JPH05506223A

JPH05506223A - 下降睾丸の処理のためのカルシトニン遺伝子関連ペプチド

Info

Publication number: JPH05506223A
Application number: JP91507668A
Authority: JP
Inventors: ハットソン，ジョン　メドウィン
Original assignee: ザユニバーシティーオブメルボルン
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1991-04-10
Publication date: 1993-09-16
Also published as: EP0527774A1; WO1991015246A1; CA2080354A1; EP0527774A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】下降翠丸の処置のためのカルシトニン遺伝子関連ペプチド本発明は、雄性動物における下［８丸を非外科的に処置する方法に間する。本発明は、また、上陸電光を処置する組成物に関する。

翠丸は精液を分泌する２つの腺の器官であって、そして除雪の中に位１し、精索により懸垂されている。

過去４０または５０年の間、筆先の下降は雄性アンドロゲンホモン（テストステロン）によりコントロールされることが提案されている。アンドロゲンは導帯として知られている鼠径部中の間葉組織に作用し、鼠径除雪の電光の下降の間に鼠径部から除雪への恥骨の領域を通って移動する。導帯は翠丸を除雪の中に案内すると考えられた。

ヒトにおいて、雄性の赤ん坊のほぼ５％は下降筆先をもって生まれる。雄の１〜２％において、翠丸は除雪の中に下降しない。残りの雄において、翠丸は、３０〜３６週の妊娠の正常の時間と比較して、出産後敗退で除雪の中に到達することができる。これらの「後期下降」はきわめて正常であるわけではなく、そして多数は子供において後に除雪の中から外に「再上昇する」筆先を有する。下降翠丸のための処置は侵入性外科（翠丸固定）であり、ここで下降翠丸は物理的に除雪に移される。これは通常１〜３年の年令において実施される。なぜなら、筆先はその後漸進的組織学的異常性を発生することが知られているからである。この外科手順は個体および関係する家族に対して外傷性であり、費用がかかり、そして全身の麻酔を必要とするすべての形態の外科に関連する付随する危険を有する。

また、ＨＣＧ　（ヒトアンドロゲンテストステロン）または黄体を形成するホルモン解放性ホルモン（ＬＨＲＨ）で投与することによって、滞留している翠丸を処置することが提案された。これらの処置は無効であることが証明された。

したがって、滞留している電光の外科以外の便利な処置が要求されている。

本発明の１つの面に従うと、処置を必要とする被検体に、カルシトニン遺伝関連ペプチド（以後Ｃ０ＲＰ）またはその類似体を、必要に応じて担体および／または賦形剤と組合わせて、筆先の下降を引き起こすために有効量で投与することからなる、雄の動物における下降翠丸を処置する方法が提供される。

他の面において、本発明はＣＧＲＰまたはＣＧＲＰ活性を有するその類似体および製剤学的に許容されうる担体および／または賦形剤からなる、雄の動物における下降翠丸を処置する組成物に関する。

他の面において、本発明は、下降翠丸の処置において使用する薬物の調製におけるＣ０ＲＰまたはその類似体の使用に関する。

Ｃ０ＲＰはカルシトニンのｍＲＮＡの交互するスプライシングにより産生される３７アミノ酸のペプチドである（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３０４．１９８３）　、　ＣＧＲＰはニューロペプチドであり、そして多数の怒覚神経およびわずかの運動神経において記載されてきている。ここで使用するとき、Ｃ０ＲＰは任意の動物種、例えば、ヒト、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラット、マウスなどからのＣ０ＲＰを呼ぶ。原理的には、しかし限定されないが、ＣＣ，ＲＰはヒ）ＣＯＲＰを呼ぶ。用語ＣＧＲＰはＣＧＲＰペプチド配列の天然に存在するアレルの変異型に拡張される。

ヒ）ＣＯＲＰは次の配列を有する：Ｈ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａ　Ｉａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ　−Ｖａ　Ｉ −Ｔｈｒ−Ｈｉｓ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−に　Ｉ　凵| しｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ＧＩｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　Ｉ　−Ｖａ　Ｉ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−シａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ。

Ｃｆ、、ＲＰ（ヒト）多数の供給会社、例えば、ベニンスラー・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から商業的に入手可能である。ＣＧＲＰは、よく知られた手ｊ頓に従い、それを含有する組織から精製することができる。好ましくは、Ｃ０ＲＰはペプチド合成技術、例えば、固相ペプチド合成により産生されるか、あるいは組み換えＤＮＡ法により産生される。

アミノ酸配列の変異型を含んでなるＣ０ＲＰの類似体は、３つのクラスの１または２以上の中に入る：置換、挿入または欠失の変異型。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端の融合体ならびに単一のまたは多数のアミノ酸の配列内挿入を包含する。一般に、Ｃ０ＲＰの成熟コード配列内の挿入は、アミノまたはカルボキシル末端の融合をもつものより、例えば、１〜４残基程度小さいであろう。

Ｃ０ＲＰの挿入のアミノ酸配列の変異型は、■または２以上のアミノ酸残基がＣ０ＲＰペプチドの中の所定の部位の中に導入されているものである。

欠失変異型は、Ｃ０ＲＰペプチド配列からの１または２以上のアミノ酸の除去により特徴づけられる。典型的には、約２〜６以下の残基がＣ０ＲＰ分子内の任意の１つの部位において欠失される。

