか、 あるいは化学的に合成されたとき、化学的前駆体または池の化学物質を含まない 。さらに、本発明は、第３ｂ図、第６図、および第７ａ図および第７ｂ図に記載 されているヌクレオチド解読配列に全体または一部分が相当するか、あるいはそ れらの同義性または相同性の形態に相当する、タンパク質または断片（ペプチド ）を包含する。

本発明の範囲内の核酸の断片は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性応 答：ＩｇＧおよびＩｇＭの抗体を引き出すこと；またはＴ細胞の応答、増殖を引 き出すおよび／またはリンホカインの分泌および／またはＴ細胞の誘発：を引き 出すＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの一部分をコードするものを包含する 。Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌｐＩｂの前述の断片を、ここにおいて、抗原性断 片と呼ぶ。本発明の範囲内の断片は、また、Ｌｏｔ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌ ｂと交差反応性であるアレルゲンを検出するためのスクリーニングのプロトコル において使用する、他の植物種からの核酸とハイブリダイゼーションすることが できる断片を包含する。ここで使用するとき、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐ ｌｂをコードする核酸配列の断片は、Ｌｏ’ｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂお よび／または成熟Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの全体のアミノ酸配列を コードするヌクレオチド配列以外の、より少ない塩基を有するヌクレオチド配列 を呼ぶ。一般に、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの１または２以上の断片 をコードする核酸配列は成熟タンパク質をコードする塩基から選択されるが、し かしながら、ある場合において、本発明の核酸配列のリーダー配列の一部分から の１または２以上のすべてまたは一部分を選択することが望ましいことがある。

本発明の核酸配列は、また、リンカ−配列、制限エンドヌクレアーゼ部位および Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂまたはその断片のクローニング、発現また は精製に有用である他の配列を含有することができる。

所望の抗原性応答を引き出す、ライグラスの花粉からのアレルゲン、好ましいＬ ｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの断片（ここにおいて抗原性断片と呼ぶ）は 、このようなペプチドまたはこの分野において知られている技術を使用して化学 的に合成されたペプチドをコードする、本発明の核酸配列の対応する断片から、 組み換え法により生産されたペプチドをスクリーニングすることによって得るこ とができる。アレルゲンのペプチドの断片は、任意のこの分野において知られて いる方法により、例えば、アレルゲンの化学的切断、アレルゲンをペプチドのオ ーバーラツプをもたない所望の長さの断片へ任意に分割すること、あるいは好ま しくはアレルゲンを所望の長さのオーバーラッピングする断片に分割することに より得ることができる。断片を試験してそれらの抗原性またはアレルゲン性を決 定することができる。Ｔ細胞の応答、例えば、刺激（すなわち、増殖またはリン ホカインの分泌）を引き出すすることができるおよび／またはＴ細胞のアネルギ ーを誘発することができるＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｔ　ｐｌｂの断片は、と（ に望ましい。免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に結合しないおよび／または最小のＩ ｇＥ刺激活性を有するＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｕｂの断片は、また、望 ましい。Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの断片がＩｇＥに結合する場合、 このような結合はヒスタミンの結合に導かない、例えば、このような結合はマス ト細胞上のＩｇＥの交差連鎖を引き起こさないことが好ましい。

最小のＩ’ｇＥの刺激活性は、全体のＬｏｌ　ｐ［ａまたはＬｏｔ　ｐｉｂタン パク質により刺激されたＩｇＥの生産の量より少ないことを意味する。好ましい 断片は、また、ライグラスの花粉に感受性の個体に投与したとき、個体のライグ ラスの花粉へのアレルギー性応答を変更することができる抗原性断片、およびラ イグラスの花粉に感受性の個体に投与したとき、個体のライグラスの花粉の抗原 に対するＢ−細胞の応答、Ｔ−細胞の応答または両者の応答を変更することがで きる断片を包含する。

タンパク質またはその断片に結合するＩｇＥについてのスクリーニングは、実験 室の動物またはヒトについての引っ掻き試験または陵内皮膚試験、あるいはｉｎ 　ｖｉｔｒｏの系、例えば、ＲＡＳＴ　（ラジオアレルゴソーベント試験）　、 ＲＡＳＴ阻害、ＥＬＩＳＡアッセイまたはラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）に より実施することができる。

本発明は、発現ベクターおよび本発明の核酸配列を発現するように形質転換され た宿主細胞を提供する。Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂｏまたはその少な くとも１つの断片をコードする核酸配列は、バクテリアの細胞、例えば、Ｅ、ｃ ｏｌｉ、昆虫、酵母菌、または哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター 卵巣細胞（ＣＨＯ）の中で発現することができる。適当な発現ベクター、プロモ ーター、エンハンサ−１および他の発現コントロール要素は、Ｓａｍｂｏｒｏｏ ｋら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプ リング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、−＝−ニーヨーク州コールド・スプ リング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、１９８９の中 に見いだすことができる。酵母菌、昆虫または哺乳動物細胞の中の発現は、組み 換え物質の部分的または完全なグリコジル化および、存在する場合、特性の相互 または内部のジサルファイド結合の形成に導くであろう。酵母菌の中の発現に適 当なベクターは、次のものを包含する：ＹｅｐＳｅｃｌ　（Ｂａｌｄａｒｉら（ １９８７）Ｅｍｂｏ　Ｊ、６：２２９−２３４：ｐＭＦα（Ｋｕｒｊａｎおよび Ｈｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ　（１９８２）細胞（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ）　、３０　：　９ ３３−８４３；およびＪＲＹ８８　（Ｓｈｕ　Ｉ　ｔｚら（１９８７）遺伝子（ Ｇｅｎｅ）且４：１１３−１２３）。

Ｅ、ｃｏｌｉの中の発現のために、適当な発現ベクターは、次のものを包含する ：　ｐＴＲＣ（Ａｍａｎら（１９８８）遺伝子（Ｇｅｎｅ）６９：３０１−３１ ５）；ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ　Ｃａｒｐ、オーストラリア国メルボル：／）；ｐ ＭＡＬ　（Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ、？サチュセッツ州ベバリー）：ｐＲＩＴ５ 　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャーシイ州ビスカタウェイ）、およびｐＳＥ Ｘ　（Ｋｎａｐｐら（１９９０）バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ）８：２８０−２８１）。ｐＴＲＣおよびｐＧＥＸの使用は、融合しな い調製の発現に導くであろう。ｐＭＡＬ、ｐＲＩＴ５およびｐＳＥＭの使用は、 マルトースＥ結合性タンパク質（ｐＭＡＬ）、プロティンＡ　（ｐＲＩ　Ｔ５） 　、または切頭β−ガラクトシダーゼ（ＰＳＥＭ）に融合したアレルゲンの発現 に導くであろう。Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ、その１または２以上の 断片が融合タンパク質として発現されるとき、担体タンパク質とＬｏｌ　ｐｌａ またはＬｏｌ　ｐＩｂまたはその断片との間の融合接合部に酵素の切断部位を導 入することはとくに有利である。次いで、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ またはその断片を、融合タンパク質から、酵素部位における酵素的切断およびタ ンパク質およびペプチドの精製のための普通の技術を使用する生化学的精製によ り回収することができる。適当な酵素的切断部位は、血液凝固因子Ｘまたはトロ ンビンのための部位を包含し、これらのために適当な酵素および切断のためのプ ロトコルは、例えば、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａ！　Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイスおよびＮ、　Ｎ、バイオラプス（ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュセッツ州ベバリー、から商業的に入手可能である。

宿主細胞は、普通の技術、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共 沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、またはエレクトロボレ イションを使用して、本発明の核酸配列を発現するように形質転換することがで きる。宿主細胞を形質転換のために適当な方法は、Ｓａｍｂｏｒｏｏｋら、前掲 、および他の実験室のテキストブックの中に見いだすことができる。本発明の核 酸配列は、また、標準の技術を使用して合成することができる。

現在入手可能な構造の情報を使用して、ライグラスの花粉に感受性の個体に十分 な量で投与したとき、ライグラスの花粉に対する個体のアレルギー性応答変更す る、Ｌｏｌ　ｐｅａまたはＬｏｌ’　ｐＩｂのペプチドを設計することができる 。これは、例えば、Ｌｏｌ　’ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの構造を検査し、ペ プチドを生産して（発現系、合成的にまたは他の方法で）ライグラスの花粉に感 受性の個体におけるＢ−細胞および／またはＴ−細胞の応答に影響を及ぼす、そ れらの能力について検査し、そして細胞により認識された適当なエピトープを選 抜することによって実施することができる。エピトープに関係すると、エピトー プはレセプター、と（に免疫グロブリン、組織適合性の抗原およびＴ細胞の受容 体による基本的要素または最小単位であり、ここでレセプターの認識に対して必 須のアミノ酸はアミノ酸配列において隣接するおよび／または隣接しないことが できる。エピトープのアミノ酸配列をまねそしてＬｏｌ　ｐｒａまたはＬｏｌ　 ｐｌｂに対するアレルギー性応答を下方に調節することができるアミノ酸配列を 、また、使用することができる。

今回、ライグラスの花粉に感受性の個体においてアレルギー性反応を誘発するラ イグラスの花粉のアレルゲンの能力をブロックまたは阻害することができる薬物 の因子を、設計することができる。このような因子は、例えば、それらが関係す る抗Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ−ＩｇＥに結合し、こうしてＩｇＥ− アレルゲンの結合を防止し、そして引き続いてマスト細胞の脱顆粒を防止するよ うな方法で、設計されるであろう。あるいは、このような因子は免疫系の細胞の 成分に結合し、ロリウム・ベレンネ（Ｌｏｌ　ｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）の花粉 のアレルゲンに対するアレルギー性応答の抑制または脱感作を生ずるすることが できる。この例の非限定的例は、本発明のｃＤＮＡ／タンパク質の構造に基づい て、適当なり一細胞およびＴ細胞のエピトープのペプチドを使用して、ライグラ スの花粉に対するアレルギー性応答を抑制することである。これは、ライグラス の花粉に感受性の個体からの血液成分を使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏの研究におい てＢ−細胞およびＴ細胞の機能に影響を与える、Ｂ−細胞およびＴ細胞のエピト ープのペプチドの構造を定めることによって実施することができる。

本発明のタンパク質、ペプチドまたは抗体は、また、ライグラスの花粉病の検出 および診断のために使用することができる。例えば、これはライグラスの花粉に 対する感受性についてアッセイすべき個体からの細胞または血液生産物を、Ｌｏ ｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの単離された１または２以上の抗原性ペプチド 、または単離Ｌｏｌ　ｐｅａまたはＬｏｌ　ｐｌｂタンパク質と、血液の中の成 分（例えば、抗体、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞）と１または２以上のペプチドまたはタ ンパク質との結合に適当な条件下に、組み合わせ、そしてこのような結合が起こ る程度を決定することによって、実施することができる。

さらに、トランスジェニック植物に対する哺乳動物の感受性は、ＬＯＩ　ｐｌａ またはＬｏｌ　ｐｌｂの核酸配列またはその断片または化学的合成されたもので 形質転換された宿主細胞の中の生産された、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬ ｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、またはその少なくとも１つの抗原性断片の 十分な量を哺乳動物に投与して、哺乳動物においてアレルギー性応答を誘発し、 モして哺乳動物においてライグラスの花粉のアレルゲンに対するアレルギー性応 答の発生を決定することによって、決定することができる。

本発明の任意の実施態様において使用するＤＮＡは、ここに記載するようにして 得られたｃＤＮＡであることができるか、あるいはここにおいて表す配列のすべ てまたは一部分を有する任意のオリゴデオキシヌクレオチド、またはそれらの機 能的同等体であることができる。このようなオリゴデオキシヌクレオチドの配列 は、既知の技術を使用して、化学的または機械的に生産することができる。オリ ゴヌクレオチドの配列の機能的同等体は、１）第３図、第６図または第７ａ図お よび第７ｂ図に示す配列（または対応する配列の一部分）またはそれらの断片が ハイブリダイゼーションする相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーショ ンすることができる配列であるか、あるいは２）第３図、第６図または第７ａ図 および第７ｂ図に示す配列に対して相補的な配列（または対応する配列の一部分 ）であるおよび／または第３図、第６図または第７ａ図および第７ｂ図に示す配 列（または対応する配列の一部分）によりエンコードされる生産物の同一の機能 的特性を有する生産物（例えば、ポリペプチドまたはペプチド）をエンコードす る配列であるものである。

機能的同等体が一方または双方の基準を満足しなくてはならないかどうかは、そ の使用に依存するであろう（例えば、それをオリゴプローブとしてのみ使用する 場合、それは第１または第２の基準のみを満足するすることが必要であり、そし てＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂタンパク質を生産するために使用すべき 場合、それは第３の基準のみを満足すればよい）。

また、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたはその断片またはそれらの誘導 体または相同体およびこれらのアレルゲン性タンパク質の断片に対する抗体と免 疫学的に交差反応性のアレルゲン性タンパク質を本発明の範囲内に包含する。「 免疫学的に交差反応性」は、その最も広い意味において使用し、そして、一般に 、抗体へ検出可能に結合することができるタンパク質を意味し、抗体はＬｏｌ　 ｐｒａまたはＬｏｌ’ｐＩｂ、またはその断片またはＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏ ｌ　ｐＩｂの誘導体または相同体またはその断片に対して特異的である。このよ うな免疫学的に関係するタンパク質は、ここにおいて、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬ ｏｌ　ｐＩｂに免疫学的に関係すると呼ぶ。

他による研究により、アレルゲンの高い投与量が最良の結果（すなわち、最良の 症候の解放）を一般に生成ことか示された。しかしながら、多数の人々は、アレ ルゲンに対するアレルギー性反応のために、大きい投与量に耐えることができな い。天然に存在するアレルゲンの修飾は、対応する天然に産出するアレルゲンと 同一のまたは増強された治療学的性質を有するが、副作用（ことにアナフィラキ シ−反応）が減少した、修飾されたペプチドまたは修飾されたアレルゲンを生産 することができるような方法で、設計することができる。これらは、例えば、本 発明のタンパク質またはペプチド（例えば、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｔ　ｐＩ ｂのアミノ酸配列のすべてまたは一部分を有するもの）であるか、あるいは修飾 されたタンパク質またはペプチド、またはタンノ（り質またはペプチドの類似体 （例えば、アミノ酸配列が、例えば、アミノ酸の置換、欠失、付加により変更さ れて、免疫原性を変更および／またはアレルゲン性を減少するか、あるいは成分 が同一目的で付加された、タンノくり質またはペプチド）であることができる。

例えば、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂタンパク質またはペプチドは、Ａ 、５ｅｈｏｎおよび共同研究者らのポリエチレングリコールを使用して修飾する ことができる。

Ｗｉｅら（１９８１）インターナショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・ アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉ ｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ）６４：８４−９９゜Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌｐＩｂタンパク質またはペ プチドの修飾は、また、次のものを包含することができる：還元／アルキル化（ Ｔａｒｒ　［１９８６］　、タンパク質のミクロ特性決定の方法（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉ　Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）　 、Ｊ、Ｅ、Ｓｉ　ＩｂｅｒＷ、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、ニュージャーシイ州 りリフトン、ｐｐ１５５−１９４）；アシル化（Ｔａ　ｒ　ｒ。

前掲）；エステル化（Ｔａｒｒ、前掲）、適当な担体への化学的力・ノブリング （ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編［１９８０コ細胞の免疫学における選択 された方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＣｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ＷＨＦｒｅｅｍａｎ。

