JPH05507908A - Ｈｓｐ７０によって処置する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＳ　Ｐ、　７０によって処置する方法の 本発明は細胞および組織を外来のｈｓｐ　７０で処置することにより細胞および 組織の生存率を高める方法に関するものである。

の 熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は細菌からヒトまでの細胞に見い出される高度 に保存された構造および誘導タンパク質（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ａｎｄ　 １ｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である、ニス、ジンドクイスト：　ｒＡｎｎ 、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、」５５．１１５１　（１９８６）　、構造ｈｓ ｐは多くの異なる細胞機能にとって重要である。最も遍在していて最も良く研究 されているｈｓｐ群は、７０．０００ダルトンに近い分子量を有するｈｓｐ群（ ｈｓｐ　７０）であって、このｈｓｐ群はタンパク質が小胞体およびミトコンド リアにトランスロケ−シラン（ｔｒａｎｓｌ。

ｃａｔｉｏｎ）するのを助けることが示されている、アール、デシェイス等：　 ｒＮａｔｕｒｅＪ刹ムｓｏｏ　（１９８８）、ダブリュ、キリコ等：ｒＮａｔｕ ｒｅＪ　刹ム８０５　（１９８８）　、他のｈｓｐの潜在的な構造的機能として は：アクチン細胞骨格を形質膜に結合させる作用、ニス。

コヤス等：　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡＪ　 Ｆ１３−、８０５４　（１９Ｂ６）；特に飽和脂肪酸を結合させる作用、ビー、 グイトンおよび工　゛ル６ハイタワー：　ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　ｎ、 　３２３１　（１９８６）　；ビー。

グイトンおよびエル、ハイタワー：　ｒＪ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　 Ｊ　■Ｌ２３９　（１９８６）、および若干のステロイド結合性受容体の成分と して、イー、ボウル−およびエム、カテリ：　ｒＡｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉ ｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ」２７５　（１９８９）、また、これらのタンパク 質は抗菌剤において抗原として作用し、ディー、ヤング等：　’Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　ｌｌｈ、　４２６７　（１９８８ ）　；ニー、メーラート等：　’Ｂｉｏｃｈｅ＊、　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓｇ　 １６．７２１　（１９８８）、および自己免疫反応を行う、ニス、ミッタ等：　 ｒＪ、Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、Ｊ　ｌｆｌ！１ＬＬ１４７５　（１９８８）、　ニス 、ミッタ等：　ｒＪ、　Ｃｌ１ｎ、　ＩｎｖｅＳｔ、」ｊｌｌ、　１０６　（１ ９８８）。

なお、いくつかの他の機能が示唆されている。ニス、リントクイスト：　’Ａｎ ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　５５．１１５１　（１９８６）、エム 、シュレジンガー等：　ｒｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｊ　１９８２．エム、パルブラー等：　ｒＡｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ 、　Ｉｎｃ、４　（１９８９）＋　エム、シュレジンガー等：　ｒＪ、　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏ１ｇ皿３　３２１　（１９８６）、イー。

フレイブ：　Ｉ’ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ」ｖｏｌ、１８＋竺Ｊ　２３９　（１９８５）参照。

誘導できる形態のｈｓｐは、高い温度、エム、シュレジンガー等：　’Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｔｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｊ　１９８２．重金属 、エム。

シェレジンガー等：　ｒＡｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　ｌｌＩＣ，Ｊ　１３７　（ １９８９）、アミノ酸同族体、ピー、ケリーおよびエム、シュレジンガー：ｒＣ ｅ１１Ｊ　１，７１２７７　（１９７８）、エル、ハイタワー：　ｒＪ、　Ｃｅ １１．　Ｐｂｙｓｉｏｌ、」１ｆ１２．４０７　（１９８０）、酸素の作用を受 ける基、エム、アッシュバーナー：　ｒｃｈｒｏｍｏｓｏｍａＪ３１．３５６　 （１９７０）、ジエイ、コンプトンおよびビー、マツフカ−シー：　ｒｃｅｌｌ ＪｌＡ、　１９１　（１９７８）、虚血または酸素欠乏からの復帰、ニス、ガツ トマン：　ｒｃｅｌｌ　Ｊ　Ｈ。

２９９　（１９８０）、エム、アッシュバーナーおよびジエイ、ボンナー：　ｒ ｃｅｌｌＪＩＪ−、２４１（１９７９）、機械的損傷、エル、ハイタワーおよび エフ、ホワイト：　’Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ」３６９（１９８２）　、ディー、ゴワー等：　’Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、　Ｊ　１０３　２９１　（１９８６）および異常タンパク質、ジエイ、 アナンサン等：　ｒｓｃｉｅｎｃｅ」皿５２２　（１９８６）を包含する種々の ストレッサーによって導出される。統一する機能特性は、非理想的条件下に正常 細胞機能を維持する作用をすることである。

ストレス下の細胞に対するｈｓｐの機能上の重要性は動脈壁およびアテローム性 動脈硬化に及ぶ０発育するプラク（ｐｌａｑｕｅ）は動脈壁の組成における形態 学的および生物化学的な変化を含む、アール、ロス：　ｒＮ、　Ｅｎｇ−Ｊ、　 Ｍｅｄ、　Ｊ　！Ｌ４．４８８　（１９８６）　。

慢性的にストレスを受けているアテローム性動脈硬化プラク細胞では、ｈｓｐの 変化が重大な関係を有していることがある０例えば、ｈｓｐの一般的な作用の一 つは細胞膜を安定化することであり、アール、シバ−等：　’Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　ｎ、　１８１（１９８８）　、動脈リゾソーム膜 の安定化はプラク細胞による脂質の取り込みを容易にすることができることが示 唆されている。ジェイ、バールセット等：　ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　Ｊ　５ ０．１８２　（１９５１）、シー、ドデュープ：　ｒＨａｒｖｅｙ　Ｌｅｃｔｕ ｒｅｓ　Ｊ　５３．４９　（１９６５）、ピー。

バーパリアン等：　ｒＦｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｊ　Ｑ、　７１１　（１９８４） 。さらに、ｈｓｐによる細胞の安定化は発育するプラクの種々の領域内における 細胞の相対的な生存性（ｓｕｒｉｖａｌ）をめるのを助けることができるが、そ の相対的な不足は壊死に至るまで傷つき易い区域を形成することがある。

ｈｓｐは細胞間で交換することができるという証明がなされている。エル、ハイ タワーおよびピー、グイトン：　ｒＪ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｊ　 Ｘ３ｉＬ２５７　（１９８９）、エム、タイチル等：　’Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、 　Ｊ３６３　１６１　（１９８６）。従って、ｈｓｐの作用は、ストレスを受け ているｈｓｐ合成細胞に限定されないことがあり得る。しかし、細胞の生存性に 対する外来的に添加されたｂｓｐの作用は未だ試験されたことがない０本発明は このような試験を行った後に本発明者等が見い出したことに基づく。