アミノ酸の置換は典型的には１つの残基である；挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基程度である；そして欠失は約１〜２０残基の範囲であろう。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対でなされる、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入。

置換変異型は、ＣＧＲＰ配列中の少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基がその場所に挿入される。このような置換は、一般に、次の表に従いなされる。

表１もとの残基　１換の例示Ａｓｎ　Ｇｌｎ；ＨｉｓＨ４ｓ　Ａｓｎ；Ｃ１ｎＬｙｓ　Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｃ；ＩｕＭｅｔ　Ｌｅｕ；１ｉｅＰｈｅ　Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ一般に、アミノ酸は同様な性質、例えば、疎水性、親水性、電気陰性、バルキーな側鎖などを有する他のアミノ酸で置換される。

前述のＣＧＲＰのアミノ酸の変異型は、この分野においてよく知られているペプチド配列技術、例えば、面相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８５、ｐ、２１４９　（１９４６））などを使用するか、あるいは任意の特定の動物のＣＧＲＰをコードする遺伝子を組み換えＤＮＡ操作することによって、容易につくることができる。既知の配列を有するＤＮＡの中の所定の部位において１換突然変異をつくる技術は、よく知られており、例えば、Ｍ１３の突然変異誘発である。置換、挿入または欠失の変異型として発現する変異型のタンパク質を産生ずるＤＮＡ配列の操作は、この分野においてよく知られており、そして、例えば、マニアチス（Ｍａｎｊａｔｉｓ　）ら〔分子クローニング：実験室のマニュアル（門ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、１９８２）に記載されている。

Ｃ０ＲＰの前述のアミノ酸配列の変異型のすべては、それらが以後定義するようなＣ０ＲＰ活性を存する場合、ＣＧＲＰの類似体と定義することができる。

後に定義するＣＧＲＰ活性を有する任意の化合物はＣ０ＲＰの類似体として見なされる。これは、例えば、Ｃ０ＲＰの３次元構造またはその一部分を模倣するように設計することができる、小さい有機または無機の薬物を包含する。この型の化合物は、ＣＧＲＰのＸ線結晶学または他の３次元のモデル化技術の結果として生成することができる。

ｒＣＣ，ＲＰ活性」は、下降電光を有する動物において電光の下関を行う能力として定義される。ＣＧＲＰ活性についての便利な生体内アッセイは、摘出した雄の導帯Ｍ織を利用する。ＣＧＲＰ活性を有する有効量の化合物の存在下に、摘出された雄の導帯はリズムのある収縮およびある場合において曲がりくねった運動を行う。Ｃ０ＲＰの存在下のこのような活性は、雌の導帯、骨格筋か、あるいは清書の組織を使用しては観察されない、この便利なアッセイ（その詳細はこの明細書の実施例に記載されている）を使用して、化合物は不都合な実験に錬らないで、ＣＧＲＰの活性について容易に試験することかできる。

Ｃ０ＲＰの生物活性は、また、翠丸がまだ下降していない雄性動物、例えば、新しく生まれたラット、または先天的に下１ｌｌｌ丸を有する動物、例えば、ＴＳ系ラットを利用して、生体内で試験することができる。Ｃ０ＲＰの活性を有する化合物をこのような動物の除糞に、例えば、注射により、適用するとき、翠丸の下降は起こる。

再び、記載したような生体内のモデルはＣ０ＲＰの活性をアッセイする迅速な手段を提供する。

商業的に入手可能なＣ０ＲＰの例は、ニワトリＣＧＲＰ、ヒトＣＧＲＰ、ビオチニル−ＣＯＲＰ　（ヒト）、［Ｔｙ　ｒ’　）　−ＣＯＲＰ（ヒトＬ　ＣＧＲＰ　（ラット）およびビオチニル−ＣＯＲＰ　（ラット）を包含する。

Ｃ０ＲＰは、−Ｓに、医師のガイダンスの下で投与すべきであり、そして医薬組成物は通常を動量のペプチドまたはその類似体を普通の製剤学的に許容されうる担体と組み合わせて含有するであろう。

医薬担体は、例えば、液体または固体であることができる。液体の担体の例は、生理学的塩溶液、デキストロース、無曹水、オリーブ油などを包含する。同様に、担体はこの分野においてよく知られている時間遅延物質、例えば、グリセリルモノステアレート、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどを包含することができる。固体の担体の例は、ラクトース、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。

広範な種類の製剤学的形態を使用することができる。注射可能な形態のＣ０ＲＰは、一般に、無菌の賦形剤、例えば、水、生理学的塩類溶液、デキストロースなどの中に溶解したＣ０ＲＰを含有する。

ＣＧＲＰの注射可能な溶液は、例えば、５０μｇ〜５００５ｇ／ａｄを含有することができる。注射可能な溶液はアンプルまたはバイアルまたは非水性液体懸、ｉｉで提供することができる。

固体の担体を使用する場合、調製物は錠剤化し、硬質ゼラチンカプセルの中に入れるか、あるいは徐放性のポリマーと混合して投与形態を形成することができる。固体の担体Ｑ量は広く変化するであろうが、好ましくは約０．ｌｆｆ１ｇ〜１ｇであろう。

