JPH05507203A

JPH05507203A - 真核性発現ベクター系

Info

Publication number: JPH05507203A
Application number: JP91511005A
Authority: JP
Inventors: ギリ，チャンドラカント　ピー．; 小川　啓恭; ハリス，カーチス　シー．
Original assignee: アメリカ合衆国
Priority date: 1990-06-18
Filing date: 1991-06-14
Publication date: 1993-10-21
Also published as: AU8006891A; AU652566B2; WO1991019809A1; EP0535096A4; CA2085353A1; US5604118A; EP0535096A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は真核生物遺伝子をクローニングするためのＤＮＡ構成物及び方法に関する。

２、背景情報ハイブリッド形成又は免疫学的プローブは利用できないがしかし所定の表現型が真核細胞で選択されうる遺伝子を分子クローニングするためには、全鎖長ｃＤＮＡを高い割合で含有する真核生物発現ｃＤＮＡライブラリーの構築が必要である。未知遺伝子の全鎖長ｃＤＮＡを高割合で含むライブラリーの作製では、ベクタープライマーｃＤＮＡ合成が用いられる。

この関係において、ＳＶ４０転写要素のコントロール下において哺乳動物細胞で発現されうる機能性ｃＤＮＡの高効率クローニングに関するベクタープライマーｃＤＮＡ合成に基づく新規方法はＯｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ（Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．ＢＩｏｌ、、３：２８０　（１９１ｉ３））により開発された。第−鎖のｃＤＮＡの合成は、５ｖ４０ポリアデニル化シグナルを保有したプラスミドベクターｐｃＤＶ１に由来する直鎖ＤＮＡに共有結合されたオリゴ（ｄＴ）をプライマーとしてなされる。モノポリマーｄＣ尾部はその新た合成されたＣＤＮＡの３′−ヒドロキシル末端に酵素的に加えられる。ベクタープラスミドの３′−末端に同時に加えられたｄＣ尾部は制限酵素による切断で除去される。次いでプラスミドベクターは、一端に付着末端及び他端にｄＧ残基のホモポリマー尾部を保有するリンカ−ＤＮＡで環化される。プラスミドベクターｐＬ１に由来するリンカ−ＤＮＡはＳＶ４０　“初期”プロモーターに関するヌクレオチド配列も有する。

ｄＧ残基はｃＤＮＡの第−鎖のｄＣ尾部と対形成し、ＲＮアーゼＨ及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■で触媒されるｃＤＮＡの第二鎖の代替合成用プライマーとして働く　。

最近ＳＭａｒｇｏｌｓｋｅｅら（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１．ｃｅｌｌ。

Ｂｉｏｌ、、８：２８３７　（１９８ｇ）　）はＥＢＯ−ｐｃＤと表示されるシャトルベクターを開発した。そこではＯｋａＹａｒｎａ−ＢｅｒｇｃＤＮＡクローニングベクター系で作製られたｃＤＮＡ発現ライブラリーが細菌中で増殖及び増幅されうるだけでなく、高コピー数で安定的にエビソーム的に複製されてＥＢＯセグメントのクローニング後にヒト細胞で発現されうる。プラスミドＤＮＡのＥＢＯセグメントは、形質転換ヒト細胞において発現ｃＤＮＡライブラリーの安定な染色体外複製の維持を保障するＤＮＡ複製のエプスタイン−パールウィルス（ＥＢＶ）［及びＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）遺伝子に加えて、ヒト細胞の安定なトランスフェクトントの選択を可能にするヒグロマイシンＢ（ｈ　ｐ　ｈ）に関する耐性マーカーを含んでいる。更に、全ｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリーは真核細胞においてエビソーム的に高コピー数で維持されうろことから、完全ｃＤＮＡクローンは個別的形質転換株から容易に“救助”され、細菌中で増殖により回収されつる。このため、希有なメツセージに対応するｃ　ＤＮＡクローンの発現に関して直接選択して、更に重要にはその後に更なる機能的な特徴付けの研究のために、これらのエビソームを回収することができれば、ハイブリッド形成及び免疫学的スクリーニング方法が利用できないが、細胞表現型がヒト細胞で選択され得る遺伝子のクローニングを可能にするはずである。

上記のようなＥＢＯ系のような最近の進歩にもかかわらず、同時ｃ　ＤＮＡ減算（サブトラクション）なしにＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇベクタープライム化ｃＤＮＡ合成系で希有ｃＤＮＡクローンをクローニングすることは更にもっと困難である。しかしながら、減算を実施するため培養中ヒト細胞から十分なポリ（Ａ）＋　ＲＮＡを得ることは経済的に実施不能であるため、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド形成に基づきｃＤＮＡライブラリーを減算する慣用的な方法論はヒト細胞系で実施不可能である。

発明の要旨本発明は得られる表現型で特徴付けられる遺伝子の全鎖長ｃＤＮＡに富むベクタープライマーｃＤＮＡ合成系を提供することを目的としている。

ＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成に基づく減算法用にＲＮＡプローブを得るためインビトロでセンス及びアンチセンスＲＮＡを合成できるベクター系を提供することも本発明の１つの目的である。

更に、ＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成に基づく減算法を提供することも本発明の目的である゛。

ファージミドに基づ（ｃＤＮＡ減算ライブラリーの作製手段を提供することも本発明のもう１つの目的である。

所定の補乳動物細胞表現型に基づき関連遺伝子に関して発現ｃＤＮＡライブラリーを富化させる手段を提供することも更に本発明の目的である。

本発明の様々な他の目的及び利点は図面及び本発明の詳細説明本発明は真核生物遺伝子、特に希有遺伝子をクローニングするためのＤＮＡ構成物及びそれを用いる方法に関する。

図面の簡単な説明図１．ｐＬＨＣ２−ＨＯ２の構築図２．ｐＬＨＣ２−ＣＧ５の構築図３．ＥＢＯ−ｐＬＨｃ２　（ＦＩＡ）−ＣＤ−Ｘ７７一ジミドベクター地図図４．ｐＬＨＣ２ーｃＤベクター系におけるＢＥＡＳ２Ｂ−Ｒ１　ｃＤＮＡライブラリークローンがらのインビトロＲＮＡ合成ｐＬＨＣ２−ｃＤベクター系においてＢＥＡＳ２Ｂ−ＲＩ　ＤＮＡライブラリーがらランダムに選択されたクローン＃６及び１６は、各に１．０及（Ｆｌ．５ｋｂｐ　ｆイズのｃＤＮＡインサートを有する。これらのプラスミドクローンは、各々Ｓａｉｌ又はＮｏｔｒ切断にょる直鎖化後にＳＦ３又はＴ７　ＲＮＡボリメラーゼによりインビトロで触媒されるＲＮＡ合成反応において鋳型として用いられた。放射能１１Ｆ識されたＲＮＡは、グリオキサール及びジメチルスルホキシドによる変性後にアガロースゲル電気泳動され、その後オートラジオグラフィーにより分析された。

図５．ＥＢＯ−ｐＳＶ２−Ｎｅｏ又はＥＢＯ−ｐＬＨＣ２−ｃＤ−ＮｅｏブラスミドのいずれかでトランスフェクトされたＢＥＡＳ２Ｂ−Ｒ１細胞の、ヒグロマイシンＢ及びＧ４１８耐性の安定な形質転換株においてインビボで発現されたＮｅｏ特異性ＲＮＡのノーザンブロットハイブダイゼーション分析。

ヒト気管支上皮細胞系ＢＥＡＳ２Ｂ−Ｒ１は、Ｂｒａｓｈら（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．ＢＩｏ．、７：２０３１　（１９８７）　）の方法により、Ｅ　Ｂ　Ｏ　−’ 　ｐ　Ｓ　Ｖ　２　−　Ｎ　ｅ　ｏ又はＥＢＯ−ｐＬＨＣ２−ｃＤ−ＮｅｏプラスミドＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされた。ヒグロマイシンＢ及びＧ４１８の双方に耐性である安定な形質転換株が選択された。次いでこれらの形質転換株から単離された全ＲＮＡ　（２０μｇ）は、ホルムアルデヒドを含有したアガロースゲルで電気泳動に付された。次いでＲＮＡはナイロン膜フィルターに移され、放射能標識されたＮｅｏ特異性プローブとハイブリッド形成され、しかる後オートラジオグラフィーのため一７０℃で露出された。

図６．ｐＬＨＣ２−（ＦＩＡ　ＤＲＦＩＢ）−ｃＤ−Ｎｅｏの構築図７．ｐＬＨＣ２−ＣＧ６の構築図８．ｐＬＨＣ２−ｃＤ−ＦＩＡベクターにおける減算ｃＤＮＡライブラリーの構築本発明の詳細な説明一態様において、本発明は哺乳動物発現ベクター（例えば、図３）のような真核生物発現ベクターであって、例えば時計回り方向でＳＶ４０プロモーターのような真核生物プロモーターと；時計回り方向であって真核生物プロモーターの下流にある第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと一時計回り方向である真核生物タンパク質をコードするＤＮＡ配列と；反時計回り方向である第二バクテリオファージポリメラーゼブロモ−ターと；第二バクテリオファージポリメラーゼブロモ−ターと；そしてｄＡ−ｄＴ配列に作動的に結合された時計回り方向のポリアデニル化シグナルとを含んでなるベクターに関する。第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及び前記ＤＮＡ配列は、約１０〜１５塩基対のデオキシシチジレートーデオキシグアニジレート（ｄＣ−ｄＧ）配列を介して作動的に結合される。第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及び前記ＤＮＡ配列は、約４０〜６０塩基対、好ましくは約４５〜５０塩基対のデオキシアデニレートーデオキシチミジレート（ｄＡ−ｄＴ）配列を介して作動的に結合される。第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターから開始されるＲＮＡ転写物はセンス転写物であり、一方第二バクテリオファージボリメラーゼプロモーターはアンチセンスＲＮＡ転写物を開始する。更に、発現ベクターは少くとも２つの異なる希有制限部位（ｒａｒａｒｅｓｔｒ！ｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　）　、即ちプラスミドを直鎖化するため少くとも６塩基対からなる制限部位を有している。一方、希有制限部位の代わりにポリメラーゼに特異的な転写終結部位をコードするヌクレオチド配列もベクターに組み込んでクローニングすることができる。第一制限部位は第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及びｄＣ−ｄＧ配列の間に存在し、それに対応して第二制限部位は第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及びｄＡ−ｄＴ配列の間に存在する。