の　・ 本発明の第１の面は、ストレス下の細胞における死すべき状３Ｉ（ｍｏｒｔａｌ ｉｔｙ）を阻止（ｃｏｍｂａｔ）する方法である。この方法では、細胞にｈｓｐ 　７０を細胞の生存性を高めるのに有効な量で接触させる。

本発明の第２の面は、動脈組織のようなストレス下の組織における死すべき状態 を阻止する方法である。この方法では、組織にｈｓｐ　７０を該組織中に存在す る細胞の生存性を高めるのに有効な量で接触させる。この組織はインビボまたは インビトロで処置することができる。なかんずく、この方法は移植用臓器を保存 するのに有用である。

本発明の第３の面は、このような処置を必要とするヒトまたは動物の被験者（ｓ ｕｂｊｅｃｔ）におけるアテローム性動脈硬化を阻止する方法である。この方法 では、被験者にｈｓｐ　Ｔｏを、被験者に存在する動脈プラクにおける壊死を減 少させるのに有効な量で投与する。

本発明の第４の面は、このような処置を必要とするヒトまたは動物の被験者にお ける血管形成後の動脈再狭窄を阻止する方法であり、この方法では、このような 処置を必要とする被験者に存在する動脈組織にｈｓｐ　７０を再狭窄阻止量で投 与する。

本発明の第５の面は、このような処置を必要とするヒトまたは動物の被験者にお ける神経の損傷を阻止する方法であり、この方法では、被験者にｈｓｐ　７０を ストレス下の神経細胞の生存性を高めるのに有効な量で投与する。

本発明の第６の面は、治療に有効な量のｈｓｐ　７０を薬剤として受け入れるこ とのできる組成物中に含有する薬剤である。

本発明の第７の面は、動脈組織における死ぬべき状態を阻止する薬剤を製造する ためにｈｓｐ　７０を使用することである。

本発明の第８の面は、神経組織における死ぬべき状態を阻止する薬剤を製造する ためにｈｓｐ　７０を使用することである。

゛　の　な− 図１はｈｓｐ　７０を添加しなかった場合の、単離細胞の生存率と構造に関連す るリソッーム酵素の潜在率（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−１ｉｎｋｅｄ　１ａｔｅｎｃ ｙ　ｏｆ　１ｙｓｏｓｏｓａｌ　ｅｎｚｙｍｅｓ）との関係を示す、データは試 験したすべての温度にわたって正常なサル（黒の正方形）と病変したサル（白の 正方形）とをプールして得た大動脈細胞の値（ｎ＝２３）である（　ｒ　＝０． ８５）。

図２はｈｓｐ　７０を添加しなかった場合の動脈細胞の生存率（図２ａ）および 構造と関連するリゾソーム酵素の潜在率（図２ｂ）に及ぼす温度の影響を示す。

６個の大動脈の平均値上標準誤差（ｓ、ｅ、腸、）が示されている０図２ａは温 室温度が高くなるにつれて生存率に有意な低下（ｐ　＜０．０００５）が起るこ とを示し、図２ｂは温室温度が高くなるにつれてリソソーム酵素の潜在率の有意 な低下（Ｐ　＜０．００４）が起ることを示す。

図３は、生存率に及ぼすｈｓｐ　７０用量の影響（零時間およびｈｓｐ添加せず の場合を含む）が示されている。４個の大動脈の平均値上標準誤差（ｓ、ｅ、− 、）を示す、　１０ｎｇ／細胞１０３個の用量で生存率に有意差（ｐ　＜０．０ ５）が生じたが、１０倍の多い用量ではを意な上昇は認められない。

図４は動脈細胞の生存率に及ぼす温度によるｈｓｐ　７０の影響を示す、　１０ ｎｇ／細胞１０”個のｈＳｐ７０を添加または添加せずに各温度において試験し た。大動脈からの６個の細胞の平均値上標準誤差（ｓ、ｅ、■、）が示されてい る。全処置試料と全未処置試料とを比較すると、３７℃でｈｓｐを添加した場合 に生存率の有意な上昇（ｐ　＜０．０５）が認められた。

図５は構造に関連するリゾソーム酵素の潜在率に及ぼす温度によるｈｓｐ　７０ の影響を示す、６個の大動脈試料の平均値上標準誤差（ｓ、ｅ、ｓ、　）が示さ れている。外来のｈｓｐによる有意な増大は生じなかった。

図６は光で生じた損傷に対する銅膜の感受性に及ぼす右目に硝子体内注射したｈ ｓｐ　７０の影響を示す、左右の光受容体面積（平方μｍ）の差が示されている 。高いｈｓｐ　Ｔｏ用量において光受容体の破壊が有意に防止された。

の−１ 本発明方法により、動物、植物および細菌の細胞を含む任意の起源の細胞を処置 することができる。細胞はインビトロまたはインビボで処理することができる。

同様に、動物および植物の組織を含む任意の起源の組織を本発明の方法によりイ ンビトロまたはインビボのいずれかで処置することができる。本発明を実施する にあたっては、動物の細胞および組織が好ましく、哺乳類動物（例えば、イヌ、 ネコ、ヒト）の細胞および組織が特に好ましい。ここで用いる「動物」という用 語は、獣医学分野における被験者、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびウマを 意味する。

ストレス下にある細胞および組織をｈｓｐ　Ｔｏで処置して死すべき状態を阻止 する０例えば、培養状態に（ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ）維持されている細胞（例え ば、細胞からタンパク質または他の物質を生成させるために）、あるいは培養状 態に維持されている組織（例えば、移植前の心臓、肺、肝臓または腎臓のような 完全な臓器）は、本発明を実施するために、「ストレス下」と考えることができ る０例えば、臓器をｈｓｐ　７０含有溶液中に浸漬することができ、あるいは比 較的大きい臓器に血管系を介してｈｓｐ　７０溶液を潅流させることができる。

ｈｓｐ　７０は臓器細胞によって取り込まれ、これらの細胞を血液、栄養素およ び他の必要な物質が身体から取り出されることにより生ずるこれらの物質の欠乏 に対する抵抗性を一層太き（する、同様にｈｓｐ　７０は再潅流溶液に含ませて 再潅流による組織の損傷を阻止することができる。

ｈｓｐ７０を既知溶液に加え、かつこれらの目的に当業者に知られている方法に よって使用することができる。このような溶液および方法は「臓器保存用の細胞 内フラッシュ溶液（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｊａｒ　Ｆｌｕｓｈ　５ｏｌｕｔｉｏ ｎ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｓ）　」という発明の名称の米 国特許第４，９２０，０４４号明細書、「臓器保存用溶液（Ｓ。

１ｕｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｒｇａ ｎｓ）　Ｊという発明の名称の米国特許第４，８７９，２８３号明細書、「臓器 保存用組成物（Ｃ。

ｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｒ ｇａｎｓ）　Ｊという発明の名称の米国特許第４，８７３，２３０号明細書およ び「臓器保存用潅流液（Ｐｅｒｆｕｓａｔｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｓｅｒｖ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｓ）　Ｊという発明の名称の米国特許第４，７９ ８，８２４号明細書に開示されている。