Ｃ０ＲＰは、除糞への局所的適用のために、クリーム、軟膏、ペースト、軟膏剤などに配合することができる。このような形態は皮膚浸透剤を含んでＣ０ＲＰまたはその類似体が除糞の中に行くのを促進する。適当な皮膚浸透剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを含む、Ｃ０ＲＰまたはその８４以体を含有する局所的使用のための配合物は、１〜４回／日約１〜１０日間陰嚢に通用する。局所的適用のために、活性成分は配合物の約０．００１％〜１０％Ｗ／Ｖ、例えば、１〜２重量％を含有することができる。局所的投与に適当な配合物は、処置が要求される部位に皮膚を通して浸透するために適当な液体または半液体の調製物、例えば、リニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストを包含する。皮膚への適用に適当なローションまたはりニメント剤は、また、合成を加速しかつ皮膚を冷却する物質、例えば、アルコール、アセトンおよび／または湿潤剤、例えば、グリセロールまたは油、例えば、ヒマシ油を含むことができる。

本発明によるクリーム、軟膏またはペーストは、外部の適用のための活性成分の半固体の配合物である。それらは活性成分を微細なまたは粉末状の形態で、単独でまたは水性または非水性の流体中の溶液でまたは懸濁液で、適当な機械の助けにより、グリースまたは非グリースの基剤と混合することによって調製することができる。

基剤は炭化水素、例えば、硬質、軟質または液体のパラフィン、グリセロール、蜂ろう、ゴムのり、天然源の油、例えば、アーモンド油、トウモロコン油、ヒマシ油またはオリーブ油、羊毛脂またはその誘導体または脂肪酸、例えば、ステアリン酸ならびにアルコール、例えば、プロピレングリコールからなる。配合物は任意の適当な表面活性剤、例えば、イオン性、カチオン性または非イオン性の界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルを含むことができる。

好ましくは、Ｃ０ＲＰを含有する製剤学的形態の各非経口的投与量は、約０．０５１１ｇ−ｖ１５００ｍｇの量の反応性成分を含有する。経口的投与量を使用する場合、それらは活性成分を約０．０５ｍｇ〜約１．０躍ｇの量で含有する。

Ｃ０ＲＰまたはその類似体は、移植可能なまたは皮膚付着性の持続解放性の物品から投与することができる。適当な系の例は、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチルーＬ−グルタメートのコポリマー（Ｕ、Ｓｉｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８３、”Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ’　２２．１　：　５４７−５５６）、ポリ　（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）　（Ｒ，Ｌａａｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１　Ｊ、Ｂｉｏａｘｅｄ、Ｍａｔｔｅｒ、ＲＥＳ、、１５　：　１６７−２７７およびＲ，Ｌａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２、“Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、”　１２　：　９８−１０５）などを包含する。このような物品は、例えば、皮下的に除糞の中に移植するか、あるいは除糞の皮膚と接触させて配置することができる０本発明により処置することができる動物は、ヒト、ウマ、および他の家畜を包含する。

薬物または組成物は、ＣＧＲＰを製剤学的に許容されうる担体または賦形剤とこの分野においてよく知られている方法に従い混合、溶解、配合、粉砕などすることによって調製することができる。

Ｃ０ＲＰはこのような動物に有効量で投与することができる。用語「有効量」は翠丸の下降を引き起こすために有効な量を意味する。

当業者は認識するように、製剤学的に許容されうる担体または希釈剤の形態および性質は、それと組み合わせる活性成分の量、投与のルートおよび他のよく知られた変数により支配される。

ＣＱＲＰまたはその類似体の投与ルートは、非経口的、局所的または経口的であることができる。用語「非経口的」は、ここで使用するとき、静脈内、筋肉内または皮下の投与を包含する。除糞への非経口的投与の皮下の形態は一般に好ましい。

Ｃ０ＲＰまたはその類似体は、出生時またはその後短い時間に、除糞の中への導帯の正常の移動を刺激する方法として、触知可能であるが下降している翠丸の側において除糞の中に注射することができる。好ましくは、単一のポーラスの注射で除糞の中に注射されるＣＧＲＰまたはその類似体の量は、約２０μｇ〜１００ μｇ／ｋｇ。

より好ましくはＩμｇ１５〜Ｌｏｇ体重である。単一の除雪注射、または制限された期間、例えば、１〜１０日間にわたる数回の注射する区域に適用する場合、ＣＧＲＰは除糞にゆっくり解放されて、Ｃ０ＲＰまたはその類似体の投与の量および頻度は、しばしば、任たはその類似体の投与回数／Ｂは、当業者により普通の処置コースかしながら、下降筆先を有するいかなる年令の動物も本発明に従い処置することができる。

１　本発明を限定するものではないが、ＣＣ；ＲＰは除雪内の陰部大腿：　の神経により解放される走化性のシグナルであると出願人は信する６ＣＧＲＰは、まだ未知のメカニズムのあるものを通して、導帯を陰れが除糞の中に行かないような）、あるいは多分心理学問題（ＣＧＲＰを分泌することができない）（これは下降電光を引き起こすことがある）が存在しろるということが本発明者の仮説である。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例区画からのコンピューター化したデンシトメトリーにより誘導される、置換曲線が示されている。

実施例１（Ｂｅａｓｌｅｙ　、、Ｓ、Ｗ、＆　Ｈｕｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｍ、　［１９Ｂ７］　Ａｕｇ、ｌＪＺ　Ｊ、Ｓｕｒｇ、５　’　、４９−５１）。ＧＦＨの切断は、テステステロンの分泌を妨害しないで、アのサイクルで保持した。生後１〜８日の１０匹の隨性ラットを使用ンス顕微鏡（ＬｅｉＬｚ　Ｄｉａｐｌａｎ）下に系統的切片を研究することによ。