当業者であれば認識するように、複製源、好ましくはｐＢＲ３２２複製源、及び、例えばアンピシリン耐性遺伝子のような選択マーカーは真核生物発現ベクターに固有である。したがって、本発明の発現ベクターはこれらの要素を含む。

本発現ベクターでの使用に適したバクテリオファージポリメラーゼプロモーターとしては格別限定されないが、Ｔ３及びＴ７、好ましくはＳＦ３及びＴ７プロモーターが挙げられる。加えて、可能な希有制限部位は例えばＮｏｔｌＳＳａｃＩ又は５ａｌｌである。

上記発現ベクターは、既に記載された方法（Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ、Ｍｏ１．Ｃｅ！１．Ｂｉｏｌ、、３：２８０　（１９８３））を用いて、ベクタープライマーｃ　ＤＮＡ合成により２つのプラスミドベクターから構築される。第一プラスミドベクター（図１参照）は、ポリアデニル化シグナルと：例えばＳＰ６プロモーターのようなバクテリオファージポリメラーゼプロモーターと：各々少くとも６塩基対からなる少くとも１つの希有制限酵素部位と；例えば５ａｃＩのような切断で３′突出末端を残すプラスミドに特有な制限部位とを含む。プラスミドベクター内においてポリアデニル化シグナルは時計回り及びその逆に向けられ、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは反時計回りに向けられている。加えて、特有の制限部位は希有制限部位の下流に存在する。更に、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターはポリアデニル化シグナルとプロモーターの下流に存在する制限酵素部位との間に存在する。

ポリアデニル化シグナル、プロモーター及び制限酵素部位は、発現ベクターが作製された場合にｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列、ｄＡ−ｄＴ配列及びポリアデニル化シグナルが作動的に結合されるように実質上記いに隣接している。

第ニブラスミドベクター（図２参照）は真核生物プロモーターと；Ｔ７プロモーターのようなバクテリオファージポリメラーゼプロモーターと；少くとも６塩基対からなる希有制限部位と；切断で３′突出末端を残すプラスミドに特有な制限部位とを含む。真核生物プロモーター及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターはプラスミドベクター内に同方向で存在し、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは真核生物プロモーターの下流にある。更に、希有制限部位はバクテリオファージポリメラーゼプロモーターの下流に存在し、特有の制限部位は希有制限部位の下流に存在する。

本発明での使用に適した真核生物プロモーターとしては格別限定されないが、レトロウィルス長末端反復（ＬＴＲ）のようなＳＶ４０の強い構成真核生物プロモーター、又は、メタロチオニンもしくは熱シヨツクプロモーターのようなサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の誘導性プロモーターが挙げられる。

真核生物発現ベクター及びそれに対応した本発明の第ニブラスミドベクターは、（例えばＤＮＡ複製のＦＩＡ源のような）−水路ＤＮＡをパッケージ化するファージ複製源を更に含んでもよい（図７参照）。発現ベクター（又は第ニブラスミドベクター）がファージ複製源を含む場合、その源は真核生物プロモーターと同方向又は反対方向で真核生物プロモーター内に存在する。本発明のベクター系内におけるＤＮＡ複製のＦ１バクテリオファージ源は、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇベクター系でベクタープライマーｃＤＮＡ合成の利点を留めながら、現在不可能なファージミドに基づ（ｃＤＮＡサブトラクション（減算）ライブラリーの構築を可能にする。

一方、本発明の真核生物発現ベクターがファージ複製源を含まないならば、その真核生物発現ベクターは真核細胞でエビソーム複製を行える配列を更に含んでもよく、例えばその配列はエプスタイン−バールウィルス複製源、エプスタイン− バールウィルス核抗原遺伝子及び例えばヒグロマイシンＢ（図３参照）又はヒスチノールデヒドロゲナーゼのような真核生物選択マーカー遺伝子を含んでもよい。エビソーム複製に関する配列はマーカー遺伝子と一緒に真核生物プロモーターに入れられる。

もう一つの態様において、本発明は例えば哺乳動物細胞のような真核細胞で遺伝子をクローニングする方法にも更に関するが、その発現は薬物処理で影響される。この方法において、真核細胞群は二群に分けられる。第一群の細胞は希有遺伝子、即ちｍＲＮＡが薬物処理前に細胞の全ｍＲＮＡの０．０１〜０．００１％である遺伝子の発現を誘導する薬物のような薬剤で処理される。第−ｃＤＮＡライブラリーは、薬物処理細胞の第一群のメツセンジャーＲＮＡに対応するｃＤＮＡが本発明の真核生物発現ベクターでクローニングされるように、本発明のプラスミドベクターを用いて作製される。第二ｃＤＮＡライブラリーもまた、細胞の第二未処理群のメツセンジャーＲＮＡから本発明の発現ベクターによって、第一ライブラリーのように作製される。

ライブラリーが構築された後、第一ライブラリーはバクテリオファージポリメラーゼプロモータ一部位の１つで発現ベクターを切断する希有制限酵素で直鎖化され、しかる後放射能標識されヌクレオチドの存在下で発現ベクターに存在する他のバクテリオファージポリメラーゼプロモーターに特異的な例えばＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼでインビトロ処理され、第一群のＲＮＡを形成する。

また、第ニライブラリ−は第一ライブラリーで完全なままに残存するバクテリオファージポリメラーゼプロモータ一部位で発現ベクターを切断する希有制限酵素で直鎖化され、その後他のバクテリオファージポリメラーゼプロモーターに特異的なポリメラーゼでインビトロ処理リーにおいて図３で示された発現ベクターがＴ７プロモーターで切断されてそのライブラリーがＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼで処理されるならば、第ニライブラリ−はＳＰ６プロモーターで切断され、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼで処理される。

減算ステップ前に、第二群のＲＮＡはフォトビオチニル化される。次いで第一群のＲＮＡは、相補的ＲＮＡ配列が対をなして二本鎖ＲＮＡ：ＲＮＡ／％イブリッドを形成できるような条件下で第二群のＲＮＡと接触させられる。これはＲＮＡ：ＲＮＡｚＸイブリッド゛形成に基づく減算と呼ばれる。二本鎖ハイブリッドは、好ましくはストレプトアビジン−アガロースクロマトグラフィーにより分離され、それにより真核生物遺伝子に関して減算化プローブとして作用できる減算化放射能標識−水路ＲＮＡが得られる。これらのプローブはクローン化遺伝子に関する第一ライブラリーをスクリーニングするために用いられるが、その発現は薬物処理により影響される。

当業者であれば、ＲＮＡ：ＲＮＡｚＸイブリッド形成が行われるように第ニライブラリ−から対が得られる限り、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡのいずれかが、選ばれた制限酵素及びＲＮＡポリメラーゼの組合せに応じて第一ライブラリーから得られることを認識するであろう。

薬剤で誘導又は抑制される遺伝子は前記方法を用０てクローニングできる。誘導性遺伝子がクローニングされる場合、前記のようにコントロール細胞からのＲＮＡは処理細胞のＲＮＡから減算される。他方、抑制される遺伝子がクローニングされる場合、処理細胞からのＲＮＡはコントロール細胞のＲＮＡから減算される。

ＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成に基づく減算では、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため一水路減算化放射能標識ＲＮＡプローブを産生ずる。

しかしながら、ＲＮＡプローブは量及び半減期に関して制限されるため、それはライブラリーをスクリーニングする上で有限回数だけ使用できるにすぎない。このため、更なる実験に繰返し利用できる減算化ｃＤＮＡライブラリーが更に一層望ましい。

したがって、もう一つの態様において、本発明はそれらの表現型で同定及び特徴付けられる真核生物遺伝子、（好ましくは低コピー数で自然発現される遺伝子）のｃＤＮＡを含む減算化ｃＤＮＡライブラリーの構築方法に関する（図８参照）。前記クローニング方法のように、細胞群は二群に分けられ、そしてその一群は希有遺伝子の発現を誘導する薬剤で処理される。次いでｃＤＮＡライブラリーは本発明のプラスミドベクター及び発現ベクターを利用して上記方法で記載されるように二群のｍＲＮＡから作製される。この方法で用いらむる第ニブラスミドベクターは、最終発現ベクターがファージ複製配列を含むように、真核生物プロモーター及びバクテリオファージプロモーターと同方向でファージ複製原配列を含むことが必要である（例えば、図７で示されるプラスミドベクターｐＬＨＣ２− ＣＧ６）。

ライブラリーの構築後、−水路ＤＮＡは当業者に周知の方法を用いてファージミド複製源の使用により第一ライブラリーから得られる。

第ニライブラリ−は、第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーター近くの希有制限部位を切断する制限酵素、例えばＳａｃ　Ｉ又は５ａｌｌ、で直鎖化され、ファージミド複製源と反対方向に転写する発現ベクターの第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーターに特異的なポリメラーゼ、例えばＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼでインビトロ処理される。得られたＲＮＡはフォトビオチニル化され、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ配列が対をなして二本鎖ＤＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドを形成できるような条件下で、第一ライブラリーから産生される一本鎖ＤＮＡと接触される。非ハイブリッド形成りＮＡ　（減算化−水路ＤＮＡ）は例えばストレプトアビジン−アガロースクロマトグラフィーにより二本鎖ｌ＼イブリッドから分離される。