本発明者等は、ここに引用したこれらおよび他のすべての特許における開示を参 照としてここに加入する。

また、ストレス下の組織をインビボで処置することができる。

例えば、動脈および心筋の組織をバイパス外科手術中にｈｓｐ　７０を投与する ことにより処置して、この組織中の細胞の生存率を高めることができる。心臓の 虚血を、はぼ心筋梗塞形成時にｈｓｐ７０を投与することにより処置して、この 組織中の細胞の生存率を高めることができる。腎臓をｈｓｐ　７０の投与により 抗生物質ゲンタマイシンのような毒性物質による損傷から保護することができる 。動脈組織には、レーザーによる血管形成中およびアテレフトミー（ａｔｈｅｒ ｅｃｔｏｍｙ）中にｈｓｐ　７０を投与して、このような方法から生じるこれら の組織の損傷を小さくすることができる。

また、ストレス下の神経組織（すなわち、末梢神経および中枢神経）を、本発明 の方法により、インビボで処置することができる０例えば、切断された末梢神経 は、神経軸索の余りにも大きい部分が切断部位から遠位にある場合には、逆行性 変性を受け、この変性は神経細胞または体幹の死亡時に頂点に達することがある 。この変性が細胞死亡時に頂点に達しない場合には、神経が再生する機会がある 。従って、ｈｓｐ　７０をこのような神経細胞に宿主動物への投与により投与し て、末梢神経の切断によって生じることのある細胞の死すべき状態を阻止するこ とができる。

また、神経細胞はインビボで酸素欠乏によるストレスを受けることがある。例え ば、酸素欠乏によるストレスは発作または破裂動脈瘤から生じることがあり、こ の場合には神経組織が血液を失うことにより神経組織が損傷される。中枢神経が このように損傷された場合には、代表的な例では損傷が血管に関連して分水界（ ｗａ　ｔｅｒｓｈｅｄ）パターンで生じる：損傷された供給管に最も近い組織は 最も重度に損傷され、損傷された供給管から最も遠くに位置し他の管により供給 を受ける組織は最も軽度に損傷され；これらの両端の中間の組織は中程度の損傷 を示す、このような損傷を受けた被験者にはｈｓｐ　７０を投与してこの種のス トレスを受けた細胞における死すべき状態を阻止する。

上述のように、本発明は血管形成後の再狭窄を阻止するために用いることができ る。血管形成は、閉塞または遮断された動脈を拡張する方法である。代表的なト ランスルミナル　バルーン（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ　ｂａｌｏｏｎ）血管形 成方法では、遠位端に膨張可能な拡張バルーンを支持しているカテーテルを用い て部分閉塞した動脈を再形成する。バルーンを収縮した状態で動脈の挟窄部中に 挿入して、血液がより良好に通過できるように閉塞管腔を拡張バルーンにより再 形成する。閉塞物質は管から移動せず、管から除去されず、どちらかといえば管 壁に押圧される０次いで、これまで閉塞していた物質を適応させるために管壁を 引き伸ばす、管腔を再形成した後に、拡張バルーンを収縮させ、取り出す、しか し、閉塞生成部位は管が以前の形状に戻った際／場合に再閉塞することがある： これは「再狭窄」として知られる現象である０種々の血管形成方法および機器が 知られている。

例えば、米国特許第４　、８３８．２６９号および同第４，７９４．９２８号の 明細書（これらの開示をここに参考として加入する）参照、再狭窄を防止する処 置（すなわち、再狭窄開始前における血管形成中または血管形成後のいずれかに おいて）を必要とする被験者は、再形成された管の管腔にｈｓｐ　７０を（例え ば、静脈内注射または動脈内注射により）投与することにより処置することがで きる。　ｈｓｐ　７０を被験者の血流中または処置部位に導入する任意の投与が 適当であるが、投与方法としては、ｈｓｐ　７０を血管形成の特定の部位（すな わち、再形成された管壁）に直接向けるものであるのが好ましい０例えば、ｈｓ ｐ　１０は処置部位にスウエ’７テイング（ｓｗｅａｔｉｎｇ）バルーンカテー テル（すなわち、孔があけられていて血管形成中にこれらの孔を経てｈｓｐ　７ ０を動脈細胞壁に与える血管形成バルーン）により適用することができる。

創傷、熱傷、潰瘍、感染および他のタイプの外傷性損傷に起因するストレス下の 皮膚組織を本発明方法により処置することができる。このような目的のために、 皮膚にｈｓｐ　７０をクリーム軟膏剤の形態で局所適用により投与して、組織の 修復および治癒を増強することができる。また、組織はガンの化学療法における ような化学療法による処置に起因するストレス下にあることがある。このような 場合には、化学療法による処置後にｈｓｐ７０を「救助（ｒｅｓｃｕｅ）　Ｊ剤 として投与することができる。

ｈｓｐ　７０は熱シヨツクタンパク質（すなわちｒｈｓｐ　Ｊ　）群の一員であ り、これは細胞または生体が高温に曝された際に生成する。この応答は今日まで 本質的にすべての生体において観察されている。一般に、ニス、リントクイスト ：熱シヨツク反応ｒＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅａ、」５５．１１５１　 （１９８６）参照０例えば、ｈｓｐ７０は植物中に見い出される０例えば、ジエ イ・マーシャル等：ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、υＳＡＪ 　８７．３７４　（１９９０）参照、　ｈｓｐ　７０群はｈｓｐ群中で最も高度 に保存されている一員である。例えば、ヒトのタンパク質は７３％がショウジヨ ウバエ・タンパク質と同一であり、５０％が対応する大腸菌タンパク質Ｄｎａに と同一である。

「ストレスの生じたタンパク質（Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ）」２７　（１９８９）（アラン・アール、リス社発行）中のビー、ブカウ 等：　’ＤｎａＫおよびＧｒｏＥタンパク質は、低温、中温、ならびに高温で、 大腸菌代謝において役割を演する」参照。差異の多くは単に相同置換であり、当 業者が異常であると考える相同領域が存在する、ニス、リントクイスト二同上、 　１１５５〜５６゜若干の種のなかでは、ｒｈｓｐ７Ｊという用語自体は、すべ てがこの種に属する密接に関連したタンパク質の属を示す、サツカロミセス・セ ラビシアエにおいて、ある程度のｈｓｐ　７０突然変異を受けている菌株は生育 不能であるが、残りの遺伝子の転写１１ｊ！ｆｆを変えることにより生存率を回 復させることができる。

［ストレスの生じたタンパク質Ｊ　５１　（１９８９）中のイー、フレイブ等： 「サツカロミセス・セラビシチェ中の３種の熱で生じるｈｓｐ　Ｔｏ関連遺伝子 の複雑な調節」参照、生物学的交換可能性および相同性の観点において、１個の 種のうちのｂｓｐ　７０群の任意の一員は、本発明を実施する際に有用であると 考えられる。

