JPH05506718A

JPH05506718A - 液相免疫診断アッセイ

Info

Publication number: JPH05506718A
Application number: JP91507837A
Authority: JP
Inventors: クレモンズ，ロジヤー・エム
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・フロリダ
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2015-04-10
Also published as: DE69130217D1; JP3032293B2; US5637473A; WO1991015767A1; CA2079891A1; EP0524249A4; EP0524249B1; AU658823B2; AU7686591A; EP0524249A1; DE69130217T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｙ遍１本発明は、液体（ｆｌｕｉｄ）中のアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）の存在を調べるための免疫診断アッセイ方法で有用な試薬、この新規試薬の製造方法、この新規試薬を用いる免疫診断方法、並びに前記アッセイ方法を実施するためのキットに関する。

生物学的液体中の物質の存在を調べるためのエンザイムイムノアッセイは既に知られている。この種の方法の１つは、アッセイすべき抗原と酵素とからなる結合体（ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅ）を形成する“ＥＭＩＴ”ホモジーニアスエンザイムイムノアッセイである。前記結合体が適当な抗体と結合すると酵素の活性は低下する。これに対し、前記結合体ではなく非結合抗原が液体試料中に存在していれば、酵素の活性は存在する非結合抗原の量に比例して増加する。しかしながら、このＥＭＩＴ法は小さいハプテンの使用を必要とするため、大きい分子のアッセイには適していない。

ホモジーニアスエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）と称する別の方法では、プレートのような固相支持体に抗原を吸着させることによりこの支持体を感作する０次いで溶液状の検査抗体を加え、その後リガンドを加える。このリガンドは通常、結合抗体に対して特異的な分子に結合した酵素である。最後に、リガンドの酵素部分の存在下で着色最終産生物を生成せしめる色原体（ｅｈｒｏｍｏ−ｇｅｎ）を加える。所定時間経過後に測定した溶液の光学密度は存在する酵素の量に比例し、従って検査抗体の量に比例する。

ＥＬＩ　ＳＡ法は感度はかなり高いが、固体支持体を使用しなければならないという大きな欠点を有する。固体支持体を使用すると、支持体の感作の後で洗浄ステップが必要であると共に、検査抗体及びリガンドをそれぞれ添加しなければならない、また、総てのステップを連続的に実施しなければならない、従って、典型的ＥＬＩＳＡの所要時間は約２〜６時間である。更に、ＥＬＩＳＡの適切な実施には、アッセイの性質に関して知識のある人員が必要とされる。加えて、タンパク質のような大きい抗原の酵素結合体の活性を調節する（−ｏｄｕｌａｔｅ）のは困難であることが判明した。

エンザイムイムノチャネリングアッセイ（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎ。

ｃｈａｎｎｅｌｉｎ４　ａｓｓａｙ、Ｅ　ｒ　ＣＡ　）と称する方法は、酵素活性の調節という問題を回避するために直接的抗原−杭木結合を使用する。この場合は、成る酵素の生成物が次の酵素の基質として機能する多酵素複合体（ｍｕｌｔｉｅｎｚ）＋ｎｅ　ｃｏｓ＋ｐｌｅｘ）が形成される。生成物はバルク溶液（ｂｕｌｋ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）中に消散する前に第２の酵素と相互作用し得る。

このようにして、第１の生成物が第２の酵素に「チャネリング」される。

ビーズ又はプレートのような固体支持体を必要とするＥＩＣＡ法は、ＥＬＩＳＡと顕似の欠点を有する。

ＥＩＣＡは固体支持体なしでも実施できるが、ＥＩＣＡを液体に適合させることは難しい、この方法を実施するためには通常アッセイすべき物質が、比較的接近した２つのエピトープを含んでいなければならない、このような近接性はチャネリングに必要な微小環境　゛　°　を提供する。極めて大きい分子が有用なエピト−１を２つしか有しておらず且つこれらのエピトープがかなり離開していると、必要な微小環境の形成が不可能となり得る。また、ＥｒＣＡ法は各エピトープ毎に別個の特異的抗体を必要とする。６断上重要である可能性のある分子の中には別個の有用エピトープを２つ備えていないものもあるため、２つの抗体の間で同一エピトープに対する競合が生じ得る。このような条件ではＥＩＣＡ法を実施するのは極めて難しい。

米国特許第４，６８７，７３５号に開示されているチャネリング結合アッセイ（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ　ｂｉｎｄｉＢ　ａｓｓａｙ）は、アッセイの開始時にプレート、ビーズ又は他の一般的固体支持体と使用せずに液体媒体中で実施される。しかしながらこの先行技術の方法では、信号発生システムの酵素の１つをポリマー凝集体（ｐｏｌｙｖｅｒｉｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅ）に含ませてその場で固体支持体を形成する結合系が形成される。標準的ＥＩＣＡの場合と同様に、アナライトは別個のエピトープを少なくとも２つ有していなければならない。

１に１１そこで本発明は、目的の１つとして、真の液相免疫診断アッセイ（１ｉｑｕｉｄ −ｐｈａｓｅ　ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｓｓａｙ＋ＬＩＤ＾）、即ち固体支持体又は洗浄ステップを必要とせずに完全に液相中で実施できるアッセイのための試薬を提供する。

本発明は別の目的として、複数の抗体を必要としない、又はアナライト上に複数の別個の結合部位が存在することを必要としない試薬を提供する。

本発明は更に別の目的として、大きな感度と選択性とを示す試薬を提供する。

本発明は、前述のような新規の試薬の製造方法を提供することも目的とする。

本発明は更に、前記試薬を使用する液相免疫診断アッセイ方法も提供する。

本発明は、ＬＩＤＡ法を実施するためのキットも提供する。

以上の目的を達成するために、本発明ではまず、第１の酵素と、第２の酵素と、アナライトと結合して複合体を形成できる第１物質であって前記第１及び第２の酵素の一方に結合する物質と、残りの酵素に結合する複合体結合物質とを含む液相免疫診断アッセイ（ＬＩＤＡ）用の試薬を実現した。第１の酵素は、第１の酵素の基質の他に、この第１の基質の他の任意の必要な基質と相互作用して第２の酵素の基質を生成することができ、第２＃素も、前述のように生成された基質の他に、任意の別の必要な基質と相互作用することができ、前記相互作用のうち第２の相互作用の生起が検出可能である０本発明の新規の試薬は、好ましい実施態様では、第１の酵素によって生成された基質を不活性化することができるスカベンジャー物質をも含む、この試薬は液体又は固体の形態を有し得る。

１　本発明では前記試薬の製造方法も提供する。この方法は、試薬の第１及び第２の酵素のうち一方の酵素を第１物質と結合させるステップ、残りの酵素を酸化し、次いで酸化した酵素を複合体結合物質と反応させることにより残りの酵素を複合体結合物質に結合させるステップ、並びに前記２つの結合体を組合わせるステップを含む。

）　本発明では更に、液体、特に生物学的液体中のアナライ坊　トの存在を調べるアッセイ方法であって、アナライトと反応する前述のような試薬を用意するステップと、この試薬ｉ　を、前記液体と、前記試薬の第１の酵素の基質並びに任意の必要な別の第１の酵素の基質と、第１の酵素によって生成された基質並びに任意の必要な別の第２の酵素の基質と混ぜ合わせるステップとを含む方法を提供する。

本発明では更に、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法であって、アナライトを含んでいる疑いのある試料中に存在する液体に溶解し得且つアナライトと反応する前述のような固体試薬を用意するステップと、この固体試薬を試料に適用するステップとを含む方法も提供する。

本発明では、ＬＩＤＡ法を実施するためのキットも提供する。このキットは、（ａ）目的のアナライトと反応する前述のような試薬と、（ｂ）試薬の第１及び第２の酵素の基質を任意の必要な別の基質と共に含む溶液と、（ｃ）試薬を液体及び溶液と接触させるための手段とを、前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなる。

本発明ではまた、ＬＩＤＡ法な実施するための診断装置も提供する。この装置は、支持体と、前述のような固体試薬と、それぞれアナライト及びアナライト担持液相に対して透過性の膜（ｍｅｓｉｂｒａｏｅ）とを含む、この診断装置を用いるＬＩＤＡ法を実施するためのキットも提供する。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、当業者には以下の詳細な説明から明らかであろう。但し、以下の詳細な説明及び特定実施例は本発明の好ましい実施態様を示すものであって、本発明を限定するものではないと理解されたい。

本発明はその範囲を逸脱することなく様々な変形が可能であり、これらの変形は総て本発明に含まれる。特に説明がない限り、以下の説明で引用されている文献の内容は参考として本明細書に包含される。

