JPH05504133A - 効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビン - Google Patents

効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビン

Info

Publication number
JPH05504133A
JPH05504133A JP3501516A JP50151690A JPH05504133A JP H05504133 A JPH05504133 A JP H05504133A JP 3501516 A JP3501516 A JP 3501516A JP 50151690 A JP50151690 A JP 50151690A JP H05504133 A JPH05504133 A JP H05504133A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hemoglobin
poly
ethylene glycol
polyalkylene oxide
activated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP3501516A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2907300B2 (ja
Inventor
ノー，クワング
ザリプスキー，シュムエル
デイビス，フランク
Original Assignee
エンゾン，インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エンゾン，インコーポレーテッド filed Critical エンゾン，インコーポレーテッド
Publication of JPH05504133A publication Critical patent/JPH05504133A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2907300B2 publication Critical patent/JP2907300B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6445—Haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビ ン １、序文 本発明はヘム酸素結合部位の構造完全性を保持する条件下て基質（ｓｔｒｏｍａ ）をもたないヘモグロビンを最初に効果的に脱酸素化し、かつ還元し、続いてポ リ　（エチレングリコール）　（ＰＥＧ）のようなポリアルキレンオキシドと結 合させる、新規で効率的な方法により製造される化学的修飾ヘモグロビンに関す る。本発明の好ましい実施態様において、ヘモグロビンは化学的修飾のまえに部 分的に脱酸素化されるだけである。本発明方法により製造されるポリアルキレン オキシド化学的修飾ヘモグロビンはすぐれた酸素結合性を有し、効果的で、非免 疫原性の、安定した赤血球代替物として使われる。
２、発明の背景 ２．１．輸血および輸血反応 輸血は、血液量の減少すなわち血液減少症（例えば、出血による）、血液細胞数 の減少（例えば、骨髄破壊による）、または欠陥または損傷した血液細胞（例え ば、溶血性貧血による）を包含する種々の疾患をわずらう患者の血流力学系を補 充するために使われる。輸血は血管内の量を増加させるだけでなく、溶存酸素を 運搬し組織に酸素を運搬する赤血球を供給する役目を果たす。
たびたび、輸血を要する事態か急に起こる。以前に健康な人の場合、正常血液量 の１０％（すなわち、約５００ｍ１）の急性血液損失は、小動脈床の収縮と脈は くの増加により補われるが、血液量か１５％〜２５％（すなわち、約７５０〜１ ２５０ｍ１）減少すると、心拍出量か著しく落ちる。その後、相対的に少ない血 液損失か、心拍出量、血圧および組Ｗ＆潅流の生命を脅かす程の減少をもたらす 。組織への酸素運搬の減少は嫌気性グリコリシスおよび血中乳酸レベルの上昇を 促進する（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　＋９８３．　ｉ ｎ″Ｈａｒｒｉｓｏｎ’　５Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ″、　ｐ＋４６ｒｓｄｏｒｆら、ｅｄｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉ ｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎ、Ｙ、、　ｐ、１７３）。かかる状況に おいて、十分な血液補充かすぐに利用できることが重要である。
現在、多くの静脈内流体か急性血液減少症の治療に利用されており、乳酸含有リ ンゲル液または生理食塩水のような結晶質、および正常ヒト血清アルブミンのよ うなコロイド液を包含する。結晶質およびコロイド液は一時的に量の不足を補う が、組織への酸素運搬を直接補足しない。輸血は好ましい治療の方法であるか、 輸血が命じられて投与される前にしばしば時間的遅れが生じる。
たびたび、患者の正確な血液型を供与血液の注文前に決定する必要がある。Ｍａ ｙ、ｉｎ　”Ｅ＋ｎｅｒｇｅｎｃｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”　（１９８４，Ｊｏｈ ｎ　Ｗｌｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｐｕｂｌ、、　ＮＹ、　＋２６３）は、重湛を 負った患者にとって“供与される血液の型は通常その時の血液銀行での入手可能 性に左右される”と説明している。不幸なことに、輸血のために入手可能な血液 の量および種類は一貫性がなく予測できないし、まれな血液型については、入手 可能性が常に問題となる。