減算化−水路ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡが形成されるような条件下において、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片と一本鎖ＤＮＡでコードされる発現ベクターのセグメント、例えばＳＰ６プロモーターに、相補的な約２０〜３０ヌクレオチドのオリゴデオキシヌクレオチドブライマーとで処理される。次いでその二本鎖ＤＮＡは、適切な宿主細菌を形質転換して減算化ｃＤＮＡライブラリーを作製するために用いられる。

減算が行われると、ｃＤＮＡライブラリーの発現ベクターにおけるＦＩ　ＤＮＡ配列は、例えば５ｆｉｌのような制限部位においてＥＢＯＤＮＡセグメントで減算することができる。次いでＥＢＯ減算化ｃＤＮＡライブラリーはここで記載されたようなＭＢｒｇｏｌｓｋｅｅらのＥＢＯ法（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、８：２８３７　（１９８８））に従い哺乳動物細胞をトランスフェクトして所定表現型に基づき特異的ｃ　ＤＮＡクローンに関してスクリーニングするために使用できる。

前記のように、ファージ複製配列が真核生物プロモーター及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターと同方向に存在する場合、第二ｃＤＮＡライブラリーは第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーター近くの制限部位で直鎖化され、第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーターに特異的なポリメラーゼでインビトロ処理される。しかしながら、ファージ複製配列が真核生物プロモーター及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターと反対方向に存在する場合、第ニライブラリ−は第二バクテリオファージポリメラーゼブロモ−ター近くの制限部位で直鎖化され、第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターに特異的なポリメラーゼで処理される。当業者であれば理解しうるように、センス及びアンチセンス双方のメツセンジャーが一本鎖ＤＮＡ及び−水路ＲＮＡでコードされるようこれが必要とされる。

ＲＮＡ　：　ＲＮＡ及びＲＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッドがＤＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッドより安定であるほど、ハイブリダイゼイションがより高い厳格条件下で実施できかつより低い分解複雑化で行えるため本方法は有利である。

高厳格条件の使用は、二本鎖誤対合が望まれるメツセージの限定コピーを容易に除去しうるため、希有メツセージの単離上特に重要である。更に、ストレプトアビジン−アガロース（ＳＡ）クロマトグラフィーの使用は、ＲＮＡのような一本鎖配列からＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドのような二本鎖複合体の分離を改善する。ＳＡクロマトグラフィーによる−及び二本鎖核酸の分離は、慣用的ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによる分離よりもかなり簡便かつ効率的である。２サイクルの液中ハイブリッド形成、例えばＲＮＡ　：　ＲＮＡ又はＲＮＡ　：ＤＮＡ、それに続＜ＳＡクロマトグラフィーによれば、平均で９８％の減算が達成できる。

一本鎖ファージミドＤＮＡから二本鎖ＤＮＡへの変換に関する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片の使用はもう一つの主要な改善である。本発明者らはフレノウ断片が逆転写酵素の慣用的使用よりも約２７０倍効率的であることを見出した。

もう一つの態様において、本発明は、その産物が細胞増殖を阻害する、真核生物遺伝子の同定方法に関する。

本方法は増殖阻害、最終分化、腫瘍抑制及び老化の調節に関与する遺伝子を同定する上で特に有用である。

本方法において、減算ｃＤＮＡライブラリーは前記方法のような増殖阻害遺伝子の発現を誘導する薬剤で処理された細胞から作製される。増殖阻害遺伝子をコードする二本鎖ＤＮＡが作製されると、真核細胞でエピソーム複製を行える配列は制限部位を介してファージ複製配列に置き代わった。次いで、増殖阻害された真核細胞が第一群の細胞で既に用いられた薬剤との処理により得られる。これらの増殖阻害された細胞は、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ及び（１１）真核生物発現ベクターでトランスフェクトされる。このベクターは、産物が哺乳動物細胞でアンチセンスＲＮＡを形成する真核生物発現ベクターのプロモーターに特異的なバクテリオファージポリメラーゼ遺伝子、核標的配列と、そして真核生物発現ベクターの選択マーカーと異なる選択マーカーとを含む。その細胞は当業者に周知の方法を用いて二本鎖ＤＮＡ及びベクターで前トランスフェクト又は同時トランスフェクトできる。増殖を再開する細胞は、細胞内でアンチセンスＲＮＡの発現により止められた関心のある阻害遺伝子で高度に富んでいるべきである。その遺伝子をコードするｃＤＮＡは、増殖細胞からエビソーム複製プラスミドを単離することにより得られる。

当業者であれば認識するように、処理により誘導される遺伝子が望まれる場合、前記のように一本鎖ＤＮＡは処理群から得られる。一方、望ましい遺伝子が処理により抑制されるならば、−水路ＤＮＡはコントロールの未処理群から得られ、処理群がそこから減算される。

実施例物質：Ｏｋａｙａｍａ−ＢｅｒｇプラスミドベクターｐｃＤＶ−１及びｐＬｌはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、一方ｐＢＳ（＋）はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から得た。

Ｎｅｏ　ＲＮＡはベーリンガー・マンハイム（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍｅｉｎｈｅｌｍ）市販のｃ　ＤＮＡ合成キットから得た。特定の制限酵素部位と共にＳＦ３又はＴ７プロモーターＤＮＡ配列を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーはミツドランド・サーティファイドやりエージェント社（Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆ’Ｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏ１１ｐａｎｙ）により注文合成、精製及びリン酸化された。他の合成りＮＡクリンカはアプライド・バイオシステムズ（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のＤＮＡシンセサイザー、モデル３８１Ａで合成した。制限酵素、ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）　、ＲＮアーゼＨ等はファルマシア、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｌｏＬａｂｓ）又はベセスダ・リサーチ会ラボラトリ−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。逆転写酵素はＳｅｉｋａｇａｋｕ社から得た。ＲＮＡのインビトロ合成はプロメガ社（Ｐｒｏｓｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｌｏｎ）から購入したキットを用いて実施した。ヘルパーファージＲ４０８はインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）製であった。細菌株５ＣＳ −１及びＸＬ１ブルーはストラタジーンから、ＷＭＩｌｏｏはバイオラッド社（ＢｉｏＲａｄＣｏｍｐａｎｙ）から得た。特に指摘のないかぎり、すべての組換えＤＮＡ法はＭａｎｌａｔｉｓ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、（１９８２）。

Ｎｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　（分子クローニング：実験マニュアル）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　）から採択した。

ｐＬＨＣ２−ＣＤベクター系における発現ｃＤＮＡライブラリーの作製：ｐＬＢｃ２−　ｃＤベクター系の作製はＯｋＢｙａｍａ及びＢｅｒｇ　（Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ、Ｍｏ１．Ｃｅ！１．Ｂｉｏｌ、、３：２８０　（１９８３）　；Ｏｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４：３　（１９８７）　）のベクタープライマーｃＤＮＡ合成プロトコールの修正法に基づいていた。簡単には下記のように記載される。

ヒト細胞からポリ（Ａ）＋　ＲＮＡの抽出及び精製のため、全ＨＭＡを６Ｍチオシアン酸グアニジニウムと共にヒト細胞の単層培養し、その後塩化セシウム溶液中での遠心から抽出した（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ　ｅｉ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｌｓｔｒｙ、１８コ５２９４　（１９７９））。ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡは少くとも２サイクルのオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより全ＲＮＡ調製物から精製した。ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ調製物の完全性はＧＡＰＤＨメツセージのノーザンプロットハイブリッド形成分析により試験した。機能分析はプライマーとしてオリゴｄＴ及びｄＴ尾部形成ｐＬＨＣ２−ｃＤベクターを用いて鋳型活性（１０’Ｏ回用いられたＲＮＡ＠型μｇ当たりで合成されるｃＤＮＡμｇ）ａ定により実施した。プライマーとしてオリゴｄＴ及びＳｅｉｋａｇａｋｕ社のＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ）を用いた場合、ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ調製物の鋳型活性は３０％過剰であった。

ＡＭＶ　−ＲＴで触媒される第−鎖ｃＤＮＡ合成の場合、ｄＴ尾部形成ベクタープライマー対ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡの最適比は各々約２μｇ：５μｇであった。

ＣＤＮＡのｄＧ尾部形成の場合、濃度０．０１５μｇ／μｍで反応混合液中ポリ（「Ａ）の含有であれば未利用ベクター分子及びそのベクターに共有結合されていないＣＤＮＡの優先的尾部形成を最少に抑制することがわかった。これはインサートのないｃＤＮＡクローンの数を最少にする。最良の尾部鎖長は約１０〜１５’ｄＧ残基であった。

Ｂｉｎｄ３切断にとり最良の条件は獲得されたばがりの酵素約４０単位、であることがわかり、切断時間は約１４時間であった。

オリゴｄＣ尾部形成リンカ−ＤＮＡにより媒介される環化及びＤＮＡによるＲＮＡ鎖の置き換えにとり、ベクタ一対リンカ−ＤＮＡの最適モル比は各々約１：２であった。

コンピテント宿主細菌の形質転換の場合、細菌の化学的コンピテント５Ｃ５−１株を用いた形質転換の効力はｐＵｃ１８　ＤＮＡｕｇ当たり約１０８形質転換株であった。細菌株ＷＭＩ１００の形質転換のエレクトロポレーション法を用いた場合、本発明者らはｐＵｃ１８ＤＮＡ　（バイオラッド−ジーン・パルサー（ＢＩｏＲａｄ　ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ）及びパルスやコントローラー（Ｐｕｌｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ））　ｕ　ｇ当たり１０００以内の形質転換株を得ることができた。高品質脱イオンｄＨ２ｏ〔ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）又はＨＰＬＣグレード〕がエレクトロコンピテント細菌を産生ずる際に用いられねばならない。