起源の種に関して、広く分岐する種のうちのｈｓｐ　７０群の高度に保存されて いる性質の観点から、起源の任意の種からのｈｓｐ７０が本発明を実施する際に 有用であると考えられる（先にｈｓｐ７０に関する多くの文献を挙げた。これら の文献の開示を参考としてここに加入する）、従って、動物、植物（例えば、エ ントウマメ）、および細菌のｈｓｐ　７０はすべて、本発明を実施する際　。

に、任意の起源の細胞または組織を処置するのに有用であると考えられる。しか し、処置される細胞または組織に関連する起源のｈｓｐ　７０が本発明を実施す るのに好ましいと考えられる。例えば、植物のｈｓｐ　７０は植物の細胞または 組織を処置するのに好ましいと考えられ、動物のｈｓｐ　７０は動物の細胞また は組織を処置するのに好ましいと考えられ、哺乳類動物のｈｓｐ　７０は哺乳類 動物の細胞または組織を処置するのに好ましいと考えられる、などである。

’ｈｓｐ　７０Ｊという用語は、活性フラグメント、サブユニットおよびこれら の人工的類似物を含むことを意味する。異なる生体および種の間で最大の構造的 類似を示すｂｓｐ　７０分子のこれらの領域は、その生物活性の重要な源である と考えられる。従って、生（ｎａｔｉｖｅ）のタンパク質のフラグメント、置換 変異、欠失変異、または付加変異を含む同属体、あるいはｈｓｐ　７０の完全合 成同族体は、既知方法により製造することができ、また１二に記載する方法を用 いて組織または細胞の試料の代謝ストレス耐性を増大させるこれらの能力を常法 によって試験することができる。

ｈｓｐ　７０の用量は、用いる特定の投与経路に依存して変化する。

一般に、全身処置、局部処置およびインビトロ処置の場合には、処置する細胞ま たは組織１ｇ当り約０．０２ｍｇ〜約２０−ｇの範囲の総ｈｓｐ　２０用量が考 えられる。さらに、局部処置の場合には、最大用量は最大全身処置用量より約２ ０倍多いと考えられる。

ｈｓｐ　７０は他の治療薬と同時にあるいはこれと組み合わせて投与することが できる０例えば、ｈｓｐ　７０は、細胞を急性損傷から保護することが知られて いる他の薬剤と併用することができる。

このような薬剤としては、損傷を与えるでき事が反応性酸素分子の生成を介して 作用する場合には、酸化防止剤または遊離基捕捉剤、例えば、ビタミンＣおよび Ｅならびにスーパーオキシド　ジスムターゼがある。細胞外カルシウムの流入が 細胞の損傷の機構に含まれる場合には、他の薬剤は過剰カルシウムイオンの流入 を減少させるもの（例えば脳組織において）、例えばデキストロファン（ｄｅｘ ｔｒｏｒｐｈａｎ）およびＭＫ−８０１である。損傷の機構が心筋梗塞である場 合には、他の薬剤は心筋への血液の流れを妨害するものを除去するもの、例えば 組織プラスミノゲン活性化剤（ＴＰＡ）およびストレプトキナーゼである。

ｈｓｐ　７０はそれ自体でまたは薬剤として受け入れることができる塩の形態で 投与することができる。薬剤中に用いる場合には、ｈｓｐ　７０の塩は薬理学的 および薬剤としての両方について受け入れることができなければならないが、薬 剤として受け入れることができない塩を好都合に用いて遊離の活性化合物または その薬剤として受け入れることができる塩を製造することができ、従ってって薬 剤として受け入れることができない塩が本発明の範囲から除外されることはない 。このような薬理学的および薬剤として受けいれることができる塩は、以下のＭ ：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、Ｐ −）ルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、キ酸、マロン酸 、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸から製造さ れたものを含むが、これらに限定されるものではない、また、薬剤として受け入 れることができる塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えばカル ボン酸群のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として製造することができ る。従って、さらに、本発明はｈｓｐ７０のほかに１種以上の薬剤として受け入 れることができる担体および所要に応じて他の任意の治療成分を含有し、獣医学 およびヒトの医学の両分野に使用される薬剤を提供する。

この組成物は経口、直腸、局所、鼻、眼または非経口（皮下、筋肉内および静脈 内を含む）投与に通しているものであり、これらのすべてを本発明を実施するた めの投与経路として用いることができる。他の適当な投与経路はを髄液（Ｃ３Ｆ ）への直接鞘内投与、再狭窄を防止するための動脈表面への直接注射、および臓 器の目標区域への直接実質内（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）注射を含む 、非経口投与に適する組成物が好ましい。

これらの組成物は単位投薬量形態で提供するのが好都合であり、製薬業界でよく 知られている任意の方法により製造することができる。すべての方法が、活性化 合物と１種以上の補助成分を構成する担体とを組み合わせる工程を有する。一般 に、これらの組成物は、活性化合物を液体担体、微粉砕固体担体、またはこれら の両方と均一かつ緊密に組み合わせ、次いで生成物を所要に応じて所望の組成物 に成形することにより、製造される。

経口投与に適する本発明の組成物はカプセル、カシュ剤、錠剤またはロゼンジの ような個々のユニットとして提供することができ、これらはいずれも所定量の強 化剤を、粉末または粒子として；ｈｓｐ７０を含むリポソームとして：あるいは 水性溶液または非水性溶液、例えば、シロップ、エリキシル、乳濁液またはドラ フト（ｄｒａｕｇｈｔ）中の懸濁液として含む。

錠剤は、所要に応じて１種以上の補助成分と共に、圧縮または成形により製造す ることができる。圧縮錠剤は適当な機械で圧縮することにより製造することがで き、この際に活性化合物は所要に応じて結合剤、崩壊剤、滑剤、不活性希釈剤、 界面活性剤または分散剤と混合して、粉末または顆粒のような易流動性形態とす る。粉末状活性化合物と適当な担体との混合物から成る成形錠剤は、適当な機械 で成形することにより製造することができる。

シロップは、活性化合物を糖、例えばスクロースの濃厚水溶液に加えることによ り製造することができ、糖水溶液にはさらに任意の補助成分を加えることができ る。このような補助成分としては、香味料、適当な防腐剤、糖晶出遅延剤、およ び多価アルコール、例えばグリセリンまたはソルビトールのような他の任意成分 の溶解度を増加させる溶解度上昇剤がある。

非経口投与に適当な組成物は、活性化合物の無菌水性調剤を含有するのが好都合 であり、この水性調剤は受容者の血液と等張であるのが好ましい。

鼻に用いるスプレー組成物は、防腐剤および等張剤を含む活性化合物の精製水溶 液を含む、このような組成物は、鼻の粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調整 するのが好ましい。

直腸投与用組成物は、適当な担体、例えば、ココアバター、または水素化脂肪ま たは水素化脂肪族カルボン酸を含有する座薬として提供することができる。

眼に用いる組成物は、！１）１および等張性の因子を目のためのものに適合する ように調整するのが好ましい点を除いて、鼻に用いるスプレーと同様な方法によ り製造される。