カリフォルニア州すンフランシスコ、米国特許第４．９３９．２３９号）；温和 なホルマリン処理（Ｍａｒｓｈ　［１９７１］インターナシヨナル・アーチーブ ス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）４１：１９９−２１５）。

Ｌｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐＩｂをエンコードするｃＤＮＡのクローニング は、特異的モノクローナル抗体および草の花粉に感受性の患者からの特異的血清 １ｇＥの両者を使用する、ラムダ−ｇｔｌｌファージで形質転換された大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ）により発現されたタンパク質の認識に基 づ（。２つのこのようなりローンを１２Ｒおよび１３Ｒと表示する。また、使用 するモノクローナル抗体はＭａｂ３．２、ＦＭＣＡ７　（１２，３）　、２１． ３およびＦＭＣＡ１　（４０，１）（ＫａｈｎおよびＭａｒｓｈ　（１９８６） 　モレキュラー・イムノロジー（Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）２３ ：１２８１−１２８８　：ＳｉｎｇｈおよびＫｎｏｘ　（１９８５）インターナ ショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジ ー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　 ａｎｄ　Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）７８３００−３０４　：　 Ｓｍａｒｔら（１９８３）インターナショナル・７−チーブス・オブ・アレルギ ー・アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃ ｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇＹ）７２：２４３−２４８）。

Ｌｏｌ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐｌｂのクローニングの詳細は実施例に記載され ている。

本発明のタンパク質のアレルゲン性は、一部分、アレルギー性患者の血清の中に 高いレベルで存在するレアギンのＩｇＥ抗体のそれらの結合により特性決定され る。アレルギー性タンパク質上のエピトープへの■ｇＥの結合は発色アッセイに おいて試験することができ、ここで固体の支持体上に固定化されたアレルゲンを （１）アレルギー性患者の血清：（２）酵素標識された抗１ｇＥ抗体の中で順次 にを包含するすることによって可視化することができる。

種々の発現ベクターをＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたはそれらの誘導 体のために構成することができる。したがって、本発明の他の面は、組み換えＬ ｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂまたはその少な（とも１つの断片、またはそ れらの誘導体または相同体、あるいはそれらの免疫学的に関係するもの（前に定 義した）を生産する方法を包含し、この方法は、複製可能な組み換えＤＮＡ分子 を含有する有機体を、前記組み換えＤＮＡ分子が安定に維持されかつＬｏｌ　ｐ ＩａまたはＬｏｌｐｌｂ、その少なくとも１つの断片、またはその誘導体または 相同体、またはその免疫学的に関係するものの合成を指令する条件下にかつ十分 な時間の間培養し、前記組み換えＤＮＡ分子は、前記有機体の中で発現すること ができるプロモーター、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ。

またはその少なくとも１つの断片、またはその誘導体または相同体、またはＬｏ ｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの免疫学的に関係するタンパク質をエンコード し、前記プロモーターから下流に位置しかつそれから転写された遺伝子、選抜可 能なマーカーおよび原核生物の複製由来を含有するＤＮＡベヒクルからなり、次 いで組み換えＬｏｌ　ｐｒａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたはその少な（とも１つの 断片、またはその誘導体または相同体、あるいはＬｏｔ　ｐｌａまたはＬｏｌ　 ｐＩｂまたはその少なくとも１つの断片またはその誘導体または相同体に対する 抗体と免疫学的に反応性のアレルゲン性タンパク質を単離する、ことからなる。

本発明は、また、ライグラスの花粉のタンパク質のプロモーター、およびとくに 、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの遺伝子のプロモーターにその範囲が拡 張される。このプロモーターは、発育的に、ＬｏｌｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ の遺伝子の発現を調節し、そして器官、すなわち、花粉特異的である。発育の調 節は、ここで使用するとき、植物の生命サイクルにおけるある段階の間の、特定 の特性、この場合において花粉の中のアレルゲン性タンパク質および他の段階の 間の非発現を呼ぶ。それゆえ、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂのプロモー ターは、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、または他の遺伝子またはそれに 関係するヌクレオチド配列の発現を可能とするとき、花粉の発育の間においての み、とくに有用である。当業者は、花粉の形成の間に特定の特性を選択的に発現 するこのようなプロモーターの重要性を直ちに認識するであろう。

したがって、本発明は、花粉の発育または機能を阻害し、これによりポアセアエ （Ｐｏａｘｅａｅ）族、とくにロリウム・ベレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎ ｎｅ）Ｌ、の植物における核の雄性不稔性を誘発する方法を包含し、この方法は 、工程 ａ）組み換えＤＮＡ分子を有する植物を発育させ、前記組み換えＤＮＡ分子はそ の上に位置するライグラスの花粉のプロモーター配列またはその相同体または同 義性の形態、およびボアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）族から誘導された細胞の中で 有害な機能を有するポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列からなり、 前記ヌクレオチド配列は前記プロモーターから転写可能であり、そして前記組み 換えＤＮＡ分子は花粉を生産する細胞を安定に含有し、そして ｂ）植物の発育段階について、前記プロモーターから前記ヌクレオチド配列を発 現させ、これにより前記花粉を生産する細胞に対して有害な機能を有するポリペ プチドを生産し、こうして花粉の形成が阻害されるか、あるいは前記花粉か不活 性であるために十分な条件下にかつ時間の間、前記植物を成長させる、 からなる。

組み換えＤＮＡ分子を植物細胞の中に導入するよく確立された方法、例えば、な かでも癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のプラスミドおよびエレクトロポ レイションが存在する。ポリペプチドに関して「有害な機能」とは、細胞の成長 を阻害し、細胞の溶解を引き起こすか、あるいは細胞の種々の機能を阻害し、こ れにより細胞の正常の機能を妨害する、前記ポリペプチドの特徴を呼ぶ。この場 合において、花粉の形成を阻害または妨害し、これにより雄性不稔性植物を生ず る、有害な機能を有する致死的遺伝子が考えられる。このような「致死的遺伝子 」は、他の分子の間で、酵素、酵素阻害因子および／または毒性ポリペプチドを エンコードすることができる。あるいは、致死的遺伝子はｍＲＮＡの特定の種の 翻訳を阻害することができるアンチセンスＲＮＡをエンコードすることができ、 その翻訳された生産物は花粉の発育のためにきわめて重大である。

雄性不捻性植物はハイブリッドの作物の変種を発育するときとくに有用である。

Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌｐｌｂのプロモーターは、ライグラスのゲノムＤＮ Ａから、任意の数の手順により単離することができる、このような手順はプロモ ーターのプローブのベクター、「染色体のウオーキング」およびＳ１ヌクレアー ゼのマツピングおよび転写開始部位の上流ＤＮＡとしての配列決定の使用を包含 する。

したが７て、本発明は、その上にライグラスの花粉のプロモーターの配列、とく にＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの遺伝子のためのプロモーター、または その相同体または同義性の形態を含み、そしてさらに前記プロモーターの下流に １または２以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を有し、こうしてこれらの部位の １または２以上の中に挿入されたヌクレオチド配列が正しいリーディングフレー ムで転写可能である、組み換えＤＮＡ分子を包含する。ここで使用するとき、「 正しいリーディングフレーム」は［インフェイズ（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）Ｊと同一 の意味である。前述のＤＮＡ分子は、好ましくは、その上に選抜可能なマーカー 、例えば、抗生物質耐性または他の薬物耐性、例えば、アンピシリン、カルベニ シリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどに対する耐性をエンコード する遺伝子を有するであろう。組み換え分子は、さらに、原核生物および／また は真核生物の細胞における安定な遺伝のための手段を含む。これは、発現ベクタ ーに関して前述したように、真核生物および／または原核生物の複製由来を有す る前記組み換え分子により達成することができる。

あるいは、組み換え分子は、宿主細胞の中に、ゲノムを組み込み、これにより前 記宿主細胞の複製と同調して前記組み換え分子の複製を可能とする手段を有する であろう。好ましい原核生物の宿主の例は、なかでも、Ｅ、ｃｏｌｉ、バチルス 属（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ）の細胞を包含する。好ましい真核生物の宿主は、酵母菌および菌類、昆虫、 哺乳動物および植物からの細胞を包含する。なおいっそう好ましい宿生細胞は、 ポアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）族、とくにロリウム（Ｌｏ　Ｉ　ｉ　ｕｍ）属、 ロリウム・ベレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）の植物である。したがっ て、好ましい実施態様において、ポアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）族またはロリウ ム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）からの植物の細胞のゲノムの中 に組み込むことができる組み換えＤＮＡ分子は、相対的に位置する有害な機能を エンコードする遺伝子をもつ、Ｌｏｌ　’ｐＩａまたはり。

］　ｐｌｂの遺伝子のプロモーターを有するであろう。このような組み換えＤＮ Ａ分子は、前述の細胞に、例えば、エレクトロポレイションにより転移される。

理想的には、前記細胞はカルス誘導細胞である。次いで、前記組み換えＤＮＡ分 子で形質転換された前記カルス誘導細胞を全植物に再生させる。全植物はＬｏｌ 　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの遺伝子のプロモーターを花粉の中に入れ、それ ゆえ、有害な機能をエンコードする遺伝子が発現する。結局、花粉の発育は阻害 または妨害され、そして核の雄性不捻性植物がそれから生ずる。

あるいは、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂのプロモーターは有利な機能を 有する遺伝子、例えば、サイトカイニンの発現を指令するであろう。すべてのこ のような組み換えＤＮＡ分子は本発明の範囲内に包含される。

本発明は、国際特許出願筒ＰＣＴ／ＡＵ８９１００１２３号に記載されている方 法ように思われる生産された、組み換えまたは化学的に合成されたＬｏｌ　ｐｌ ａまたはＬｏｌ　ｐｕｂ、またはＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの少なく とも１つの断片に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、および その中に記載されているようなイムノアッセイおよび試験キットにおけるそれら の使用に、その範囲が及ぶ。

本発明において使用するモノクローナル抗体は、種々の関係する草の種の花粉か らのアレルゲン性タンパク質と交差反応性を示した、Ｌｏｌｐｌａのクローンに ついてｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングする働きをする。これが示すよ うに、これらの花粉により生産されたアレルゲン性タンパク質と、すべての関係 する草への本発明の応用可能性を支持するＬｏｌｐｌのアレルゲンとの間の相同 性が存在する。本発明は、また、組み換えＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ、 それらの誘導体、相同体および、それらの化学的合成誘導体を包含する、免疫学 的に関係するものに対する抗体に関する。以下の論考において、Ｌｏｌｐｌａま たはＬｏｔ　ｐＩｂに対する言及は、それらの誘導体、相同体および免疫学的に 関係するものおよびそれらの化学的合成誘導体を包含する。このような抗体は、 ことに治療および診断の養生法の監視の間におよびＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｔ 　ｐｌｂの精製において、前記Ｌｏ１　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂについての 検出アッセイ（イムノアッセイ）の開発において有用であると考えられる。抗体 はモノクローナルおよびポリクローナルであることができる。さらに、前述の第 １抗体に□１＋ 対して向けられた第２抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）を本発明の 範囲内に包含する。本発明は、さらに、検出アッセイにおいておよび、例えば、 診断または投与された医薬組成物の効果の監視において、これらの第１または第 ２の抗体の使用を包含する。さらに、Ｌｏｌｐｌａのグリコジル化領域（存在す る場合）、および前記Ｌｏｌ　ｐＩａと複合化した分子に対する抗体を本発明の 範囲内に包含する。したがって、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂに対する 抗体は、ＬｏｌｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、またはその抗原性部分、および関 連する分子（例えば、グリコジル化領域、脂質領域、担体分子、融合タンパク質 など）に対する抗体を包含する。

ここにおいて考慮する、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ、またはその部分 を精製し、次いで抗体の生産において利用する。モノクローナル抗体およびポリ クローナル抗体の両者はＬｏｌ　ｐｌａまたはＬＯＩ　ｐＩｂを使用する免疫化 により得ることができ、モして各型はイムノアッセイについて利用することがで きる。両者の型の血清を得る方法はこの分野においてよ（知られている。ポリク ローナル血清は好ましさに劣るが、適当な実験室動物に有効量の精製されたＬｏ ｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、またはその抗原性部分を注射し、動物から血 清を集め、そして任意の既知の免疫吸着技術により特異的血清を単離することに よって比較的容易に調製される。この方法により生産された抗体は事実上任意の 型のイムノアッセイにおいて利用することができるが、それらは一般に生産物の 潜在的な不均質性のために好ましさに劣る。

イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体の使用は、それらを大量に生産する 能力および生産物の均質性のために、とくに好ましい。永久分裂能の細胞系およ び免疫原性調製物に対して感作されたリンパ球を融合することによって誘導され た、モノクローナル抗体の生産のためのハイブリドーマの細胞系の調製は、当業 者によく知られている技術により実施することができる。（参照、例えば、Ｋｏ ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔ　ｅ　ｔ　ｎ　（１９８６）ヨーロピアン・ジャーナ ル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）、６：５１１ −１１９）。

ポリクローナル血清の調製と異なり、動物の選択はリンパ球と融合することがで きる適当な永久分裂能の系統の入手可能性に依存する。マウスおよびラットはハ イブリドーマ技術において選択した動物であり、そして使用に好ましい。ヒトは 、また、適当な永久分裂化されたヒト（またはヒト以外）の細胞系が入手可能で ある場合、感作されたリンパ球源として利用することができる。本発明の目的に 対して、選択した動物い約０．１ｍｇ〜約２ＱｍＨの精製されたＬｏｌ　ｐＩａ またはＬｏｌｐＩｂまたはその一部分を注射することができる。通常、注射物質 をフロイント完全アジュバントの中で乳化する。促進注射をまた必要とすること がある。抗体の生産の検出は、抗血清を適当に標識した抗原で試験することによ って実施することができる。リンパ球は無菌の方法で感作した動物の稗臓または リンパ節を取り出し、そして融合を実施することによって得ることができる。あ るいは、リンパ球は、例えば、Ｒｅｄｉｎｇ（１９８２）ジャーナル・オブ・イ ムノロジカル・メソッズ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）５３：２６１−２９１）に記載 されているように、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏで刺激または免疫化することができる。

融合のために適当なある数の細胞が開発され、そしてハイブリダイゼーションの プロトコルのための任意の特定の系統の選抜はある数の基準、例えば、速度、成 長特性の均一性、成長培地の成分のためのその代謝の欠乏、およびすぐれた融合 頻度についての可能性の任意の１つにより支配される。

種内のハイブリッド、とくに同様な菌株の間のハイブリッドは種の間のよりよく 働く。いくつかの細胞系が入手可能であり、これらには骨髄腫の免疫グロブリン を選抜する能力の損失について選択した突然変異を包含する。

細胞の融合は、ウィルス、例えば、ニスパインバールウィルスまたはセンダイウ ィルス、またはポリエチレングリコールにより誘発することができる。ポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）は、哺乳動物の体細胞の融合のために最も効率よい因 子である。ＰＥＧそれ自体は細胞に対する毒性であることができ、そして種々の 濃度を融合を試みる前に生存可能性への効果について試験すべきである。ＰＥＧ の分子量範囲は１０００〜６０００で変化することができる。それは生理食塩水 の中に血清不含培地の中で約２０％〜約７０％（Ｗ／Ｗ）に希釈したとき、最良 の結果を与える。ＰＥＧに３７℃において約３０秒間暴露することは、現在の場 合において、ネズミ細胞を使用するとき、好ましい。温度の極端（すなわち、約 ４５℃）は回避され、そして融合の前の融合系の各成分の３７℃における予備イ ンキュベーションは有用であることがあるリンパ球と悪性細胞との間の比を最適 化して、牌細胞の間の細胞の融合を回避し、そして約１・１〜約１：１０の範囲 は普通に使用される。