ＲＮＡのフォトビオチニル化は本質的に製造業者により記載されたようにインビトロゲン社のサブトラクターキット（Ｓｕｂｔｒａｃｔｏｒ　Ｋｉｔ）を用いて酢酸フォトビオチンでのＲＮＡの標識化により行フな。

ストレプトアビジン−アガロース（ＳＡ）カラムクロマトグラフィーの場合、ポリープレプ（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ）クロマドグラフィーカラム（バイオラッド社）をシリコーン処理し、ＤＥＰＣ処理し、オートクレーブ処理し、しかる後ストレプトアビジン−アガロース（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）約０．４ｍｌで充填した。カラムを約５倍カラム容量の充填緩衝液（１０ｄ）リスＨＣ１゜ｐＨ７，５−０，３Ｍ　ＮａＣ１−５ｓＭＮａＣ１−５ｓ酵母ｔＲＮＡ１００ μｇ／ｍｌ−ポリ（ｒＡ）２００μｇ／ａｔ）で平衡化した。キャリアとして酵母ｔＲＮＡ２００μｇ及びポリ（ｒＡ）２０μｇと共にサンプルフォトビオチニル化ＲＮＡを含有した充填緩衝液０．２１をカラムに適用し、流通をカラムに何度も（×４）再適用して、ストレプトアビジン−アガロースカラムへのフォトビオチニル化ＲＮＡの定量的結合を確実にした。次いでカラムは本質的にフォトビオチニル化されていない未結合核酸を定量的に集めるため充填緩衝液で洗浄した。

オリジカルＯｋａｙａｍａ−ＢｅｒｇプラスミドベクターｐｃＤＶ１及びｐＬｌは下記のようにベクター−プライマー及びリンカ−ＤＮＡを各々得るため修正した。ＲＮＡ　：ＲＮＡハイブリッド形成に基づき減算を行う上で十分な量でインビトロでｃＤＮＡインサートからセンス及びアンチセンスＲＮＡ転写物の合成を可能にするため、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターＤＮＡ配列ＳＰ６及びＴ７を反転写方向で希有制限酵素部位Ｎｏｔｌ及び５ａｌｌと共に各々ｐＬＨＣ２−ＨＯ２及びｐＬＨＣ２−ＣＧ５と表示される修正ベクター−プライマー及びリンカ−プラスミド内でクローニングした。

図１で概略的に示されるように、オリジナルＯｋａｙａｓａ−Ｂｅｒｇベクター −ブライマープラスミドｐｃＤＶｌにおいてＥｃｏＲＩ制限部位はｐＬＨＣ２− ＨＯＩと表示されるプラスミドを得るため合成５ｆｆｌリンカ−結合で５ｆｆｌに変換させた。ｐＬＨＣ２−ＨＯＩプラスミドを５ｆｉＩ及びＫｐｎＩで切断し、大きな方のＤＮＡ断片をゲル精製した。次いで５ｆｉｌ及びＫｐｎｌ付着末端で隣接されるＳＰ６プロモーター配列と共にＳａｃ　１及びＮｏｔＩ制限部位を含む４９ｂｐ合成二本鎖ＤＮＡを、ｐＬＨＣ２−ＨＯ１／Ｓ　ｆ　ｉ　Ｉ／Ｋｐｎ　Ｉに結合させて、ｐＬＨＣ２−ＨＯ２を得た。

次いでｄＴ尾部形成ｐＬＨＣ２−ＨＯ２ベクター−プライマーを本質的にＯｋａｙａｗａ及びＢｅｒｇ　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　３：２８０（１９８３））に従い作製した。簡単に言えば、ｐＬＨＣ２−ＨＯ２のＳａｃ　Ｉ切断後に、平均４５ｄＴの残基を末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｔ　ｄ　Ｔ）触媒反応で３′末端に共有結合させた。

望ましくない尾部は５ｆｉｌ切断により除去した。得られた大きなりＮＡ断片をＰＥＧ−６０００で選択的に沈降させ、しかる後オリゴｄＡセルロースカラムクロマトグラフィーで精製した。次いでこれを逆転写酵素触媒ｃＤＮＡ合成のためｄＴ尾部形成ベクター−プライマーとして用いた。

ｄＣ尾部形成リンカ−ＤＮＡプラスミドｐＬＨＣ２−ＣＧ５の作製のため、最初にオリジナルＯｋａｙａＩＩａ−ＢｅｒｇプラスミドｐＬ１からの５２１　ｂｐリンカ−ＤＮＡ断片をＰｓｔｌ及びＨｉｎｄ３切断ｐＧＥＭ４クローニングベクターに組み込んでクローニングし、このベクターにお番ブるＳａｃ　Ｉ及びＫｐｎｌ制限部位を用いた。ｐ　Ｌ、ＨＣ２−ＣＧ４と表示される得られたプラスミドクローンを５ａｃｌ及びＫｐｎＩで切断した。図２で示されるように、５ａｌｌ制限部位と５ａｃｌ及びＫｐｎｌ付着末端で隣接されるＴ７プロモーター配列を含む３８ｂｐ合成二本鎖ＤＮＡを５ａｃＩ及びＫｐｎｌ切断ｐＬＨＣ２−ＣＧ４ベクターに結合させて、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ　（ＭｏｂＣｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、、３：２８０　（１９８３）　）によるリンカ−ＤＮＡ断片作製用の起源プラスミドであるが但し下記のように修正されたｐＬＨＣ２−ＣＧ５を得た。

簡単に言えば、ｐＬＨＣ２−ＣＧ５を５ａｃＩ切断で直鎖化し、平均９ｄＣの尾部（０ｋａｙａｉａ及びＢｅｒｇプロトコールのようなｄＧ尾部の代わり）をＴｄｔと共にリンカ−ＤＮＡの３゛末端に加えた。Ｈｉｎｄ３切断後、ＳＶ４０及びＴ７プロモーター配列を含む５８６ｂｐｄＣ尾部形成りＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。

ｃＤＮＡインサートは、ベクタープライム化ｃＤＮＡ合成のＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇプロトコールに従いｐＬＨＣ２−ｃＤｌｌｉ乳動物発現ベクター系に組み込んでクローニングされた場合に、図３で概略的に示されたように反転写方向でＳＦ３及びＴ７プロモーター配列で隣接される。これらの原核生物プロモーターＤＮＡ配列によれば減算を行う上でセンス及びアンチセンスＲＮＡのインビトロ合成を可能にする。

前記のようにｃＤＮＡクローニング経路ＣＯｋａｙａｍａ　ａｔａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４：３　（１９８７）　）に関与するステップの各々で最適の条件を用いて、ヒト気管支上皮細胞系（ＢＥＡＳ２Ｂ−Ｓ６及び−Ｒ１）から単離されたポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ調製物からＣＤＮＡライブラリーを作製した。約２０〜３０％の評価バックグラウンドに関する補正後（即ち、ｃＤＮＡインサートサイズ０．２ｋｂｐ以下）、ｃＤＮＡライブラリーはポリＣＡ）”　ＲＮＡｕ　ｇ当たり約１０６独立ｃＤＮＡクローンを構成した。

ｃＤＮＡクローニングベクターｐＬＨＣ２−ＣＤ内における様々な調節遺伝要素の下記機能分析を行った。

インビトロ分析：　ｐＬＨＣ２−ｃＤベクター内の適切な部位に組み込んでクローニングされるＮｏｔｌ及び５ａｉｌ制限部位と共にＳＦ３及びＴ７プロモーターＤＮＡ配列は約１．０〜１．５ｋｂｐサイズ範囲のランダムに選択されたＢＥＡＳ２Ｂ−Ｒ１ｃＤＮＡクローンから各々ＳＰ６及びＴ７　ＲＮＡポリメラーゼでインビトロ触媒されるＲＮＡ転写物を合成する能力に基づき機能的であることを試験した（図４）。

インビボ分析：　ｐＬＨＣ２−ｃＤベクター内で計画的にクローニングされるＳＦ３及びＴ７プロモーターＤＮＡ配列（図３参照）がＳＶ４０遺伝要素の転写コントロール下でｃＤＮＡインサートの発現に悪影響を与えなかったことを保証するため、部分的〜全体的鎖長クローンからなるミニｃＤＮＡライブラリーをｐＬＨＣ２−ｃＤベクターでＢＥＡＳ２Ｂ　ｃＤＮＡライブラリーに関して本質的に前記されたようにｎｅｏ耐性遺伝子をコードする市販（ベーリンガー・マンハイム）１．１ｋｂポリ（Ａ）＋　ＲＮＡから作製されたｏ　ｐ　Ｌ　ＨＣ２−ｃ　Ｄ　−？’Ｊｅｏと表示されるサイズ（１、２ｋｂｐ）上見掛は全鎖長のｃＤＮＡクローンをコロニーハイブリッド形成及びミニプラスミド調製分析により単離した。ヒト細胞におけるＮｅｏ遺伝子の発現に関して分析するため、プラスミドＤＮＡをＢＥＡＳ２Ｂ−Ｒ１細胞中にトランスフェクトした。結果は、コントロールプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏと区別しえない効率で、Ｇ４１８耐性トランスフエクタントの回収に基づきヒト気管支上皮細胞においてｎｅｏ遺伝子ＲＮＡ及びタンパク質産物の高レベル発現を示した（図５）。