て追跡することができた。使用した両者の色素は紫外線の励起波長星状に肛門および頭部的に未成熟の陰茎の間の皮膚の領域として定義された。

除糞の中に引き込む走化性シグナルとして作用すると信しられる、ニューロペプチドの証拠を提供する。

実施例２ＧＦＮの組織化学的分析：ＧＦＮを、この実施例において、その中に分布し、導帯および蛍光の下降を仲介する可能なトランスミノターとして作用することができるニューロペプチドを同定することを試みて、組織化学的に分析する。このようなトランスミツターはペプチドであるように思われる。なぜなら、これらは延長した期間にわたって走性およびＵＲ節作用を発揮し、そしてしばしば二二一ローエンドタリンの方法で機能することができるからである。

林料爽よ囚１灰：この実施例において使用した動物は、操作のとき生後６日の１２匹の雄性および３匹の雌性ラット、そして操作のとき生後１０日の５匹の雄性、５匹の雌性および５匹の蛍光性女性化症候群（ＴＦＭ）のマウスであった。

３０の異なるニューロペプチドに対する抗体をこの実施例において使用した。これらは、血管作動性腸ペプチド、５−ヒドロキシトリプタミン、ソマトスタチン８、ｍｅｔ−エンケファリン、物質Ｐ、チロトロフィン解放ホルモン、ニューロペプチドＹおよびカルシトニン遺伝子−関連ペプチド（ＣＣ，ＲＰ）に対する抗体を包含する。

抗体はＪ、ファー２ス（Ｆｕｒｎｅｓｓ）教授（Ｆｌｉｎｄｅｒｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）から人手したが、ただしカルシトニン遺伝子−関連ペプチドのウサギ抗ラット抗体はペニンスラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＩＪ、Ｓ、Ａ、）から購入した。この後者の抗体は濃度１：２０００で使用した。

動物は、実施例１におけるように、麻酔し、外科的に調製し、そして組織を取り出し、そして固定した。

組織をＯＣＴプラスチック媒質の中に埋め込み、液体窒素およびイソペンタンで冷却し、次いで１４μｍの凍結した系統的切片を切断して１％のゼラチンコーティングしたスライド上に配置し、そして放置して乾燥した。を髄を切断し、そして骨盤を叉状平面で切断した。スライドを１０％の正常ヒツジ血清（ＮＳＳ）に対してカバーして非特異的染色を遮断して３０分間前前辺インキュベーションした。過剰の血清を除去し、次いでスライドを湿ったボックス中で異なるニューロペプチドに対してレイズされた種々の一次抗体を一夜インキュベーションした。

抗体の混合物をＰＢＳで希釈し、そして最終溶液において１０％のＮＳＳを含有した。

次の日に、固体をＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）中の１５分間すすぎ、次いで１：２００にＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）で希釈したヒツジ抗ウサギフルオローイソーチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した二次抗体（Ｓｉｌｅｎｕｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｈａｗｔｈｏｒｎ、　Ｖｉｃ、）と１時間インキュベーションした。さらにすすいだ後、カバースリップを緩衝化したグリセロールで取り付け、そして蛍光のパターンをニブフルオレセンス顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ　Ｄｉａｐｌａｎ）で観察した。

免疫組織化学的染色の位置を同−切片上の逆行性標識つけと、単に励起フィルターを交換することによって比較した。なぜなら、Ｆ　ＩＴＣ（５２０＋＋＋ｓ）およびＤＡＰ　ｒ　（４００ｎｍ）が光を放射するようにするために、異なる波長が要求されたからである。首尾一貫して細胞を定量するために、すべての切片を計数し、そして鮮明に染色されそして核が明瞭に定められる細胞を陽性として計数した。

陰性対照は、ＰＢＳ単独で、あるいは−次抗体の代わりに、過剰の合成うｙトＣ０ＲＰを有する抗血清を包含する。を髄神経節はＣＧＲＰに対して陽性の対照として働いた。

定性的データがラットについて得られ、そして定量的実験を生後１０日の雄、雌およびＴＦＭ突然変異のリノターメイツ（ｌｔｔｅｒ　ｌ１ａｔｅｓ）のマウスについて実施した。統計学的分析は、ウイルコクソン・ランク−サム）（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　Ｒａｎｋ−５ｕａ＋）試験およびＬ−試験の両者を使用して実施した。

ＣＧＲＰの免疫反応性は腰の運動ニューロンにおいて有意の量で存在した。さらに、を髄の後角を通して多数のＣ０ＲＰ免疫反応性怒覚線維が存在し、そして腹側正中の線維の束は鮮明に染色した。

血管作動性腸ペプチド、５−ヒドロキシトリプタミン、ソマトスタチン８、ｍｅｔ−エンケファリン、ｓｉｐ、チロトロフィン解放ホルモンおよびニューロペプチドＹ−Ｈの後角が存在しなし）場合、を包含する、すべての他のニューロペプチドを試験した。

雄のラットにおいて、二重の標識つけは、ＣＧＲＰ染色部位が陰部大腿の神経内のＤＡＰＩ蛍光に非常に類似するが、同一でなし）ことを示した。ＤＡＰＩ標識した細胞の約半分は、前角内の他の明確な領域に局在する小さい数の非ＤＡＰＩ標識運動ニューロンと同様に、Ｃ０ＲＰについて染色された。

