JPH05505595A

JPH05505595A - 二つのエフェクター機能を有する二元特異性異種抗体

Info

Publication number: JPH05505595A
Application number: JP91500408A
Authority: JP
Inventors: ファンガー，マイケル　ダブリュー．; ガイアー，ポール　エム．; ボール，エドワード　ディー．
Original assignee: メダレックス　インク．
Priority date: 1989-10-20
Filing date: 1990-10-18
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: WO1991005871A1; DE69032979T2; DK0595798T3; ES2133139T3; GR3030415T3; DE69032979D1; EP0595798B1; JP3360108B2; ATE177152T1; EP0595798A1; CA2069960A1; CA2069960C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１４、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生される、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。

１５、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるモノクロナール抗体のＦａｂフラグメントである、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。

１６．前記エフェクター辛田ａが、単核細胞、マクロファージ、好中球、及び、好酸球から成るグループから選択されるヒト細胞である、ことを特徴とする請求項１目遺の標的特異性エフェクター細胞。

１７、腫瘍細胞が、骨髄性白血病、肺小細胞ガン、決腸ガン及び乳ガンから成るグループから選択される、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。

１８、標的特異性エフェクター細胞で、（ａ）エフェクターｍ上に表出する、高親和性Ｆｃガンマレセプターと、（ｂ）レセプターの結合領域外にある、エフェクター細胞のＦｃレセプターの抗原決定基に結合する異種抗体と、を備え、前記異種抗体が、更に、（ｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＣＲＬ１０２６６を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　ＰＭ８１と、（ｉ　１）ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　３２．２と、を含む、ことを特徴とする特許１９、腫瘍患者に、治療に適した量の、標的化されたエフェクター細胞を投与する腫瘍の治療法で、標的化された各エフェクター細胞が、（ｉ）細胞表面のＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、（百）ヒト免疫グロブリンＧに阻害されることなく、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的に結合する抗体あるいはそのフラグメントと、を含む、ことを特徴とする治療法。

２０、前記ＣＤ１５抗原に特異的な抗体が、ＩｇＭ分子を含むことを特徴とする請求項ｌ９記載の治療法。

２１、ＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体あるいはそのフラグメントとを、二硫化物の架橋により結合させる、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。

２２、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するパイプリドーマにより産生される、ことを特徴とする請求項１つ記載の治療法。

２３、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるＩｇＧ分子のＦａｂフラグメントである、ことを特徴とする請求項１９言ｆｆｉの治療法。

２４、前記エフエクタ一連出ａが、単核細胞、マクロファージ、好中球、及び、好酸球から成るグノレーブから選択されるヒト細胞である、ことを特徴とす６Ｍｌｎ項１９言占賎の治療法。

２５、腫瘍細胞が、骨髄性白血病、肺小細胞ガン、決腸ガン及び乳ガンから成るグノレーブから選択される、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。

２６、腫瘍患者に、治療に適した量の、標的特異性エフェクター細胞を投与する腫瘍の治療法で、各標的特異性エフェクター細胞が、（ａ）エフェクター紹遺江上に表出する、高親和性Ｆｃガンマレセプターと、（ｂ）レセプターの結合領域外にある、エフェクター表冊包のＦｃレセプターの抗原決定基に結合する異種抗体と、を備え、前記異種抗体が、更に、（ｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＣＲＬ１０２６６を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　ＰＭ８１と、（ｉ　ｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　３２．２と、を含む、ことを特徴とする治療法。

明細書二つのエフェクター機能を有する二元特異性異種抗体穴型Ｑ背量エフェクター細胞を標的化する異種抗体で、高親和性ＦｃＲＩレセブターに特異的な抗体と、これに結合する、標的細胞上に存在する抗原に特異的な第２抗体と、を備える異種抗体の生成に関しては、既に、米国特許番号４．６７６．９８０（シガールら）及びカルボブスキーら（Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１６０：　１６８６−１７０１　（１９８４））等により、報告されている．このように構成された抗体は、　（腫瘍細胞やウィルス感染細胞等）不必要な細胞を特異的に破壊するために用いられる。

近年、可変部領域を介して、高親和性Ｆｃガンマレセプターと反応するモノクロナール抗体が、開発されている．この場合、アンダーソンら（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅ＋ｎ。