ヒト気管支上皮細胞におけるＥＢＯ−ｐＬＨＣ２−ｃＤ希有ｃ　ＤＮＡクローンを単離する上でシャトルベクターとしてこれらプラスミドの利用可能性二ＭａｒｇＯＩＳｋｆｌ！ｅらのＥＢＯ法［Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｆｏｌ、、８：２８３７　（１９ＢＢ））もまたヒト気管支上皮細胞においてｐＬＨＣ２−ｃＤベクター系で機能することを証明するため、７．５ｋｂｐ　ＥＢＯセグメントをｐ　ＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏにおいて５ｆｉＩ部位でクローニングした。ＥＢＯ−ｐＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏと表示される得られたプラスミドクローンをヒト上皮細胞中にトランスフェクトした。ヒドロキシルＢ及びＧ４１８双方に耐性であるヒト上皮細胞形質転換株を回収したが、これはこれらの細胞におけるＥＢＯ及びｎｅｏ遺伝子双方の機能的発現を示す（図５の説明文参照）。完全プラスミドはこれらの形質転換株からのＨｔｒｔ上澄で抽出されるだけでなく、細菌に戻して増殖させることもでき、それにより多数コピーで安定してエビソームで複製したＥＢＯ−ｐＬＨＣ２−ｃＤベクターのシャトル性質を証明した。ＥＢＯ法が、希有ｃＤＮＡクローンの単離を容易にする本修正ベクター系及び親Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇベクター系でうまく活用されうることはこれらのデータから明らかである。

減算化ＲＮＡプローブを得るためＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成に基づく減算方法：当業者に周知の方法を用いて処理及びコントロール細胞からｃＤＮＡライブラリーの対の構築後に、ＲＮＡ　：ＲＮＡ減算は下記のようにして実施できる。

減算される２つのｃＤＮＡライブラリー（各々処理及びコントロール細胞タイプ）からの放射能標識（３２Ｐ又は３５Ｓ）及び未標識ＲＮＡをインビトロで合成する。放射能標識ＲＮＡを過剰（１０００を超えるロット（Ｒｏｔ）当量）に未標識フォトビオチニル化ＲＮＡと液中でハイブリツド形成させる。二細胞タイプ間で減算される共通配列を表す得られたフォトビオチニル化二本鎖（ｄ　５）ＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドはストレブ′トアビジンーアガロースクロマトグラフィーによりハイブリッド形成混合物から除去する。処理細胞タイプで特有に発現される配列を表す得られた放射能標識−水路（ｓ　５）ＲＮＡは処理細胞タイプからｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして直接使用できる。

この方法の実施可能性を例証して、更にＲＮＡ　：ＲＮＡハイブリッド形成に基づく減算の効力を調べるため、単純なミキシング実験をＲＮＡの二種のみの公知種で行った；即ちＴ７／　［”２Ｐ）ＲＮＡとして表示される（”２Ｐ）ＵＴＰを含有したＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ触媒反応においてＮｏｔｌ切断で直鎖化された各々ｐＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏ及びｐＬＨｃ２−　ｃＤ　−１，５ｋｂＲ１（ＢＥＡＳ２Ｂ−Ｒ１，ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択されたクローン）プラスミドからインビトロ合成されたｎｅｏ及び１．５ｋｂＲＩＲＮＡである。１．．５ｋｂＲ１／Ｔ７／　Ｃ３２ＰＥ　ＲＮＡをＲ１／ＳＰ６／未標識ＲＮＡとのハイブリッド形成により選択的に減算したが、その理由はＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼで５ａｌＩ切断プラスミドｃＤＮＡクローンから合成されたＲＮＡがＴ７　ＲＮＡポリメラーゼで合成されたＲＮＡと相補的であって、このためｄｓ　ＲＮＡを形成するようにハイブリッド形成するはずだからである。減算前及び後における１、５ｋｂ：Ｎｅｏ−特異的ＲＮＡの比率から、減算の効力は下記のように評価できる。

液中ハイブリッド形成：１．５ｋｂ及びＮｅｏ　ｃＤＮＡに相当する痕跡量のＴ７／　［３２Ｐ］ＲＮＡ転写物の１：１混合物を２００倍過剰（“ドライバー” ）の未修正又はフォトビオチニル化いずれかのＳＰ６／未標識１．５ｋｂＲＮ　Ａと液中ハイブリッド形成させた。液中／Ｘイブリッド形成の程度はＲＮＮアーゼ及びＴ１保護アッセイで調べた。二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは切断から保護され、一方一水路（ｓ　５）ＲＮＡはＲＮアーゼで酸溶解性ヌクレオチドに完全に切断される。

ヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）又はストレプトアビジン−アガロース（ＳＡ）カラムクロマトグラフィーによる減算：　ｄ　ｓ　（”Ｐ）　／、Ｔ　７／　１．　５ｋｂ：　Ｓ　Ｐ　６／１゜５ｋｂＲＮＡ（未修正又はフォトビオチニル化）をＲＡＰ（未修正ＲＮＡ用）又はＳＡ（フォトビオチニル他用）カラムのいずれかに結合させることでｓｓ［”’Ｐ）／Ｔ７／Ｎｅｏ　ＲＮＡから減算した。ＳＡカラムクロマトグラフィーを行う初期コントロール実験では、未修正又はフォトビオチニル化いずれかの（３２Ｐ）／ＴＶ／Ｎｅｏ　ＲＮＡを用いた。表１で要約されたように（下記参照）、未修正ＲＮＡの６％以下がカラムに結合しくおそらく非特異的結合を表す）、一方フオドビオチニル化ＲＮＡのほぼ９９％はカラムに結合できた。次の実験において、この非特異的結合はキャリアとして１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡで補充された結合緩衝液でカラムを平衡化させることにより２％以下まで減少した。

ＨＡＰ及びＳＡ双方のカラムクロマトグラフィーは同等にうまく機能した。しかしながら、ＳＡと比較した場合に、ＨＡＰカラムクロマトグラフィーは扱いにくくて時間がかかりすぎる。

［１９９，１５０１００５７４，０００１００未結合　８５８．１７０　９４．１４　７．０５０　１２３結合　４０，９８０　５４６　５Ｂ８．９５０　９８．７７結合緩衝液：ｌＯＩＭトリス、ｐＨ７，２−０，１Ｍ　ＮａＣ１−１ｍＭ　ＮａＥＤＴＡサンプル：ストレプトアビジン−アガロースへの非特異的結合を最少に抑制するためキャリアとして１００μｇの酵母ｔ　ＲＮＡを含有した結合緩衝液０．１ｓｌ中ＲＮＡ１　μ　ｇ減算前及び後に１．５ｋｂ：Ｎｅｏ特異性ＲＮＡの比率を定量するドツトプロブトハイブリツド形成分析：（３２Ｐ）　／Ｔ７．／１．　５ｋｂ及びＮｅｏ特異性ＲＮＡをここで記載されたようにドツトプロ・ソト／Ｘイブリ・ノド形成分析により減算前及び後に定量した。これらのデータは表２で要約されている（下記参照）。（３２Ｐ）／Ｔ７／１．５ｋｂＲＮＡのみを（１，５ｋｂ：Ｎｅｏ　ＲＮＡの１：１混合物の代わりに）プローブとして用いた場合、おそらく相補的ＲＮＡにおける末端１０〜１５Ｇ及びＣ残基のためｌ：１．５ｋｂ及びＮｅｏ　ＲＮＡの間で１２．４％の交差ハイブリッド形成と見積もられた。このため、データを１２．４％バックグラウンドに関して補正した。

２サイクルの液中ハイブリッド形成とその後のＳＡクロマトグラフィー減算では、１．５ｋｂＲＮＡの約９７％が１．５ｋｂ：Ｎｅｏ　ＲＮＡの原１：１ミックスから減算することができた。

表２＝ストレプトアビジンーアガロース（フォトビオチニル化ＲＮＡ）又はヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ。

未修正ＲＮＡ）いずれかのカラムへの結合しかる後ドツトプロットハイブリッド形成分析により定量される液中ＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成後における未ハイブリッド形成ＲＮＡの減算効力ＲＮＡプローブ　減　算　減　真前　後　％　前　後　％ドツトされた　Ｌ５ｋｂ及びＮＥＯプラスミドＤＮＡ　ｎｇ５０　１．２９　０．０８７　９３Ｊ　１．８８　０．２８　８３．４１０　１．２８　０．０２８　９７．８　１．９５　０．２４・　８７．６５　０．９５　０１００．０　１．１４　０．２２　８０．８１．５ｋｂ　ＲＮＡプローブ単独　減算前後のＲＮＡ　ＣＰＭドツトされた　１．５ｋｂ及びＮＥＯプラスミドＤＮＡ　ｎｇ５０　２１０４　７２　９８．６　４０８３　２５９　９３．７１０　４８３　１７　９Ｂ、３　９４．４　１０７　８８．７５　＋、７３　０　１００．０　３７０　３Ｂ　９０．３平均　江」９７．６化ＲＮＡ）又はヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ、　未修正ＲＮＡ）いずれかのカラムへの結合しかる後ドツトプロットハイブリッド形成分析により定量される液中ＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成後における未ハイブリッド形成ＲＮＡの減算効力ＲＮＡをＴ７又はＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼ触媒反応において適切な制限（Ｎｏｔｌ又はＳａ　Ｉ　Ｉ）１）ＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏ又は１．５ｋｂＲ１プラスミド鋳型ＤＮＡからインビトロ合成した。各駒５０ｎｇ（痕跡量）の（３２Ｐ）　／Ｔ　７／Ｎ　ｅ　ｏ及び（３２Ｐ　）　／Ｔ　７　／１　、　５　ｋｂＲＮ　Ａを５０℃で４０時間にわたり未修正又はフォトビオチニル化いずれかのＳＰ６／１．５ｋｂＲＮＡ１０μｇ（ドライバー）と１０Ｐｇの最終容量中で液中ハイブリッド形成させた（４４３のロフト当量）。ハイブリッド形成溶液は４０ｉＭＰ　ｌＰＥ５．ｐＨ６，４，５０％ホルムアミド、３ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ及び２０Ｐｇ／ｌのポリ（ｒＡ）を含有していた。Ｉ＼イブリッド形成はフレーム密封１００μｇキャピラリー中で実施した。ハイブリッド形成の程度はＲＮアーゼＡ及びＴ１保護アッセイで定量した。二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは保護され、一方一水路（ｓ　５）ＲＮＡはＲＮアーゼ切断で酸溶解性ヌクレオチドに分解される。得られたＣ”ＰＩ／Ｔ７／１．５ｋｂ：未修正又はフォトビオチニル化ＳＰ６／１．５ｋｂｄｓＲＮＡをヒドロキシルアパタイト（ＨＡＰ）又はストレプトアビジン−アガロース（ＳＡ）カラムクロマトグラフィーにより（３２Ｆ）／Ｔ７／Ｎｅｏ　ｓｓ　ＲＮＡから減算した。ＨＡＰカラムクロマトグラフィーは下記のように実施した：簡単に言えば、ヒドロキシルアパタイト（ＤＮＡグレード、バイオラッド社）を水ジヤケツト化ガラスカラム（バイオラッド社、１、ＯＸ２．Ｏｃｍ）に充填した。カラムを６０℃において１０倍カラム容量の結合緩衝液、ｐＨ６，８の０．１ＭＮ　ａ　Ｐ　Ｏ４緩衝液で平衡化した。ｓｓ及びｄｓ　ＲＮＡ含有サンプルを６７℃で結合緩衝液中カラムに充填した。