首尾よく融合された細胞は、この分野において知られている任意の技術により、 骨髄腫系統から分離することができる。最も普通の好ましい方法は悪性系統を選 抜することであり、この系統はハイポキサンチングアニンホスホリボシルトラン スフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠乏であり、ハイブリッドの成長のみを可能とする ために使用されるアミノプテリンを含有する培地、そしてハイブリッドの成長の みを可能とするために使用され、そして一般にハイポキサンチント１０−４モル 、アミノプテリン１×１０〜３モル、およびチミジン３Ｘ１０−’モルから構成 され、ＨＡＴ培地として知られている、培地の中で成長しないであろう。融合炭 酸マグネシウムはＨＡ　Ｔ含有培地の中で融合直後に、あるいは２４時間後に成 長させることができる。供給スケジュールは、通常、ＨＡＴ培地の中で２週間の 維持および次いで正規の培養またはハイポキサンチン、チミジンを含有する培地 の供給を伴う。

次いて、成長するコロニーを抗原性調製物を認識する抗体の存在のための試験す る。ハイブリドーマの抗体の検出はアッセイを使用して実施することができ、こ のアッセイにおいて、抗原を固体支持体に結合させ、そして推定上の抗体を含有 するハイブリドーマの上澄み液と反応させる。

抗体の存在は「サンドイッチゴ技術により種々のインジケーターを使用して検出 することができる。普通の方法の大部分は、ハイブリッドの成長の間に選択した 抗体濃度の範囲における使用のために十分に感受性である。

ハイブリットのクローニングは、選択した培地の中の細胞の２１〜２３日の成長 後に、実施することができる。クローニングは流体相の細胞の制限希釈法による か、あるいは半固体のアカロースの中で成長する単細胞を直接選抜することによ って実施することができる。制限希釈法のために、細胞響濁液を系統的に希釈し て、ただ１つの細胞／ウェルを有する統計学的確率を生ずる。アガロースの技術 のために、ハイブリッドを、フィーダー細胞を含有する下の層より上の、半固体 の上の層の中に接種する。上の層からのコロニーをピンクアップし、そして究極 的にウェルの中に移す。

抗体を分泌するハイブリッドを種々の組織培養フラスコの中で成長させて、種々 の濃度の抗体を有する上澄み液を生成する。より高い濃度を得るために、ハイブ リッドを動物の中に転移して炎症性腹水を得ることができる。抗体を含有する腹 水を腹腔内注射後８〜１２日に収穫する。

腹水はより高い濃度の抗体を含有するが、炎症性腹水からの両者のモノクローナ ル抗体およびポリクローナル抗体を含有する。次いで、抗体の精製は、例えば、 親和クロマトグラフィーにより達成することができる。

患者の血清、植物または哺乳動物の組織または組織抽出物の中の、ここにおいて 考えるＬｏｌ　ｐｅａまたはＬｏｌ　ｐｌｂ、またはそれスポドプテラ・フルギ ベイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｉｄａ）抗体の存在は、上のよ うにして調製した抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を利用し て、事実上任意の型のイムノアッセイにおいて検出することができる。広い範囲 のイムノアッセイ技術を、米国特許第４，０１５，０４３号、米国特許第４．４ ２４．２７９号および米国特許第４．０１８．６５３号を参照することによって 理解できるように、利用可能である。これは、もちろん、非競争的型の、単一の 部位および２つの部位の両者、または「サンドイッチ」のアッセイ、ならびに伝 統的競争結合アッセイを包含する。サンドイッチアッセイは最も有用なものの１ つであり、そして普通に使用されているアッセイであり、そして本発明における 使用に好ましい。サンドイッチアッセイ技術のある数の変法が存在し、そしてす べては本発明に包含されることを意図する。簡単に述べると、典型的なアッセイ において、非標識抗体を固体支持体の中に固定化し、そして試験すべき試料を結 合した分子と接触させる。適当なインキュベーション期間後、抗体−抗原の二次 複合体の形成を可能とするために十分な期間の間、検出可能なシグナルを生成す ることができるリポータ−分子で標識した第２抗体を次いで添加し、インキュベ ーションし、抗体−抗原標識した抗体（例えば、抗体−Ｌｏｌｐｌａ−抗体また は抗体−Ｌｏｌ　ｐｌｂ−抗体）の３次複合体を十分な時間の間形成させる。未 反応の物質を洗浄除去し、そして抗原の存在をリポータ−分子により生成したシ グナルの観測により決定する。結果は、可視のシグナルの観察により、定性的で あるか、あるいは既知の量のハブテンを含有する対照試料との比較により定量す ることができる。

上のアッセイについての変法は、次のものを包含する・同時のアッセイ、ここで 試料および標識した抗体の両者を結合した抗体に同時に添加する、あるいは逆ア ッセイ、ここで標識した抗体および試験すべき試料をまず組み合わせ、インキュ ベーションし、次いで結合した抗体に同時に添加する。これらの技術はこの分野 においてよく知られており、任意の小さい変化は容易に明らかであろう。

次の説明はＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｕｂの検出に関するが、それはＬｏ ｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂの抗体の検出に等しく適用可能であり、そして その十分な記述であることを意図する。典型的なサンドイッチアッセイにおいて 、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂに対する特異性を有する第１抗体、また はその抗原性部分（本発明において考えられる）を固体の表面に共有結合または 受動的に結合させる。固体の表面は典型的にはガラスまたはポリマーであり、最 も普通に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポ リスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は管、ビ ーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイの実施に適当な任意 の池の表面の形態であることができる。結合法はこの分野においてよく知られて おり、そして一般に交差共有結合または物理的吸着から成り、抗体の複合体を試 験試料のための調製において洗浄する。次いで試験すべき試料のアリコートを固 相の複合体に添加し、そして２５℃において抗体の中に存在するサブユニットの 結合を可能とするために十分な時間の間インキュベーションする。インキュベー ション期間は変化するが、一般に約〜４０分の範囲であろう。インキュベーショ ン後、抗体のサブユニットの固相を洗浄し、乾燥し、モしてノ１ブテンの一部分 に対して特異的な第２抗体とインキュベーションする。第２抗体をリポータ−分 子に連鎖し、これを使用して、ハブテンへの第２抗体の結合を示す。

「リポータ−分子」とは、ここで使用するとき、その化学的性質により、抗原結 合した抗体の検出を可能とする、分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を 意味する。検出は定性的または定量的であることができる。この型のアッセイに おいて最も普通に使用されるリポータ−分子は、酵素、蛍光団または放射性核種 を含有する分子（例えば、放射性同位元素）である。酵素のイムノアッセイの場 合において、酵素は第２抗体に、一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩 により接合する。

しかしながら、容易に認識されるように、広範な種類の異なる接合技術が存在し 、これらの当業者に容易に入手可能である。普通に使用される酵素は、なかでも 、セイヨウワサヒペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーター−ガラ クトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを包含する。特異的酵素とともに 使用すべき基質は、一般に、対応する酵素により加水分解すると、検出可能な色 の変化を生成するように選抜される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート はアルカリ性ホスファターゼとともに使用するために適当なである：ベルオキシ ダーゼ接合体のためには、１，２−フエニ１ノンジアミン、５−アミノサリチル 酸、またはトルイジンは普通に使用される。また、前述の発色性基質よりむしろ 蛍光性生成物を生ずる、蛍光発生基質を使用することができる。すべての場合に おいて、酵素標識した抗体を第１抗体ハブテン複合体に添加し、結合させ、次い で過剰の試薬を洗浄除去する。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体−抗原 −抗体の３次複合体に添加する。基質を第２抗体に結合した酵素と反応させて、 定量的視的シグナルを生成し、これを、通常分光光度測定的に、定量して、試料 の中に存在するハブテンの量の指示を得る。「リポータ−分子」はまた細胞の凝 集または血球またはラテックスビーズの阻止の使用に拡張される。

あるいは、蛍光性化合物、例えば、フルオレセインおよびローダミンは抗体に、 抗体の結合能力を変更しないで、化学的に結合することができる。特定の波長の 光で照明することによって活性化するとき、フルオロクロームで標識した抗体は 光のエネルギーを吸収し、分子の中で励起した状態を誘発し、次いで光学顕微鏡 で視的に検出可能な特徴ある色で光を放射する。ＥＩＡにおけるように、蛍光標 識した抗体を第１抗体−ハブテン複合体に結合させる。結合しない試薬を洗浄除 去した後、残留する３次複合体を次いで適当な波長の光に露出し、観測される蛍 光は問題のハブテンの存在を示す。免疫蛍光およびＥＩＡの技術の両者は、この 分野において、非常によ（確立されており、そして本発明の方法のためにとくに 好ましい。しかしながら、他のリポータ−分子、例えば、放射性同位元素、化学 発光性または生物発光性分子をまた使用することができる。要求される目的に適 合すうように手順を変化させる方法は、当業者にとって容易に明らかであろう。

また、明らかなように、以上のことを使用して、本発明のＬｏｌ　ｐＩａまたは Ｌｏｌ　ｐｕｂタンパク質を直接または間接的に（すなわち、抗体により）検出 することができる。

したがって、本発明の１つの面は、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたは それらの誘導体または相同体または前記Ｌｏｌ　ｐｅａまたはＬｏｌ　ｐＩｂま たはそれらの誘導体または相同体と免疫学的に反応性のアレルゲン性タンパク質 を血清、組織の抽出物、植物の抽出物または他の生物学的流体の中で検出する方 法を包含し、この方法は、試験すべき血清、抽出物または流体をＬｏｌ　ｐＩａ またはＬｏｌ　ｐｌｂに対する抗体と、アレルゲン性タンパク質−抗体の複合体 が形成するために十分な時間の間かつ十分な条件下に接触させ、そして前記複合 体を検出手段に付す工程からなる。本発明は、また、ポアセアエ（Ｐｏａｘｅａ 　ｅ）　（Ｇ　ｒ　ａｍ　ｉ　ｎ　ｅ　ａ　ｅ）族の花粉からのアレルゲン性タ ンパク質に対する抗体を血清または池の生物学的流体の中で検出する方法を包含 し、この方法は前記血清または流体を組み換えＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐ ｌｂまたはそれらの抗原性誘導体と、抗体−Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｕ ｂの複合体が形成するために十分な時間の間かつ十分な条件下に接触させ、そし て前記複合体を検出手段に付す工程からなる。

後者の複合体は、リポータ−分子をそれに取り付けて有するＬｏｌ　ｐＩａまた はＬｏｌ　ｐｌｂによるか、あるいはリポータ−分子で標識した第２抗体の添加 により検出することができる。

したがって、本発明は、また、ｆｎ　ｖｉｖｏの細胞培養物の上澄み液、および 細胞リゼイトの中における、哺乳動物の体液（例えば、血清、組織の抽出物、組 織の流体）の中のＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂまたはそれらの誘導体、 相同体または免疫学的に関係する物質に対する抗体についての迅速なかつ便利な アッセイのためのキットに関する。

キットは分割されていて、その抗原性成分に適合する第１容器、およびＬｏｌ　 ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂに対する抗体を含有するように適合した第２容器を 受け取り、前記抗体は前述したように検出可能なシグナルを与えることができる リポータ−分子で標識されている。リポータ−分子が酵素である場合、前記酵素 のための基質を含有するように適合した第３容器が設けられる。本発明のキット の例示的使用において、試験すべき試料を第１容器の内容物と、存在する場合、 抗体が前記第１容器の中のＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂに結合するため に十分な時間の間かつ十分な条件下に接触させる。第１容器のＬｏｌ　ｐｌａま たはＬｏｌ　ｐｌｂが試験流体の中の抗体に結合する場合、第２容器の抗体は二 次複合体に結合して３次複合体を形成しそして、これらの抗体はリポータ−分子 で標識されているので、３次複合体は検出される。したがって、本発明の１つの 面は、アレルゲン性を有するタンパク質に対する抗体の検出のためのキットであ り、前記タンパク質はポアセアエ（Ｐｏａｘｅａｅ）（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）族 の花粉からのタンパク質であり、キットは分割されていて、組み換えＬｏｌ　ｐ Ｉａまたはり。

ｌ　ｐｌｂまたはそれらの抗原性誘導体または相同体を含有するように適合され る第１容器、およびＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたはそれらの抗原性 誘導体または相同体に対する抗体を含有するように適合される第２容器を受け取 り、前記抗体は検出可能なシグナルを与えることができるリポータ−分子で標識 されている。「リポータ−分子」は、また、ラテックスビーズ上の赤血球（ＲＢ 　Ｃ）の凝集を含むことができる。このキットにおいて、リポータ−分子は放射 性同位元素、酵素、蛍光性分子、化学発光性分子、生物発光性分子またはＲＢＣ である。あるいは、キットは検出可能なシグナルを与えることができるリポータ −分子で標識された、組み換えＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐＩｂまたはそれ らの抗原性誘導体または相同体を含有するように適合した容器からなる。

環境の中のアレルゲンの存在のために、枯草熱および季節的喘息は、それらの製 剤学および免疫学においてなされた利点にかかわらず、有意な病的状態および西 洋共同社会への社会経済の衝撃を有し続けている。

抗ヒスタミンおよびステロイドを包含する薬物の利用可能なスペクトルはアレル ギー性疾患の処置において改良を生じたが、それらは長期間の使用に関連する不 都合な副作用を有する。これらの問題のために、更新された重要性はアレルギー 性疾患の免疫治療において示された。免疫治療は効力のあるアレルゲンの抽出物 を注射して患者をアレルギー性反応に対して脱感作することを包含する（Ｂｏｕ ｓｑｕｅｔおよびＭｉｃｈｅ＋　（１９８９）ＡＩ　Ｉｅｒｇｙ　Ｃ１ｉｎ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、Ｎｅｗｓ　１ニア−１０）。不都合なことには、アレルゲンとし て使用する花粉調製物は多価であり、そして品質に劣る。結局、使用する濃度は ＩｇＧ応答を誘発するためにしばしば高いが、アナフィラキシ−を包含する、前 身の反応のトリが−により致死的であることがある。アレルゲンの配列に基づ（ クローニングされた遺伝子の生産物または合成ペプチドは、品質をコントロール し、特性決定し、そして標準化することができるので、治療のために安全な媒質 を提供する。

症候の解放ための正確なメカニズムは仮説のままである。しかしながら、本発明 のタンパク質またはその少なくとも１つのからなる調製物をライグラスに感受性 の個体に投与すると、ライグラスに感受性の個体のライグラスの花粉のアレルゲ ンに対するアレルギー性応答は、例えば、Ｌｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ 、Ｌｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｌｐｌｂに対するＴ−細胞の応答、または両者に対 するＢ−細胞の応答を変更することによって変更される。

現在の免疫治療はアレルギー学において最も頻繁に投与される処置であり、そし て米国において、最初の選択であると考えられている。花粉の鼻炎のためのこの 処置の利点は３年まで得られるが、製剤学的処置を患者の全寿命の期間にわたっ て実施しなくてはならない。免疫治療のために花粉の抽出物を与えられた患者は 臨床的利益を示し、これは処置の終わり後４年間持続した（Ｇｒａｍｍｅｒら（ １９８４）Ｊ、ＡＩ　Ｉ　ｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、７３：４８４ −４８９）。