比較において、雌のラットでは、運動ニューロンはより小さく見え、そして数が少なく、そしてそれらのより小さし）比率シよＣＧＲＰに対して免疫反応性であるが、運動ニューロンの他の群４よなお雄におけるようにＣ０ＲＰ陽性であった（表１）。

い細胞を含有し、ＴＦＭ突然変異体は中間の数の細胞を有した。さらに、雄において、これらの標識した細胞の有意により大きい比率は雌のマウスと比較してＣ０ＲＰ免疫反応性であった。この比率は、また、ＴＦＭ突然変異体より大きいが、この差は統計学的に有意ではなかった。

得られた結果の統計学的分析は、雄および雌のマウスの間の比較が研究したすべてのパラメーターについて有意である（ｐｒｏ、０５）ことを示した。ＴＦＭ突然変異体と埋のマウスとの間の比較は、ＤＡＰＩ標識細胞の数（Ｐ＜０．０１）およびＤＡＰ　Ｉでまた標識したＣ０ＲＰ陽性細胞の数（ｐ＜０．０５）について有意であったが、ＣＧＲＰＣＧＲＰＤＡＰ　Ｉ標識した細胞の百分率について有意ではなかった。雄のマウスおよびＴ　Ｆ　Ｍ突然変異体について得られた結果は統計学的に異ならなかった。

球海綿体筋のＤＡＰ　Ｉ標識つけ後の下の腰を髄の染色はＣＧＲＰがこの核の中に存在しないことを示したが、それはこのレベＪしでより横方向に位置する２つの他の運動核内に局在化するように思われた。

免疫組織化学的結果は、カルシトニン遺伝子−関連ペプチドの免疫反応性が陰部大腿の神経の性的に２形性のを髄核の中に大きい量で存在することを示した。ＣＧＲＰ免疫反応性を含有するこれらの細胞の比率は、雄のマウスにおいて最大であり、次いでＴＦＭ突然変異体および雌のマウスであり、ＣＧＲＰの蓄積がアンドロゲン依存性でありうることを示唆した。

陰部大腿の神経内のＣ０ＲＰ免疫反応性の存在および存在量の性的差は、ＣＧＲＰが陰部の中への導帯の移動に対してその作用発揮するトランスミツターであることを示す。

実施例３電光の下降の間の導帯のリズム的収縮運動：この実験は試験管内および生体内の導帯およびそれへのＣＧＲＰの作用を検査する。

雄性ラフ）（０〜５日）からの導帯（ｎ＝１８２）を、有機培養において、Ｃ０ＲＰ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ソマトスタチン、アセチルコリンまたは対照の培地とインキュベーションした。培養物をビデオカメラ接続した解剖顕＠鏡およびテープを使用して検査した。いくつかのラントを麻酔しそして円径除雪皮膚を切除して生体内導帯をビデオで記録した。

ＣＧＲＰｌ！！、’ｌした導帯（２，５〜５０Ｘ１０−目モル）ノＩ／２はリズム的収′ａ（１，２０〜２ｏＯＺ分）を示し、より高い投与量はより急速な収縮を示した。これを９／４０のＶＩＰ処！した導帯の収縮および２／２６の対照（２０層分）と匹敵した。雌の導帯、骨格筋または線帯はＣ０ＲＰ誘発収縮を示さながった。生体内の導帯は、激しい収縮および曲がりくねった運動を示し、これらは腹内の圧力の増加およびＣＧＲＰの直接の適用により強調された。

これらの研究は、導帯が畢丸の下降の間に高度に運動性であることを明らかにする。リズム的収縮は、平滑筋様成分を示唆し、そしてＣＧＲＰが導帯の移動へのアンドロゲンの作用を仲介することができることを示唆する。

実施例４完全なＧＦＮが電光の下降に要求される：生後１〜２日の雄のスプレィグーダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　）ラット（ｎ＝１３）を麻酔し、そして下の腹を横切って小さく横方向に切開することによって腹膜を開いた。各陰部大腿の神経（ＧＦＮ）を分解し、セグメントを取り出し、そして末端を分割した神経の各端に熱源を適用することによってシアチルミーにがけな。

ラットを電光の下降について毎週４週間検査した。ＪＩ丸の下降は、腹の圧縮のとき、陰部の中への電光の下降として定義した。

上の方法で処１した動物の５４％において、滞留している電光が観察された。

ＧＦＮを切断しない対照動物において、すべての畢丸は下降した。

この実験は、ＧＦＮは電光の下降のために完全でなくてはならないことを示し、そしてＧＦＮに沿ったＣ０ＲＰの通行が遮断される場合、電光の下降は阻害されることを直接説明する。

さらに、Ｃ０ＲＰ　（４７０μモル／日、１４日間）を鼠径預域に対して横方向に右の鼠径部の中に注射した。同一部位における水の注射は対照として作用した。水の注射では５回の右の試験のうちで２回は下降せず（４０％）これに対してＣ０ＲＰを付近に注射したとき、６回のうちで４回（６７％）であった。

実施例５導帯の中のＣ０ＲＰレセプターこの実施例において、導帯の中の放射性ＣＧＲＰの結合を試験管内で検査して、導帯がＣＧＲＰのためのレセプターを含有するかどうかを決定した。