局所用組成物は、１種以上の媒質、例えば、鉱油、石油、多価アルコールまたは 局所用薬剤に用いられる他の基材に溶解または懸濁させた活性化合物を含む、下 記の他の補助成分を加えるのが好ましい。

本発明の組成物は、上述の成分のほかにさらに、希釈剤、緩衝剤、香味料、結合 剤、崩壊剤、界面活性剤、増粘剤、滑剤、防腐剤（酸化防止剤を含む）等から選 択された１種以上の補助成分を含むことができる。

次の実施例は本発明を例示するためのものであって、これに限定されると解釈し てはならない、温度は特記しない限り、摂氏温度で示す。

実施例１ お　びアーローム　のカニ　イザＪしＣｎＯ園Ｏ１ｏ　ｕｓ　＋ｗａｃａ　ｕｅ ｓ　ｓ；の　の　に・　るＨ３Ｐ７０のｔ来 八一方法 上一礼料 必須および非必須のアミノ酸、ペニシリン（１００ＩＩＪ／ｍｌ）、ストレプト マイシン（１００μｇ／ｍｌ）　、およびフェノールレッド指示薬を添加した低 カルシウム（０，２ｄ）のハンクスの平衡塩類溶液（ＬＣ−ＨＢＳＳ）　、およ びアミノ酸またはフェノールレッドを含まない特別な低カルシウムのハンクスの 平衡塩類溶液（ＳＬ−ＨＢＳＳ）を、既知の技術により使用前に新たに製造した 。エヌ、ハレイ等：ｒＬａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｊ　■、２８７　（１９７７） 参照、クロマトグラフィにより精製したコラゲナーゼおよびエラスターゼを、米 国ニューシャーシー州フリーホルト所在のワーシングトン・ダイアグノスティッ ク社０１ｏｒｔｉｎｇｔｏｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から得た。大豆トリプ シンインヒビター（粗製品）は米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のミ リポア社からのものであった。Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＳ Ａ）酵素活性測定用メチルウンベリフェリル−２−アセチミド−２−デオキシ− β−Ｄ−グルコピラノシド（分子量３７９．３７）基質はコツホ−ライト・ラボ ラトリーズ（英国コインプライト−パックス）からのものであった。

使用したｂｓｐ７０は本質的にシュロッスマン等：　’９９　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ １０ｆ、　Ｊ　７２３（１９８４）の方法に従ってウシ脳から精製した。　ｈｓ ｐ７０およびＮ２７Ｆ３４モノクローナル抗体はそれぞれローレンス・ハイタワ ー博士（米国ストース所在のコネチカット大学）およびウィリアム・ウェルヒ博 士（米国サンフランシスコ所在のカリフォルニア大学）から寄贈されたものであ った。ウェスタンプロット分析用のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ−接合二 次抗体およびｈｓｐ７０との比較用の乳酸脱水素酵素、ヒストンＨ−ＩＩａ、お よび甲状腺ホルモンは米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマケミカルズ社か らのものであった。

−ローム　の逢 ８匹の成体の雄カニクイザルをチャールズ・リバー・ラボラトリーズから入手し 、個々のカゴに入れた。５匹の動物はカロリーの４０χが乳脂肪からのもので、 カロリーの３８χが糖質からのもので、カロリーの２２χがタンパク質からのも のである１、０ｌｇ／ｋｃａｌのコレステロールと２７０ｌｌ／ｋｇの水とから なるアテローム発生性の食餌を与えた、ディー、スモール等：　’Ｊ、Ｃｌ１ｎ 、１ｎｖｅｓｔ、　Ｊ　、　７３．５９０（１９８４）　、３匹のコントロール 動物にプリナ・モンキー・チャウ（登録商標、Ｐｕｒｉｎａ　Ｍｏｎｋｅｙ　Ｃ ｈｏｗ　）を給餌した。サルにこれらの食餌を２３〜２７ケ月間無制限に与えた 。

周期的な血しょう脂質の分布を過コレステロール血症の誘発における成功の尺度 としてめた（表１）。

３　の　゛び　の 動物に０．２ｃｃのケタミンＢＣ１および１　、０ｃｃのベントパルビタールナ トリウム＜ｍで麻酔をかけた。大動脈を大動朦弓から腸骨分岐まで取り出し、標 準食塩水中で４℃に保った。付着性外膜を切開除去し、次いで各大動脈を開いて 平坦にした。大動脈を０〜ＩＶの尺度でアテローム性動脈硬化の等級について、 エフ。

パーカー、ジー、オグルンド：　ｒＡｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、　Ｊ　、ｌ、１９ ７　（１９６６）、またコンフルエンシイ−（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）について 視覚的に評価した（表１）、それぞれ重量的１．０ｇの部分を切開しマツタイル ワイン（Ｍｃｌｌｗａｉｎ）組織切断器（米国カリフォルニア州フラートン所在 のベックマン・インストルメンツ社）を使用して、２５０μ−平方に切断した。

この切断された材料を組織１００■ｇに対し１．０ｍｌのＬＣ−ＨＢＳＳ中に入 れた。この溶液は６００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ、５Ｕ／■ｌのエラスターゼ、 および１１ｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビターを含んでいた。この消化混合 物を中性に維持するのに必要な炭酸ナトリウムを添加し、ダブノフ・メタポリツ ク（Ｄｕｂｎｏｆｆ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ）恒温器（米国ペンシルベニア州ピッ ツバーグ所在のフィッシャー社）中で振とうして温度した。遊離した細胞を３０ 分ごとに集め、酵素混合物から分離し、３０００ｒｐｍで６分間５Ｌ−ＨＢＳＳ で２回洗浄し、全細胞が採収されるまで２．０■１の５Ｌ−１８５５中に４’Ｃ で懸濁させた０個々の採収物をプールし、細胞密度を測定し、単離体を５Ｌ−Ｈ ＢＳＳで１０６個／■ｌの細胞に希釈した。最終の希釈単離体を処置養生（ｔｒ ｅａ　ｔ■ａｎｔ　ｒｅｇｉ■ｅｎ）の前後で４°Ｃに保持した。

４　ｈｓ７０の　量および ウシ脳ｈｓｐ７０は２０−ＭのＩＩＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ１，０中の１０μｇ／ μｔの溶液として受け取り、常法により一３０°Ｃで貯蔵した０組成はウェスタ ンプロット分析を使用して確認した。タンパク質の試料を還元条件下にＩＯ！ポ リアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースに吸い取らせ、７３ｋＤ構 造ｈｓｐおよび７２ｋＤ誘導ｈｓｐに特異なハツカネズミモノクローナル抗体で あるＮ２７Ｆ３４と反応させた。二次抗体はセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ −接合ウサギ抗マウス抗１ｇＧであった。最終染色はトリス緩衝液、ｐＨ７，２ 中でジアミノベンジジン／過酸化水素により行った。同定されたタンパク質バン ドの相対濃度はウルトロスキャン（［１１ｔｏｒｏｓｃａｎ）　ＸＬレーザー濃 度計（米国メリーランド州ロックビル所在のエルケービー社）を使用して測定し た。