ヒトの集団におけるライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌ　ｐｌＩおよびＬｏ ｌ　ｐＩＩＩに対する免疫応答は、組織適合性の白血球の抗原ＨＬＡ−ＤＲ３有 意にに関連する（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆら（１９８８）Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇ ｅｎｓ　３↓：２１１−２１９　；Ａｎｓａｒｉら（１９８９）Ｈｕｍｍａｎ　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、２５：５９−７１；Ａｎｓａｒｉら（１９８９）インターナシ ョナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジー （Ｉｎｔｅｒｎａｔ　１ａｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　 ａｎｄ　Ａｐｐｔｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８８：１６４−１６９）。こ れが意味するように、抗原を表す細胞のクラスＩＩ　Ｉａ分子をエンコードする ＨＬＡ−ＤＲ３は、池のアレルゲン上で存在する同様な免疫優性Ｔ細胞／Ｉａの 認識部位を認識することができる。Ｌｏｌ　ｐＩａはＬｏｌｐＩＩおよびＬｏｌ 　ｐＩＩＩと免疫優性Ｔ細胞／　Ｔ　ａの認識部位（ＹＴＴＥＧＧＴＫＳ　ＥＶ ＥＤＶ　１．Ｐ）を共有するすルコとが知られている。Ｌｏｌ　ｐＩＩおよびＬ ｏｌ　ｐｌＩＩに対して応答する最もアレルギー性の個体は、また、Ｌｏｌ　ｐ Ｉに対して応答するが、逆ではない。こうして、Ｌｏｌ　ｐＩａはＬｏｌ　ｐｌ ＴおよびＬｏｌｐＩＩＩの中に存在しない１または２以上の独特Ｔ細胞／　Ｉ　 ａ認識部位を有するように思われる。これらの独特部位はＬｏｌ　ｐｌａおよび Ｌｏｌ　ｐｌｂの間で共通であるように思われる。確かに、Ｌｏｌ　ｐＩａ、Ｌ ｏｌ　ｐＩＩおよびＬｏｌ　ｐＩＩＩの間で共有される共通のＴ細胞／　Ｉ　ａ 認識部位は、Ｌｏｌ　ｐＩｂの推定された配列において表されない。

さらに、ここにおいて、Ｌｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌｐｌｂは、断片２Ｐの中に 存在する、共通のＢ−細胞のエピトープを有することが証明される。それゆえ、 この共通のエピトープはＬｏｌ　ｐｌａと反応性のすべての３つのＭａｂを使用 して検出された。これはあるエピトープを表し、このエピトープはＬｏｌ　ｐｌ ａおよびＬｏｌ　ｐｌｂの間で共通であるが、Ｌｏｌ　ｐｌＩおよびＬｏｌ　ｐ ｌＩＩの中に存在せず、そして証明された調和した応答性の原因となるように思 われる。

したがって、本発明はＬｏｌ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐＩｂ、それらの検出、相 同体または免疫学的に関係する物質に関し、免疫学的に関係する物質はり。Ｉ　 ｐｌａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの間の共通の抗原性エピトープを含有する誘導体を 包含し、これは草の花粉のためのアレルギーに対してヒトを脱感作するワクチン の開発において有用である。

したがって、本発明は、草の花粉に対するヒトのアレルゲン性を脱感作する方法 を包含し、この方法は、脱感作有効量のＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐＩｂ、 またはＬｏｌ　ｐｌａまたはＬｏｔ　ｐｌｂ＋７）少なくとも１つの断片、また は誘導体、相同体、またはそれらの免疫学的に関係する物質またはそれらの組み 合わせをヒトに投与することからなり、免疫学的に関係する物質は組み換えまた は合成手段により作られ、前記投与は草の花粉に対してヒトを脱感作するために 十分な時間の間かつ条件下に実施する。

したがって、本発明は、脱感作または治療的に有効量のＬｏｔ　ｐｉａまたはＬ ｏｌ　ｐｌｂ、またはＬｏｌ　ｐＩａまたはＬｏｌ　ｐｌｂの少なくとも１つの 断片またはそれらの誘導体、相同体または免疫学的に関係する物質またはそれら の組み合わせ、および１または２以上の製剤学的に許容されうる担体および／ま たは希釈からなる医薬組成物を包含する。Ｌｏｌ　ｐｌａおよび／またはＬｏｌ 　ｐｌｂおよび／またはなどからなる医薬組成物の活性成分は、一部分場合に依 存する量で投与したとき、例えば、草の花粉に対するヒトアレルゲン性の脱感作 において、きわめてすぐれた治療学的活性を示すと考えられる。例えば、約０５ μｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日を投与することができる。投与の養生法は最適 な治療学的応答を提供するように調節できる。例えば、いくつかに分割した投与 量を毎日投与するか、あるいは投与量は治療的立場の経験により示されるように 比例的に減少することができる。活性化合物は便利な方法で、例えば、経口的、 静脈内（水溶性である場合）、筋肉内、皮下、鼻内、陵内または廃剤のルートで 、または移植（例えば、ゆっ（り解放される分子）により投与することができる 。投与のルートに依存して、Ｌｏｌ　ｐＩａおよび／またはＬｏｌ　ｐｌｂおよ び／またはなどからなる活性成分は、前記成分を酵素、酸および前記成分を不活 性化しつる他の自然の条件の作用から保護するための物質でコーティングするこ とが要求されることがある。例えば、Ｌｏｌ　ｐＩａおよび／ナナニ！ｕ−ｏ１ 　ｐＩｂおよび／またはなど低い脂肪親和性は、胃腸管内で、ペプチド結合切断 することができる酵素により、そして胃内で酸性加水分解によりそれを破壊でき るようにする。非経口的投与以外でＬｏｌ　ｐｌａおよび／またはＬｏｌ’　ｐ ｌｂおよび／またはなど投与するために、それらをそれらの不活性化を防止する 物質でコーティングするか、あるいはその物質とともに投与する。例えば、Ｌｏ ｔ　ｐＩａなどはアジュバントの中で、酵素阻害剤とともにまたはリポソームの 中で同時に投与することができる。アジュバントはその最も広い意味において使 用し、そして任意の免疫刺激化合物、例えば、インターフェロンを包含する。こ こにおいて考えられるアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤 、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエ チレンエーテルを包含する。酵素の阻害剤は、膵臓トリプシンを包含する。リポ ソームは、水中油中水ＣＧＦ乳濁液ならびに普通のリポソームを包含する。

活性化合物は、また、非経口的または腹枠内に投与することができる。

分散液は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの 混合物の中で、および油の中で調製することができる。通常の貯蔵および使用の 条件下に、これらの調製物は微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。

注射可能な使用に適当な製剤学的形態は、無菌の水溶液（水溶性である場合）ま たは分散液およびまたは体外の無菌の粉末を包含する。すべての場合において、 この形態は無菌であり、そして注射が容易である程度に流動性でなくてはならな い。それは生産および貯蔵の条件下に安定でなくてはならず、そして微生物、例 えば、バクテリアおよび菌類の汚染作用に対する防腐しな（ではならない。担体 は溶媒または、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、 ポリエチレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、それらの 適当な混合物、および植物油を含有する分散媒質であることができる。適切な流 動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合 において要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維 持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗バクテリア剤および抗菌 類剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメ ロサルなどにより発生させることができる。多くの場合において、等眼側、例え ば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の延長 した吸収は、吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチ ンを組成物の中に使用することによって発生させることができる。

無菌の注射可能な溶液は、活性化合物を要求される物質で適当な溶媒の中に、必 要に応じて、種々の他の前述の成分と一緒に混入し、次いで滅菌濾過することに よって調製される。一般に、分散液は種々の滅菌した活性成分を、基本的分散媒 質および要求される他の前述の成分を含有する無菌の賦形剤の中に混入すること によって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合に おいて、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥の技術であり、これらは前 板て滅菌濾過される溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末をを 生ずる。

Ｌｏｌ　ｐＩａおよび／またはＬｏｌ　ｐｌｂまたはＬｏｌ　ｐｌａおよび／ま たはＬｏｌ　ｐｌｂおよび／またはなどの少なくとも１つの断片は前述したよう に適当に保護するとき、活性化合物を経口的に、例えば、同化可能な食用担体の 不活性希釈とともに投与するか、あるいは硬質または軟質の外殻のゼラチンカプ セルの中に取り囲むか、あるいは治療食の食物の中に直接混入することができる 。経口的治療的投与のために、活性化合物は賦形剤とともに混入し、そして摂取 可能な錠剤、ブッカル錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロ ップ、オブラートなど形態て使用することができる。このような組成物は少なく とも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物および調製物の百分率は 、もちろん、実施することができ、そして便利には単位の約約５〜８０重量％で あることができる。このような治療的に有用な活性化合物の量は、適当な投与量 が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または調製物は、経 口的投与単位が約１０μｇ〜２０００ｍｇの活性化合物を含有するように調製さ れる。

錠剤、トローチ、火剤、カプセル剤などは、また、次の成分を含有することがで きる・結合剤、例えば、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼ ラチン、賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、コーンスター チ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸など、滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウ ム；および甘味剤、例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリンを添加す ることができるか、あるいは香味剤、例えば、ペパーミント、ヒメコウジ油、ま たはサクランボの香味剤。投与単位形態がカプセル剤であるとき、それは、前述 の型の物質に加えて、種々の他の物質はコーティングとして、あるいはそうでな ければ投与単位の物理的形態を変更するために存在することができる。

例えば、錠剤、火剤またはカプセル剤をシェラツク、糖または両者でコーティン グすることができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてス クロース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素および香味剤、例 えば、サクランボまたはオレンジの香味剤を含有することができる。もちろん、 任意の投与単位の形態を調製するとき使用する任意の物質は、使用する量におい て、製剤学的に純粋なかつ実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物 は持続解放性の調製物および配合物の中に混入することができる。

ここで使用するとき、「製剤学的に許容されうる担体および／または希釈剤」は 、任意のかつすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗バクテリア剤および抗 菌剤、等眼側および吸収遅延剤などを包含する。製剤学的な物質のためのこのよ うな媒質および剤は、この分野においてよ（知られている。任意の普通の媒質ま たは剤が活性成分と不適合性であることを除外して、治療的組成物の中でそれら の使用は考えられる。補助的活性成分は、また、組成物の中に混入することがで きる。

投与単位形態で投与の容易および投与の均一性のために、非経口的組成物を配合 することはことに有利である。投与単位形態は、ここで使用するとき、処置すべ き哺乳動物の被検体のために均一な投与に適合した物理的に明確な単位を意味す る：各単位は、要求される製剤学的担体に関連して所望の作用を生成するために 計算された、前辺て決定した量の活性物質を含有する。本発明の新規な投与単位 形態のための規格は、次によりかつ直接に依存する：　（１）活性物質の独特の 特性および達成すべき特定の治療的効果、および（ｂ）体の健康がここにおいて 詳細に開示するように障害されている、疾患の状態を有する生きている被検体に おける疾患の処置のために、このような活性物質を配合する分野において固有の 制限。

主な活性成分を、便利なかつ有効な投与のために、有効量で適当な製剤学的に許 容されうる担体と前述した投与単位形態で配合される。単位投与形態は、例えば 、主要な活性化合物を０．５ｍｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量でを含有する。比 率で表すと、活性化合物は一般に約０．５ｍｇ〜約２０００ｍｇ／ｍｌ担体で存 在する。補助的活性成分を含有する組成物の場合において、投与量は通常の投与 量および前記成分の投与方法を参照することによって決定される。

次の非限定的実施例によって、本発明をさらに説明する。

寒施珂 実施例１−ｃＤＮＡのクローンの単離 ベクターのラムダ−ｇｔｌｌの中のｃＤＮＡの発現ライブラリーを、成熟ライグ ラスの花粉のポリアデニル化されたｍＲＮＡから調製した（ＢｅａｌｌおよびＭ ｉｃｈｅ　Ｉ　ｌ　（１９８６）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ （Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｊｃａｌ　ＭｅｔｈｏｄＳ）８６　：　２１７−２２ ３）このライブラリーを最初にモノクローナル抗体（Ｍａｂ）４０．１でスクリ ーニングした（第１ａ図）。

成熟ライグラスの花粉からフェノール法（ＨｅｒｒｉｎおよびＭｉｃｈａｅｌｓ 　（１９８４）プラント・モレキュラー・ノくオロジー・リポータ−（Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）２：２４−２９）により単離された ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡを使用して、ベクターのラムダーｇｔｌｌの中のｃＤＮＡ を構成した。次いで、ライブラリーを抗体のプローブでスクリーニングして、群 Ｉのタンノくり質を発現する検出した。３Ｘ１０’の組み換えファージで形質転 換されたＥ、ｃｏｌｉＹｌ、０９０ｗｏプレートし、そして４２℃において３時 間インキュベーションした。プレートをｌＱｍＭのＩＰＴＧの中の予備ソーキン グした乾燥した１３２ｍｍのニトロセルロース（ＮＣ）のフィルターでオーバー レイし、約３７℃において移した。３時間インキュベーションした後、フィルタ ーを注意して剥離し、そして２０ｍ１／フイルターのＭＴＢＳ　（１０％ｗ／ｖ の非油指孔粉末、５０ｍＭのトリス−ＨＣＬｐＨ７，６，１５０ｍＭのＮａＣＩ ）の中の室温において３０分間インキュベーションした。第２組のＮＣフィルタ ーをファージのプレート上に配置し、そして２時間インキュベーションした後、 上のようにして処理した。ＮＣフィルターの両者の組をＭａｂ４０．１のプラー クへの結合についてＨｙｎｈら（１９８５）、ＤＮＡのクローニング、実際のア プローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｇ、Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ ）、ＧｌｏｖｅｒＳＤ、Ｍ、（編）Ｖｏｌ、１、ｐｐ、４９−７８、ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ、英国オックスフォードに記載されている方法により試験した。抗体陽 性のプラークを取り上げ、精製し、次いで再プレートし、そしてプローブへの結 合について試験した。陽性のクローンをプラーク−精製し、そして草の花粉にア レルギー性の被検査体からの血清を使用してＩｇＥの結合について試験した。１ ８のクローンを両者のＬｏｌ　ｐＩ特異的ＭａｂおよびＩｇＥ抗体により認識さ れたタンノ（り質をエンコードするとして選択した（表１）。ライグラスのアレ ルゲン性タンパク質を発現したｃＤＮＡのクローンの最大のもの、１．２ｋｂの 大きさのものを、最初に、それ以上の特性決定および配列決定のために選択し、 そしてクローンラムダ−１２Ｒと表示した（第１ａ図）。

表１ ライグラスの群Ｉのアレルゲンを発現するｃＤＮＡのクローンの特性１３（Ｌｏ ｌｐＩａ）　＋　＋＋　＋　８ＱＱ１４　Ｈ＋　＋　１２００ １６　＋　＋＋　８００ １７　４　＋＋　４００ ＋８＋＋　＋　＋　１２００ ＋＋ニー最も強い結合 −ニー結合しない Ｍａｂ１２．３はＬｏｌ　ｐｌｂ（クローン１２Ｒ）について高い親和性を示す 。