パ　の　゛　ｔ　・本発明は添付図面を参照することによってより容易に理解されよう。

添付図面中、第１図は本発明のＬＩＤＡ法の反応を簡単に示す説明図である。

第２図は本発明の診断手段の断面図である。

い　態　の；　ｔ　＝特に説明がない限り、以下に引用されている文献は本明細書に参考として包含される。

本発明は、液体、特に生物学的液体中の特定アナライト、例えば抗原又は抗体の存在を簡単且つ迅速に検出する方法で有用な試薬を提供する。この試薬の複合体結合物質はスカベンジャーと共に、アナライトの存在を特異的に検出する二酵素（ｄｕａｌ−ｅｎｚｙ＋ｓｅ）システムを媒介（ｍｅｄｉａｔｅ）する。

本発明の詳細な説明及び請求の範囲で使用されている用語の定義は以下の通りである。

アナライトーーアッセイの対象となる化合物である。アナライトは小さいハブテン分子、大きい高分子又は診断的に有意な他の任意の分子であり得る。アナライトは特に、抗原、抗体、ホルモン、薬物、感染性疾患ベクター、細胞膜タンパク質フラグメント又は受容体、例えば細胞に由来したものか、もしくはフラグメント化細胞マトリクス由来の可溶性受容体である、ＩＬ−１もしくは神経成長因子の受容体であり得る。

第１物質（ｆｉｒｓｔ　ａｇｅｎｔ）−一アナライトとの相補結合対（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｉｒ）を形成する分子又は化合物。

この第１物質は、特定アナライトに応じて、例えば抗体、抗原であるか、又は適当なハブテンに結合した、従って複合体の形成につながる免疫応答を誘起することができる合成化合物、例えば薬物であり得る。

抗体−一完全抗体、抗体フラグメント又はサブフラグメント、抗体は任意のクラスの完全イムノグロブリン（Ｉｇ（：）、例えば１．に、　ＩｇＭ、Ｉｇ＾、ＩｇＤ、■ｇＥ又はフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆｉｂ’、Ｆａｂ等であり得る。抗体は更に、非ヒト由来源、例えばマウス、ウマ、ヤギ又はウサギに由来したものであり得る。抗体はまた、任意のイムノグロブリン、又は天然、合成もしくは遺伝子工学で製造したタンパク質てあって、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように機能する任意のタンパク質であり得る。

抗体はまた、特定のイディオタイプ抗体のアッセイでは、抗イデイオタイプ抗体であり得る。

抗原−一免疫システムによって認識され、免疫応答を誘起する分子。

複合体結合物質−一アナライトと第１物質とによって形成された複合体には選択的に結合するが、単離状態のアナライト及び第１物質には結合しない分子又は化合物、適当な複合体結合物質類としては特に、複合体形成時の第１物質及び／又はアナライトのコンフォーメーションの変化に起因して前述のような複合体に選択的に結合する総ての化合物が挙げられる。

結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）　Ｌ　Ｉ　Ｄ　Ａ試薬（ＣＬｒ）−一複合体結合物質を第１の酵素又は第２の酵素のいずれかに結合することによって形成した化合物。

基質−一酵素の作用を受ける物質、基質はＨ２Ｏ又は１Ｉ２０□のような無機分子、グルコース又はタンパク質のような有機分子、ＡＴＰのような分子等であり得る。

スカベンジャー−一第１の酵素によって生成された基質と作用し合って、その基質が第２の酵素と相互作用できないようにすることができる分子又は化合物、スカベンジャーは、例えば開裂、酸化又は還元によって基質を破壊するものが好ましい。

液体（ｆｌｕｉｄ）−−アナライトを含んでいる疑いがある任意の液体。この液体は、生物学的液体又は生理学的液体、例えば血液、血清、尿、涙、唾液、汗、排泄物又は他の身体分泌物であり得る。この液体はまた、細胞溶解物、組織培養物等のような細胞物質を含む液体であり得る。この液体は、水、廃水流、製造処理液等でもあり得る。

本発明の試薬は二酵素システムを構成する第１及び第２の酵素を含む、第１の酵素と基質との相互作用、そして必要であれば更に１種類以上の別の基質との相互作用は、第２の酵素の基質として機能する分子又は化合物を生成する６第２の酵素は、任意の必要な別の基質の存在下で前述の生成された基質と相互作用して検出可能な出力（ｏｕｔｐｕｔ）を発生する。出力信号はく基質による変色の測定又は着色溶液の光字密度の測定により）比色的に検出するか、（基質による光子の放出又は吸収の測定により）電磁的に検出するか、又は他の任意の所望の方法、例えば電気化学的方法、熱的方法、又は比濁分析によって検出し得る。

本発明の試薬における結合酵素反応には広範囲の酵素が有用である。二酵素システムを選択する上で考慮すべきファクターには、酵素の安定性、液体試料中の酵素もしくは基質の存在、化学的修飾に対する８度、液体のｐＨ、イオン強度プロフィル及びコストがある。例えば、ペルオキシダーゼを含む二酵素システムは、それ自体がペルオキシダーゼ活性を有する抗原のアッセイでは使用しない方がよい。本発明の新規の試薬で有用な酵素対の非限定的具体例としては、米国特許第４，２７５，１４９号の表ＩＶ−ＶＩＩに記載の酵素対が挙げられる。

本発明で使用するのに適した二酵素システムは、例えグルコースオキシダーゼ／ホースラディツシュペルオキシダーゼシステムである。第１の酵素であるグルコースオキシダーゼは第１の基質であるグルコースとの相互作用によって過酸化水素を発生させる。この過酸化水素はホースラディツシュペルオキシダーゼの基質として機能し、ホースラディツシュペルオキシダーゼは適当な別のペルオキシダーゼ基質との相互作用により、検出可能な出力信号として変色を生起させる。オルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２．２−アジノージ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−６）ジアンモニウム塩（ΔＢＴＳ）又は３．３’　、５，５°−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のような化合物は［１２０□と共にペルオキシダーゼ基質として有用である。これらの及び他の適当なベルオキシダ−ゼ基質は、Ｖｏｌｌｅｒら、ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｈａｐｔｅｒ　１７に記述されている。

他の好ましいシステムは、選択したキナーゼと対応するホスフェート基質とを使用するキナーゼ／ルシフェラーゼである。このようなシステムの１つでは、第１の酵素がクレアチンキナーゼであり、基質がクレアチンホスフェート及びＡＤＰである。クレアチンキナーゼは前記２つの基質と相互作用してＡＴＰを生成する。生成されたＡＴＰはルンフェリン及び０２と共に、第２の酵素であるルシフェラーゼの基質として機能する。第２の相互作用は、検出可能な信号として光子を発生させる。ピルビン酸キナーゼを、対応する基質としてのホスホエノールピルベートと共に使用することもできる。

他の好ましいシステムとしては、スカベンジャーとしてのホスホフルクトキナーゼもしくはホスホグルコースイソメラーゼ及び検出可能な信号としてのＮＡＤＰＨを含むヘキソキナーゼ／Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ、並びにリボアミドデヒドロゲナーゼをスカベンジャーとして含むジアホラーゼ／デヒドロゲナーゼが挙げられる。後者のシステムでは、種々のデヒドロゲナーゼな対応する酸陰イオン基質（例えば乳酸デヒドロゲナーゼ／ラクテート）と共に使用し得る。更に、種々の染料、例えばメチルブルー又は２，６−シクロロフエノールインドフエノールをジアホラーゼ基質として使用し、検出可能な信号として変色を生起させることもできる。

前述の反応は表１に詳細に示す。

本発明の試薬は更に、存在検出の対象となる特定アナライトと反応する第１物質を含む、好ましい実施態様では、この第１物貿とアナライトとが相補的抗体／抗原対を形成する。その場合は第１物質が、対応する抗原又は抗体のいずれがアッセイの対象であるかに応じて、抗体又は抗原であり得る。好ましい抗体／抗原対は、下記の抗原に対する抗体を含む：　ＨＩＶ−１：７アタンパク質抗原（ｇａｇ：ｐ１７、ｐ１８、ｐ２４、ｐ５５）及びエンベロープタンパク質（ｇｐ４１、ｇ　ｐ　１２０．ｇ　ｐ　１６０）　；梅毒、淋病、クラミジア及びヘルペス抗原；ウィルス性肝炎抗原；サイトメガロウィルス抗原；ヒト絨毛注性ｍ剰激ホルモン、フェノバルビタール及びジギタリスのような治療薬；並びにコカイン及びＴＨＣのような乱用性薬物０診断上重要であり得る他のアナライトは曜　米国特許第４，２７５，１４９号に記載されている。