２６１：１２８５６　（＋９８６）　）及びシェノら（Ｊ．　ｂ＋＋ｍｕｎｏｌ．　１３７：３３７８−３３８２　（１９８６））等により報告されているように、血清免疫グロブリンが、Ｆｃレセプターに対する抗体の結合と競争することはない．即ち、血清ＩｇＧが、標的に向かうエフェクター細胞の細胞破壊を阻害することはない。

登■少慝藍本発明は、標的細胞の細胞表面抗原に結合する抗体あるいはそのフラグメントと、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに結合する抗体と、を含も、二元特異性異種抗体に関する．この異種抗体は、補体に媒介される、並びに、エフェクター細胞に媒介される、細胞溶解を誘発する．Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体は、ＩｇＧのＦｃ部分に対する配位子結合部位とは異なる部位に結合するため、この結合がＩｇＧにより阻害されることはない。この二元特異性分子は、正常な血清ＩｇＧの存在下で、エフェクター細胞のＩｇＧ占有占有グセブタ−合する。

標的細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体が１ｇＭ分子であることが、望ましい、ＩｇＭを用いて形成される異種抗体は、エフェクター細胞に媒介される、また、補体に媒介される、標的細胞の溶解を引き起こす。

本発明の異種抗体を用いて、腫瘍細胞やウィルス感染細胞等、不必要な細胞を標的として破壊することができる．この場合、異種抗体を単独で投与してもよいし、あるいは、エフェクター細胞に予め結合させた後、患者に投与してもよい。

また、他の分子と結合させて用いることもできる。例えば、本発明の分子を、インターフェロン−ガンマ等のサイトカインと共に用いて、サイトカインの持つ治療力を活性化したり、効果を高めたりすることもできる。

兄■Ω詳細ｌ説医本発明の異種抗体は、少なくとも２つの異なった結合特異性を有する．即ち、この分子は、標的細胞の表面抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、を含む。本発明の異種抗体は、２つのエフェクター機能を有し、補体に媒介される細胞溶解と、抗体依存細胞に媒介される細胞溶解とを引き起こす。

Ｆｃレセプター結合特異性は、ヒトＩｇＧに阻害されることなく、ヒトＩｇＧに対する高親和性（ｐ７２）Ｆｃガンマレセプター（ＦｃＲＩ）と結合する、結合剤により達成される．Ｆｃガンマレセプター結合剤として好ましいものは、以下の特性を有する抗体、抗体のフラグメント、抗体の可変部領域、あるいは遺伝構造体である。

ａ．高親和性Ｆｃガンマレセプターと特異的に反応する。

ｂ．Ｆｃ部分と独立な抗原結合領域を介して、レセプターと反応する。

Ｃ．レセプターのＦｃ結合領域（即ち、配位子結合領域）とは異なる、Ｆｃガンマレセプターの抗原決定基と反応する。

ｄ．配位子に占有されるレセプターを結合する。

本発明の抗Ｆｃガンマレセブター抗体は、米国特許出願番号１５１，４５０　（ファンガーら：　「ヒト単核食細胞上の免疫グロブリンＧのＦｃレセプターに対するモノクロナール抗体」）に開示される方法に従い、製造される．上述の特性を有する望ましい抗体ｍＡｂ　３２．２を産生ずるハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能である（ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９）。

細胞溶解を誘発し、また、異種抗体にこのエフェクター機能を与えるような抗体であることが望ましい、標的細胞に特異的な抗体は、好ましくは、ＩｇＭである。このような抗体を含む異種抗体は、以下の実施例に示されるように、標的細胞を効果的に破壊することができる。

ここで、標的細胞とは、除去することが宿主にとって望ましいような細胞、例えば、腫瘍細胞である０本発明の異種抗体は、ＦｃＲＩ特異性及び腫瘍あるいは腫瘍特異抗原に対する特異性を有する。

異種抗体を製造するために用いられる、所望の腫瘍特異性を有する抗体は、市販されているものの中から選択されるものでも、あるいは、新たに製造されるものでもよい。腫瘍抗原に対するモノクロナール抗体の製造法に関しては、例えば、米国特許４，１７２，１２４　（コブロウスキーら）に開示されている。現在、数多くの適当な抗腫瘍抗体が入手可能である。