の峰　ス　レス 正常および病変した動脈細胞単離体を長期に及ぶストレスに応答する生存率およ び構造に関連するリゾソーム酵素の潜在率の変化について試験した。０．２ｍｌ の細胞単離体試料を、これに０．０１曙ｌの５Ｌ−ＨＢＳＳを加え、ｈｓｐ７０ を添加または添加せずに密封した１ｍｌエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ） 試験管に入れた。　ｈｓｐ７０についての用量に対する応答は、１０３個の細胞 当たり２．５．１０、または１００　ｎｇのｈｓｐ７０を添加または添加せずに ３７℃に２０時間曝した細胞を使用して測定した。熱誘発ストレスの応答を測定 するために、１０３個の細胞当たり１０ｎｇのｈｓｐ７０を添加または添加せず に細胞を２３°Ｃ１３７℃、または４５°Ｃに２０時間曝した。外来のタンパク 質による非特異的変化についての比較研究は、乳酸脱水素酵素、ヒストントＩｌ ａ　、および甲状腺ホルモン、標準および標準の１０倍の生理学的濃度において 、３７°Ｃで行った。

の　゛よＬ２ｆ−ム　の六Ｉｎｔｅ　ｒｉｔ　）夏見主 細胞の生存率は０．４χトリパンブルーの色素排除を使用して、２０時間の試験 期間後に直ちに測定した。貯蔵した各細胞懸濁液から同様な４個の試料を採取し 、二人の研究者によって個々に試験を行った。また、無傷細胞対細胞溶解を記録 した。構造に関連するリゾソームのＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（Ｎ ＡＢＡ）の潜在率をリゾソーム膜の完全性の代表例として計算した。遊離ＮＡＢ Ａおよび全ＮＡＢＡ活性を前述のように蛍光測定法で測定した。ピー、バーパリ アン、ニス、フオウラー；　ｒＥｘｐ、Ｍｏｌ。

Ｐａｔｈｏｌ、　、Ｊ　３０．２７　（１９７９）参照、要約すると、０．１ｍ ｌの実験用大動脈細胞試料を５Ｌ−ＨＢＳＳ中で適当に希釈し、２５０５Ｍのス クロースを含む１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，８中の０．５ ０腸台の４−メチルウンベリフェロン基質溶液に０．１χトリトンＸ−１００（ 商品名）を添加（全活性）した溶液または添加しなかった（遊離活性）溶液０． １■ｌを加えて、３７℃で９０分間温１した。構造に関連するリゾソーム酵素の 潜在率は全ＮＡＢＡ活性と遊離ＮＡＢＡ活性との間の差によって定義され、全活 性に対するχとして表示した、ジュー。バールセント等、ｒＢｉｏｃｈｅｍ、Ｊ 、　Ｊ　５ｆｌ、１８２（１９５２）。

量　、 これらの結果を細胞の生存率および構造に関連するリゾソーム酵素の潜在率の差 について、反復手段ＡＮＯＶＡを用いて解析した。試料を病変大動脈細胞対コン トロール大動脈細胞、熱シヨツクタンパク質の添加量、および試験温度中の温度 の作用について比較した。生存率と潜在率との相互関係は標準線形回帰を使用し て試験した。

アテローム発生性食餌は表１に示すように過コレステロール血症を誘発し、その 後にプラクを形成した。光学および電子顕微鏡試験の結果、病変大動脈からの細 胞単離体は脂質に満ちた泡沫細胞および脂質に富んだ平滑筋細胞ならびに正常な 平滑筋細胞の大部分を含んでいた。正常な大動脈は病変を示さず、そのそれぞれ の細胞単離体は主として正常な平滑筋細胞を含んでいた。

表■ サルの血液脂質値およびアテローム性動脈硬化の等級サル　アテローム　コレス テ　コンフルエＬ　２」ば１１級　ロール１　」匹１皿１−１１丸−−乙乞二に １　あり　７７８　１５　１６　ＩＩ〜ＩＩＩ　７０２　あり　５７２　３３２ １　ＩＩ　３０３　あり　６７２　４０　９２　ＩＩＩ　１００４　なし　１１ ２　６５２３　０ ５　なし　１４２　６６２８　０ ６　なし　１８３　１００　２７　０ １血しょう値は犠牲前の断食動物からのもので、Ｂ／ｄｉで表示する。コレステ ロール−全血しよう コレステロールｉ　ＨＤＬ＝全血しよう高密度リポタンパク質；ＴＧ−全血しょ うトリグリセリド ・　２等級：　０＝病変なし１ＩＩ＝アテローム病変が極めて僅か発生、ＩＩＩ ＝アテローム病変が繊維症を伴って有意に発生ｈｓ７０の この研究で使用した精製ｈｓｐ７０のウェスタンプロ・ノド分析では、２個の免 疫反応性バンドが生じ、２個のバンドは７３ｋＤ構造形（全反応性タンパク質の ７０ｚと推定）および７２ｋＤ誘発形（全反応性タンパク質の３０χと推定）の ｈｓｐに対応した。

の　１　＃＋　ｔ　１−ム　六　。

゛　ス　レスの≦ 反復手法ＡＮＯＶＡを用いたデータ解析は正常動物および病変動物からの細胞単 離体の間にいかなる有意な試験応答の差も示さなかったので、これらの単離体は その応答において類似していると考え、これらのデータを解析のためにプールし て検討した（ｎ・６）、コントロール（ｈｓｐ７０無添加）の大動脈細胞単離体 （ｎ・２３）の場合における、構造に関連するリゾソーム酵素の潜在率（すなわ ち、リゾソーム膜の完全性）対生存率の線形回帰はリゾソーム膜の完全性と生存 率とは製置温度にかかわらず良好に相関している（ｒ・０．８５）ことを示した （ｌｆｆｌｌ）、さらに、コントロール試料の生存率およびリゾソーム膜の完全 性は両方とも製置温度が上昇するにつれ有意に低下した（それぞれ、ｐくｏ、ｏ ｏｏｓおよびｐ＜０．００４　）（図２ａおよび図２ｂ）、Ｌかし、ｈｓｐ７０ によって処理した場合にはこれらの２個のパラメータに不均衡な影響が生じた。

ｂｓｐ７Ｑに対する３７℃で２０時間における単離体細胞の応答は、ｈｓｐ　７ ０無添加の細胞と比べて、１０３個の細胞当たりＬｏｎｇまたはこれ以上のｈｓ ｐ７０において生存率に有意な増加を示した（ｐ＜０゜０５）（図３）、用量を １０倍増加して１０３個の細胞当たり１１００ｎのｈｓｐ７０としたした場合で も、生存率に変化はなかった。温度一応答研究は、１０３個の細胞当たりＬｏｎ ｇのｈｓｐ７０がすべての３種の試験温度において２０時間貯蔵後に、３７℃で 最大の作用を示し、細胞生存率を増大させ（ｐ＜０．０５）　、最大の効果は３ ７℃で現れることを示した（図４）、これらの結果に基づき、添加したｈｓｐの 長期間（すなわち、２０時間）の効果を決める最適温度は３７°Ｃであった。こ れに対し、リゾソーム膜の完全性に及ぼすｈｓｐ７０の影響は、試験したｈｓｐ 添加量または温度範囲については、明らかでなかった（図５）、非特異的な外来 作用について個々に試験した３種のコントロールタ“ンバク質の３７℃における 研究は、標準または標準の１０倍の生理学的濃度において、生存率またはリゾソ ーム膜の完全性の維持を示すことができなかった。