選択した二酵素システムの第１又は第２の酵素は本発明の試薬の第１物質に結合し得る。生成される酵素結合第１物質がモノマーであるようにするためには、第１物質を適当な酵素に結合するのに使用する結合方法の選択に注意が必要である。特に、第１物質が抗体の場合には、使用する結合方法を抗体の凝集（ａ８ｇｒｅｇａｔ　１ｏｎ）が起こらないように選択しなければならない。抗体凝集が起こると、複合体結合物質がアナライト−第１物質複合体だけに結合するのではなく、形成された凝集体に結合して偽陽性信号を発生させることになる。好ましい結合方法としては、アビジン−ビオチン反応、並びにＳ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　（Ｐｉｅｒｃｅ社）のような架橋剤の使用が挙げられる。ビオチニル化抗体は特に有用である。

残りの酵素は、後で詳述する複合体結合物質に結合する。

第１物質とアナライトとの反応は複合体を形成し、この複合体に本発明の試薬の複合体結合物質が選択的に結合する。化合物ＲｈＣは好ましい複合体結合物質である。

ＲｈＣの特徴及び製造方法は米（Ｅｌ特許第４，７８３，５２５号に記載されている。使用し得る別の複合体結合物質は第１補体成分ＣＩのＣ１ｑサブユニツトである。Ｃ１ｑの製造は米国特許第４，５９５，６５４号に記述されている。単離状態の第１物質又はアナライトのいずれにも結合せずに第１物質−アナライト複合体に選択的に結合する物質はいずれも本発明の試薬で使用するのに適していると考えられる。

第１物質に結合しない酵素は複合体結合物質と結合して結合ＬＩＤＡ試薬（ＣＬｒ）を形成する。非限定的具体例として、第１の酵素は複合体結合物質に結合し、第２の酵素は第１物質に結合する。

ＣＬｒを製造すべく複合体結合物質を選択した酵素と結合させる場合には注意が必要である。好ましくは、特に過ヨウ素酸法を用いて酵素を酸化させ、その後で複合体結合物質に結合させる。複合体結合物質ではなく酵素をこのように処理することは、複合体結合物質がＲｈＣの場合には特に好ましい、なぜなら、ＲｈＣを例えば強イオン性緩衝液のような特定の媒体中で処理すると活性が失われるからである。この失活の理由は判明してはいないが、ＲｈＣがイオン性ダイマーであるため、そのままではイオン性Ｍ衝液で処理した時に構造が破壊され且つ官能基が失われるからだと考えられる。この問題は、複合体結合物質ではなく酵素を処理した場合には起こらない。

ＣＬｒは、ワンステップグルタルアルデヒド法を用いて酵素と複合体結合物質とを結合することにより製造することもできる。この方法は場合によっては好ましいこともあるが、効率は低い。

本発明の試薬はスカベンジャーと共に、又はスカベンジャーなしで使用し得る。

スカベンジャーを含む試薬を選択するか、又はスカベンジャーを含まない試薬を選択するかは、アッセイの実施条件、特定酵素の入手可能性、コスト、時間的拘束等に依存する。

本発明の新規試薬及びアッセイの前記２種類の実施態様、即ちスカベンジャーを用いる実施態様又は用いない実施態様はどちらもバルク液体コンパートメント化（ｂｕｌｋ　ｆｌｕｉｄｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ　１ｚａＬｉｏｎ）の概念を利用する。アナライトが存在しない溶液部分では（同じ理由から、アナライトを含んでいない試料でも）アナライト−第１物質複合体は形成されない、溶液中に複合体が存在しないためＣＬｒは結合せず、従って第１及び第２の酵素は接近しない、このような条件では、２つの酵素の必要な基質の存在下で、結合第１酵素が反応して第２の酵素に必要な基質を生成する。この基質は第２の酵素まで拡散し、その結果第２の酵素が出力信号を発生させる。信号の発生は速度定数に、によって特徴付けられる速度で起こる。

一方、アナライトが存在する領域では、アナライトが第１物質との複合体を迅速に形成する。この複合体の形成とほぼ同時に、ＣＬｒがこれに結合する。従って、第１及び第２の酵素は密に接触し合う、そこで、前述のように、第１の酵素が必要な基質の存在下で第２の酵素の基質な生成する。この基質は第２の酵素にチャネリングされ、その結果第２の酵素が出力信号を発生する。この場合は信号の発生が、より大きい速度定数に２によって特徴付けられる速度で起こる。

スカベンジャーを含まない新規試薬を本発明のＬＩＤＡ法で使用する場合には、２つの酵素の近接度に依存する二酵素システムの反応速度の差、即ちｋＩとに２との差を利用する。この場合に観察される検出可能な出力信号の発生の速度定数は、ｋｘ＝　（１ｘ）ｋｌ＋ｘｋ２である。

前記式中、Ｘは密に接触している酵素対のフラクションを表す、接触し合っている酵素のフラクションは、液体試料のアナライト濃度対第１物質濃度の比に等しい（前者の濃度が後者の濃度を超えることはないものとする）、その結果、Ｘ　 ”　ｎ　、Ｆ１］τとなる。ｎｌは、それぞれｉ＝Ａ及びＦＡの場合のアナライト及び第１物質のモル数を表す。従って、観察される速度定数はｋｘ＝に＋＋　［ｎＡＦ「；］　（ｋ２−に１）となる、この観察される速度定数はｎＡに比例する。従って、ｋｌ、に２及びｎＦＡがわかっていれば、ｋ３の測定からｎＡが得られる。ここで留意すべきこととして、この結果は、ｋｌがゼロではなく、ｋ、及びに２が互いに異なると共にに、とも異なる場合にしか有効ではない。

一方、本発明の新規の試薬を本発明のＬＩＤＡ法でスカベンジャーと共に使用する場合には、第１の酵素によって生成された基質が第２の酵素に到達する前にスカベンジャーがこの基質を不活性化する。従って、この場合は第１及び第２の酵素が接近し合っていない限り、検出可能な信号の出力は抑制される。換言すれば、スカベンジャーを使用すると前記分析における速度定数に、がゼロになる。しかしながら、アナライトが存在する場合には、複合体の形成とＣＬｒの結合とが逐次発生し、第１及び第２の酵素が接近し合う、そこで前述のように、必要な基質の存在下で、第１の酵素が第２の酵素に必要な基質を生成する。

このようにして第１の酵素により生成された化合物は、スカベンジャーがこれを不活性化できないうちに第２の酵素にチャネリングされる。その結果、第２の酵素が検出可能な出力信号を発生する。出力信号の強さを測定すればアナライトの量が決定される。この場合は、酵素活性の量が試料中のアナライト量に直接比例する。既知の濃度のアナライトを含む標準アッセイ媒体を調製すれば、出力信号の強さをアナライト濃度に合わせて較正できる。較正後は、観察される信号によってアナライト濃度を決定することができる。

スカベンジャーを用いずに本発明の試薬を調製した場合の利点は、この試薬に使用できる酵素対の範囲がより広くなるという点にある。潜在的に望ましい特定の酵素対と共に使用するための容易に入手できる又は経済的なスカベンジャーは存在し得ない、また、使用する酵素は２種類だけであるため、この試薬では３つの別個の化合物の相容性を最適化する必要はない、この実施態様は、ｋ２とに＋との差が大きい場合には特に有用である。好ましくは、アナライトを含んでいる試料を試薬と組合わせ、十分な時間にわたってインキュベートした後基質を加える。アナライトを加える前に第１の酵素の基質が存在していると、第１の酵素がその基質と作用し合ってこの基質を消失させ得る。また、試料自体に選択した酵素の基質が含まれていないことを確認する必要もある。

スカベンジャーを用いて本発明の試薬を調製した場合の利点は、アッセイ方法が全体的に簡略化されることにある。

スカベンジャーを使用すると、試料、試薬及び基質溶液を一度に混ぜ合わせることができ、インキュベーションステップが不要であり、基質消失の問題がない、また、試料溶液が第１及び第２の酵素の基質を含んでいないことを確認する必要もない、この実施態様では、ｋｌ及びに２が類似の大きさを有している場合の、ｎＡの不正確な測定という問題も回避される。また、スカベンジャーを使用すると、信号の強さが溶液中のアナライト量に確実に比例する。