以下に、抗腫瘍抗体の例をいくつか挙げる。

抗体　特異性ＡＭＬ−２−２３，ＰＭ−８１，ＰＭＮ−６，ＰＭＮ−１９骨髄性白血病５ＣＣＬ−１，５ＣＣＬ−１７５肺小細胞ガン０Ｃ１２５，０ＶＣＴ−３卵巣ガンＣ０Ｌ−１，Ｃ０Ｌ−２，、、、、Ｃ０Ｌ−１３結腸ガン好ましい抗腫瘍抗体の一例として、上記の表にＰＭ−８１として示される抗体に代表されるような、ＣＤ１５抗原に特異的な抗体が挙げられる。ＣＤ１５抗原は、　（表に示されている）骨髄性白血病細胞以外にも、結腸腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞に、表出される。

ＰＭ−８Ｌ抗体を産生ずるハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能であり、承認番号ＣＲＬ　１０２６６が割り当てられている。

上記のような腫瘍細胞以外にも、自己免疫疾患の治療のために、自己抗体産生リンパ球を、あるいは、アレルギーの治療のために、ＩｇＥ産生リンパ球を、本発明の抗体で標的化されたエフェクター細胞が対抗する、標的細胞とすることができる。更に、バクテリア、ウィルス等の微生物、あるいは、リューマチ因子、自己抗体等の可溶性抗原を標的細胞とすることもできる。

本発明の２価の異種抗体は、Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体（あるいはそのフラグメント）と、標的細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体（あるいはそのフラグメント）とを、含む、異種抗体は、以下の実施例に詳述されるように、ＦＣガンマレセプター抗体を、標的細胞抗原に特異的な抗体と共役させることにより、製造される。抗体の共役には、プロティンＡ、カルボジイミド、シマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安１色香酸（ＤＴＮＢ）　、Ｎ−サクシンイミジルー３ −（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）等の、様々なカップリング剤あるいは架橋剤を用いることができるが、特に、ＤＴＮＢ％５ＰＤＰの使用が望ましい、前記抗体と５ＰＤＰ試薬との架橋方法は、周知のものであり、例えば、カルボブスキー−Ｂら（（１９８４）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　！Ｉ％ｅｄ、　１６０：１６８６）　、リュー・Ｍ−Ａら（（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８２：８６４８）　、米国特許番号４，６７６．９８０（シーガル・Ｄ−Ｍ、ペレッッ・Ｐ：１９８７年６月３０日）、あるいは、ブレナン・Ｍ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：４２４　（１９８６））により報告されている。

本発明の異種抗体を、次のいずれかの方法で投与することにより、不必要な細胞を標的として破壊することができる。即ち、分子をそのまま遊離した形で投与してもよいし、生体外で分子をエフェクター細胞の表面に結合させた後、この細胞を投与する方法を採ってもよい、何れの方法でも、原理は同じであり、後者の場合、エフェクター細胞は、標的抗原を担持する細胞に対して、標的化される。

用いられるエフェクター細胞としては、ヒト白血球、特にマクロファージが好ましいが、単核細胞、活性化された好中球、活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好酸球等を用いることもできる。マクロファージを標的化する前にインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマで処理し、標的化するための抗体、即ち、異種抗体に結合するＦｃレセプターの数を増加させておいてもよい。また、同様に、好中球及びＮＫ細胞をｒＦＮ−ガンマで活性化することができる。あるいは、エフェクター細胞を、標的化する前に、他のサイドキン、例えば、腫瘍壊死因子、リンリンフォトキシン、コロニー刺激因子、インターロイキン−２等で活性化することもできる。必要な場合には、治療対象の宿主から、あるいは、他の免疫学的に同等なドナーから、標的細胞に向かうエフェクター細胞を取り出してもよい。

標的に向かうエフェクター細胞は、生理学的に受容可能な細胞懸濁液として投与される。投与される細胞数は、１０８ないし１０’の範囲であり、この数は、治療目的に従い変化する。通常、標的細胞に局在し、補体に媒介される聡容解及び抗体依存細胞に媒介される細胞破壊（ＡＤＣＣ）によって標的細胞を殺すために充分な量が投与される。投与経路は、治療対象、方法等により、まちまちである０例えば、標的化されたエフェクター細胞を、静脈投与してもよいし、あるいは、筋肉内投与、腹膜組織内投与でもよい。