カラムを同温度で５倍カラム容量の緩衝液で洗浄した。

−水路ＲＮＡを同緩衝液により９０℃でカラムから溶出させた。二本鎖ＲＮＡは９０℃において０．３ＭＮａＰＯ４で溶出させた。

１、　５ｋｂ：　Ｎ　ｅ　ｏ　（３２Ｐ）　ＲＮＡの比率は下記のようなドツトプロットハイブリッド形成分析により減算前及び後に定量した：ドツトプロットハイブリッド形成分析：ナイロン膜フィルターのシートにおいて、５．１０及び５０Ｐｇ量のｐＬＨＣ２−ｃＤ　−１，５ｋｂＲ１及びｐＬＨＣ２−ｃＤ置（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社）でドツトした。各々のドツトはキャリアとしてサケ精子ＤＮＡ５μｇを含有していた。フィルターの適切な処理後、ハイブリッド形成はプローブとして減算前及び後に〔３２Ｐ〕ＲＮＡを用いて一夜６５℃で実施した。ノ＼イブリッド形成溶液は５０％ホルムアミド、３ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／■１の酵母ＲＮＡ及び１０Ｐｇ／ｍ　ｌのポリ（ｒＡ）を含有していた。フィルターのハイブリッド形成後洗浄に続き、ドツトを切断して、液体シンチレーションにより放射能を測定した。データは、１．５ｋｂ特異性（”Ｐ）ＲＮＡのみをプローブとして用いた場合に得られるハイブリッド形成データから評価されるように、末端ＣＴＣ配列のため１．５ｋｂ及びＮｅｏ　ＲＮＡの間で約１２．４％交差ハイブリッド形成に関して補正した。

ファージミド誘導ｃＤＮＡ減算うイブラリー構築法：ファージミドに基づく減算ｃＤＮＡライブラリー作製法は現在入手可能である（インビトロ合成社のサブトラクターキット）。ファージミドベクターにおけるＦＩＤＮＡ配列は適切なヘルパーファージ（Ｒ４０８）感染プロトコール及び適切な宿主細菌株（ＸＬＩブルー）を用いてＳＳファージミドＤＮＡの救済を可能にするＦ１繊維状ファージ複製源を構成する。しかしながら、これらのクローニングベクターはＦ１配列がベクターに組み込まれてクローニングされた場合に本ｐＬＨＣ２−ｃＤベクター系で行われるベクタープライム化ｃＤＮＡ合成の利点を示さない。

ｐＬＨＣ２−ＣＤベクター系でファージミドに基づく減算プロトコールを採択するため、Ｆ１配列を図６で示されるようにｐＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏプラスミドで最初にクローニングした。ファージミドｐＢＳ　（＋）からのＦ１配列を保有する５８２ｂｐＮｄｅ　Ｉ／Ｐｖｕｌｌ　ＤＮＡ断片を、フレノウによるプラント末端へのＮｄｅｌ制限部位の変換後にアガロースゲル電気泳動で回収した。

プラント末端を保有する５８２ｂｐＦＩ　ＤＮＡ断片を合成ｄｓ　５ｆｉｌリンカ−ＤＮＡに結合させ、５ｆｉｌで切断し、ゲル精製し、しかる後５ｆｉｌ及びＣＩＰ処理で既に切断されたｐＬＨｃ２−ｃＤ−ＮｅｏプラスミドＤＮＡに結合させた。

ヘルパーファージＲ４０８感染を伴うＳＳファージミド救済法を用いて、Ｆ１配列が複製源の反対方向に存在する２つの組換えクローンを選別した。時計回り方向のＦ１複製源を保有する組換え株はｐＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏ−ＦＩＡと表示し、反対方向である他方はｐＬＨＣ２−ｃＤ−Ｎｅｏ−ＦＩＢと表示した。

５ｓ−ｄｓファージミドＤＮＡの変換のため、インビトロゲンサブトラクターキットで用いられるＡＭＶ　−ＲＴを５Ｃ５−１コンピテント細菌の形質転換効力に基づき５ｓ−ｄｓファージミドＤＮＡの変換効力に関してフレノウ酵素と比較した。表３で示されるように（下記参照）、フレノウ酵素で達成された形質転換効力は等量のＳＳファージミドＤＮＡ　（１μｇ）が変換プロセスで用いられたときにＡＭＶ　−ＲＴの場合よりも約２７０倍高かった。

表３ニ一本鎖（ｓ　ｓ）から二本鎖（ｄｓ）ファージミドＤＮＡへの変換に関するＡＭＶ　−ＲＴ及びフレノウ酵素の相対的効力収量（μｇ）　コロニー数　（倍率）ＡＮＹ−ＲＴ　Ｏ，０８２８μ　ｇ　２．Ｏｘ　１０’　／　ｕ　ｇ　（１）ＡＭＶ　−ＲＴに関する反応混合液は全容量４０μｇ中に５０＋ｇＭトリスＨＣ１，ｐＨ８，５−８ｍＭＭｇＣ１−３０ｓＭＫＣＩ　−０，３ｍＭＤＴＴ　−２ｍＭｄＮＴＰ　−３０ＨｇＳＰ６プライマーー１μｇ　ｓｓ環状プラスミドＤＮＡ鋳型−４０Ｕ　ＡＭＶ−ＲＴ−１０μＣ１（３２Ｐ）ｄＣＴＰを含有しており、これを４２℃で６０分間インキュベートした。フレノウ酵素に関する反応混合液は全容量４０μＩ中に１００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ６，９−１０ｍＭＭｇＣＩ　 −２，５ｍＭＤＴＴ　−７０ｍＭＫＣ１−２ｄｄＮＴＰ　−３０ＨｇＳＰ６プライマーー１μｇ　ａｓ環状プラスミドＤＮＡ鋳型−２５０クレノウ酵素−１０μ Ｃ】（３２Ｐ）ｄＣＴＰを含有しており、これを１５℃で４時間インキュベートした。ｓ　ｓ　−ｄ　ｓプラスミドＤＮＡ変換の量（収量）はＴＣＡ沈降放射能標識核酸に基づき計算した。形質転換効力は超コイル化ｐＢＲ３２２μｇ当たり６．０ＸＩＯ８コロニーを産生ずるコンピテント５Ｃ８−１細菌を用いて測定した。

次いでＦＩ　ＤＮＡ配列（Ｓｆｉｌ付着末端を有する５　８２　ｂｐ）を特有の５ｆｉｌ制限部位でベクタープライマーｃＤＮＡ合成プロトコールにおいてｄＣ尾部形成リンカ−ＤＮＡの作製用起源プラスミドｐＬＨＣ２−ＣＧ５に組み込んでクローニングした。得られたクローンはｐＬＨＣ２−ＣＧ６と表示した（図７で示される）。

（ｐＬＨｃ２−ＨＯ２から作製されるｄＴ尾部形成ベクター−プライマー及びｐＬＨＣ２−ＣＧ６から作製される約１．２ｋｂのｄＣ尾部形成リンカ−ＤＮＡを利用して）ファージミドベクター系ｐＬＨＣ２−ｃＤ−ＦＩＡで（ＴＧＦ−β１処理（４時間）ヒト気管支上皮細胞系、ＢＥＡＳ２Ｂ−５６、ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ調製物から）ここに組立てられた二本鎖ｃＤＮＡライブラリーはＤＮＡ複製のＦＩＡ源を用いてＳＳファージミドＤＮＡに変換できる。図８で概略的に示されるように、ＳＰ６プロモーター駆動５ｓＲＮＡを５ａｉｌ又はＳａｃ　！切断で直鎖化された“コントロール”ｃＤＮＡライブラリープラスミドＤＮＡからインビトロ合成し、フォトビオチニル化し、しかる後“処理“ｃＤＮＡライブラリー（ＤＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッド形成）に由来する過剰（１０００を超えるロット当量）のＳＳファージミドＤＮＡと液中ハイブリッド形成させる。“コントロール“及び“処理″細胞系ｃＤＮＡライブラリー間の共通配列はハイブリッド形成してｄｓ　ＤＮＡ：ＲＮＡ−フォトビオチンハイブリッドを形成するはずであり、これはＳＡクロマトグラフィーにより除去され、こうして減算することができる。得られたＳＳ形の減算化ファージミドＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ断片によりｄｓ形に酵素変換できる。次いでｄｓ　ＤＮＡはエレクトロポレーションにより適切な宿主コンピテント細菌をファージミドベクター系で作製された発現ｃＤＮＡライブラリーにおけるＦＩＡ　ＤＮＡ配列はもはや不要であり、このため５ｆｔＩ制限部位において７．５ｋｂｐＥＢＯＤＮＡセグメントと簡単に置き換えられる。次いで　ＥＢＯ−減算化ｃＤＮＡライブラリーは前記のよう　なＭａｒｇｏｌ　５ｋｅｅら（１９Ｈ）のＥＢＯ法に従い所定表現型に基づき特異的ｃＤＮＡクローンに関してスクリーニングするため哺乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる。