スカベンジャーを用いる好ましい実施Ｒ様の具体例としては、カタラーゼをスカベンジャーとして使用し得るシステム、例えば、前述のグルコースオキシダーゼ／′ホースラディツシュペルオキシダーゼシステムが挙げられる。カタラーゼは、グルコースオキシダーゼによって生成された過酸化水素基質を水に変換することによって不活性化する。

過酸化水素を破壊する他の酵素もこの酵素システムと共に使用するのに適している。

本発明の新規の試薬は液体又は固体の形態で提供し得る。

液体形態の試薬は、試薬成分の液体キャリヤー、好ましくは水性キャリヤーをも含む、１種頭以上の補助溶剤も使用し得る。第１物質、ＣＬｒ並びに第１及び第２の酵素の基質は、スカベンジャーを使用する場合にはこのスカベンジャーと共に、同−溶液又は２種票以上の別個の溶液中で混ぜ合わせることができる。これら１種類以上の溶液の温度は約２０〜５６℃が好ましく、ｐＨは約７．１〜８．４が好ましい、感度を最適化するためのこれら溶液の試薬成分濃度の調整は、当業者によって容易に実施される。

本発明の新規試薬は固体形態でも提供し得る。好ましい実施態様では、第１物質、ＣＬｒ及び任意的なスカベンジャーを例えばスクロースで安定化し、次いで凍結乾燥する。

本発明の試薬の種々の成分は別個に又は任意の所望の組合わせで凍結乾燥し得る。凍結乾燥した試薬の成分は、本発明のアッセイを実施する前に、適当な液体キャリヤー中で再構成する。

別の実施態様では、任意に適当な基質も用いて、試薬を下記のような別の実施態様のＬＩＤＡ法（固体ＬＩＤＡ法）で使用するための固体形態で調製する。この固体試薬又は試薬／基質組合わせ体は、例えばマトリクス材料を試薬と任意的な１種頭以上の基質とを含む溶液中に浸漬し次いで乾燥することにより、湿潤性マトリクス中に分散させることができる。固体形態の試薬の製造中に反応が起こることのないように、溶液は２つの酵素の必要な基質を全部は含まないことが好ましい、特に好ましくは、第１の酵素の基質（又は１種類以上が必要な場合には前記基質の一方）を固体形態の試薬から省く、特定の用途における特定の酵素では、省いた基質が液体試料中に存在するため添加する必要はない１例えば、固体形態の本発明の試薬にはグルコースオキシダーゼを使用し得る。アッセイすべき液体が血液又は尿の場合には、この液体中に既に含まれているグルコースが必要な基質として機能する。他の用途では、省いた基質を試薬に添加しなければならない。

マトリクスは、綿、羊毛又はガラス繊維のような湿潤性成分からなり得、好ましくは、液体及び所望のアナライトは通すが＃胞破片等は通さない不活性多孔質膜の中に閉じ込める。適当な膜としては、ナイロン、ポリプロピレン及びポリカーボネートが挙げられる。この実施！ｇ、様では、試薬がスカベンジャーを含むのが好ましい。

本発明のＬＩＤＡ法の実施Ｒ様の１つでは、アナライトを含んでいる疑いのある液体を含む試料溶液を、第１及び第２の酵素の適当な基質と共に、試薬−一第１物質、ＣＬ　ｒ及び任意的なスカベンジャー　−−を含む溶液に加える。

アナライトの存在は信号の発生によって示される。

ＬＩＤＡ法の別の実施態様では、まず試料溶液を試薬に加える０次いで、インキュベーションステップの後で試薬／試料組合わせ体に基質を加える。別の好ましい実施態様では、液体試料並びに第１及び第２の酵素の基質の各々を試薬に逐次加える。更に別の好ましい実施態様では、液体、基質及び任意的スカベンジャーを混ぜ合わせ、得られた混合物を試薬に加える。この場合は、試薬にスカベンジャーを含ませない、他の組合わせも可能であり、それらは総て本発明の範囲内に含まれる。

本発明の固体ＬＩＤＡ法では、アッセイすべき試料、倒えば血液、尿又は排泄物に固体形態の試薬を導入する。試料は液相を含んでいなければならず、選択する固体試薬マトリクス材料はこの液体によって湿潤し得るものでなければならない、必要であれば、試料に１種類以上の基質を加える。試料中に存在する液相が試薬と作用し合う（即ち、乾燥試薬を溶解させる）と、前述の実施態様の場合と同様に、形成された溶液中で反応が生じる。この固体ＬＩＤＡ法の好ましい検出可能出力は変色である。この信号は質的（変色はアナライトの存在を示す）、又は量的（例えば、反射率の測定値はアナライトの量を示す）に判読が可能である。

ＬＩＤＡ法では、広範囲の物質の存在について多くの生物学的液体の定量アッセイを迅速に実施することができる。

本発明のＬＩＤＡ法を用いれば、アナライト濃度を１０−１２〜１０−”ｇ／ｌという低さまで検出することができる。約１０１ｇ７１以上の濃度はアッセイの前に希釈するのが好ましい。

この方法は自動化に特に適している。ＬＩＤＡは、現在ＥＭＩＴ検査に使用されている大部分の臨床分析機器、例えばＥｎｃｏｒｅ　ＩＩ　Ｓｙｓｔｅｍ　５ｐｅｅｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅｒｏｎｏ−Ｂａｋｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて実施できる。この方法はまた、Ｂａｋｅｒ　１．２．３．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ａｎａｌｙ −ｚｅｒのような分光光度計システムを用いて実施することもできる。この固体ＬＩＤＡ法は、反射率を測定するための分析機器、例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎを用いて実施し得る。

便利さのために、本発明の試薬は、所期の範囲のアッセイの感度が実質的に最適化されるように総ての成分を所与の割合で含むキットとして提供し得る０本発明の試薬は液体キャリヤー中に含ませた状態で提供するのが好ましいが、試薬の成分はユーザーによって適当な液体キャリヤー中で再構築される凍結乾燥状態で提供することもできる。このキットは更に、選択した二酵素システムの必要な基質の溶液、又はアッセイの前に再構成される凍結乾燥基質と、試薬を生物学的液体試料及び基質溶液に接触させるための手段とを含む、前記手段は、例えば使い捨て容器、バイアル、シリンジ等である。固体ＬＩＤＡ試薬はディツプスティックのような診断装置の形態で提供し得る。固体ＬＩＤＡ試薬は、液体又は固体（例えば凍結乾燥形態）であり得る別の必要な基質と共にキットに含ませ得る。

スカベンジャーを使用しない試薬の場合には、試薬の種々の成分の量を、アナライトが検出された時に試薬ブランク（ｒｅａｇｅｎｔ　ｂｌａｎｋ）即ちゼロ試料（ｚｅｒｏ　ｓａｍｐｌｅ）の２倍以上の反応速度が得られるように選択しなければならない。

本発明のＬＩＤＡ法は広範囲のアナライトの検出に有用である０本発明の方法の診断用途の具体例としては、エイズのような病気の感染状態のモニタリング（例えばＩ（ＩＶ抗原、■１及びＩｇＧの経時的レベルをモニターする）又はＢ型肝炎の怒染状態のモニタリング、薬物の治療効果の評価；乱用性薬物の存在の検出；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの存在の確認（妊娠検査）が挙げられる。

添付図面の第１図は、スカベンジャーを用いる本発明のアッセイの実施ｉ様の１つを示している。この実施態様では、本発明の試薬、第１及び第２酵素の基質並びにアナライトを含む液体試料を組合わせる。第１の酵素は複合体結合物質に結合して第２の酵素の基質を生成し、第２の酵素は第１物質に結合する。この第２の酵素が第１の酵素によって生成された基質の存在下で基質と作用し合うと、検出可能な出力信号を発生する反応が起こる。

第２図は本発明の診断装置を断面図で示している。ディツプスティック形態の診断装置１、固体ＬＩＤＡ試薬５を取付けたプラスチック製支持ストリップ３を含んでいる。前記固定ＬＩＤＡ試薬は、例えば綿、羊毛又はガラス繊維のような湿潤性マトリクスに選択したＬＩＤＡ試薬の成分と分散させ、任意に１種頭以上の酵素基質も分散させたものからなる。この試薬５は、支持ストリップ３と、やはり支持ストリップ３に取付けた膜７との間に閉じ込められている。使用時には、ディツプスティック１を試料中に挿入して試薬５及び膜７と試料中に浸漬させる。試料中に存在する液体が膜７に浸透して試薬５を湿潤させると、ＬＩＤＡ試薬の成分及びその中に分散している任意の基質が溶解する。必要であれば、別の必要な基質を試料に加える。その結果、アッセイすべきアナライトが存在していれば、ＬＩＤＡ法の酵素反応が生起する。