Ｃ１考察 ここに記載したデータは外来のｈｓｐ７０が動脈細胞の生存性を高めることがで きることを示している。ストレスパラメータとして生理温度において比較的長い 試験期間を用いることが研究にとって必要である。従来のｈｓｐ研究は比較的高 温（４２〜４５°Ｃ）において短期間（１５〜９０分間）を用いて細胞または動 物にストレスを与えている、エム、シュレジンガー等：　「コールドスプリング ハーバ−研究所（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）　Ｊ、１９８２　；エム、パルデユー等：「アラン・アール、リス社（Ａｌ ａｎＲ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、）　Ｊ　（１９Ｂ９）。これに対し、アテローム性 動脈硬化プラクは慢性の多重ストレス系を表す。これらの条件、特にプラクの壊 死中心で見出される条件をより良く近似させるために、ここでは、酵素による細 胞遊離（ｅｎｚｙｓａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｒｅｌｅａｓｅ）、酸素欠乏症、低ア ミノ酸レベル、および一層長い製置期間の組み合わせによりストレスを受けた細 胞を研究した。

統計学的な差は正常および病変の動脈細胞単離体の間における試験応答について は観察されなかった。これはこの研究の母集団の大きさが限定され、かつ／また はアテローム性動脈硬化の範囲が限定され、すなわち、これら動物にはアテロー ム性動脈硬化が欠けていることを表していることがある。さらに、この研究にお いて適用した細胞遊離方法および試験条件は、正常および病変の両方の細胞単離 体に、最大ｈｓｐ応答を生じさせ、インビボで現れるｈｓｐ応答の差を隠すこと もあった。最大の病変した動脈細胞単離体においても見出される正常な平滑筋細 胞の大部分は隠す作用を有することがある。また、差がないことは外来のｈｓｐ についての潜在作用点を反映している。アテローム性動脈硬化中に組成または数 が変化しない形質膜エフェクタ一部位を介してｈｓｐが生存率に影響を及ぼす場 合には、外来ｂｓρに反応する細胞はその脂質負荷レベルにかかわらず同じであ る。

従って、ここに示した結果は動脈細胞に及ぼす外来ｂｓｐの作用にとって可能な 共通の進路を示している。

生存率とリゾソーム膜完全性とは全温度範囲にわたって正常に良好な相関関係に ある（図１）が、外来のｈｓｐ７０に対する応答は一致していない、細胞単離体 の生存率に及ぼす添加ｈｓｐ７０の正の作用は１０ｎｇ／１０’個の細胞のよう な少量で始まり、一旦有意な作用が得られると、ｈｓｐ濃度を１０倍に増大して も細胞生存率をさらに変化させることはできなかった（図３）、この増大は全温 度範囲にわたって生じるが、３７°Ｃにおいて最も有意であった（図４）、これ は恐らくこの温度において研究下の細胞における分解酵素が最大限活性化される ためである。

細胞の生存率に対し、リゾソーム膜の完全性は外来ｈｓｐ７０によって有意には 変化しなかった（図５）、この観察結果は時間依存因子も測定する必要があるこ とを反映しているかもしれない０図５は、構造に関連するリゾソーム潜在率の温 度による低下がｈｓｐ添加または無添加の両方の試料について生じることを示す 、リソソームＮＡＢＡ潜在率がこの系における膜完全性に対する生存率より早期 のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）である場合には、２０時間前の時点での測定は生存 率の後期の変化に匹敵する全温度域にわたる潜在率の変化を明らかにすることが ある。これに取り組むため、時間応答研究を目下実施中である。あるいはまた、 ｈｓｐ７０は一般的細胞膜安定性よりさらに特異な機構によって細胞生存率に影 響を及ぼすことがある。その場合には、構造に関連するリゾソーム潜在率は生存 率と無関係に影響を受けるか、あるいは外来ｈｓｐによる影響を受けない。

実施例２ Ｈ４Ｆ　７に　の この実験は、モルデル系であるラットの網膜において光で生じた損傷を用い、ｈ ｓｐ　７０を使用して神経細胞を損傷から保護することを示すために行った。方 法は本質的にエム、バーブ等：　ｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　Ｌ、１８１７　（１９ ８Ｂ）に記載されている通りとした。

ｈｓｐ　７０は上述の実施例１に関連して記載した通りのものであった。

それぞれ３匹のラットからなる２個の群において、２μｇまたは１０μｇのいず れかの精製ｈｓｐ　７０を含有する食塩水を右目の硝子体眼房内に注射した。ま た、これらのラットの左目に食塩水のみを注射して、注射自体が及ぼす影響に対 するコントロールとした。２匹のラットからなる第３の群には注射をせず、未処 理のコントロールとした。これらの３個の群のすべてに１７５〜２００フートキ ヤンドルのけい光を照射した。照射は注射の４時間後に開始し、２４時間継続し た。光照射の２週間後に、通常の組織学的検査を行うために各ラットの目から試 料を調製し、冬目において生存する光受容体の数を標準的手法によりめた。

次に、右目網膜と左目網膜との間における生存光受容体の差を計算した。注射し たｈｓｐ　７０の作用が認められなかった場合には、右目および左目からの光受 容体の損失は平均して同一となり、左右の差は零との有意差が認められなかった 。

これらの結果を図６にまとめて示した。いくつかの統計的比較に基いて、１０μ ｇの用量のｈｓｐ　７０を投与した群は、光で生じた損傷に対して網膜光受容体 の有意な保護作用（ｐ　＜０．０５）を示し、右目は左目より約３６％多い光受 容体を有していた。２μｇの用量のｈｓｐ　７０を投与した群は、より多い用量 の群と同じ傾向を示したが、試験した被験者の数が少なく統計的有意性を示さな かった。

上述の実施例１および２は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定す るものと解釈してはならない。本発明は以下の請求の範囲により明らかにされ、 請求の範囲の記載と同等なものも本発明に包含される。

条件 Ｈ３Ｐ７Ｑｔｎ石斉子イ本肉辻村１てよＪ準ｎ月費のメロで奮Ｕ゛／ミ劇１Ｃ禦 Ａ”；ｄ１イスよｊ１要　約　書 ストレス下の細胞または組織における死すべき状態を阻止する方法が開示されて いる。この方法では、細胞または組織にｈｓｐ７０を細胞または組織の生存性を 高めるのに有効な量で接触させる。この方法は、このような処置を必要とするヒ トまたは動物の被験者におけるアテローム性動脈硬化、血管形成後の再狭窄、お よび神経の損傷を阻止するために使用することができる。また、薬剤として受け 入れることのできる組成物中に治療に有効な量のｈｓｐ　７０を含有する薬剤も 開示されている。