ｃＤＮＡライブラリーを富化するアンチセンスＲＮＡ子前記のように、アンチセンスＲＮＡはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６ＲＮＰ）によりファージミドベクター系内でｃ　ＤＮＡインサートからＳＰ６プロモーターでインビトロ合成できる。加えて、５Ｐ６ＲＮＰ遺伝子が生物活性酵素産物として発現されかつ哺乳動物細胞の液中に効率的に転位されうるならば、本ベクター系は哺乳動物細胞においてインビボでｃＤＮＡインサートからアンチセンスＲＮＡのＳＰ６プロモーター駆動過剰発現をトランス活性化する可能性も与える。真核生物転写コントロール下における原核生物５Ｐ６ＲＮＰ遺伝子のインビボ発現が低レベルであっても、関与する酵素的増幅のためにアンチセンスＲＮＡのＳＰ６プロモーター駆動過剰発現をトランス活性化する上でおそらく十分であろう。アンチセンスＲＮＡの過剰発現は同時トランスフェクトされた場合にＥＢＯ−ｐＬＨＣ２−ｃＤベクターにおいてＳＶ４０転写要素のコントロール下でｃＤＮＡインサートから発現されるセンスＲＮＡの翻訳を阻害すると予想できる。トランス活性化プロセスは真核細胞の核で起きなければならないため、好ましくはメタロチオニン又は熱シヨツクプロモーターのような誘導性真核生物プロモーターのコントロール下で同時又は前トランスフェクトされた５Ｐ６ＲＮＰ遺伝子構成物から構成される５Ｐ６ＲＮＰ酵素タンパク質はその機能的な形で核に物理的に転位されることが前もって必要である。そのタンパク質は約１００ｋｄサイズであって原核生物起源であるため、それは要求される核標的配列の助けなしに単なる拡散で液中に転位される見込みはない。

本発明のアンチセンスＲＮＡアプローチのインビボ合成において、本ファージミド減算ｃＤＮＡベクター系は哺乳動物細胞において所定表現型に基づき減算ｃ　ＤＮＡライブラリーを富化する上でＥＢＯ法（前記）を更に増強することができる。このアプローチは慣用的なアプローチが非産生的である増殖阻害、最終分化、腫瘍抑制、老化等の調節に関与する遺伝子を同定する上で特に有利である。本発明者らの研究室で特に遂行される下記ケース力その方法について例示している。

ＳＶ４０　Ｔ抗原媒介永続化されたがしかし非腫瘍原性ヒト気管支上皮細胞系である親ＢＥＡＳ２Ｂ細胞系の８６及びＲ１クローンは、形質転換する増殖因子β １（ＴＧＦ−β１）誘導性扁平上皮最終分化をうける感受性及び耐性細胞系を各々表す（Ｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｄｉｆｆ’ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、３８：８０　（１９Ｎ））。分化特異性減算ｃＤＮＡライブラリーは、Ｒ１細胞特異性共通ｃＤＮＡ配列を減算することにより前記のように本発明のＥＢＯ−ｐＬＨＣ２− ｃＤベクター系で作製される。この分化特異性ライブラリーＤＮＡがＴＧＦ−β １で既に処理された増殖阻害Ｓ６細胞中に５Ｐ６ＲＮＰ遺伝子構成物で同時又は前トランスフェクトされた場合に、アンチセンスＲＮＡの過剰発現は増殖制御遺伝子から特異的に発現されるセンスＲＮＡの翻訳を停止する結果として増殖阻害を止めるはずである。その結果、ＴＧＦ−β１で補充された増殖培地で生存して増殖するＳ６細胞コロニーのヒグロマイシンＢ耐性形質転換株のみが増殖阻害コントロールに関与する分化特異性発現遺伝子で高度に富化される株である。

前記すべての文献は参考のため本明細書の開示の一部とされる。

前記発明は明確化及び理解の目的で一部詳細に記載されてきた。形式及び細部に関して様々な組合せが本発明の範囲から逸脱せずに行いうろことも明らかであろう。

唖Ｌ’ｓ”仏”；ｑ　／　Ｓｆｉ　ｌ　／　ＣＩ　Ｐ要　約　書本発明は、二つのプラスミドベクター及びそれから得られる真核性発現ベクターに関する。本発明は更に、その発現が薬剤処理により影響を受ける真核細胞中の遺伝子のクローニング方法、減算ｃＤＮＡライブラリーの構築法、及び、その生成物が細胞の生長を阻害する真核性遺伝子の同定方法に関する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　４　年　１２月　１８日立へ