以下に本発明の非限定的実施例を挙げる。

１１爽１１選択した酵素に結合したＲｈＣを含むＣＬｒを下記のプロトコルに従って調製する。

（１）ヨ　、ム（ａ）ＡＰ−ＲｈＣ結合アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、０．３８ｍ１．１２．１ｍｇ／ｍｌ（タイプＶＩＩＩ−Ｔ、１２．１ｍｇ／ｍｌ；１３．１５８単位／　ｍ　Ｉ　、Ｓｉｇｍａ　Ｐ−６７７４）を４Ｘ１００μ＋アリコートで１００ｍ１ｘ４回交換のｐＨ４，０、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に対して室温で１時間透析する。靜かに撹拌しながらメタ過ヨウ素酸ナトリウム１９μｌ、０．４Ｍを加える。得られた溶液を暗所室温で３０分間インキュベートする。酸化ＡＰを４Ｘ１００μｌアリコートで、１００ｍ１ｘ３回交換めｐＨ４，０，１０ｍＭ酢酸ナトリウムＩＩＩ液に対して、暗所室温で１時間透析する。

ＲｈＣ１０，２５ｍ　ｌ、２０ｍｇ／ｍ　Ｉ　（ＭｅＤｏｎａｌｄ、Ｕ。

ｏｆ　Ｎｅｂｒａｓｋａ）を２Ｘ１２５μ＋アリコートで、１００ｍ１×３回交換のＯ，ＬＭホウ酸ナトリウムｗｌ衝液、０．ＩＭＮａＣｌ　（ｐＨ９，０）に対して室温で１時間透析する。

次いで、静かに撹拌しながらＲｈＣと酸化ＡＰとを４℃で混合し、暗所４℃で一晩インキユベートする。

撹拌下４℃でホウ水素化ナトリウム２．５ｍｇを加え、４℃で４時間インキュベートする。得られた生成物を、１００ｍ１Ｘ３回交換のｐＨ８，０，１０ｍＭトリス／）（ＣＩに対して４　”Ｃで一晩透析する。沈澱物を１５分間１５、ＯＯＯＸｇで分離し、Ｐ）［８，Ｏの冷１０ｍＭ）リス／ＨＣＩ　３Ｘ０．５ｍｌで洗浄し、最後に０．５ｍｌ、０．２５Ｍ）リス／ＨＣＩ、０．５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，０）に溶解し、４℃で貯蔵する。

（ｂ）Ｇｏ−ＲｈＣ結合グルコースオキシダーゼ（Ｇｏ）、２ｍｌ、５．３ｍｇ／ｍｌ（タイプＶ−Ｓ、５．３ｍｇ／ｍｌ　；　１１３０単位／ｍ　ｌ　、　Ｓｉｇｍａ　Ｇ−６８９１）を、Ｃｅｎｔｒｉｆｌｏ　ＣＦ−２５限外ｒ過コーン（＾＋＊１ｃｏｎ）を用いて１．２ｍｌに濃縮する。Ｇｏを５×２４０μｍアリコートで、１００ｍ１Ｘ４回交換の蒸留水（ｄ　ｉ　Ｈｘ　Ｏ）に対して透析する０次いで、新しく調製した１０ｍＭＩＪン酸ナトリウムｗＬＷｉ液（ｐＨ７，０）中０．１Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを０．３ｍｌ加える。この溶液を室温で２０分間インキュベートする０次いで、酸化ＧＯを５ｘ３００μｌアリコートで、１００ｍ１Ｘ４回交換のｐＨ４，０，１ｍＭ酢酸ナトリウムに対して室温で２時間透析する。

ＲｈＣ（０，２５ｍ１．２０ｍｇ／ｍ１　）を２Ｘ１２５μ！アリコートで１００ｍ１Ｘ４回交換の２０ｍＭホウ酸塩榎衝液、０．５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ９，０）に対して室温で２時間透析する。ＲｈＣ及び酸化Ｇｏを組合わせ、室温で２時間インキュベートする１次いで、蒸留水を用いて新しく調製した４ｍｇ／ｍｌのホウ水素化ナトリウムを１００μｍ加えることによりシッフ塩基を還元する。この溶液を４℃で２時間インキュベートする。得られた生成物を５ｘ３５０μｌアリコートで、１００ｍ１ｘ４回交換の１０ｍＭ）リス／ＨＣｌ−０，２５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，０）に対して透析する。

（ｃ）ＨＲＰ−ＲｈＣ結合ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、５ｍｇ（タイプＶ［、ＲＺ３．０１５１ｇ＋ｉａ　Ｐ８３７５）を１．２ｍｌの蒸留水に溶解する。ｐＨ７，０の１０ｍＭリン酸ナトツナトリウム中Ｍで新しく調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウムを０．３ｍｌ加える。この溶液を室温で２０分間インキュベートする。酸化ＨＲＰを、マイクロダイアライザー（Ｐｉｅｒｃｅ。

５ｅｒｉｅｓ　５００　Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｚｅｒ）を用いて、５Ｘ３００μ ｌアリコートで、１００ｍ１ｘ４回交換のｐＨ４，０，１ｍＭ酢酸ナトリウムに対して透析する。

ＲｈＣ（０，２５ｍ１．２０ｍｇ／ｍｌ）を２ｘ１２５μ！アリコートで１００ｍ１Ｘ４回交換の２０ｍＭホウ酸塩ＩＩ衝液、０．５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ９，０）に対して室温で２時間透析する。ＲｈＣ及び酸化ＨＲＰを混ぜ合わせ、室温で２時間インキュベートする１次いで、蒸留水を用いて新しく調製した４　ｍ　ｇ　／　ｍ　１ホウ水素化ナトリウムを１００μｍ加えることによりシッフ塩基を還元する。得られた溶液を４℃で２時間インキュベートする。得られた生成物を５ｘ３５０μｌアリコートで１００ｍ１Ｘ４回交換のｌｏｍＭ）リス／ＭＣＩ、０．２５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，０）に対して４℃で透析する。

（２）　ル　ル　ルーヒト　ム（ａ）Ｇｏ−ＲｈＣ結合（第１の方法）ＲｈＣ（０，２５ｍ１．２０ｍｇ／ｍｌ）を、マイクロダイアライザー（Ｐｉｅｒｃｅ、５ｅｒｉｅｓ　５００　Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｚｅｒ）を用いて、２Ｘ１２５μｌアリコートで、１００ｍ１ｘ４回交換の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．５Ｍ　ＮａＣＩ（ｐＨ７，２）に対して室温で２時間透析する。

グルコースオキシダーゼ、１．２６ｍ１．５．３ｍｇ／Ｓｉｇ＋ｓａ　ｇ−６８９１）を、マイクロダイアライザーを用いて、５Ｘ２５０μｌアリコートで、１００ｍ１Ｘ４回交換の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．５Ｍ　ＮａＣＩ（ｐＨ７，２）に対して室温で２時間透析する。ＧＯに、０．２９ｍ１の５０ｍＭリン酸カリウムＩＩ液、０．５ＭＮａＣＩ（ｐＨ７，２）及び１０μ＋の２５％グルタルアルデヒド（グルタルアルデヒド、５０％、ＥＭグレード、ＴｅｄＰｅｌｌａ、　Ｉｎｃ、１８４３２）を撹拌しながら加える。この混合物を室温で５０分間インキュベートする。

Ｒｈ　Ｃ及びＧｏ／グルタルアルデヒド溶液を合わせて室温で７５分間インキュベートする。この混合物を水浴で０℃に冷却する０次いｔ”、１００μ＋７７）２Ｍ）！Ｊス／ＨＣｌ、ｐＨ８，７を加え、得られた混合物を４℃で３０分間撹拌する。ホウ水素化ナトリウム３０ｍｇ／ｍｌを水冷蒸留水中で新しく調製し、これを０℃で１００μｌ加える。得られた混合物を０℃で２．５時間インキュベートする。最後に、得られた生成物を５Ｘ４００μｌアリコートで、１００ｍ１ ×４回交換の１０ｍＭ）リス／ＨＣＩ、０．２５ＭＮａＣｌ　（ｐＨ８，０）に対して４℃で一晩透析する。