断頭後、各ランドを仰向きの位置に配置し、そしてその足を氷上の金属トレーにテープで固定した。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）の操作顕微鏡を使用して、請より約２ｆｆｉＩｗ下で下腹を横方向に切開しそして、フラップ形の円径除雪皮膚を切除することによって、導帯を露出して円錐形の突起を示した。コントンウールのパッド（ｂｕｄ）で上の腹をプレスすることによって腹の圧力を増加して、導帯の切除を促進した。微細マイクロ外科用ハサミを使用して、導帯とともに尾の精巣上体の末端を分割した。

切除した導帯を急速に取り出し、そして液体窒素中の浸漬により素早く凍結した。厚さ２０１Ｉｍの矢状切片を−１２”Ｃの低温槽上で切断し、そして０．５％のゼラチンコーティングしたスライド上に融解してマウントした。切片を真空デシケータ−中で４“Ｃにおいて一夜乾燥し、そして−７０゛Ｃで貯蔵した。別の切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、定量のときＩＺＳ■標識導帯の微細な構造を同定した。

放射線Ｎ識したヒトＣ０ＲＰ　（（２−（”’Ｉ）ヨードヒスチヂルＩＱ）ヒトＣＧＲＰＪをアマ−ジャム・インターナシボナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ、）　（英国パツキンガムシャイア−）がら入手した（約２０００ＣＩ／ミリモル）。次の合成ペプチド：ヒトＣＧＲＰ、う７　トＣＧＲＰ　（８３７）　、ラットＣ０ＲＰ　（Ｔｙ　ｒｔ７．２３−３７）、サケチロカルシトニン、ヒト血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ソマトスタチン、および物質Ｐを、アウスベプ（Ａｕｓｐｅｐ　Ｐｔｙ、Ｌｔｄ、　）　（オーストラリア国メルボルン）から購入した；ヒトチロカルシトニンおよびセロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）　（５−ヒドロキシトリプタミン）をシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｆｆｉｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（ミゾリー州セントルイス）から購入した。

次の緩衝液を種々のりガントとの組織切片とのインキュベーションに使用した＝１００ミリモルのＨＥＰＥＳ、１２０ミリモルのＮａｃＬ　１．２ミリモルのＭｇ５Ｏ，，２，５Ｍｇ５Ｏ，ＫＣＩ、１５ミリモルのＮａ　Ｃ２Ｈｙ　Ｏｚ　、１０ミリモルのＤ−グルコース、１ミリモルのＥＤＴＡ、、０．５％のＢＳＡ、および０．３５ミリモルのバシトラシン（Ｂａｃｉｔｏｒａｃｉｎ　）。

結合を最適化する条件を、ｐＨ７，０，７，４，８，０およびｐＨ８゜４の緩衝液を使用して、４°Ｃ１２２°Ｃ１３６°Ｃで、２．６．２４．３０．４８時間のインキュベーションで検査した。

インキュベーション条件の最適化後、組織の切片を融解し、引き続いて３５ピコモルの（”’））−ヒトＣＧＲＰを含ｆする前述ノ緩衝液ｐＨ８，０中で４　’ Ｃにおいて２４時間インキュベーションした。

非特異的結合を決定するために、いくつかの切片を、また、１μモルの非標識ヒ）ＣＯＲＰとインキュベーションした。結合性質および特異性の特性決定のために（１２５１３−ヒ）ＣＯＲＰの結合の変位を、１系列の隣接するＭｉ織切片を増加する濃度の非極１１ｃＧＲＰまたは次のペプチドとインキュベーションすることによって誘導した二ラットＣ０ＲＰ　（８−３７）、ラットＣＧＲＰ　（Ｔｙｒ”）、２３−３７）、サケチロカルシトニン、ヒトチロカルシトニン、ヒトＶＩＰ、ソマトスタチン、および物質Ｐ０インキュベーション後、切片を氷上で緩衝液ｐ１１８．　０の連続する３０秒の４回の交換に通過させて、非特異的に結合したりガントを除去した０次いで、切片を冷たい空気の流れ中で乾燥し、そしてＸ線フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ　ＫｏｄａｋＣｏｍｐａｎｙ　、米国ニューヨーク州）に室温において７日間露出した。

放射性標準は、オートラジオグラフィーの（ＩｔＪ）マイクロ−スケール（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ、　、英国パツキンガムシャイア−）、これは非放射性層により分離された比活性が増加する順番で配！された１０層の［＋！Ｓｉ）混入ポリマーから成る、を使用し、そしてＸｖＡフィルムに同時に露出した。放射性標準は、指数方程式、崩壊定数および露出＃Ａ闇の中央への経過時間開隔を使用して、崩壊について補正した。これらのデータは、ｄｐＨ／ｅ１ｇタンパク質によりオートラジオグラフの光学密度のコンピューターの目盛り定めを可能とした。

インキュベーシヨンした導帯を露出したフィルムを現像し、そしてＤＥＣＩＩ／２３ＬＳＩコンピューターとカップリングした、Ｅｙｅｃｏｍ８５０型画像プロセンサー（Ｌｏｇε／５ｐａｔｉａｌ　Ｄａｔａ　５ｙｓｔｅ１１、米国バージニア州スプリングフィールド）を使用してデンシトメトリーをコンピューター処理して定量化して、ラジオリガンドの密度により目盛り定めした色コードの画像を得た。