Ｍａｂ４０．１はＬｏｌ　ｐＩａ（クローン１３Ｒ）について高い親和性を示す 。

ＩｇＥおよびＭａｂの特異性を、ライグラスの花粉のタンパク質の抽出物のイム ノプロット分析により試験した（第１ｂ図）。

可溶性タンパク質を、ライグラスの花粉から、氷上のＰＢＳ　（１５０ｍＭ、ｐ Ｈ７，２）の中で３時間の間激しく農産することによって抽出した。花粉を回転 除去し、そして抽出されたタンパク質をバイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）のアッセイ を使用して標準化した。１２０μｇ／レーンを還元性条件下に１０〜１５％Ｗ／ Ｖの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動させた。タンパク質をＮＣフ ィルター上にエレクトロブロッティングし、そしてプロットを１０％Ｗ／Ｖの非 油指孔粉末を含有するＴＢＳ　（１０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ Ｈ７，９）でブロックした。プロットをストリップに切断し、そして各々を種々 のプローブで処理した；Ｍａｂを１％のＢＳＡを含有するＴＢＳの中で１＋　１ ０００に希釈した。草の花粉について高いＲＡＳＴのスコアをもつ少なくとも４ 人の患者から集めた血清をプールし、そしてＩｇＥの結合のためにＴＢＳ／１％ Ｗ／ＶのＢＳＡの中で１＝５に希釈して使用した。

セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合した二次約を使用しくＤａｋｏｐａ　ｔ　 ｔ　ｓ）そして洗浄後、結合を４−クロロ１−ナフトール（Ｂ　ｉ　ｏ　ｒａｄ ）およびＨ，Ｏ□で可視化した。

イムノプロットを草の花粉にアレルゲン性の個体からプールした血清の中でイン キュベーションしたとき、強いＩｇＥの結合は２８〜３５ｋＤの領域を通じて観 測された。この研究において使用したＭａｂ３．２．１２．３．２１．３および ４０，１は従来部分的に特性決定された（ＫａｈｎおよびＭａｒｓｈ　（１９８ ６）モレキュラー・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）２ ３：１２８１−１２８８；ＳｊｎｇｈおよびＫｎｏｘ（１９８５’）インターナ ショナル・アーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジ ー（Ｉｎｔｌアーチーブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー（Ｉｎｔ 、Ａｒｃｈ、ＡＩＩｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、７２：２４３ −２４８）、Ｍａｂ３．２．２１．３および４０．１は、タンパク質と２８〜３ ５ｋＤの領域において強い反応性を示した。Ｍａｂ１２゜３は３５ｋＤのバンド に対して結合を示さなかったが、より低いバンドに対して強く結合した。これら の相互作用が示唆するように、ＩｇＥおよびＭａｂの両者は変性されたアレルゲ ンを認識することができ、これによりそれらはＥ、ｃｏｌｉの中の組み換えタン パク質の発現の検出のために適当なプローブである。

ラムダ−１２Ｒの溶原性培養物の誘発により生産されたアレルゲン−ベーター− ガラクトシダーゼの融合タンパク質を、Ｍａｂ４０．１を使用するイムノプロッ ト分析により特性決定した。はぼ１４６ｋＤのこの融合タンパク質は、１１６ｋ Ｄのベーター−ガラクトシダーゼおよび３０ｋＤのアレルゲンをエンコードする 配列から構成されていると仮定する。この融合タンパク質は低い収量で生産され た。それゆえそれ以上の分析のためにクローニングしたアレルゲンの収量を増加 するために、われわれは別発現系を使用した。１．２ｋｂのインサートをｐＧＥ Ｘｌ−３系列のプラスミドの発現系の中にサブクローニングした。これらのプラ スミドは、シストソーマ・ジャポニクム（Ｓｃｈｉｓ　ｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎ ｉｃｕｍ）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ ｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３ｌ−４０）のカルボキシル末端をもつ融 合ポリペプチドを与える。強いＩｇＥの結合はｐＧＥＸ−１２Ｒて形質転換され たバクテリアにおいてのみ検出され、そして親のｐＧＥＸプラスミドをもつもの において検出されなかった（データは示されていないが、同様な結合は第４図に 示されている）。

ライグラスの花粉について陰性のラジオアレルゴソーベント（ＲＡＳＴ）のスコ アを有した対照の血清をもつウェスタンプロットのブロービングは、ＩｇＥの結 合を示した。

実施例２−クローニングしたアレルゲン１２Ｒおよび１３Ｒの同一性この研究に おいて使用したすべてのＭａｂはクローニングしたアレルゲンを認識した（第１ ａ図）。

すべてのＭａｂは自然のＬｏｌ　ｐＩタンパク質に対して同一の特異性を示すわ けではない（第１ｂ図）。とくに、Ｍａｂ１２．３は３５ｋＤバンドを認識しな い。クローニングしたアレルゲンのバンドはすべてのＭａｂに結合し、そして高 い強度でＭａｂ１２．３に結合するので、クローニングされたアレルゲンはより 低い分子量のタンパク質に相当し、モして３５ｋＤのタンパク質に相当しないよ うに思われる。その同一性を確証するために、病害体の抗原について開発された 免疫学的アプローチを使用した（例えば、ＢｅａｌｌおよびＭｉ　ｔ　ｃｈｅ　 １１　（１９８６）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ。

ｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）８６：２１７−２２３）。この方法において、ク ローニングしたアレルゲン１２Ｒをニトロセルロースの膜に固定化し、そして血 清からの特異的ＩｇＥ抗体を結合するために使用した。

結合した抗体を溶離し、そしてライグラスの花粉のタンパク質のウェスタンプロ ットをブロービングするために使用した。結合の高度に特異的なかつ再現性ある パターンは、分子量３１および３３ｋＤの２つのタンパク質成分に対するいくつ かの実験において絶えず得られた。草以外の花粉にアレルゲン性の個体からのＩ ｇＥ抗体を使用したとき、ここで非組み換えｐＧＥＸプラスミドで形質転換され たＥ、ｃｏｌｉの抽出物を使用してＩｇＥ抗体を選抜したとき、特異的結合は観 測されなかった。

これらの実験が実証するように、クローン１２Ｒに結合するＩｇＥ抗体はわずか にＤＮＡ断片分子量３１および３３ｋＤのをもつ２つの成分を認識する。３１／ ３３および３５ｋＤのの成分はそれらの物理化学的特性が構造的に異なることが あり、そして仮にＬｏｌｐｌａ（クローン１３．３５ｋＤの成分）およびＬｏｌ 　ｐＴｂ　（３１／３３ｋＤの成分）と表示する。

この仮説を試験するために、Ｌｏｌ　ｐｅａおよびＬｏｌ　ｐｌｂのタンパク質 を、第１の次元において調製用等電点電気泳動を包含する２次元の分析により、 次いで集められた個体の分画の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより精製した。コノ手順はＬ ｏｔ　ｐｌａ　（ｐＩ５．５）およびＬｏｌｐｌｂ　（ＰＩ９．Ｏ）を十分な量 で、決定すべきそれらのＮ−末端の配列のために首尾よく分離した（表２３゜表 ２ 報告された配列と比較したこの研究において得られたライグラスの花粉のアレル ゲンのＮ−末端のアミノ酸配列アレルゲン　Ｎ−末端の配列 Ｃ１，ｏｎｅ　］、３ＲＩＡＫＶＰＰＧＰＮＩ　ＴＡＥＹＧＤＫＷＬ、Ｄ　ＡＫ ＳＴＷＹＧＫＰＴ阿ｐＩｂ　ＡＤ＾ＧＹＴＰＡＡ？　？ＴＰ＾ＴＰＡ７ＴＣ１ｏ ｎｅ　１２ＲＡＤＡＧＹＴＰＡＡＡ　ＡＴＰＡＴＰＡＡＴＰＡ　ＧＧＷＲＥ個々 のタンパク質の成分をロトフォ−（Ｒｏｔｏｆｏｒ）（バイオラド（Ｂｉｏｒａ ｄ））を使用して単離した。タンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして ＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉ　ｌ　Ｉ　１ｐｏｒｅ））に移した。Ｎ−末端の配 列決定はＭａｔｕｄａｉｒａ　（１９８７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２６２　：１００３５−１０ ０３８、およびＳｉｍｐｓｏｎら（１９８９）、ジャーナル・オブ・クロマトグ ラフィー（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、）↓ヱ旦：３４５−３６１、に従い実施 した。

３５ｋＤのアレルゲンの配列は、Ｌｏｌ　ｐＩの従来発表された配列との相同性 を示す（表２）。３１／３３ｋＤのタンパク質のＬｏｌ　ｐＩｂは、Ｌｏｌ　ｐ Ｉａと異なるＮ−末端のアミノ酸配列を有する。クローン１２Ｒによりエンコー ドされたアレルゲンは主要な新しく同定されたアレルゲンのＬｏｌ　ｐＩｂを表 し、そしてクローン］、３ＲはアレルゲンＬｏｌ　ｐＩａをエンコードする。ク ローン］、２Ｒおよび１３Ｒのヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸配列 を、それぞれ、第３図および第６図に示す。

クローン４Ｒ１６Ｒ，１６および１７Ｒ（表１）をまた配列決定し、そしてＬｏ ｌ　ｐＩａの部分的クローンであることが発見された。全長のヌクレオチド配列 に関する配列決定されたクローンのＬｏｌ　ｐＩａの相対的位置（第７ａ図およ び第７ｂ図に示す）を表３に示す。

表３ プロテアーゼ阻害剤のｃＤＮＡクローンに結合する抗体の要約クローン　ＦＭＣ −ＡＩ　ＦＭＣ−Ａ７　ＩｇＥ　ラドの位置４Ｒ＋＋　＋　０−７６４ ６Ｒ＋＋　＋　１５９−７５４ １６Ｒ＋＋　＋　１２−７６４ １７Ｒ＋＋　＋　３８３−７５６ 実施例３−アレルゲンの花粉特異的発現ポリＡ＋ＲＮＡを異なる植物の組織二種 子、葉、根および花粉から単離した。異なる組織からの全体のＲＮＡの２０ｐｇ を１．２％Ｗ／Ｖのアガロースゲル上でホルムアミドおよびホルムアルデヒドの 存在下に電気泳動させ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）、ハイボンド（Ｈｙｂｏｎ ｄ）−〇エキストラ（アマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　、イリノイ 州アーリントンハイツ）に移し、そしてフィルターを８０℃において２時間の間 ベーキングした。１．．２ｋＤの１２ＲのｃＤＮＡを３２ｐで放射線標識し、そ してＮＣフィルターと６５℃において５０％Ｖ／Ｖのホルムアミドの存在下にイ ンキュベーションした。この膜を０．１％のＷ／ＶのＳＤＳを含有する２ＸＳＳ Ｃで６５℃において洗浄した。

タンパク質を異なる組織（花、葉、根および花粉）から１ｍＭのＰＭＳＦを含有 する１０ｍＭのＰＢＳの中で粉砕し、そして示した抗体でイムノプロットした（ １０ｐｇのタンパク質／レーン）。結合をＭａｂについて＋２５１−ヤギ抗マウ スＩｇ（アマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　）、およびポリクローナ ル１２５Ｉ〜ヤギヒ）ｉｇＥ（カレアソド（ＫａｌＩｅｓｔａｄ）、米国）を使 用して可視化し、そしオートラジオグラフィーにかけた。

花粉から調製したＲＮＡのノザンプロット分析は、花粉においてクローニングし たアレルゲンの遺伝子の高いレベルの発現を示したが、いかなる栄養成長の組織 において示さなかった。はぼ１．３ｋｂの長さの優勢のバンドは栄養成長の組織 からのＲＮＡにおいて検出可能ではない（第２ａ図）。花粉特異的ＲＮＡの発現 は、Ｍａｂ４０．１．１２３およびＩｇＥ抗体により認識された抗原の花粉特異 的発現に相当した（第２ｂ図）。特異的結合は、花粉および花の組織（花粉を含 有する）をタンパク質源として使用したときにのみ、起こった。

実施例４−一次構造の分析 ｃＤＮＡのクローン１２Ｒを単離し、そしてｐＧＥＭ−３２（プロメガ（Ｐｒｏ ｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン）の中にサブクローニングし、制限マツ ピングし、そして種々の大きさの制限断片でｐＧＥＭベクターの中に再サブクロ ーニングした。ＤＮＡ配列をジデオキシヌクレオチド連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ ら（１９７７）ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズ（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、７４　：５４６３−５４６８）に より、セクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ＵＳバイオケミカル（Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌ））およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ ｃ　ｉ　ａ）　、ニュージャーシイ州ピンツバーグ）を使用するを使用して、二 本鎖の配列決定により決定した。配列決定はｄｄＮＴＰおよび７−デアザｄＧＴ Ｐの両者と同時に実施させた。リーディングフレームは、第４図に詳細に描写さ れているように、ｐＧＥＸベクターの中で２つの発現サブクローンを配列決定す ることによって確証された。ＤＮＡ配列のデータはＭＥＬＢＤＢＳＹＳ系を使用 して分析した（ＮＢＲＦタンパク質同定源（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　Ｒ，ｅｓｏｕｒｃｅ）、米国ワシントン州、ＧＥＮＢＡＮＫ、ロ ス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ−（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏ ｎａＪ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、米国；ＥＮＢＥＬ、　ドイツ国ハイデルベル グ、スイスプロドツト（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）およびＮＢＲＦ　ＰＩＲのタンパ ク質データベース）。

ｃＤＮＡクローン１２Ｒのヌクレオチド配列はＧＣにに富んでいた（６８％のＧ Ｃ１第３ｂ図）。位置４０のＡＴＧ開始コドンで開始しそして位ｆ９６４のＴＧ Ａコドンで停止する９２１ｂｐのオープンリーディングフレームが存在する。提 案された翻訳開始部位およびそのフランキング配列は、コンセンサス植物配列Ａ ＡＣＡΔ工ＧＧＣ（ＬＯＣ３６−４４）と８９％の相同性を共有し、そしてメチ オニンのコドンから位置−３のプリンの存在と最適な関係にあると考えられる。

このオープンリーディングフレームは潜在的に分子量３４．１ｋＤのタンパク質 をエンコードする。

アラニン（２３％）およびプロリン（１３％）にに富んだ、予測されたタンパク 質配列は、２５アミノ酸の推定上のシグナルまたは標的ペプチド配列を有する。

これは分子量３］、、３ｋＤの切断されたタンパク質を示す。Ｌｏｌ　ｐｌｂの Ｎ−末端のタンパク質配列は、シグナルの推定上の切断部位置後において、クロ ーン１２Ｒの推定されたアミノ酸配列と同一である。これは、ｃＤＮＡ−１２Ｒ がＬｏｌ　ｐＩｂのアレルゲン性タンパク質をエンコードすること、およびタン パク質が切断されるシグナルタンパク質の配列を有することを確証する。

ソゲナル配列は、他の真核生物の配列に典型的である特徴を有する：Ｃ−末端に おける５アミノ酸の比較的親水性の配列・Ｎ−末端においてより親水性となるソ ゲナル領域のほとんどを越えて延びる比較的疎水性の配列（第３Ｃ図）。Ｃ−末 端におけるアミノ酸は、切断部位におけるアラニン、−２における芳香族残基の チロシン、および−６におけるらせんのブレーカ−のプロリンを含み、それらの すべてはシグナル配列のＣ−末端の領域の普通の特徴である。

現存するデーターベースのサーチは、ラムグー１２Ｒの推定されたアミノ酸と任 意の他のタンパク質との間の相同性を示さない。さらに、推定されたアミノ酸配 列の中のコンセンサスグリコジル化配列（Ａｓｎ−ｘ−８ｅ　ｒ／Ｔｈ　ｒ）に ついてのサーチはこのような配列を検出しなかった。アレルゲン上のＮ一連鎖し た炭水化物鎖の不存在は、酵素のＮ−グリカナーゼおよびエンド−Ｆグリコシダ ーゼで処理後の脱グリコジル化の欠如により確証された。化学的脱グリコジル化 および引き続＜５ＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質の分子量の減少を示さなかった 。３１／３３ｋＤの成分は二重線として残り、分子量の差がグリコジル化のため でないことを示唆した。脱グリコジル化処理は３１／３３　ｋＤの成分へのＩｇ Ｅの結合に影響を与えなかった。５％の炭水化物を有するＬｏｌ　ｐＩａと比較 して、Ｌｏｌ　ｐｌｂの中に炭水化物は存在しない。