（ｂ）Ｇｏ−ＲｈＣ結合（第２の方法）グルコースオキシダーゼ、１　ｍ　ｌ　、５．３ｍｇ／ｍ　！（タイプＶ−Ｓ、５．３ｍｇ／ｍ　Ｉ　；　１１３０単位／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ［；−６８９１）を、マイクロダイアライザー（Ｐｉｅｒｃｅ、５ｅｒｉｅｓ５００　Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｚｅｒ）を用いて、５Ｘ２００ μｌアリコートで１００ｍ１Ｘ３回交換の０．１Ｍリン酸ナトリウム＃１．ｇＩ液（ｐＨ６，８）に対して室温で２時間透析する。

ＲｈＣ（１ｍｌ、５．３ｍｇ／ｍｌ）を５Ｘ２００ｔｚｌアリコートで１００ｍ１Ｘ３回交換の１０ｍＭ）リス／ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）に対して室温で２時間透析する。沈澱物を１５秒問１５．ＯＯＯＸｇで分雛する０次いでペレットを、微小磁気撹拌千人りの５ｍｌビーカー内でｐＨ６，８の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中１ｍｌのＧ。

に再溶解する。静かに撹拌しながら、０．１５ｍ１の１％グルタルアルデヒド（２５％グルタルアルデヒド、Ｓｉｇｍａ　Ｇ−６２５７、非ＥＭグレード）を加える。この溶液を室温で２時間インキュベートする。得られた生成物を５ｘ２００μｌアリコートで、１００ｍ１Ｘ３回交換のｐＨ７，４，０、ＯＩＭ　ＰＢＳ（リン酸ｗＩ衝塩水）に対して４℃で一晩透析する。３０分間φ１５．ＯＯＯＸｇで綿状物質を完全に除去する。上清を４℃で貯蔵する。

ＲｈＣではな（Ｃ１ｑを含むＣＬｒも同様の方法で調製できる。

次いで第１物質（例えばＨＲＰ−Ａｂ、Ｇｏ−Ａｂ）を、アビジン−ビオチン法のような適当な方法を用いて例えばＨＲＰ又はＧｏを選択した抗体く例えばＩＩＩＶ　ｐ２４抗原に対する抗体）と結合させることにより調製する。

次いて、１ｏ〜１００ｃｍカラム（０，Ｄ、　０．５〜１．５”、Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）での液体クロマトグラフィーを用いてＣＬｒ及び酵素結合第１物質を精製する。カラムには、ＣＬｒ又は抗体（第１物質）を分離するためのセファロース６Ｂを詰める。溶離緩衝液はｐＨ８，０の０．２５Ｍ　ＮａＣ１中１０ｍＭトリスである。流速は１ｍｌ／分に設定する。

液体がフローセルを通過するのに伴って、ピークを２８０ｎＭてモニターする。

フラクションコレクターでピークを集め、第１のピークに対応するフラクションを全部プールして結合物質を表すものとする。非結合酵素及び抗体又は複合体結合物質を含む後続ピークをモニターし、廃棄する。

次いで酵素活性を調べる。マイクロプロティン法（Ｍｉｃｒｏ　ＢＣ＾アッセイ試薬キット、Ｐｉｅｒｃｅ）とＥｎｃｏｒｅ　ｌｌ５ｐｅｃｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅｒｏｎｏ−Ｂａｋｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とを用いて、精製した第１物質又はＣＬｒをタンパク質測定にかけ、標準的方法（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）で酵素活性を測定して、タンパク質１ｍｇ当たりの酵素比活性を決定する。

１月ＪＬＬリン酸［［ｒ（ＰＢ）溶液を液体キャリヤーとして調製する。ＰＢＳを３％ポリエチレングリコール６０００．０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．１％オボアルブミンと混合する。

ＰＢＳ溶液を第２の液体キャリヤーとして調製する。

２７ｍＭ　Ｐ＋０．１４Ｍ　ＮａＣｌに、８．２％のポリエチレングリコール６０００．０．１４％のＴｗｅｅｎ　２０及び０．２７％のオボアルブミンを加える。その結果、１０ｍＭＰＢＳ溶液が調製される。

１９０μｍのＰＢＳ溶液と１００．０μ１ｌ）ＨＲＰ−アビジン−ビオチン−Ａｂ　（０゜２７８ｍｇ／ｍｌ）と１０、μｌのＧｏ−ＲｈＣＣＬｒとを混ぜ合わせて、試薬を含む第１の溶液を調製する。これで３００μｌの試薬溶液が得られる。

ＰＢ溶液中１０ｍＭのＡＢＴＳと、２５０ｍＭのグルコースと１０．０Ｍｇ　／　ｍ　ｌのカタラーゼとを混ぜ合わせることにより、基質とスカベンジャーとを含む第２の溶液を調製する。第１の溶液を３００μｌ得るには２．５ｍｌの量で十分である。前記ＰＢ浴溶液使用は沈澱物の形成を補助し反応を促進するが、沈澱物の形成はアッセイの実施には必要ない。

液体容量は下記のように特定する／ａ）試料の容量＝３μｍｂ）希釈剤の容量（Ｈ２０）＝１０μｌＣ）第１の溶液の容量＝３０μｌｄ）第２の溶液の容量＝２１０μｍアッセイはＥｎｃｏｒｅ　５ｙｓｔｅ−ＩＩ（Ｅｎｃｏｒｅ　Ｐ２Ｏ００ｐｉｐｅｔｔｅｒ／Ｅｎｃｏｒｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて実施する。Ｅｎｃｏｒｅ　Ｐ２Ｏ００ｐｉｐｅｔ−ｔｅｒは試料又は標準（希釈剤を含む）及び第２の溶液を試料ウェル内に自動的に導入し、第１の溶液を試薬ウェル内に導入する０次いで、トランスファーディスクをＥｎｃｏｒｅ　ＩＩ内に配置する。試料／第２の溶液の混合物と第１の溶液とを混ぜ合わせ、スピンサイクルの始めにキュベ・ントに送る。

初期ブランキング期間の後、該反応混合物の光学密度を４０５ｎＭで経時的にモニターし、結果を形成された標準曲線と比較して試料のアナライト濃度を読み取る。

ｌ胆ｌよ試料、希釈剤及び第２の溶液は使用例１と同様である。

ＰＢＳ溶液中で３９６．０μｇ／ｍｌのＨＲＰ−アビジン−ビオチン−Ａｂと１８０．０μｇ／ｍｌのＧＯ−ＲｈＣＣＬｒと０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０と１％のオボアルブミンとを混ぜ合わせて、試薬を含む第１の溶液を調製する。

液体の容量は下記のように特定する：ａ）試料の容量＝３μｌｂ）希釈剤の容量（Ｈ２０）−１０μＩＣ）第１の溶液の容量−２０μｌｄ）第２の溶液の容量＝２１０μｌ試料を使用例１と同様にＥｎｃｏｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩで分析する。

これらの使用例のいずれでも、ＲｈＣ−酵素ＣＬｒは適当であればＣ１ｑ−ＨＲＰ又はＣ１ｑ−Ｇｏに換えることができる。

票」γ 液相免疫診断アッセイ（ＬＩＤＡ）方法のための試薬であって、第１の酵素と、第２の酵素と、アナライトと結合して複合体を形成できる第１物質であり前記第１及び第２の酵素の一方に結合する物質と、残りの酵素に結合する複合体結合物質とを含む試薬、ここで、前記第１の酵素は、この第１の酵素の基質及び該第１の酵素の任意の必要な別の基質と相互作用して前記第２の酵素の基質を生成することができ、前記第２の酵素は、前記第１の酵素によって生成された基質及び任意の必要な別の基質と相互作用することができ、前記相互作用のうち第２の相互作用の生起が検出可能である。この試薬は任意に、第１の酵素によって生成された基質を不活性化できるスカベンジャー物質をも含む。

補正書の写しく翻訳力提出書（特許法第１８４条の８）特許庁長官麻　生　波膜　平成４年１０月６日Ｊ１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０２０４４２、発明の名称　液相免疫診断アッセイ３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国、フロリダ・３２６１１　、ゲインズビル、グリンター・ホール・２２３名　称　ユニバーシティ・オブ・フロリダ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提出年月日　１９９２年６月８日】１１ｊ１１１、液相免疫診断アッセイ方法のための試薬混合物であって、（ａ）第１の酵素と、（ｂ）第２の酵素と、（ｃ）アナライトと結合して免疫複合体を形成できる第１物質であって、酵素結合第１物質がモノマーであるように前記第１及び第２の酵素の一方に結合する物質と、（ｄ）１Ａつの酵素に結合する免疫複合体結合物質とを含んでおり、前記第１の酵素がこの第１の酵素の基質と相互作用して、前記第２の酵素との相互作用により、検出可能な出力信号を発生させることができる生成物を生成することができ、総ての相互作用が完全に液相中で生起するように、前記第１物質及び免疫複合体物質が固相キャリヤーには結合されていない試薬混合物。