インキュベーションした切片のいくつかを次のようにして乳剤オル３秒間浸し、６０％の相対湿度で室温において１時間乾燥し、そしてシリカゲルを含有するプラスチックのスライドボックスの中に４°Ｃにおいて４週間露出のために貯蔵した０次いで、スライドをコダック（Ｋｏｄａｋ）　Ｄ　１９現像液の蒸留水によるｔｒｉの希釈物で２０℃において５分間現像し、１％の酢酸停止液の中に２０ ℃において３０秒間浸漬し、定着液〔イルフォード・ハイマム・フィクサー（ｒｌｆｏｒｄ　Ｈｙｐａｍ　Ｆｉｘｅｒ）の蒸留水による１：４の希釈物、およびイルフォード・ハイマムーハードナー（Ｉｌｆｏｒｄ　Ｈｙｐａｍ　Ｈａｒｄｅｎｅｒ）（目ｆｏｒｄ　Ｐｔｙ、　Ｌｔｄ、、オーストラリア国メルボルン）に１０分間浸漬し、そしておだやかに流れる水中に１時間浸漬した。現像後、切片を乾燥し、そしてヘマトキシリンで染色して、粒子の密度の位置決定を可能とした。

４°Ｃにおいて緩衝液ｐＨ８，０と２４時間インキユベーシゴンすることによって、結合を飽和させた。最適な条件より長いインキュベーション時間、高いインキュベーション温度、または高い緩衝液のｐＨがより高い非特異的結合を生した。したがって、特異的結合が見られたとき、明確な結合の研究は４°Ｃにおいて２４時間実施した。

置換曲線は、放射線標識したヒ）ＣＯＲＰの存在下に増加する濃度の非標識ヒトＣＧＲＰとインキュベーションした系統切片からのデンシトメトリーをコンピューター処理して誘導した（第１図）。

これらのデータのコンピューター誘導したプロットは、また、単一のクラスの結合部位を明らかにした。

ラットＣ０ＲＰ　（８−３７）は（＋２５７〕−ヒトＣＧＲＰとの競争において、非標識ヒトＣ０ＲＰのそれに類似するか、あるいはそれより大きい親和定数で効力があった；サケカルシトニンはこの部位においてヒトＣＧＲＰより低い親和性で競争したが、ヒトカルシトニンは非常に低い効力を有しただけであった；ラットＣＧＲＰＴｙ　ｒ　２　？　）は、また、結合部位と競争したが、ヒトＣ０ＲＰより親和性であった。

しかしながら、関係しないペプチド、ヒトＶＩＰ、ソマトスタチン、セロトニン、および物質ＰはｌＸｌ０−’モルまでの濃度についてまった←競争しなかった。

乳剤オートラジオグラフィーを使用する〔′ｚ５Ｉ〕−ヒトＣ０ＲＰレセプターの光学顕微鏡により位置決定は、精巣挙動にわたって結合の高い密度を示した。

オートラジオグラフを染色した隣接する切片と比較すると、粒子の密度が内側および外側の精巣挙動の厚い層に限られることを示す。結合は中央の間葉においてかなり低かっ実施例６ＣＧＲＰの拮抗剤は電光の下降を遅延させる：この実施例において、ＣＧＲＰ拮抗剤ＣＧＲＰ　（８−３７）の電光の下降への作用を新生児のマウスにおいて検査した。

新しく生まれたＡＲＣおよびプリンドル（Ｂｒｉｎｄｌｅ）下位系統のＭＯＢＲ／ＭＯＶＬＯマウスをこの研究において使用した。

マウスに２０μｌの１０−４モルのＣＧＲＰ　（２，５ナノモル）を最初の３日以内に注射した。マウスに左の腸骨窩の皮膚を通して注射し、そして発育する左の陰部を斜めに入れた。注射した投与量のほぼ半分がいったん投与されたとき、陰部のセブツム（ｓｃｅｐｔｕｍ）を穴あけして右の陰部を入れ、そして注射の残部を続けた。

１週齢において、その後毎週、５０μｍの１０−’モルのＣＧＲＰ（８−３７）を注射した。

Ｃ０ＲＰ　（８−３７）はＣ０ＲＰの競争阻害因子であり、そしてＣ０ＲＰの活性部位を構成する最初の７アミノ酸を欠如する。

マウスを毎週４数週翠丸の下降について検査した。検査のとき寒丸の下降を示したマウスはその側に再び注射しなかった。

電光の下降は腹の圧縮のときの陰部の中への電光の下降として定義した。導帯の下降は有意と考えなかった。すべでのレフトラフタイル（ｒｅｃｔｒａｃｔｉｌｅ）　４Ｉ丸は下降した電光に含めた。

４週齢において、滞留している電光をもつすべてのマウスを殺し、そして組織学的に検査して、電光の下降を阻害する機械的因子、すなわち、注射の結果として線維質組織の形成、が存在するかどうかを決定した。

マウスの対照群に、同一体積のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を注射した。非パラメーター分析を使用して、結果を比較した。実験の群は１３８匹のマウスから成っていたが、対照群は３７匹のマウスから成っていた。