ＭａｂおよびＩｇＥの決定基を局在化するために、Ｅ、ｃｏｌｉの組み換え発現 系を使用した（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ　（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７ ：３ｌ−４０）、　この系を使用して、ある数の制限断片を発現プラスミドのｐ ＧＥＸｌ−３の中にサブクローニングした。全長のｃＤＮＡのｐＧＥＸの中への 「インフレーム」のサブクローニングは、ＩｇＥおよびＭａｂ４０．１および１ ２３の両者により認識される６１ｋＤの融合タンパク質を発現した。

全長のｃＤＮＡの１２Ｒまたは２つの制限断片ＩＨおよび２「を、プラスミドの 発現ベクター１２Ｒの中にサブクローニングした。融合タンパク質を誘発する手 順およびバクテリアのリゼイトの調製は初期に記載された（ＳｍｉｔｈおよびＪ ｏｈｎｓｏｎ、前掲）。得られたリゼイトを還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次 いでＮＣ膜に移した。プロットをＩｇＥ抗体およびＭａｂ４０．］、１２３で第 １ｂ図に記載するようにブローヒレ・グしたが、ｔこｔどし１２５■−抗ヒトＩ ｇＥ（カレスタ・ノド（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ）を使用してＩｇＥの結合を検出し た。

イムノプロット分析は、生産された融合タンパク質の大部分が、その融合部位付 近でバクテリアのプロテアーゼによりグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼを使 用して切断され、破壊された生産物を発生し、これはＩｇＥ抗体により認識され ることを示した（第４図）。組み換え融合タンパク質は断片２Ｐにより発現され るが、両者のＭａｂと強く反応性であり、プールしたアレルゲン性血清の中のＩ ｇＥ抗体により認識されなかった。しかしながら、断片ＩＨにより生産されたＮ −末端が切頭されたタンパク質はＭａｂのいずれによっても認識されないが、Ｉ ｇＥ抗体と高度に反応性であった。

このようにして、アレルゲン性分子の２つの明確なドメインが描写された　Ｎ− 末端を含有する断片はＭ’ａｂ１２．３および４０．１のための認識部位を有す る。そしてＣ−末端を含有する断片ＩＨは強いＩｇＥ結合を示し、こうしてアレ ルゲンの１または２以上の決定基を有する。

２つのＭａｂは異なる結合特異性を有しく第１ｂ図）、２つのＭａｂのための認 識部位は異なるように思われるが、同一断片の中にある。１２゜３および４０１ の結合部位を描写するためには、より小さい断片を使用する優れたマツピングが 要求されるが、これらの耐性はＩｇＥ決定基が異なることを示すために十分であ る。

実施例６−ライグラスの花粉の中のＬｏｔ　ｐＩｂの細胞内タープ・ソテイング ロリウム・ベレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）の成熟した花粉を、確立 された方法（Ｓｔａｆｆら、（１９９０）ヒストケミカル・ジャーナル（Ｈｉｓ ｔｏｃｈｅｍ、Ｊ、）２２．２７６−２９０）するように思われる走査電子顕微 鏡のために調製した。免疫細胞測定のために、成熟した朽を無水条件：２．２− ジメトキシプロパンの中の０．１％のグルタルアルデヒド、１％のパラホルムア ルデヒド下に４°Ｃにおいて２時間固定し、そして透過型電子顕微鏡検査（Ｓｔ ａｆｆら、前掲）のために処理した。この方法は水性媒質の中でそれらの細胞の 部位からのアレルゲンの拡散を減少するために開発された。ブロックをＬＲ金樹 脂を１％のベンジルと一２５℃において紫外線の照明下に重合させ、そして８０ Ｒｍの薄い切片を金のグリッド上に取り上げた。免疫標識つけはまず一次抗体、 Ｍａｂ１２．３　（Ｌｏｌ　ｐＩｂに対して特異的な）であり、次いて金−ヤギ ー抗マウスＩｇＧのプローブ（１５％ｍの粒子サイズ）であった。この標識を４ ０％ｍの粒子サイズに増大した（ＤａｎｓｃｈｅｒおよびＮｏｒｇａａｄ’（１ ９８３）ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（Ｊ、Ｈｅｔ、 Ｃｈｅｍ、）刊１．１３９４−１３９８から変更した）。第２の標識っけを同一 の切片について３つのＭａｂ、３．２．２１．３および４０．１　（Ｌｏｌ　ｐ Ｉａに対して特異的な）の混合物を使用して実施し、次いで１５％ｍの粒子サイ ズをもつ金−ヤギー抗マウスＩｇＧのプローブを使用して実施する。

従来記載された（Ｓｔａｆｆら、前掲）ように実施した抗体の特異性および方法 の対照は、これらの部位に金粒子を示さなかった。

Ｌｏｌ　ｐＩは細胞質ゾルの中に位置し、そしてオルガネラの中に存在しない（ Ｓｔａｆｆら、前掲）。これらの発見は、Ｌｏｔ　ｐｌに対して特異的なＭａｂ とともにイムノ−金プローブを使用して得られた。

ここにおいて示すように、Ｍａｂ１２．３は、Ｌｏｔ　ｐＩｂに対して特異的で あり、澱粉粒に主として結合する（第５ａ図および第５ｂ図）。

草の花粉はＩＸ２．５μｍの大きさであり、そしてアミロブラストの内腔の中で 発生するの澱粉粒で充填されている。

第５ｂ図に示すように、澱粉粒の上に主として位置うつ大きい金の粒子（大きい 電子の光る空間）はＭａｂ１２．３のＬｏｔ　ｐＩｂへの結合を示すが、細胞質 ゾルの上の小さい粒子はＬｏｌ　ｐＩａへの典型的な結合である。目盛りのバー は１μｍである。第５Ｃ図は、水に３０秒間に暗い場の照明に暴露された後の、 新しい、生存しうる花粉の外観を示す。花粉の大部分は破裂し、胚の小孔を通る 澱粉粒（白色粒子）を含む、それらの細胞質の内容物を押し出している。目盛り のバーは３０μｍである。

ブラスチドの中のＬｏｌ　ｐｌｂの局在化は、このタンパク質が、発育の間に、 細胞質ゾルからプラスチドの内腔へ輸送されることを意味する。葉緑体への輸送 のために、細胞質ゾルの中で合成されるタンパク質はオルガネラの中に輸送後に 切断される標的ペプチドの配列を含有する大きい前駆体として合成される。Ｌｏ ｌ　ｐｌｂのシグナル配列（第３ｂ図、アミノ酸−２５〜−１）と、発表された ミトコンドリアおよび葉緑体特異的トランシットペプチドとの比較は次の通りで ある。

プラスチドの中への輸送のために、植物のシグナルペプチドはカルボキシル末端 に追加の情報を必要とし、これはペプチドの切断部位から−１〜−７領域に存在 する。はとんどの葉緑体のターゲツティングしたタンパク質のシグナルペプチド は、配列ｒＧ−Ｒ−ＶＪまたは一２位置から読まれる機能的に相同性の配列を有 する。Ｌｏｌ　ｐｌｂ（クローン１２Ｒ）のシグナルペプチドは、この位置に配 列ｒＧ−Ｒ−３Ｊを有する（第３ｂ図）。こうして結論されるように、Ｌｏｌ　 ｐｌｂ分子はまず細胞質ゾルの中で前アレルゲンとして合成され、そして翻訳後 の修飾のためにブラスチドに輸送される。これらの細胞内のプロセシング段階は 、イムノブロッティングにより見いだされる二重線の３１／３３ｋＤの出現を説 明することができる。プロセシングされなＬＸ前アレルゲン１ま３３ｋＤであり 、そしてブラスチドの中でプロセシングされた後、成熟タンパク質は３１ｋＤで ある。両者のこれらの形態は成熟タンノ々り質の中に同時に存在する。この二重 線は、また、Ｌｏｌ　ｐＴｂの異なるアンフォームを表すことができる。

実施例７−免疫系へのＬｏｌ　ｐｌａおよびｂのプレゼンテーションライグラス の花が開（と、朽は働き、そして花粉は各駒の基部で開く小孔を通して空気の中 に解放される。ライグラスは任意の草の最大の花粉の生産を示し、はぼ４６０ｋ ｇの花粉／ヘクタールを刈り取られなＬ％か、あるいは家畜に食われない牧草の 中で大気の中に解放する。この花粉の９９％はその源のｌｋｍ以内に堆積（およ び再堆積）される。草の花粉は寿命が短く、しかも大気の中に数日間止まること ができる。実験において、花粉は解放後にわずかに数時間の間だけ生存しうるこ とが示された。

生存しつるとき、花粉粒は柱頭上で、あるいは高いレベルのオスチクム（ｏｓ　 ｔ　ｉ　ｃ　ｉ　ｃｕｍ）の人工的培地の中で、発芽することができる。

生きている生存しつるライグラスの花粉の花粉粒は、水に暴露すると、単一の発 芽の口で破裂し、細胞質の内容物を解放する（第５Ｃ図）。解放された内容物の 間で澱粉粒は顕著である。花粉粒の張性を維持するためには、高いオスチクム、 例えば、３０％Ｗ／Ｖのショ糖の培地が要求される。対照的に、死亡した花粉粒 は、透過性のバリヤーをもたず、スポンジのように作用することはよく知られて いる。細胞のタンパク質は、アレルゲンを含めて、ｆＡ７ＩＦＩ化のとき表面か ら解放される。

草の花粉が経口的または眼の粘膜と接触したとき、アレルゲンの直接解放により 、枯草熱をどのようにしてトリガーすることができるかは容易に理解される。花 粉粒それら自体は粘膜の表面上に止まるが、解放されたアレルゲン性タンパク質 は粘膜および上皮下の層を通過し、ここでそれらは好塩基性細胞およびマスト細 胞と相互作用する。３０〜５０μｍ程度に大きい直径の花粉粒がアレルギー性喘 息、肺の気道の中のアレルゲンの存在によりトリガーされる疾患を誘発すること ができるメカニズムを理解することは容易ではない。

最近の証拠が示唆するように、草の花粉のアレルゲンは大気の中のエーロゾルの 中に見いだされる小さいんの粒子と会合する。このような粒子の由来は不明瞭で ある。アレルゲンの局在化、および水の中の花粉の挙動について観察の本発明の 結果から、草の花粉が感受性の肺においてアレルギー性喘息を誘発することがで きるメカニズムを説明ための新しい仮説を提案する。生きている花粉粒が葉また は他の支持体の使用上で水蒸気または水と直面するとき、澱粉粒はミクロンの粒 子として大気のエーロゾルの中に解放される。これらの粒子、アレルゲンで被覆 されたおよび充填された両者の粒子は、上および下の気道へアレルゲンをプレゼ ンテーションするためのベヒクルとして作用する。ミクロンの粒子は、また、も ちろん、草の花粉からのアレルゲンの浸出および大気のエーロゾルの他の成分上 の堆積から生ずる。

実施例８−Ｌｏｔ　ｐｌａをコードする核酸配列の単離およびクローニング 全体のｍＲＮＡを、成熟ライグラスの花粉から、ＨｅｒｒｉｎおよびＭｉｃａｅ ｌｓ、前掲、のフェノール法により抽出した。１μｇの全体のｍＲＮＡから商業 的に入手可能なキット（ｃＤＮＡＤＮＡ合成系フキ、ＢＲＬ、マリイランド州ガ イスバーグ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。フェノール抽出およびエ タノール沈澱後に、ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐ　ｒ　ｏ ｍｅ　ｇ　ａ）　、ウィスコンシン州マジソン）で平滑末端とし、そして、Ｒａ ｆｎｅｒら（１９９１）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２６６：１２２９−１２３６）；Ｆｒｏｈｍａｎ ら（１，９９０）プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシズ（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８５　 ：８９８８−９００２　：およびＲｏｕｃら（１９９０）バイオ／テクノロジー （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ、）８：４８−５７における方法に従い、変更されたアンカ ード（Ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＰＣＲにおいて使用するために、エタノール沈澱した 、自己アニーリングしたＡＴおよびＡＬオリゴヌクレオチドに結合した。オリゴ ヌクレオチドＡＴは５’　−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＴＡＣＣＧＴＣ ＣＧＡＴＣＧＡＴＣＡＴＴ−３（Ｒａｆｎｅｒら、前掲）を有する。オリゴヌク レオチドＡＬは配列ＡＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＴ　（Ｒａ　ｆｎｅ　ｒら、前掲 ）を有する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は商業的に入手可能なキット（ＧｅｎｅＡｍｐ ’ＤＮＡ増幅キット、パーキン・エルマー・セツス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ）：＋ネチカット州ノーウオーク）を使用して実施し、ここでｄＮ ＴＰを含有する１０μｍの１０×緩衝液を１ａｇの各ブラー＋’ｖ−ＡＰ　（、 ：ｈは配列５’　−ＣＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＣＧ−３’　を有す る）（Ｒａｆｎｅｒら、前掲）およびＬｐＡ−５（これハ配列５°−ＣＣＣＴＧ ＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧ−３’を有する）　、ｃＤＮＡ　 （３〜５μＩの２０μＩの連鎖したｃＤＮＡ反応混合物）、０．５μｍのアンブ リタフ（Ａｍｐｌｉ　ｔａｑ＞　ＤＮＡポリメラーゼと混合し、そして蒸留水を １００μｍとした。

ＬｐＡ−５（７）ヌクレｒチＦ１〜８　（５’　−ＣＣＣＴＧＣＡＧ）　はクロ ーニングの目的で付加されたＰｓｔ１部位に相当する；残りのヌクレオチドは、 第６図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド４８３〜５００に対して相補的な非解読 鎖の配列に相当する。

試料をプログラミング可能な熱的コントローラーで増幅した（ＭＪリサーチ・イ ンコーホレーテッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ、　いん、）、マサチュセソツ州ケンブ リッジ）。最初の５ラウンドの増幅は、９４℃における１分間の変性、４５℃に おける１、５分間のプライマーの鋳型へのアニーリング、および７０℃における ２分間の連鎖伸長がら成っていた。最終の２０ラウンドの増幅は、前述の変性、 ５５℃における１、５分間のアニーリング、および前述の伸長から成っていた。

次いで、この最初の増幅の５％（５μｍ）を二次増幅において使用し、ここでｄ ＮＴＰを含有する１０μｍのＩＯＸ緩衝液を１ａｇの各プライマーＡＰおよびブ ライ７−ＬａＰ−３（これは配列５’　−ＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＡ ＣＴＴＧＧＣＣＧＡＧＴＡ−３’　を有する）　、０．５ｕ　Ｉｔ７）７：ｚブ リタフＤＮＡポリメラーゼと混合し、そして蒸留水で１００μｌとした。

二次ＰＣＲ反応をここに記載するように実施した。ＬａＰ−３のヌクレオチド１ 〜８（５°　−ＣＣＣＴＧＣＡＧ−３”）はクローニングの目的で付加したＰｓ ｔ１部位に相当する：ヌクレオチド９〜１２（５°−ＴＣＡ−３’　）は新しい 停止コドンのための相補的配列に相当し、そして残りのヌクレオチドは第７ａ図 および第７ｂ図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド７９３〜８１０に対して相補的 な非解読鎖の配列に相当しく第６図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド４２６〜４ ４３）　、Ｌｏ　１　ｐ　Ｉａの翻訳された配列、自然の停止コドンおよび３′ 未未翻訳列を包含する。