２、成分（ａ）〜（ｄ）を溶解する水性液相をも含んでいる請求項１に記載の試薬混合物。

３、凍結乾燥形態を有する請求項１に記載の試薬混合物。

４、更に、（ｅ）第１の酵素によって生成された前記生成物を不活性化することができるスカベンジャー物質をも含んでいる請求項１に記載の試薬混合物。

５、成分（ａ）〜（ｅ）を溶解する水性液相をも含んでいる請求項４に記載の試薬混合物。

６、凍結乾燥形態を有する請求項４に記載の試薬混合物。

７、前記第１物質がモノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項１に記載の試薬混合物。

８゜前記抗体が、ＨＩＶ抗原に対する抗体を含む請求項７に記載の試薬混合物。

９、前記ＨＩＶ抗原がｐ２４抗原又はそのフラグメントである請求項８に記載の試薬混合物。

１０、前記抗体が、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗原又はＢ型肝炎表面抗原に対する抗体を含む請求項７に記載の試薬混合物。

１１、前記第１物質が抗原である請求項１に記載の試薬混合物。

１２、前記抗原がＨｒＶ抗原である請求項１１に記載の試薬混合物。

１３、前記ＨＩＶ抗原がＰ２４抗原又はそのフラグメントである請求項１２に記載の試薬混合物。

１４、前記抗原がヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗原、Ｂ型肝炎表面抗原又はそのフラグメントである請求項１１に記載の試薬混合物。

１５、前記第１物質が抗イデイオタイプ抗体である請求項１に記載の試薬混合物。

１６、前記第１物質が前記第１の酵素に結合される請求項１に記載の試薬混合物。

１７、前記第１物質が前記第２の酵素に結合される請求項１に記載の試薬混合物。

１８、前記免疫複合体結合物質がＲｈＣである請求項１に記載の試薬混合物。

１９、前記免疫複合体結合物質がｃｔｑである請求項１に記載の試薬混合物。

２０、前記第１の酵素がグルコースオキシダーゼであり、前記第２の酵素がホースラディツシュペルオキシダーゼである請求項１に記載の試薬混合物。

２１、前記第１の酵素がグルコースオキシダーゼであり、前記第２の酵素がホースラディツシュペルオキシダーゼであり、前記スカベンジャーがカタラーゼである請求項４に記載の試薬混合物。

２２、請求項１に記載の液相免疫診断アッセイ用試薬混合物の製造方法であって、（ａ）試薬混合物の第１及び第２の酵素のうち一方の酵素を第１物質と結合させるステップ、（ｂ）残りの酵素を酸化し、次いで酸化した酵素を免疫複合体結合物質と反応させることにより、残りの酵素を免疫複合体結合物質に結合させるステップ、並びに（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で生成された結合体を混ぜ合わせるステップを含む方法。

２３、前記結合ステップ（ａ＞が、リンカ−を用いて前記第１又は第２酵素と前記第１物質とを結合させることからなる請求項２２に記載の方法。

２４、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法であって、ａ）前記アナライトに結合する請求項１に記載の試薬混合物を用意するステップと、ｂ）前記試薬混合物を、前記液体と、前記試薬混合物の第１の酵素の基質、並びに該基質と組合わせた状態で前記第１の酵素との相互作用により生成物を生成できる前記第１の酵素の任意の必要な別の化合物と、前記生成物とは異なる前記試薬の第２酵素用の化合物、並びに前記生成物と組合わせた状態で前記第２の酵素との相互作用により検出可能な出力信号を発生させることができる前記第２の酵素用の任意の必要な別の化合物と混ぜ合わせるステップと、Ｃ）ステップｂ）で検出可能な出力信号が発生したか否かを調べるステップとを含む方法。

２５、前記液体を含む溶液を前記試薬混合物に加え、得られた試薬混合物／液体溶液に、前記第１の酵素の基質と前記第１の酵素用及び第２の酵素用の前記化合物とを含む溶液を加える請求項２４に記載の方法。

２６、前記液体を含む溶液を前記試薬混合物に加え、得られた試薬混合物／液体溶液に、前記第１の酵素の基質と、前記第１の酵素用及び第２の酵素用の前記化合物と、前記試薬混合物のスカベンジャーとを含む溶液を加える請求項２４に記載の方法。

２７、前記液体を含む溶液と、前記第１の酵素の基質を該第１の酵素用の任意の必要な別の化合物と共に含む溶液と、前記第２の酵素用の化合物を該第２の酵素用の任意の必要な別の化合物と共に含む溶液とを前記試薬混合物に逐次加える請求項２４に記載の方法。

２８、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法ズあって、ａ）前記アナライトに結合する請求項４に記載の試薬混合物を用意するステップと、ｂ）前記試薬混合物を、前記液体と、前記試薬の第１の酵素の基質、並びに該基質と組合わせた状態で前記第１の酵素との相互作用により生成物を生成できる前記第１の酵素用の任意の必要な別の化合物と、前記生成物とは異なる前記試薬混合物の第２の酵素用の化合物、並びに前記生成物と組合わせた状態で前記第２の酵素との相互作用により検出可能な出力信号を発生させることができる前記第２の酵素用の任意の必要な別の化合物と合わせるステップと、Ｃ）ステップｂ）で検出可能な出力信号が発生したか否かを調べるステップとを含む方法。

２９、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトに結合する請求項１に記載の試薬混合物と、ｂ）１）前記試薬混合物の第１の酵素の基質、及び該基質と組合わせた状態で前記第１の酵素との相互作用により生成物を生成できる前記第１の酵素用の任意の必要な別の化合物、並びに２）前記生成物とは異なる前記試薬混合物の第２の酵素用の化合物、及び前記生成物と組合わせた状態で前記第２の酵素との相互作用により検出可能な出力信号を発生させることができる前記第２の酵素用の任意の必要な別の化合物を含む溶液と、Ｃ）前記試薬混合物を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。

３０、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトに結合する請求項４に記載の試薬と、ｂ）１）前記試薬混合物の第１の酵素の基質、及び該基質と組合わせた状態で前記第１の酵素との相互作用により生成物を生成できる前記第１の酵素用の任意の必要な別の化合物、並びに２）前記生成物とは異なる前記試薬混合物の第２の酵素用の化合物、及び前記生成物と組合わせた状態で前記第２の酵素との相互作用により検出可能な出力信号を発生させることができる前記第２の酵素用の任意の必要な別の化合物を含む溶液と、Ｃ）前記試薬混合物を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。

３１、液体中のアナライトの存在をスベるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトに結合する請求項１に記載の試薬混合物と、ｂ）前記試薬混合物の第１の酵素の基質を、この第１の基質と組合わせた状態で前記第１の酵素との相互作用により生成物を生成できる前記第１の酵素用の任意の必要な別の化合物と共に含む溶液と、Ｃ）前記生成物とは異なる前記試薬混合物の第２の酵素用の化合物を、前記生成物と組合わせた状態で前記第２の酵素との相互作用により検出可能な出力信号を発生させることができる前記第２の酵素用の任意の必要な別の化合物と共に含む溶液と、ｄ）前記試薬混合物を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。

３２、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトに結合する請求項４に記載の試薬と、ｂ）前記試薬混合物の第１の酵素の基質を、この第１の基質と組合わせた状態で前記第１の酵素との相互作用により生成物を生成できる前記第１の酵素用の任意の必要な別の化合物と共に含む溶液と、Ｃ）前記生成物とは異なる前記試薬混合物の第２の酵素用の化合物を、前記生成物と組合わせた状態で前記第２の酵素との相互作用により検出可能な出力信号を発生させることができる前記第２の酵素用の任意の必要な別の化合物と共に含む溶液と、ｄ）前記試薬を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。

３３、支持体と、多孔質膜と、湿潤性固体マトリクス中に乾燥状態で分散された請求項４に記載の試薬混合物とを含んでおり、前記試薬混合物が前記支持体と前記膜との間に配置されている分析装置。

３４、前記湿潤性固体マトリクスが、綿繊維、羊毛繊維及びガラス繊維から選択したものである請求項３３に記載の分析装置。

３５、前記第１の酵素によって生成された生成物とは異なる化合物であって、前記第２の酵素と相互作用でき、前記湿潤性固体マトリクス中に乾燥状態で分散されている化合物をも含んでいる請求項３４に記載の分析装置。