本発明の異種抗体は、生体内に過剰に存在するヒトＩｇＧが抗体分子のエフェクター細胞への結合を妨害することのないように、また、エフェクター細胞の作用を阻害することのないように、抗原特異性結合剤を、エフェクター細胞上のＦＣ γＲに結合させる。言い替えると、抗体分子の抗ＦｃγＲ成分が、配位子結合領域外の抗原決定基の部分で、ＦｃγＲに結合するため、妨害が起こらない。このように標的化された（マクロファージ等の）エフェクタｉ細胞を用いて、ＨＩＶやＨＩＶに感染した細胞を、抗体依存細胞媒介型の細胞溶解機構により、破壊することができる。

本発明の異種抗体は、生体内において、かなり長い半減期を有する。これは、抗体の構成成分と、単核細胞及びマクロファージ上のＦｃγＲとの相互作用によるものであり、ＦｃγＲは、これらの細胞上にかなり長い期間存在し、その大部分は循環しないが、体内の細網内皮系のあらゆる細胞上で機能的に活性であり続ける。

本発明を、以下の実施例に従い、更に詳しく説明する。

大施泗抗体及び抗体フラグメントヒト単核細胞の高親和性Ｆｃレセプターに対するネズミｍＡｂの一種であるｍＡｂ３２．２の製造と特性に関しては、アンダーリン・Ｃ−Ｌら（（１９８６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１：１２８５６　）により報告されている。

この操作を簡単に説明する。まず、固定ヒトＩｇＧ上のアフィニティー・クロマトグラフ法を用いて、ＦｃＲＩを、Ｕ９３７細胞から単離し、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミに注射した。最後の免疫注射から５日後に、牌細胞を、ＮＳＩ骨髄腫細胞系の細胞と、融合させ、フローサイトメーターを用いた間接免疫蛍光検定により、ハイブリッドの上澄み液を、Ｕ９３７細胞に対する反応性で、ふるい分けした。

限定希釈によりクローン化された所定のハイブリッドを、再びふるい分けした後、増殖させた。次に、セファロース−ヒトＩｇＧにより析出した７２，０００ダルトンのタンパク質（ＦｃＲＩ）に対して特異的な結合性を示した、ＩｇＧｌｍＡｂを選択した。この場合、予備実験及び等電点電気泳動パターンを用いて、反応性の同定を行った。ｍＡｂ３２．２のＦｃＲＩに対する結合は、Ｆａｂ’フラグメントがｍＡｂ親和性吸看ＦｃＲＩであるため、抗体のＦｃ領域から独立した部位で行われた。ｍＡｂ３２．２及びヒトＩｇＧ１の天然Ｕ９３７細胞に対する結合は、相互に阻害的なものではなく、ｍＡｂ３２．２は、ＦｃＲＩの配位子結合部位を妨害するものではない、３２．２ハイブリドーマを注射されプリスティン活性化されたネズミの腹水のＩｇＧ分画を、４０％の飽和硫酸アンモニウムを用いて沈澱させた。次に、プロティン−バック５ＰＷ　ＤＥＡＥカラム（ウォーターズ・クロマトグラフィ部、ミリポア、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用したイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、３２．２ＬｇＧ１抗体を精製した。ペプシン温浸を利用したパルハム法（パルハム・Ｐ　：　（１９８３）　Ｊ、　Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ、　１３１：２８９５参照）に従い、ｐＨ３，５で、Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメントを分解生成した。完全に分解するまで、ペプシン温浸をＨＰＬＣで監視した。次に、バイオシルＴＳＫ２５０カラム（バイオラッド、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いたＨＰＬＣゲルろ過クロマトグラフィーにより、Ｆ（ａｂ’）”フラグメントを精製し、これを、１ｍＭジチオトレイトールで１８＠Ｃ１２時間還元した後、２ｍＭヨードアセトアミドで１８＠　Ｃ１時間アルキル化して、Ｆａｂフラグメントを得た。

ＣＤ１５細胞表面抗原と特異的に反応するＩｇＭｍＡｂの一種ＰＭ８１を産生ずるバイプリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＣＲＬ１０２６６として、登録されている。