増幅されたＤＮＡは、順次のクロロホルム、フェノール、およびクロロホルムの 抽出、および引き続＜−２０℃における０、５体積の７．５酢酸アンモニウムお よび１．５体積のイソプロパツールを使用する沈澱により回収した。７０％のエ タノールを使用する沈澱および洗浄後、ＤＮＡを同時にＸｂａＩおよびＰｓｔ’ ｌで１５μＩの反応において消化し、そして調製用３％のＧＴＧヌシーブ（Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ）低温溶融ゲル（ＦＭＣ，メイン州ロックボート）を通して電気泳動 させた。適当な大きさのＤＮＡバンドをＥｔＢｒの染色で可視化し、切除し、そ してジデオキシヌクレオチド連鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）ブロシー デインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｃ）ｃ 、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、、７４　：５４６３−５４７６ ）による商業的に入手可能な配列決定キット（セクエナーゼ（’Ｓ　ｅ　ｑｕｅ ｎａｓｅ）キット、ＵＳバイオケミカル（ＢｉｏｃｈｅｍｊｃａＪ）、オハイオ 州タレブランド）を使用する配列決定のために、適当に消化したＭ１３ｍｐ１８ の中に結合した。

両者の鎖をＭ１３を使用して前進プライマーおよび逆プライマーにュー・イング ランド・バイオラプス（Ｎ、Ｅ、Ｂｉｏｌａｂｓ）　、マサチュセノツ州ベバリ ー）および内部の配列決定プライマーＬｐＡ−１３、ＬｐＡ−１２、ＬｐＡ−９ 、ＬｐＡ−２、ＬｐＡ−７、ＬｐＡ−１０、およびＬｐＡ−ＩＡを使用して配列 決定した。ＬｐＡ−１３は配列５゛　−ＧＡＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＴＧＧ Ｃ−３’を有し、これは第７ａ図および第７ｂ図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチ ド１２１〜１３９に相当する。ＬｐＡ−１２は配列５°　−ＴＴＣＧＡＧＡＴＣ ＡＡＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣ−３’　を有し、これは第７ａ図および第７ｂ図 に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド３１０〜３１８に相当する。Ｌ　ｐ　Ａ−９は 配列５’−ＧＴＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＣＧＧ−３’を有し、これは第７ａ図お よび第７ｂ図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド３３５〜３５０に対して相補的で ある非解読配列に相当する。ＬｐＡ−２は配列５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧ ＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣ−３’を有する。ＬｐＡ−２のヌクレオチ ド１〜７　（５−ＧＧＧＡＡＴＴ−３’　）はクローニングの目的で付加された ＥｃｏＲＩ制限部位の一部分に相当する；　ＬｐＡ−２の残りの配列は第７ａ図 および第７ｂ図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド４２５〜４４１に相当する。Ｌ ｐＡ−７は配列５゜−ＧＴＧＣＣＧＴＣＣＧＧＧＴＡＣＴ−３°を有し、そして 第７ａ図および第７ｂ図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド５０３〜５１８に相当 する。ＬｐＡ−１０は配列５’　−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＴＴＣ−３゜を有 し、これは第７ａ図および第７ｂ図に示すＤ　Ｎ　Ａ　酊１１のヌクレオチド５ ７５〜５９０に相当する。ＬｐＡ−ＩＡは配列５“　−ＧＧＡＧＴＣＧＴＧＧＧ ＡＧＣＡＧＴＣ−３”　を有し、これは第７ａ図および第７ｂ□す１ 図に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド６５４〜６７２に相当する。

いくつかの独立のＰＣＲ反応からの多数のクローンを配列決定した。

推定されたアミノ酸配列をもつ、Ｌｏｌ　ｐｌａの代表的なりローンの配列、ク ローン２６　ノ、を第７ａ図および第７ｂ図に示す。第７ａ図および第７ｂ図に 示すように、Ｌｏｌ　ｐＩａをコードする核酸配列はヌクレオチド１６における ＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド８０５における停止コドンで終 わるオーブンリーディングフレームを有する。翻訳されたタンパク質は、それぞ れ、２８．５ｋＤおよび５５５の予測された分子量およびｐＩをもつ２６３アミ ノ酸の推定されたアミノ酸配列を有する。開始するメチオニンはアミノ酸−２３ と番号を付され、アミノ酸番号＋１は、アミノ酸の配列決定（Ｃｏｔｔａｍら（ １９８６）バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）２３４：３０ ５−３１０）により定義されるように、成熟タンパク質のＮＨ２−末端に相当す る。第７ａ図および第７ｂ図におけるアミノ酸−２３〜−１は成熟タンパク質か ら切断されたリーダー配列に相当する：したがって、成熟タンパク質は２４０ア ミノ酸から構成され、そして、それぞれ、２６．１ｋＤおよび５．３８の予測さ れた５、３８を有する。アミノ酸９に単一の潜在的Ｎ一連鎖したグリコジル化部 位が存在する。

クローン２６　ｊのアミノ酸１〜３０（第７ａ図および第７ｂ図）は、Ｌｏｌ　 ｐｌのＮＨ２−末端の発表された配列に正確に対応する（Ｃ。

ｔｔａｍら、前掲）。クローン２６　ｊのアミノ酸２１３〜２４０はＬｏｌ　ｐ ＴのＮＨ２−末端の発表された内部のアミノ酸配列に正確に対応する（Ｅｓｃｈ およびＫｌａｐｐｅｒ　（１９８９）モレキュラー・イムノロノー（Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）２６：５５７−５６１）。

クローン１３Ｒの最初のヌクレオチド（第６図）は、第７ａ図および第７ｂ図に 示すＬｏｌ　ｐｌａをコードする配列のヌクレオチド３６８に相当する。

実施例９−Ｌｏｌ　ｐＩａにおける多形性の同定Ｌｏｌ　ｐｌａをコードするヌ クレオチド配列１こおける多形性の数（ま、異なるＬｏｌ　ｐＩａのクローンの 増幅および配列決定の間１こ発見された。多形性のい（つかはクローン２６．ｊ のそれ１こ関してアミノ酸の変化を引き起こすが、他のものはアミノ酸の変化を 引き起こさな０サイレントの多形性である。Ｌｏｌ　ｐｌａをコードする配列の 中（二見し１だされた多形性を表４に要約する。ヌクレオチドの塩基数１ま第７ ａ図および第７ｂ図に示すクローン２６．」の配列のそれである。

表４−Ｌｏｌ　ｐｌａにおいて検出された多形性ヌクレオチドの多形性　アミノ 酸の多形性Ｉ　ＧＧｅ、、ｊ→ＧＧＡ／ＧＧＴ　すＬ２　Ｇ２．、ＡＣ，Ｈ−Ｇ ＡＴ　ｏ、、−＊３　ＧＴＴ、、−ＧＴＣなし ４　ＣＧＴ、５．神ＣＧＣなし ５　ＧＧＣ，！４→ＧＧ？　なし ６　ＡＡｃｓ、、−ＡＡ’！’　なし ７　ＣＣＧユ、−ＣＣＴ　なし Ｂ　ＣＡＴ＆、３→ＣＡＣなし ９　ＧＣＣ，、−ＩＧｃＡ　なし １０　ＧＡＣＳ３．＜ＡＴ　なし １１　ＣＧ、。０峰ＧＡＣ’Ｑ４＊””Ｄ１２　ＣＣＧ、、５ＣＣＡ　Ｎ０ＮＥ １３　ＡＣＡ、３−ｋＡＣＧ　Ｎ０ＮＥ１３　ＧＣＧ、、−ＧＣＣなし すべての確証されたヌクレオチドの多形性（２つの独立のＰＣＲ反応からのクロ ーンの配列の分析において観察された多形性）を、クローン２６、ｊの配列に関 して示す（第７ａ図および第７ｂ図）。それらのそれぞれのコドンのトリブレッ トの中の多形性の残基は番号を付されている。推定上のアミノ酸の変化をまた示 す：大部分のヌクレオチドの多形性はサイレントであり、そしてアミノ酸の変化 を生じない。２８の潜在的多形性は単一の手順反応からのクローンにおいてのみ 観察された。これらの２８の潜在的多形性のうちの１７はサイレントの突然変異 であり、そしてアミノ酸の多形性を生じない、残りの１１の潜在的な多形性の部 位は、詳しくは、次のアミノ酸の変化を生ずるであろう・Ｔ１１→Ｍ１Ａ４９− ＶＳＲｅ□→Ｓ、に７９→Ｒ，Ｖｏｏ−４Ｌ　Ｑ１３３→Ｒ−１＋５２→Ｔ１Ｖ １７３−Ｅ、　Ｉ　１８７→Ｔ、Ｖｚ２３＝Ｆｉ６ヨＵＫ２ｓｘ”Ｒ０当業者は 理解するように、記載した本発明はここに詳しく記載したちの以外の変化および 変更が可能である。本発明はこのような変化および変更のすべてを包含すること が理解されるであろう。本発明は、また、この明細書に言及しかつ示したすべて の工程、特徴、組成物および化合物を個々にかつ総合的に、および前記工程およ び特徴の任意の２またはそれ以上の任意のおよびすべての組み合わせを包含する 。

ここにおいて表すヌクレオチド配列は、現在入手可能な最も正確なデータを表す 。小さい補正は、本発明の範囲を逸脱しないで、引き続いて配列についてなすこ とができる。

ＴＩＧυＲＥ　２ ０　−　ω　Φ　の　＝　１　− ■　−〇　〇寸ψ〜〜 ψ　＝　０　０　。　−０，。１ ■　ト　Ｉ＋　ロ　■　００−　（’Ｊ〜「ゝ　マ　０　ロ　へ　ｈ ″　三　＝）、。　。　、　へ ０　＋ｔ　マ ；ｇＡ　蓄　冨　響　；　８ ８３　ごＬ”　８５　瀝５８ざ　８ぎ　８ｃ℃ｏｏ　ＣＤ　＜ｏ　ヒ　■ ＣＤｃｏ　（ｒａ　０Ｏ−Ｃ）　ＯＣＬ　Ｑｅ　ＯコＱｉ５ト＞　Ｏ）　３にへ 　邑ギ　＝η　８０２の匡謬　朴　跳３　寡ｙピｉ　目ミ　談Ｓ旨３守８ミ　ｇ ：　８１　’８　ｏ：　ＥＡ　（りε　８湧０　（）　ｌ−Ｑ　Ｑ　Ｑ　ｌ− ０コ　０！−〇の　Ｈ２■包　０ユい　０２０−Ｉ　く　３３　３０　ａ＜　３ ５ｃＤ　＜。

ＯｚｉｌＩ　（Ｊ？　ＱＱ−Ｑ’ｔｌ　ＣＤ’＝　ＣＤｑ　０９ｇ臼＞　８０　 さ−２８＜　訃−３−８ａ−Ｏｉ５１ｉＳψ　ｏ：＞ｕ’＞ｏ＞　ｏｏ−ｏ芸　 ｏｇ２〜　ご１８°＝ｇ′Ｄ　、３２　１ｍ、３“０暮　ｏ＞Ｌ１２０ｍ　ｃｑ Ｈｏｇ　ａｚＢａ突Ｑ″８　ｃＤ（ｅ、　＜　３−３−ＯＳ　３−Ｃ房　０〕　 ０と　０＞　０ミ　０玩　０３目８く　巳５　足＋−８０≦ヒ　３く　≧ｃｚ− ，ｃ”）ｏｏ　０！０　ヒ弧　Ｑご　Ｏｚ　０２５芝Ｃ’％　＝ｆ　安−一　≦ ヒ　ｇＯｇｏ　３ｃ）冨　粗　＝　；　尺　− の　マ　マ　の　−０ ｇ３　雪３　冒δ　８１　定３誓　定３Ｑ　（Ｑ　←　く　く トリ　８３　β３　ｇ占　旨）　宅■ ＜　ＯＱ　（ＣＤ　ＣＤ Ｏ！２　■τり　０コ　ｏｐ　ｏ；ｇ　（１）女Ｑ（Ｌ　ｊ−乏”；ニー＜＜５ ａＩ：Ｌ　巳−３−〇　く　０　０ 雪８８茂　冒肘冒芒　−目星 ０　ト　０ ♀ｇ　訪　♀６８朗腿３　計 ＣＤ０ＣＤく ０口　０■　０？　Ｏ＞　Ｏ：）０　ＣＤｃ。