３６、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法であって、ａ）請求項３３に記載の分析装置を用意するステップと、ｂ）前記分析装置を首記液体に適用するステップと、Ｃ）ステップｂ）で検出可能な出力信号が発生したか否かを調べるステップとを含む方法。

３７、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトに結合する試薬混合物を含む請求項３３に記載の分析装置と、ｂ）前記分析装置の試薬混合物の第１の酵素の基質を含む溶液と、Ｃ）前記分析装置と、前記溶液と前記液体とを接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。

３８、液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトに結合する試薬混合物を含む請求項３５に記載の分析装置と、ｂ）前記分析装置の試薬混合物の第１の酵素の基質を含む溶液と、Ｃ）前記分析装置と、前記溶液と前記液体とを接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。

国際調査報告 ”’−””’−−””　ＰＣ’ｒＡＦＫＪＩａ

Claims

【特許請求の範囲】１．液相免疫診断アッセイ方法のための試薬であって、（ａ）第１の酵素と、（ｂ）第２の酸素と、（ｃ）アナライトと結合して複合体を形成できる第１物質であって、前記第１及び第２の酵素の一方に結合する物質と、（ｄ）残りの酵素に結合する複合体持合物質とを含んでおり、前記第１の酸素が、この第１の酵素の基質と相互作用して前記第２の酸素の基質を生成することができ、前記第２の酸素が、前記第１の酸素により生成された前記基質の他に任意の別の必要な基質と相互作用することができ、前記相互作用のうち第２の相互作用の生起が検出可能である試薬。２．成分（ａ）〜（ｄ）の液体水性キャリヤーも含んでいる請求項１に記載の試薬。３．凍結乾燥形態を有する請求項１に記載の試薬。４．第１の酸素によって生成された前記基質を不活性化することができるスカベンジャー物質（ｅ）をも含んでいる請求項１に記載の試薬。５．成分（ａ）〜（ｅ）の液体水性キャリヤーをも含んでいる請求項４に記載の試薬。６，凍結乾燥形態を有する請求項４に記載の試薬。７．湿潤性固体マトリクス中に乾燥状態で分散されている請求項４に記載の試薬。８．前記湿潤性固体マトリクスが綿繊維、羊毛繊維又はガラス繊維からなる請求項７に記載の試薬。９．前記第１の酸素によって生成された基質とは異なる基質であつて、前記浸潤性固体マトリクス中に乾燥状態で分散されている前記第２の酸素の基質をも含んでいる請求項７に記載の試薬。１０．前記第１物置がモノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項１に記載の試薬。１１．前記抗体が、ＨＩＶ抗原に対する抗体を含む請求項１０に記載の試薬。１２．前記ＨＩＶ抗原がｐ２４抗原又はそのフラグメントである請求項１１に記載の試薬。１３．前記抗体が、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗原又はＢ型肝炎表面抗原に対する抗体を含む請求項１０に記載の試薬。１４．前記第１物質が抗原である請求項１に記載の試薬。１５．前記抗原がＨＩＶ抗原である請求項１４に記載の試薬。１６．前記ＨＩＶ抗原がｐ２４抗原又はそのフラグメントである請求項１５に記載の試薬。１７．前記抗原がヒト絨毛性性腺刺激ホルモン抗原、Ｂ型肝炎表面抗原又はそのフラグメントである請求項１４に記載の試薬。１８．前記第１物質が抗イディオタイア抗体である請求項１に記載の試薬。１９．前記第１物質が前記第１の酵素に結合される請求項１に記載の試薬。２０．前記第１物質が前記第２の酸素に結合される請求項１に記載の試薬。２１．前記複合体結合物質がＲｈＣである請求項１に記載の試薬。２２．前記複合体結合物質がＣｌｑである請求項１に記載の試薬。２３．前記検出可能な酵素相互作用が、比色的方法、電磁的方法、電気化学的方法、熱的方法又は比濁分析によって検出できる出力信号を発生させる請求項１に記載の試薬。２４．前記第１の酵素がグルコースオキシダーゼであり、前記第２の酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼである請求項１に記載の試薬。２５．前記第１の酵素がグルコースオキシダーゼであり、前記第２の酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであり、前記スカベンジャーがカタラーゼである請求項４に記載の試薬。２６．請求項１に記載の液相免疫診断アッセイ用試薬の製造方法であって、（ａ）試薬の第１及び第２の酸素のうち一方の酵素を第１物質と結合させるステップ、（ｂ）残りの酵素を酸化し、次いで酸化した酵素を複合体結合物質と反応させることにより、残りの酵素を複合体結合物質に結合させるステップ、並びに（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で生成された結合体を混ぜ合わせるステップを含む方法。２７．前記結合ステップ（ａ）が、リンカーを用いて前記第１又は第２酵素と前記第１物質とを結合させることからなる請求項２６に記載の方法。２８．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法であって、ａ）前記アナライトと反応する請求項１に記載の試薬を用意するステップ、並びにｂ）前記試薬を、前記液体と、前記試薬の第１の酵素の基質及び該第１の酵素の任意の必要な別の基質と、前記試薬の第２の酵素の基質及び該第２の酵素の任意の必要な別の基質と混ぜ合わせるステップを含む方法。２９．前記液体を含む溶液を前記試薬に加え、得られた試薬／液体溶液に、前記第１の酵素及び第２の酵素の基質を含む溶液を加える請求項２８に記載の方法。３０．前記液体を含む溶液を前記試薬に加え、得られた試薬／液体溶液に、前記基質と前記試薬のスカベンジャーとを含む溶液を加える請求項２８に記載の方法。３１．前記液体を含む溶液と、前記第１の酵素の基質を該第１の酵素の任意の別の必要な基質と共に含む溶液と、前記第２の酵素の基質を該第２の酵素の任意の別の必要な基質と共に含む溶液とを前記試薬に逐次加える請求項２８に記載の方法。３２．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法であって、ａ）前記アナライトと反応する請求項４に記載の試薬を用意するステップ、並びにｂ）前記試薬を、前記液体と、前記試薬の第１の酵素の基質及び該第１の酵素の任意の別の必要な基質と、前記試薬の第２の酵素の基質及び該第２の酵素の任意の別の必要な基質と合わせるステップを含む方法。３３．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法であって、（ａ）請求項７に記載の試薬を用意するステップと、（ｂ）前記試薬を前記液体に適用するステップとを含む方法。３４．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトと反応する請求項１に記載の試薬と、ｂ）１）前記試薬の第１の酵素の基質及び該第１の酵素の任意の必要な別の基質、並びに２）前記試薬の第２の酵素の基質及び該第２の酵素の任意の必要な別の基質を含む溶液と、ｃ）前記試薬を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。３５．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトと反応する請求項４に記載の試薬と、ｂ）１）前記試薬の第１の酵素の基質及び該第１の酵素の任意の必要な別の基質、並びに２）前記試薬の第２の酵素の基質及び該第２の酵素の任意の必要な別の基質を含む溶液と、ｃ）前記試薬を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。３６．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトと反応する請求項１に記載の試薬と、ｂ）前記試薬の第１の酵素の基質を該第１の酵素の任意の必要な別の基質と共に含む溶液と、ｃ）前記試薬の第２の酵素の基質を該第２の酵素の任意の必要な別の基質と共に含む溶液と、ｄ）前記試薬を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。３７．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトと反応する請求項４に記載の試薬と、ｂ）前記試薬の第１の酵素の基質を該第１の酵素の任意の必要な別の基質と共に含む溶液と、ｃ）前記試薬の第２の酵素の基質を該第２の酵素の任意の必要な別の基質と共に含む溶液と、ｄ）前記試薬を前記液体及び前記溶液と接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。３８．支持体と、多孔質膜と、これらの支持体及び膜の間に配置された請求項７に記載の試薬とを含んでいる診断装置。３９．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトと反応する請求項３８に記載の診断装置と、ｂ）前記診断装置の試薬の第１の酵素の基質を含む溶液と、ｃ）前記診断装置、前記溶液及び前記液体を接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。４０．支持体と、多孔質膜と、これらの支持体及び膜の間に配置された請求項９に記載の試薬とを含んでいる診断装置。４１．液体中のアナライトの存在を調べるアッセイ方法で使用するためのキットであって、ａ）前記アナライトと反応する請求項４０に記載の診断装置と、ｂ）前記診断装置の試薬の第１の酵素の基質を含む溶液と、ｃ）前記診断装置、前記溶液及び前記液体を接触させるための手段とを前記アッセイ方法の感度を実質的に最適化するような相対量で組合わせてパッケージングしたものからなるキット。