異種抗体作成Ｆａｂ３２．２及びｍＡｂ　ＰＭ８１の異種抗体を、カルボブスキーら（カルボブスキー・Ｂ　（１９８４）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０：１６８６　）の方法に従い、作成した。Ｆｅｂ３２．２　（ＦａｂＷ６／３２）及びｍＡｂＰＭ８１　（１ないし３ｍｇ／ｍｌ）を、別々に、８倍モル過剰の二元機能試薬Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）　（ファーマシ乙つプサラ、スウェーデン）で、１８’Ｃ，２時間処理した。

５ＰＤＰで処理されたＦａｂ３２゜２を、ｐＨ７，４、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で透析する一方で、５ＰＤＰ処理されたｍＡｂＰＭ８１を、ｐＨ４，５，０，１Ｍリン酸塩−０，１Ｍ酢酸塩−０，１Ｍ塩化ナトリウム溶液で透析した後、０．０２Ｍジチオトレイトールで１８°Ｇ、　３０分間処理し、ｐＩ（”７．　５、Ｏ，１Ｍリン酸塩、Ｏ，１Ｍ塩化ナトリウムで平衡にしたＧ−２５セフアデツクスカラム（ファーマシア）を通した０等モル量のＦａｂ３２．２とｍＡｂＰＭ８１を混合し、１８’Ｃで４時間インキュベートした後、１ｍＭのヨードアセトアミドを用いて、架橋を終了させた０作成された異種抗体をＰＢＳで透析し、０．２μｍずつろ過して、滅菌処理した。得られた抗体は、１５％未満の非架橋Ｆａｂを含み、０．７−１．５０Ｄ２８０　Ｕ／ｍｌの濃度であった。

エフェクター細胞ＡＴＣＣから得られたＵ９３７細胞（サンドストローム・Ｃ，Ｋ・ニールソン（１９７６）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１７：５６５）を１０％熱不活性ウシつ児血清（ＦＢＳ）及びゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ　（ＲＰＭＩ−ＦＢＳ）中で培養した。ジエン・Ｌらの方法（（１９８６）　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉａ＋ｕｎｏ１．６５＋３８７　）に従い、単核細胞を、健常者から得られた細胞泳動群から精製した。即ち、細胞泳動により得られた細胞を、Ｆｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ上でスピンさせて、界面層を採取した。ＲＰＭＩで３度洗浄した後、細胞を１５ｍ１のポリプロピレン管中でＲＰＭＩ−ＦＢＳに再懸濁（５ ×１０７／ｍｌ）し、４°ＣＣ１３ｒｐで１時間回転させて、単核細胞を凝集させた、凝集した細胞を、ＩＸＧで１５ないし３０分間、氷上に沈降させて、上澄み液を除いた。　（２ｍｌの媒体内に存在する）細胞を、同容量の冷ＦＢＳ上に注意深く載せ、４°Ｃで２０分間、ＦＢＳを通して沈降させた。この結果得られた１には、６０−９５％の単核細胞、並びに、残余リンパ球が含まれていた。単核細胞をＲＰＭＩ−ＦＢＳで２度洗浄し、２×１０６／ｍｌの濃度のＲＰＭＩ− ＦＢＳ溶液に調整した後、これを検定した。また、実験によっては、Ｕ９３７細胞（ｓｘ１０５／ｍｌ）あるいは単核細胞（２×１０６／ｍｌ）を、３００国際参照単位（ＩＲＵ／ｍｌ）のヒト・リコンとナンド・インターフェロンガンマ（ジェネテック、サン・フランシスコ、カリフォルニア州）を加えたＲＰＭＩ−ＦＢＳ中で、１８ないし２４時間培養した。

標的細胞ＨＬ−６０白血病細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）を、正常食塩水中（７）２００ μＣ１５１Ｃｒクロム酸ナトリウムにューイングランド・ヌクレア、ボストン、マサチューセッツ州）で、３７°Ｃ１１時間、標識した。細胞は、使用前に、媒体１９９−１０％ＦＢＳで、３度洗浄した。