３．２　ｊ：ｆｆｉ　”’　８°　已５　異Ｅ　＞０αい　Ｃコ　〇四　〇ユ　 ０　弧　〇四１邑ηＭ（Ｑ（δギ　≦′８＜３ １ｊｉＥ　旨Ｕ　ｇ　３　８３　０　湧ｑ　ｅ、５”く　０　・　＜　１−１− 　（り ２５８　藁ξ　定δ　定３　目３　別ｒＱ　■　（）　＜　（１）　ＣＤ ８占　ビ睡翼６　Ｆ　冒３　葺Ｃ く ｌ　足−−８ぎ　呂ミョ黛蚕　基フ ＣＤ　”−Ｏ（Ｃ Ｏ２０９■′−Ｃ９特報　討と ＜（：Ｄ　（−）ＣＬ　（−’；：ｃ−。　←＜ＤＱ　＜ ρ　さ　き　９ ８湧　ＱＺ　定Ｓ　定暑冗 １−　Ｑ　Ｑ　＜ ０コ　０ψ　くψ００と ＜０　＜ご　く二さ　０の ０　く　く　− 目星　５ξ　馨占　苺門 ’ｅ）Ｉ”　８Ｑ：　’ｅ）ＣＤ　曾ξ＋　Ｑ　（１）　Ｃ） 定３翳　８占　８Ｃ８３ ＜　＜　Ｑ　ＣＤ ←α　（）Ｏ−ｃ＋　ＣＤｌ：）　ＣＤ　岬５将　く≧：　＜ＣＤ　＜− ＣＤ０　＜ Ｏ”Ｑ　ＯＡ　Ｑ　ｊ５　”ｊ３　ＣＤ　Ｅ’く、冒−胃トへ　冒ヒ く ８ε　呂ξ　８占　８６葺 ０　く　く　０ 要約書 本発明は、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｉ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐｌ ｂをコードする核酸配列、精製されたＬｏｉ　ｐＩａおよびＬｏｌ　ｐＩｂのタ ンパク質およびその断片、組み換えＬｏｔ　ｐｌａおよびＬｏｌ　ｐＩｂまたは その少なくとも１つの断片またはその誘導体または相同体を生産する方法、およ び本発明の核酸配列、タンパク質およびタンパク質を使用する方法を提供する。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、その少なくとも１つの抗原 性断片、その誘導体または相同体をコードする核酸配列、前記核酸配列の機能的 同等体。 ２、前記核酸配列は第７ａ図および第７ｂ図に示す核酸配列の解読部分のヌクレ オチド配列を有する、請求の範囲第１項に記載の核酸配列。 ３、前記核酸配列は第７ａ図および第７ｂ図に示す核酸配列の解読部分の少なく とも１つの断片から本質的に成る、請求の範囲第１項に記載の核酸配列。 ４、前記核酸配列は第６図に示す核酸配列の解読部分の少なくとも１つの断片か ら本質的に成る、請求の範囲第１項に記載の核酸配列。 ５、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、またはその少なくとも１つ の抗原性断片、またはその誘導体または相同体をコードする核酸配列からなる発 現ベクター。 ６、前記発現ベクターは第７ａ図および第７ｂ図に示す発現ベクターの解読部分 のヌクレオチド配列を有する、請求の範囲第５項に記載の発現ベクター。 ７、前記発現ベクターは第７ａ図および第７ｂ図に示す発現ベクターの解読部分 の少なくとも１つの断片から本質的に成る、請求の範囲第５項に記載の発現ベク ター。 ８、前記発現ベクターは第６図に示す発現ベクターの解読部分の少なくとも１つ の断片から本質的に成る、請求の範囲第５項に記載の発現ベクター。 ９、請求の範囲第１項に記載の核酸配列によりエンコードされるタンパク質また はペプチドを発現するように形質転換された宿主細胞。 １０、請求の範囲第２項に記載の核酸配列によりエンコードされるタンパク質を 発現するように形質転換された宿主細胞。 １１、請求の範囲第３項に記載の核酸配列によりエンコードされるタンパク質ま たはペプチドを発現するように形質転換された宿主細胞。 １２、請求の範囲第１項に記載の核酸配列で形質転換された宿主細胞の中で生産 された、精製されたライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａまたはその少 なくとも１つの抗原性断片、またはその誘導体または相同体。 １３、請求の範囲第２項に記載の核酸配列で形質転換された宿主細胞の中で生産 された、精製されたライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ。 １４、請求の範囲第３項に記載の核酸配列で形質転換された、精製されたライグ ラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａの少なくとも１つの断片。 １５、請求の範囲第４項に記載の核酸配列で形質転換された、精製されたライグ ラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａの少なくとも１つの断片。 １６、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、またはその断片、または その誘導体または相同体をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞 を適当な培地の中で培養して、細胞と前記ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏ ｌｐＩａまたはその少なくとも１つの断片またはその誘導体または相同体を含有 する培地との混合物を生産し、そして前記混合物を精製して実質的に純粋なライ グラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、またはその断片、またはその少なく とも１つの誘導体または相同体を生産する、ことからなる、ライグラスの花粉の アレルゲンのＬｏｌｐＩａ、またはその断片、またはその少なくとも１つの誘導 体または相同体を生産する方法。 １７、ライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａのすべてまたは一部分をエ ンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞の中で合成された、ライグラ スの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、またはその断片、またはその少なくとも １つの誘導体または相同体からなるタンパク質調製物。 １８、前記ＬｏｌｐＩａの少なくとも１つの断片は抗原性断片である、請求の範 囲第１７項に記載のタンパク質調製物。 １９、化学的に合成されたライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、また はその断片、またはその少なくとも１つの誘導体または相同体からなるタンパク 質調製物。 ２０、前記ＬｏｌｐＩａは第７ａ図および第７ｂ図に示すアミノ酸配列を有する 、請求の範囲第１７項に記載のタンパク質調製物。 ２１、前記ＬｏｌｐＩａは第７ａ図および第７ｂ図に示すアミノ酸配列を有する 、請求の範囲第１９項に記載のタンパク質調製物。 ２２、ライグラスの花粉の単離された抗原性断片。 ２３、ライグラスの花粉からの前記アレルゲンはＬｏｌｐＩａである、請求の範 囲第２２項に記載の抗原性断片。 ２４、ライグラスの花粉からの前記アレルゲンはＬｏｌｐＩｂである、請求の範 囲２２項に記載の抗原性断片。 ２５、前記抗原性断片はＴ−細胞刺激活性を有する、請求の範囲第２２項に記載 の抗原性断片。 ２６、前記抗原性断片はＴ−細胞刺激活性を有する、請求の範囲第２３項に記載 の抗原性断片。 ２７、前記抗原性断片はＴ−細胞刺激活性を有する、請求の範囲第２４項に記載 の抗原性断片。 ２８、前記抗原性断片は最小の免疫グロブリンＥ刺激活性をさらに有する、請求 の範囲第２６項に記載の抗原性断片。 ２９、前記抗原性断片は最小の免疫グロブリンＥ刺激活性をさらに有する、請求 の範囲第２７項に記載の抗原性断片。 ３０、前記断片はライグラスの花粉に対して特異的な免疫グロブリンＥに結合し ない、請求の範囲第２６項に記載の抗原性断片。 ３１、前記断片はライグラスの花粉に対して特異的な免疫グロブリンＥに結合し ない、請求の範囲第２７項に記載の抗原性断片。 ３２、前記抗原性断片は、それが投与されるライグラスの花粉に感受性の個体に おいて、ライグラスの花粉に対するアレルギー性応答を変更することができる、 請求の範囲第２２項に記載の抗原性断片。 ３３、前記抗原性断片は、それが投与されるライグラスの花粉に感受性の個体に おいて、ライグラスの花粉に対するアレルギー性応答を変更することができる、 請求の範囲第２３項に記載の抗原性断片。 ３４、前記抗原性断片は、それが投与されるライグラスの花粉に感受性の個体に おいて、ライグラスの花粉に対するアレルギー性応答を変更することができる、 請求の範囲２４項に記載の抗原性断片。 ３５、前記抗原性断片は、ライグラスの花粉のアレルゲンに対する個体のＢ−細 胞の応答、ライグラスの花粉の抗原に対する個体のＴ−細胞の応答、または両者 を変更することができる、請求の範囲３２項に記載の抗原性断片。 ３６、前記抗原性断片は、ライグラスの花粉のアレルゲンに対する個体のＢ−細 胞の応答、ライグラスの花粉の抗原に対する個体のＴ−細胞の応答、または両者 を変更することができる、請求の範囲第３３項に記載の抗原性断片。 ３７、前記抗原性断片は、ライグラスの花粉のアレルゲンに対する個体のＢ−細 胞の応答、ライグラスの花粉の抗原に対する個体のＴ−細胞の応答、または両者 を変更することができる、請求の範囲第３４項に記載の抗原性断片。 ３８、請求の範囲第２２項に記載のライグラスの花粉のアレルゲンの単離された 抗原性断片をコードする核酸配列。 ３９、請求の範囲第２３項に記載のライグラスの花粉のアレルゲンの単離された 抗原性断片をコードする核酸配列。 ４０、請求の範囲第２４項に記載のライグラスの花粉のアレルゲンの単離された 抗原性断片をコードする核酸配列。 ４１、ライグラスの花粉に感受性の個体に投与されたとき、ライグラスの花粉に 対する個体のアレルギー性応答を減少する、修飾されたライグラスの花粉のタン パク質のアレルゲン。 ４２、前記修飾されたライグラスの花粉のタンパク質のアレルゲンは修飾された ＬｏｌｐＩａのタンパク質である、請求の範囲第４１項に記載の修飾されたライ グラスの花粉のタンパク質のアレルゲン。 ４３、ライグラスの花粉に感受性の個体に投与されたとき、ライグラスの花粉に 対する個体のアレルギー性応答を減少する、ライグラスの花粉のタンパク質のア レルゲンの少なくとも１つの断片。 ４４、前記修飾された１または２以上の断片はＬｏｌｐＩａタンパク質の修飾さ れた断片である、請求の範囲第４３項に記載の少なくとも１つの断片。 ４５、前記修飾された１または２以上の断片はＬｏｌｐＩｂタンパク質の修飾さ れた断片である、請求の範囲第４３項に記載の少なくとも１つの断片。 ４６、ＬｏｌｐＩａまたはその断片に免疫学的に関係する、単離されたタンパク 質のアレルゲンまたはその抗原性断片。 ４７、ＬｏｌｐＩｂまたはその断片に免疫学的に関係する、単離されたタンパク 質のアレルゲンまたはその抗原性断片。 ４８、前記タンパク質のアレルゲンまたはその抗原性断片はＬｏｌｐＩａまたは その断片に対して特異的な抗体と免疫学的に交差反応性である、請求の範囲第４ ６項に記載の単離されたタンパク質のアレルゲンまたはその抗原性断片。 ４９、精製されたライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａ、またはその少 なくとも１つの断片、またはその誘導体または相同体および製剤学的に許容され うる担体または希釈剤からなる医薬組成物。 ５０、ＬｏｌｐＩａは第７ａ図および第７ｂ図に示すアミノ酸配列のアミノ酸１ −２４０の配列を有する、請求の範囲第３６項に記載の医薬組成物。 ５１、精製されたライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩｂの少なくとも１ つの抗原性断片および製剤学的に許容されうる担体または希釈剤からなる医薬組 成物。 ５２、ライグラスの花粉に対して感受性の哺乳動物に治療的に有効量の請求の範 囲第１７項に記載のタンパク質調製物を投与することからなる、このような花粉 に対して感受性の哺乳動物におけるライグラスの花粉に対する感受性を処置する 方法。 ５３、ライグラスの花粉に対して感受性の哺乳動物に治療的に有効量の請求の範 囲第１９項に記載のタンパク質調製物を投与することからなる、このような花粉 に対して感受性の哺乳動物におけるライグラスの花粉に対する感受性を処置する 方法。 ５４、ライグラスの花粉のアレルゲンに対して感受性の哺乳動物から得られた血 液の試料を、請求の範囲第１項に記載のまたは化学的に合成された核酸配列、ま たは前記ライグラスの花粉のタンパク質のアレルゲ／で形質転換された宿主細胞 の中で生産された、単離されたライグラスの花粉のタンパク質のアレルゲン、ま たはその抗原性断片、またはその誘導体または相同体と、血液の成分を前記タン パク質またはその断片、またはその誘導体または相同体と結合するために適当な 条件下に、組み合わせ、そしてこのような結合が起こる程度を決定する、ことか らなる、前記哺乳動物において検出する方法。 ５５、結合が起こる程度は、Ｔ−細胞の機能、Ｔ−細胞の増殖、Ｂ−細胞の機能 、前記タンパク質、その断片、またはその誘導体または相同体の血液の中に存在 する抗体への結合、またはそれらの組み合わせを評価することによって決定する 、請求の範囲第５４項に記載の方法。 ５６、ライグラスに感受性の個体において、ライグラスの花粉のタンパク質のア レルゲンに対するアレルギー性応答を変更することができるライグラスの花粉の アレルゲンからの少なくとも１つの断片を設計するにあたり、個体にライグラス の花粉のタンパク質のアレルゲンの少なくとも１つの断片を投与することからな り、前記断片はＢ−細胞により認識されるか、あるいはＴ−細胞により認識され たアミノ酸配列を有し、そしてＢ−細胞によるか、あるいはＴ−細胞によるその 認識は、前記個体の、それぞれ、Ｂ−細胞の下方の調節またはＴ細胞の応答の下 方の調節を生ずる、方法。 ５７、ライグラスの花粉のアレルゲンからのとして少なくとも１つの断片はＬｏ ｌｐＩａの断片、またはその誘導体または相同体である、請求の範囲第５６項に 記載の方法。 ５８、ライグラスの花粉のアレルゲンからのとして少なくとも１つの断片はＬｏ ｌｐＩｂの断片、またはその誘導体または相同体である、請求の範囲第５６項に 記載の方法。 ５９、請求の範囲第１項に記載のまたは化学的に合成された核酸配列、またはラ イグラスの花粉のアレルゲンの誘導体または相同体で形質転換された宿主細胞に おいて生産されたライグラスの花粉のアレルゲンの十分な量を哺乳動物に投与し て、前記哺乳動物においてアレルギー性応答を誘発し、そして個体における前記 ライグラスの花粉のアレルゲンに対するアレルギー性応答の発生を決定する、こ とからなる、ライグラスの花粉のアレルゲンに対する哺乳動物の感受性を検出す る方法。 ６０、精製されたライグラスの花粉のアレルゲンＬｏｌｐＩｂ、またはその少な くとも１つの断片、またはその誘導体または相同体。 ６１、約３１〜約３３ｋＤの分子量を有し、グリコシル化されていず、そしてＮ −末端のアミノ酸配列ＡＤＡＧＹＴＰＡＡＡ、ＡＴＰＡＴＰＡＡＴＰＡＧＧＷＲ Ｅを有する、組み換えＤＮＡ技術により生産された精製されたタンパク質。 ６２、前記タンパク質はクローン１２Ｒの核酸配列によりコードされるタンパク 質と同一のアミノ酸配列を有する、請求の範囲第６１項に記載のタンパク質。 ６３、ＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂに対して特異的なモノクローナル抗体。 ６４、前記モノクローナル抗体はＬｏｌｐＩａに対して特異的である、請求の範 囲第６３項に記載のモノクローナル抗体。 ６５、前記モノクローナル抗体はＬｏｌｐＩｂに対して特異的である、請求の範 囲第６３項に記載のモノクローナル抗体。 ６６、真核生物または原核生物の複製の由来、検出可能なマーカー、ＬｏｌｐＩ ａまたはＬｏｌｐＩｂのアレルゲン性タンパク質、またはその少なくとも１つの 断片、またはその少なくとも１つの抗原性断片、またはその誘導体または相同体 、または前記ＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂのタンパク質またはその誘導体ま たは相同体に対する抗体と交差反応性のアレルゲン性タンパク質をエンコードす るＤＮＡ配列、および必要に応じて前記ＤＮＡ配列の転写を指令することができ るプロモーター配列からなる、組み換えＤＮＡ分子。 ６７、プロモーターはＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂの遺伝子のプロモーター である、請求の範囲第６６項に記載の組み換えＤＮＡ分子。 ６８、組み換えＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂまたはその少なくとも１つの断 片、またはその誘導体または相同体、あるいはＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂ またはその少なくとも１つの断片またはその誘導体または相同体に対する抗体と 免疫学的に反応性のアレルゲン性タンパク質を生産する方法であって、複製可能 な組み換えＤＮＡ分子を含有する有機体を、前記組み換えＤＮＡ分子が安定に維 持されかつＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂ、その少なくとも１つの断片、また はその誘導体または相同体、またはその免疫学的に関係するものの合成を指令す る条件下にかつ十分な時間の間培養し、前記組み換えＤＮＡ分子は、前記有機体 の中で発現することができるプロモーター、ＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂ、 またはその少なくとも１つの断片、またはその誘導体または相同体、またはＬｏ ｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂの免疫学的に関係するタンパク質をエンコードし、 前記プロモーターから下流に位置しかつそれから転写された遺伝子、選抜可能な マーカーおよび原核生物の複製由来を含有するＤＮＡベヒクルからなり、次いで 組み換えＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐｒｂまたはその少なくとも１つの断片、ま たはその誘導体または相同体、あるいはＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂまたは その少なくとも１つの断片またはその誘導体または相同体に対する抗体と免疫学 的に反応性のアレルゲン性タンパク質を単離する、ことからなる、方法。 ６９、プロモーターはＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂのプロモーターまたはそ の相同体または同義性の形態であり、そして宿主有機体は前記プロモーターがそ の中で機能するものである、請求の範囲第６８項に記載の方法。 ７０、その上にライグラスの花粉のプロモーター配列またはその相同体または同 義性の形態を含み、そしてさらに前記プロモーターの下流に１または２以上の制 限エンドヌクレアーゼ部位を有し、こうしてこれらの部位の１または２以上の中 に挿入されたライグラスの花粉のアレルゲンのＬｏｌｐＩａまたはＬｏｌｐＩｂ またはその少なくとも１つの抗原性断片またはそれらの誘導体または相同体をエ ンコードする核酸配列が正しいリーディングフレームで転写可能である、組み換 えＤＮＡ分子。