１週齢において、すべての電光は下降しなかった。

２週において、１３８匹の実験のマウスのうちのすべての３６２の電光は実験群において下陳じなかったが、７４のうちの４２は対照群において下降しなかった。

３週齢において、３６２の電光のうちの４４は実験群において下降せず、そして７４のすべての電光は対照群において下降した。

４週において、３６２の電光のうちの３は下降しなかった。４週後に１つの側の下降しない電光を示した３匹のマウスを組織学的に検査すると、導帯の移動を阻害する機械的バリヤーの証拠は示されなかった。

上の実験から明らかなように、発育する陰部の中へのＣ０ＲＰ（８−３７）の競争阻害因子の注射は、対照群に比較して、マウスにおける寒丸の下降を遅延した。事実、Ｃ０ＲＰ　（８−３７）は３つの電光の下降を完全に妨害した。

Ｃ０ＲＰ　（８−３７）はレセプターに結合し、そして陰部大腿の神経から解放されたＣ０ＲＰの活性を競争的に阻害する。しかしながら、Ｃ０ＲＰ　（８−３７）の阻害作用は、多分拡散およびその生物学的半減期のために、不可逆的ではない。

処置後４週における３つを除外してすべての下降は外因性拮抗剤よりむしろレセプターへ内因性Ｃ（、ＲＰが競争的に結合し、これにより拮抗剤の作用を逆転するためであろうと信じられる。

しかしながら、この結果はＧＲＰ　（８−３７）が電光の下降を妨害または遅延することができることを実証する。これは、円径−除雪区域における陰部大腿の神経の神経線維から解放後、電光の下降を引き起こすＣ０ＲＰと一致する。

当業者は認識するように、ここに記載する本発明は詳しく記載もの以外の変化および変更が可能である０本発明はその精神および範囲内に入るすべてのこのような変化および変更を包含することを理解すべきである。本発明は、また、この明細書において、個々にまたは総合的に言及し、あるいは示したすべての段階、特徴、組成物および化合物、および前記段階または特徴の２またはそれ以上の任意のおよびすべての組み合わせを包含する。

ｌ土雄性及び雌性ラントのを髄中の細胞の定量ＤＡＰＩ標識　ＣＧＲＰ陽性　ＣＧＲＰを含むＤＡＰＴ細胞の数　細胞の数　標識細胞の％雄性　２９８　１４８　５０雌性　１６３　３５　２２、およびＴＦＭ１然パ　における　の雄性　２８１　２５１±１０４　１０１　１１４±５３　３６　４６±７Ｐ　＜０．０Ｉ　Ｐ　＜０．０１　ｐ　＜０．０５雌性　６９　１０７±２２　２７　３２＝１４　３９　３０±１２ｐ　＜０．０１　ｐ　＜０．０５　Ｎ５ＴＦ！１　１６８　１８４±３３３９７０±４０　２３　３６±１５ＦＩＧＵＲＥ　１要約書る効果的方法である。

国際調量報告＋ｎｔ＊ｒ＋＋ａ＋Ｉａ＋＋ａｌＡｐｔｓｕｅｓａｓ、Ｐｃｔ／ｍ９１／口Ｏｕ５に鈍スＴＯ露り江訝αにユα鵠ＬＳ込に万既Ｐゴびｌタ沼ジ肩国江用ｕＯ貫１世＝にψ【■四σｌＡＵ　８２９５５７１３７　＾０　６０８２６８　ＥＰ　２７７４６２ＥＮＤ　ＯＦ　ＮＩＮＥＸ

Claims

【特許請求の範囲】

１．処置を必要とする被検体に、カルシトニン遺伝子−関連ペプチド（ＣＧＲＰ）またはその類似体を、必要に応じて担体および／または賦形剤と組合わせて、睾丸の下降を引き起こすために有効量で投与することからなる、雄の動物における下降睾丸を処置する方法。
２．前記ＣＧＲＰがヒトＣＧＲＰである、請求項１に記載の方法。
３．前記ＣＧＲＰを陰嚢に投与する、請求項１に記載の方法。
４．前記ＣＧＲＰを局所的調製物の形態で投与する、請求項３に記載の方法。
５．前記局所的調製物が皮膚浸透剤を含有する、請求項４に記載の方法。
６．前記ＣＧＲＰを陰嚢または腹の中に注射する、請求項１に記載の方法。
７．前記ＣＧＲＰまたはその類似体を移植可能なまたは皮膚付着性の持続解放性物品から投与する、請求項１に記載の方法。
８．前記持続解放性物品を陰嚢の中に皮下的に移植するか、あるいは陰嚢の皮膚と接触させて配置する、請求項７に記載の方法。
９．前記雄の動物はヒト、ウマ、または他の家畜から選択される、請求項１に記載の方法。
１０．前記ＣＧＲＰまたはその類似体を出生の時またはその後に投与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
１１．ＣＧＲＰまたはＣＧＲＰ活性を有するその類似体および製剤学的に許容されうる担体および／または賦形剤を含んで成る雄性動物における下降睾丸を処置する組成物。
１２．前記ＣＧＲＰまたはその類似体がヒトＣＧＲＰである、請求項１１に記載の組成物。
１３．ＣＧＲＰまたはその類似体および皮膚浸透剤を含んでなる局所用配合物。
１４．移植可能なまたは皮膚付着性の持続解放性物品の形態のＣＧＲＰまたはその類似体を含んでなる、請求項１２に記載の組成物。
１５．雄の動物における下降睾丸の治療的処置において使用する組成物の調製におけるＣＧＲＰまたはその類似体の使用。