抗体依存細胞の細胞毒性５１Ｃｒで標識された５Ｘ１０’／ｍｌ標的細胞、標的細胞に対して様々な比率のエフェクター細胞、所定の濃度の異種抗体を、等容量（５０μｍ）、丸底のマイクロタイター容器内で混合した。全ての試験を、３度ずつ行った。異種抗体のみの影響及びエフェクター細胞のみの影響を見るために、全ての実験には、対照群を用いた。２％ドデシ／ＩＮ”ａナトリウム水溶液１００μｍを５０μｍのＣＥに加えた場合を、最大の細胞溶解状態とした。各プレートを３７°Ｃで１８８時間インキュベート、上澄み液の５０％を除いた後、放出された５１Ｃｒを数えた。細胞毒性の割合は、１００×（（エフェクター細胞＋抗体により放出された数）−（エフェクター細胞のみにより放出された数））／（最大の細胞溶解−自然放出）の式に従い、計算された。結果は、３度渭淀した平均上標準偏差で示した。

細胞の異種共役標的細胞を、所定の濃度の異種抗体で、４＠Ｃ１２時間、コーティングし、３度洗浄した後、２×１０７個／ｍｌの濃度に調整した。標的細胞及びエフェクター細胞（２×１０６／ｍｌ）を等容量（５０ｕｌ）混合して、４°Ｃで１時間、穏やかに攪ρし、１時間氷上に放置した。上澄み液を除き、細胞を１００μｍのアクリジンオレンジ中に、静かに再懸濁させて、入射光及び紫外線を用いたヘモサイトメーターで測定した。対検体のエフェクター細胞（２００）を、１つあるいは複数のＣＥ標的細胞への結合に関して、評価した。

マイクロタイター結合検定一層の標的細胞を、マイクロタイター用プレート容器内に入れて、異種抗体を加え、４°Ｃでインキュベートした。結合していない異種抗体を洗浄過程で除き、ＭＴＴでラベルされたエフェクター細胞を加えた。ＭＴＴをイソプロパツールで溶解した後、Ａ３７０でＥＬＩＳＡリーダーを用いて、沖淀した。

結果二元特異性異種抗体に、ヒト単核細胞の腫瘍標的細胞への結合を媒介する能力があることを、ＭＴＴで標識された単核細胞、並びに、ＴＨＰ−１ヒト白血病単核細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ、２０２）あるいは５ＫＢＲ−３乳ガン細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ３０）を標的細胞として用いたマイクロタイター検定により、確認したまた、異種細胞の、ＨＬ−６０前骨髄細胞性白血病細胞の破壊を媒介する能力を、ＡＤＣＣ検定により調べた。単核細胞のみを加えた場合の細胞破壊率は非常に小さいが（５−２０％）、単核細胞に二元特異性異種抗体を加えると、破壊率が２０ないし５０％に上昇し、単核細胞に、二元特異性異種抗体とヒト血清を加えた場合、最大の細胞破壊率５０−８０％が実現できた。