国際調査報告 −＝リ　＝＝　＋−＝＝−−−−１−−ＰＣＴ、’Ｕ”？１．Ｏ：：６］＋”’ ｖＨ＋Ｉ＋４＃ｌＨａｍ−・ａ；ＣＴ　じ；Ｑｌ　ｉｉｊ、ＭｌＳｅｒｔｓｌ　 Ｈａ、ＰＣＩ’／ＬＩ５９１／Ｖａ！３←りＴｈｅ　ｅｌｌｌｉｍｌｌ　ｐｒｅ ｓｅｎｔ　ＩＩＩ　ｐｌｕｒａｌｉ？−ｖ　ａｘ　ｍｕｔｕ−上１ｙ　ｅ：＜ｅ ｉυｇｉｖｅｉｎｄｅｐ＠ｎｄｅｎｔ　１ｎｖｅｎｔｉｃ、ｎ＊　ｓｍ　ｘｏｌ ｌｏｖ寥：１、Ｃｌａｉｍｓｌ−１２，＠ｎｄ２６−２８．ａｒａｖｎｔｏｍｍ ｅｔｈｏｄｓｎｄｐｅｒｔｌ口ｅｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ　ｏ ｘ　Ｌｉｒｏｕｐ　１　ｖｈｅｒｅ　ｍｌ　１露　ｔｈｅ　！ｉｒｇｔｇｐｅｅ ｉｅ＊　ａｎｄ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ｗｅｍｒｅｈ＠ａ　ｖｉｔｈ　ｅｌｍｉｍｍ 　ｌ　ａｎｄ　１２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｖｅｎｔａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｇｐｅ ｃｘ費ｍ　ｗｉｔｈｉｎ　らｒｏｕｐ　１　ｒｅ−ｑｕｚｒｅｖｘ　ｐａｙｍｅ ｎｔ　ａｔ　ｓｄｄｉｔｉｏ獅高■ ｍｌ　’ｌｈｅ　ｈｇｐ７Ｑｌ　ｉｇ　ｍｎ１ｍ５ｌ／ｍｔｍｍｓｌｉｓｎ　ｈ 嘗ｐ７の　（ｅ１龜１＋＊ｍ　２　ａｎｄ　５１゜ｂｌ　ｔｈｅ　ｈｗｐ−／の 　ｉｌｌ　ｐｌａｎｔ　ｈ！ｌｐ’／ｌｄ　ｔｅｌ＠ｆ　’１ν。

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ｍｔｈｅｒｃ＋＊ａｌｅｒｏ＊ｉ＊　ｖｌｔｈ　ｈｌｌｐ’／ＬＩＶ、　ＣＩＪ ｌｌＲ２２，ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ＩＩ　ｍｅｔｈｏｄ　ｎｏｒ　ｔｒｅｓｔｉｎ ＜＋　龜ｒｔ書ｒｉａｌｒｅ＋＋ｔｅｎｏ＊１＊　ａｔｔｅｒ　Ｓｎ９Ｓｎ９１ Ｑｐｌａ　ｖｉｔｈ　ｈ＊ｐ７Ｌｙ、Ｃｌａｉｍｓ　２コー２乳　ｄｒ＠ｌｌｎ 　ｔｏ　＠　帥ｔｈｏｄ　ｔａｒ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｎｅｒＶ＃　ｄ纏−・９ −１５　６ｔｈ　ｈ＊ｐ７＠。

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Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ストレス下の細胞における死すべき状態を阻止するに当り、前記細胞にｈｓ ｐ７０を前記細胞の生存性を高めるのに有効な量で接触させることを特徴とする 細胞における死すべき状態を阻止する方法。
2. ２．前記ｈｓｐ７０が動物のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の方法。
3. ３．前記ｈｓｐ７０が植物のｈ３ｐ７０であることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の方法。
4. ４．前記ｈｓｐ７０が細菌のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の方法。
5. ５．前記ｈｓｐ７０が哺乳類動物のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の方法。
6. ６．前記細胞は植物細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記細胞は動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記細胞は細菌細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記細胞は哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の 方法。
10. １０．前記細胞は動脈細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法 。
11. １１．前記細胞は神経細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法 。
12. １２．前記細胞をインビトロに維持し、前記接触工程をインヒドロで行うことを 特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．ストレス下の組織における死すべき状態を阻止するに当り、前記組織にｈ ３ｐ７０を前記組織中に存在する細胞の生存性を高めるのに有効な量で接触させ ることを特徴とする組織における死すべき状態を阻止する方法。
14. １４．前記ｈｓｐ７０が動物のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の範囲第 １３項記載の方法。
15. １５．前記ｈｓｐ７０が哺乳類動物のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の 範囲第１３項記載の方法。
16. １６．前記組織が哺乳類動物組織であることを特徴とする請求の範囲第１３項記 載の方法。
17. １７．前記組織が動脈組織であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方 法。
18. １８．前記組織が神経組織であることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方 法。
19. １９．前記組織をインビトロに維持し、前記接触工程をインビトロで行うことを 特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
20. ２０．処置を必要とするヒトまたは動物の被験者におけるアテローム性動脈硬化 を阻止するに当り、 前記被験者にｈｓｐ７０を前記被験者に存在する動脈プラクにおける壊死を減少 させるのに有効な量で投与することを特徴とするアテローム性動脈硬化の阻止方 法。
21. ２１．前記投与工程を静脈内注射によって行うことを特徴とする請求の範囲第２ ０項記載の方法。
22. ２２．処置を必要するヒトまたは動物の被験者における血管形成後の動脈の再狭 窄を阻止するに当り、 このような処置を必要とする前記被験者に存在する動物組織にｈｓｐ７０を再狭 窄阻止量で投与することを特徴とする血管形成後の動脈の再狭窄を阻止する方法 。
23. ２３．処置を必要とするヒトまたは動物の被験者における神経の損傷を阻止する に当り、 前記被験者にｈｓｐ７０をストレス下の神経細胞の生存性を高めるのに有効な量 で投与することを特徴とする神経の損傷を阻止する方法。
24. ２４．前記ストレスが酸素欠乏ストレスであることを特徴とする請求の範囲第２ ３項記載の方法。
25. ２５．前記ストレスが発作から生じる酸素欠乏ストレスであることを特徴とする 請求の範囲第２３項記載の方法。
26. ２６．薬剤として受け入れることができる組成物中に治療に有効な量のｈｓｐ７ ０を含有していることを特徴とする薬剤。
27. ２７．前記ｈｓｐ７０が動物のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の範囲第 ２６項記載の薬剤る
28. ２８．前記ｈｓｐ７０が哺乳類動物のｈｓｐ７０であることを特徴とする請求の 範囲第２６項記載の薬剤。