Claims

【特許請求の範囲】

１．プラスミドベクターであって、ｉ）ポリアデニル化シグナルと、ｉｉ）バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと、ｉｉｉ）各々少くとも６塩基対からなる少くとも２つの異なる制限酵素部位とを含んでなり、上記ポリアデニル化シグナルが時計回り方向で、上記プロモーターが反時計回り方向であり、上記プロモーターが上記ポリアデニル化シグナル及び上記制限酵素部位の間に存在し、上記制限酵素部位が上記プロモーターの下流にあり、そして上記ポリアデニル化シグナル、上記プロモーター及び上記制限酵素部位が実質上互いに隣接していることを特徴とする、プラスミドベクター。
２．バクテリオファージポリメラーゼプロモーターがＳＰ６ポリメラーゼプロモーターである、請求項１に記載のプラスミドベクター。
３．図１に示されたｐＬＨＣ２−ＨＯ２である、請求項１に記載のプラスミドベクター。
４．プラスミドベクターであって、ｉ）真核生物プロモーターと、ｉｉ）バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと、ｉｉｉ）少くとも６塩基対からなる希有制限部位と、１ｖ）切断で３突出末端を残すプラスミドに特有の制限部位とを含んでなり、上記真核生物プロモーター及び上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが同じ反時計回り方向であり、上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが上記真核生物プロモーターの下流にあり、そして上記希有制限部位が上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの下流にあり、上記特有の制限部位が上記希有制限部位の下流にあることを特徴とする、プラスミドベクター。
５．真核生物プロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項４に記載のプラスミドベクター。
６．バクテリオファージポリメラーゼプロモーターがＴ７ポリメラーゼプロモーターである、請求項４に記載のプラスミドベクター。
７．図２に示されたｐＬＨＣ２−ＣＧ５である、請求項４に記載のプラスミドベクター。
８．一本鎖ＤＮＡをパッケージ化するファージ複製源を更に含んでなり、その源が真核生物プロモーター及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターと同方向又は反対方向であり、かつ、上記源が上記真核生物プロモーター内に存在するものである、請求項４に記載のプラスミドベクター。
９．ファージ複製源がＦ１複製源である、請求項８に記載のプラスミドベクター。
１０．ファージ複製源が真核生物プロモーターと同方向である、請求項８に記載のプラスミドベクター。
１１．図６に示されたｐＬＨＣ２−ＣＧ６である、請求項１０に記載のプラスミド。
１２．真核性発現ベクターであって、ｉ）時計回り方向の真核生物プロモーター；ｉｉ）時計回り方向であって上記真核生物プロモーターの下流に存在する第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと、ｉｉｉ）時計回り方向で真核性タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ここで、上記第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及び上記ＤＮＡ配列はデオキシシチジレート・デオキシグアニジレート（ｄＣ−ｄＧ）配列を介して作働的に結合されていると、ｉｖ）反時計回り方向の第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーター（ここで、上記ＤＮＡ配列及び上記第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーターはデオキシアデニレートーデオキシチミジレート（ｄＡ −ｄＴ）配列を介して作働的に結合されている）と、ｖ）上記第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及び上記ｄＡ−ｄＴ配列に作働的に結合された時計回り方向のポリアデニル化シグナルとを含んでなり、；少くとも６塩基対からなる第一制限部位が上記第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及び上記ｄＣ−ｄＧ配列の間に存在し、少くとも６塩基対からなる第二制限部位が上記第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーター及び上記ｄＡ−ｄＴ配列の間に存在し、上記第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターから開始されるＲＮＡ転写物がセンス転写物で、上記第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーターから開始されるＲＮＡ転写物がアンチセンス転写物であり、そして上記第一制限部位及び上記第二制限部位が異なるものであることを特徴とする、真核性発現ベクター。
１３．真核性プロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
１４．第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
１５．第二バクテリオファージポリメラーゼプロモーターがＳＰ６プロモーターである、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
１６．ｄＣ−ｄＧ配列が約１０〜１５塩基対である、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
１７．ｄＡ−ｄＴ配列が約４０〜６０塩基対である、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
１８．ｄＡ−ｄＴ配列が４５〜５０塩基対である、請求項１７に記載の真核性発現ベクター。
１９．一本鎖ＤＮＡをパッケージ化するファージ複製源を更に含んでなり、その源が真核生物プロモーター及び第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと同方向又は反対方向であり、上記源が上記真核生物プロモーター内に存在するものである、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
２０．ファージ複製源がＦ１複製源である、請求項１９に記載の真核性発現ベクター。
２１．ファージ複製源が真核生物ベクターと同方向である、請求項１９に記載の真核性発現ベクター。
２２．図３に示されたＥＢＯ−ｐＬＨＣ２（ＦＩＡ）ｃＤ−Ｘである、請求項２１に記載の真核性発現ベクター。
２３．ｉ）真核細胞でエピソーム複製を行える配列と、ｉｉ）真核生物選択マーカー遺伝子とを更に含んでなり、上記配列（ｉ）が真核生物プロモーター及び第一バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと同方向であり、かつ、上記配列及び上記マーカー遺伝子（ｉｉ）が上記真核生物プロモーター内に存在するものである、請求項１２に記載の真核性発現ベクター。
２４．配列（ｉ）がエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス複製源及びエプスタイン−バールウイルス核抗原遺伝子を含んでなる、請求項２３に記載の真核性発現ベクター。
２５．マーカー遺伝子がヒグロマイシンＢである、請求項２３に記載の真核性発現ベクター。
２６．その発現が薬物処理で影響受ける真核細胞中の遺伝子をクローニングする方法であって、ｉ）細胞群からの真核細胞の第一群を希有遺伝子の発現を誘導する薬剤で処理する；ｉｉ）上記第一細胞のメッセンジャ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが請求項１２に記載された真核性発現ベクターで発現されるように第一ｃＤＮＡライブラリーを作製する；ｉｉｉ）細胞の第二未処理群のメッセンジャ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが請求項１２に記載された真核性発現ベクターで発現されるように第二ｃＤＮＡライブラリーを作製する；ｉｖ）上記第一ｃＤＮＡライブラリーを直鎖化する；ｖ）第一群のＲＮＡを得るため放射能標識されたヌクレオチドの存在下で上記発現ベクターのポリメラーゼプロモーターの一方に特異的なポリメラーゼで上記第一ライブラリーをインビトロ処理する；ｖｉ）上記第二ｃＤＮＡライブラリーを直鎖化する；ｖｉｉ）第二群ＲＮＡを得るため上記真核性発現ベクターの上記ポリメラーゼプロモーターの他方に特異的な第二ポリメラーゼで上記第二ライブラリーをインビトロ処理する；ｖｉｉｉ）前記工程（ｖｉｉ）で産生された上記第二群のＲＮＡをフォドピオテニル化する；ｉｘ）相補的ＲＮＡ配列が対をなして二本鎖ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成できるような条件下で、上記第一群のＲＮＡを上記第二群のＲＮＡと接触させる；ｘ）前記工程（ｉｘ）の上記二本鎖ハイブリッドを放射能標識一本鎖ＲＮＡから分離する；及びｘｉ）前記工程（ｘ）からの上記放射能標識一本鎖ＲＮＡで上記第一ライブラリーをスクリーニングし、それにより発現が薬物処理により影響される上記遺伝子を単離する；工程を含んでなる方法。
２７．分離がストレプトアビジン−アガロースクロマトグラフィーにより行なわれる、請求項２６に記載の方法。
２８．減算化ｃＤＮＡライブラリーの構築方法でむって、ｉ）細胞群からの真核細胞の第一群を希有遺伝子の発現を誘導する薬剤で処理する；ｉｉ）前記工程（ｉ）の上記処理細胞のメッセンジャ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが請求項１９に記載された真核性発現ベクターで発現されるように第一ｃＤＮＡライブラリーを作製する；ｉｉｉ）細胞の第二未処理群のメッセンジャ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが請求項１９に記載された真核性発現ベクターで発現されるように第二ｃＤＮＡライブラリーを作製する；ｉｖ）上記発現ベクターの上記ファージミド複製源の使用により上記第一ライブラリーから一本鎖ＤＮＡを得る；ｖ）上記第二ｃＤＮＡライブラリーを直鎖化する；ｖｉ）ＲＮＡ群を得るため上記ファージ複製源と反対方向である上記真核性発現ベクターのバクテリオファージポリメラーゼプロモーターに特異的なポリメラーゼで上記第二ライブラリーをインビトロ処理する；ｖｉｉ）前記工程（ｖｉ）で産生された上記ＲＮＡをフすドピオテニル化する；ｖｉｉｉ）相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ配列が対をなして二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成できるような条件下で上記一本鎖ＤＮＡ及び上記群のＲＮＡを接触させる；ｉｘ）前記工程（ｖｉｉｉ）の上記二本鎖ハイブリッドを分離し、それにより減算化群一本鎖ＤＮＡを単離する；ｘ）二本鎖ＤＮＡが上記減算化一本鎖ＤＮＡから作製されるような条件下で前記工程（ｉｘ）からの上記減算化一本鎖ＤＮＡを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片と上記真核生物発現ベクターのセグメントに相補的なオリゴデオキシヌクレオチドプライマーで処理する；及びｘｉ）適切な宿主細菌をステップ（ｘ）で産生された上記二本鎖ＤＮＡで形質転換し、それにより減算化ｃＤＮＡライブラリーを得る；工程を含んでなる方法。
２９．分離がストレプトアビジン−アガロースクロマトグラフィーにより行なわれる、請求項２８に記載の方法。
３０．産物が細胞増殖を阻害する真核生物遺伝子の同定方法であって、ｉ）細胞群からの真核細胞の第一群を増殖阻害遺伝子の発現を誘導する薬剤で処理する；ｉｉ）前記工程（ｉ）の上記処理細胞のメッセンジャ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが請求項１９に記載された真核性発現ベクターで発現されるように第一ｃＤＮＡライブラリーを作製する；ｉｉｉ）細胞の第二未処理群のメッセンジャ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡが請求項１９に記載された真核性発現ベクターで発現されるように第二ｃＤＮＡライブラリーを作製する；ｉｖ）上記発現ベクターの上記ファージミド複製源の使用により上記第一ライブラリーから一本鎖ＤＮＡを得る；ｖ）上記第二ｃＰＮＡライブラリーを直鎖化する；ｖｉ）ＲＮＡ群を得るため上記ファージ複製源と反対方向である上記真核生物発現ベクターのバクテリオファージポリメラーゼブロモ−ターに特異的なポリメラーゼで上記第二ライブラリーをインビトロ処理する；ｖｉｉ）前記工程（ｖｉ）で産生された上記ＲＮＡをフオトビオチニル化する；ｖｉｉｉ）相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ配列が対をなして二本領ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成できるような条件下で上記一本鎖ＤＮＡ及び上記群のＲＮＡを接触させる；ｉｘ）前記工程（ｖｉｉｉ）の上記二本鎖ハイブリッドを分離し、それにより減算化群一本鎖ＤＮＡを単離する；ｘ）二本鎖ＤＮＡが上記減算化一本鎖ＤＮＡから作製されるような条件下で前記工程（ｉｘ）からの上記減算化一本鎖ＤＮＡを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片と上記真核生物発現ベクターのセグメントに相補的なオリゴデオキシヌクレオチドプライマーで処理する；灯）真核細胞でエピソーム複製を行える配列で上記ファージ複製源を減算する；ｘｉｉ）上記薬剤との処理で増殖阻害された真核細胞を得る；ｘｉｉｉ）前記工程（ｘｉ）からの上記二本鎖ＤＮＡと、産物が上記真核性発現ベクターの上記第二プロモーターに特異的なバクテリオファージポリメラーゼ遺伝子、核標的配列及び選択マーカーを含んでなる真核性発現ベクターとで上記増殖阻害真核細胞をトランスフェクトする；ｘｉｖ）増殖細胞を単離する；及びｘｖ）上記増殖細胞からエピソーム複製プラスミドを単離する；工程を含んでなる方法。
３１．減算ｃＤＮＡライブラリーの作製の使用に適したキットであって、ａ）第一プラスミドベクターであって、ｉ）ポリアデニル化シグナルと；ｉｉ）バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと；及びｉｉｉ）各々少くとも６塩基対からなる少くとも２つの異なる制限酵素部位とを含んでなり；上記ポリアデニル化シグナルが時計回り方向で、上記プロモーターが反時計回り方向であり、上記プロモーターが上記ポリアデニル化シグナル及び上記制限酵素部位の間に存在し、上記制限酵素部位が上記プロモーターの下流にあり、そして上記ポリアデニル化シグナル、上記プロモーター及び上記制限酵素部位が実質上互いに隣接しているものと、ｂ）第二プラスミドベクターであって、ｉ）真核生物プロモーターと；ｉｉ）バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと；ｉｉｉ）少くとも６塩基対からなる希有制限部位と；ｉｖ）切断で３突出末端を残すプラスミドに特有の制限部位とを含んでなり；上記真核生物プロモーター及び上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが同じ反時計回り方向であり、かつ、上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが上記真核生物プロモーターの下流にあり、そして上記希有制限部位が上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの下流にあり、かつ、上記特有の制限部位が上記希有制限部位の下流にあるものと；ｃ）第三プラスミドベクターであって、ｉ）真核生物プロモーターと；ｉｉ）バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと；ｉｉｉ）少くとも６塩基対からなる希有制限部位と；ｉｖ）切断で３突出末端を残すプラスミドに特有の制限部位と；ｖ）一本鎖ＤＮＡをパッケージ化するファージ複製源（ここで、上記源は上記真核生物プロモーター及び上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターと同方向又は反対方向であり、上記源は上記真核生物プロモーター内に存在する）とを含んでなり；上記真核生物プロモーター及び上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが同じ反時計回り方向であり、かつ、上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが上記真核生物プロモーターの下流にあり、そして上記希有制限部位が上記バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの下流にあり、上記特有の制限部位が上記希有制限部位の下流にあるものと、；並びにｄ）ｃＤＮＡライブラリーを作製する上で必要な試薬；とを含んでなるキット。