本発明は、上述の実施例以外にも、本発明の要旨を超えない範囲で、様々な態様で実施することが可能である。

補正音の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月２０日〜

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞表面の抗原に結合する抗体あるいはそのフラグメントと、ヒト免疫グロブリンＧに阻害されることなく、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに結合する抗体と、を備える異種抗体で、補体に媒介された、並びに、エフェクター細胞に媒介された細胞溶解を誘発する、ことを特徴とする異種抗体。
２．前記細胞表面の抗原に結合する抗体が、ＩｇＭ分子を含む、ことを特徴とする請求項１記載の異種抗体。
３．細胞表面のＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、ヒト免疫グロブリンＧに阻害されることなく、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的に結合する抗体あるいはそのフラグメントと、を備えることを特徴とする異種抗体。
４．前記ＣＤ１５抗原に特異的な抗体が、ＩｇＭ分子を含む、ことを特徴とする請求項３記載の異種抗体。
５．細胞表面のＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体あるいはそのフラグメントとを、二硫化物の架橋により結合させる、ことを特徴とする請求項３記載の異種抗体。
６．Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体が、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマによ■産生されるモノクロナール抗体である、ことを特徴とする請求項３記載の異種抗体。
７．高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるモノクロナール抗体のＦａｂフラグメントである、ことを特徴とする請求項３記載の異種抗体。
８．前記エフェクター細胞が、単核細胞、マクロファージ、好中球、好酸球から成るグノーブから選択されるヒト細胞である、ことを特徴とする請求項３記載の異種抗体。
９．前記ＣＤ１５を担持する細胞が、骨髄性白血病、肺小細胞ガン、決腸ガン及び乳ガンから成るグループから選択される、ことを特徴とする請求項３記載の異種抗体。
１０．ＡＴＣＣ承認番号ＣＲＬ１０２６６を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　ＰＭ８１と、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　３２．２とを、二硫化物の架橋により結合させることを特徴とする異種抗体。
１１．標的特異性エフェクター細胞で、（ａ）ＩｇＧのＦｃ部位に対する親和性の高いエフェクター細胞表出レセプターと、（ｂ）レセプターの配位子結合領域外にある、エフェクター細胞のＦｃレセプターの抗原決定基に結合する異種抗体と、を備え、前記異種抗体が、更に、（ｉ）細胞表面のＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと（ｉｉ）ヒト免疫グロブリンＧに阻害されることなく、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的に結合すろ抗体あるいはそのフラグメントと、を含む、ことを特徴とする標的特異性エフェクター細胞。
１２．前記ＣＤ１５抗原に特異的な抗体が、ＩｇＭ分子を含む、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。
１３．ＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体あるいはそのフラグメントとを、二硫化物の架橋により結合させる、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。
１４．高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生される、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。
１５．高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるモノクロナール抗体のＦａｂフラグメントである、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。
１６．前記エフェクター細胞が、単核細胞、マクロファージ、好中球、及び、好酸球から成るグループかち選択されるヒト細胞である、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。
１７．腫瘍細胞が、骨髄性白血病、肺小細胞ガン、決腸ガン及び乳ガンから成るグループから選択される、ことを特徴とする請求項１１記載の標的特異性エフェクター細胞。
１８．標的特異性エフェクター細胞で、（ａ）エフェクター細胞上に表出する、高親和性Ｆｃガンマレセプターと、（ｂ）レセプターの結合領域外にある、エフェクター細胞のＦｃレセプターの抗原決定基に結合する異種抗体と、を備え、前記異種抗体が、更に、（ｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＣＲＬ１０２６６を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂＰＭ８１と、（ｉｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　３２．２と、を含む、ことを特徴とする標的特異性エフェクター細胞。
１９．腫瘍患者に、治療に適した療の、標的化されたエフェクター細胞を投与する腫瘍の治療法で、標的化された各エフェクター細胞が、（ｉ）細胞表面のＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、（ｉｉ）ヒト免疫グロブリンＧに阻害されることなく、エフェクター細胞の高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的に結合する抗体あるいはそのフラグメントと、を含む、ことを特徴とする治療法。
２０．前記ＣＤ１５抗原に特異的な抗体が、ＩｇＭ分子を含むことを特徴とする請求項１９記載の治療法。
２１．ＣＤ１５抗原に特異的な抗体あるいはそのフラグメントと、高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体あるいはそのフラグメントとを、二硫化物の架橋により結合させる、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。
２２．高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生される、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。
２３．高親和性Ｆｃガンマレセプターに特異的な抗体フラグメントが、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるＩｇＧ分子のＦａｂフラグメントである、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。
２４．前記エフェクター細胞が、単核細胞、マクロファージ、好中球、及び、好酸球から成るグループから選択されるヒト細胞である、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。
２５．腫瘍細胞が、骨髄性白血病、肺小細胞ガン、決腸ガン及び乳ガンから成るグループから選択される、ことを特徴とする請求項１９記載の治療法。
２６．腫瘍患者に、治療に適した量の、標的特異性エフェクター細胞を投与する腫瘍の治療法で、各標的特異性エフェクター細胞が、（ａ）エフェクター細胞上に表出する、高親和性Ｆｃガンマレセプターと、（ｂ）レセプターの結合領域外にある、エフェクター細胞のＦｃレセプターの抗原決定基に結合する異種抗体と、を備え、前記異種抗体が、更に、（ｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＣＲＬ１０２６６を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂＰＭ８１と、（ｉｉ）ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４６９を有するハイブリドーマにより産生されるｍＡｂ　３２．２と、を含む、ことを特徴とする治療法。