入手可能性の問題に加えて、輸血は免疫反応または非免疫反応として大別される 数々の臨床的合併症と関連している。免疫学的輸血反応のうちで溶血反応（赤血 球の溶解）は、血管内または血管外で生じる赤血球同種異系抗体によるものであ る。血管外溶血反応はＲｈ系の抗体と通常関連しているか、数種の別の抗体も関 係している（例えばＫｅｌｌ、　ＤｕｆｆｙおよびＫｉ　ｄｄ系の抗原に反応す る抗体）。臨床的症状は一般に比較的軽く、倦怠感および熱から成っている。し かしながら、血管外溶血反応はＡＢＯ系での不一致に通常よるもので、不安、心 配、紅潮、胸痛または腰痛、頻呼吸、頻脈および吐き気、しばしばこの後にショ ックおよび腎不全を包含する、さらに重い臨床的症状と関連している（Ｇｉｂｌ ｅｔｔ、　ｉｎ”Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔ ｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、”　Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ。
ら、ｅｄｓ、　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、Ｎ、Ｙ、、ｐ、１ ９１５）。
非照射血液製品の輸血は、免疫無防備状態の患者において急性移植片対宿主病と 関連している（ｖｏｎ　Ｆｌｉｅｄｎｅｒら、　１９８２．　Ａｍ、　Ｊ。
Ｍｅｄ、　７２：９５１−９６１；　Ｂｒｕｂａｋｅｒ、　１９８６．　Ｈｕｍ 、　Ｐａｔｈｏｓ、　１７：１０８５−１０８８；Ｋｅｓｓｉｎｇｅｒら、１９ ８７．　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、０ｎｃｏ１．３６：２０６−２０９）。しかしながら 、最近輸血に関連した致命的な移植片対宿主病の２つのケースが心臓手術後の免 疫能力のある患者において報告された（Ｔｈａｌｅｒｅｔ　ａｌ、、　１９８９ ．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２１：２５−２８＞。
非免疫輸血反応は、循環過負荷（特に腎不全または心不全のある患者）、感染、 代謝障害、空気および脂肪塞栓症、血栓性静脈炎、および鉄沈着症を包含する。
多量の輸血はカリウム過剰血症、アンモニアおよびクエン酸素（−週間以内保管 した血液を使用することにより避けられる）、および希釈による凝固障害（血小 板濃縮物を補充することにより回避できる）を生じうる。鉄沈着症は、溶血血液 からの遊離鉄にさらされることから生じる（Ｇｉｂｌｅｔｔ。
ｉｎ″Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐ１ｅｓ　ｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、”　Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆら、ｅｄｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈ ｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、Ｎ、Ｙ、、ｐ、＋９１５）。
輸血に関連している感染は、肝炎（特に非Ａ型、非Ｂ型）、サイトメガロウィル ス感染、梅毒、マラリャ、トキソプラズマ症、プルセラ病、後天性免疫不全症候 群および成人子細胞白血病を包含する。１９８５年３月に始まる、ヒト免疫不全 ウィルス（ＨＩｖ）の危険のある人々による血液提供の自発的延期および提供さ れたユニットのＨＩＶ利抗体のスクリーニングは輸血関連の旧■感染の危険を減 少させている（Ｗａｒｄら、　１９８６．　ＪＡＭＡ　２５６：３５７−３６１ ．　Ｗａｒｄら。
１９８８、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１８：４７３−４７８）　 、しかしながら、事前にスクリーニングした血液成分によるＨＩＶ伝播のまれな ケースか報告されている（ＭＭＷＲ，１９８６，３５：３８９−３９１）。Ｉｍ ａｇａｗａら（１９８９，Ｎ。
Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２０：１４５８−１４６２）は、従来のＥＬＩ ＳＡおよびウェスタンプロットアッセイで抗体陰性と検定された１３３人の危険 率の高い人々のうち３１人から感染性ＨｒＶ−１ウィルスが単離されたことを報 告した。さらに提供された血液ユニットのＨＴＬＶ−ｒ　（ヒトＴ細胞白血病の 一形態の原因因子）に対する抗体のスクリーニングがＦＤＡにより最近提案され た（ＭＭＷＲ，１９８８，３７：７３６−７４７）　、　Ｃｏｈｅｎら（１９８ ９，Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２０：１１７２−１１７６）は、［ ■−１伝播の観察された危険率は血液ユニット当り０　、００３パーセントであ ると報告した。ＨＴＬ’／−［感染の危険率は輸血された血液ユニット当り０． ０２４パーセントであることがわかった。
２．２．赤血球代替物 結晶質およびコロイド状静脈内容量エキスパンダーに加えて、過去１５−２０年 間のうちに酸素運搬能力を有する、いくつかの赤血球代替物が開発されている。
例えば、ペルフルオロ化合物（例えばフルオザルーＤＡ　（Ｆｌｕｏｓａｌ−Ｄ Ａ）およびオキシフェロール（Ｏｘｙ−ｐｈｅｒｏｌ））はヒトの血液代替物と して実験的に使用されている（Ｇｏｕｌｄら、　８６．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ 、　ｖｅｄ、　３１４：１６５３−１６５６）　、血液代替物としてのペルフル オロ化合物の概説についてはＲｉｅｓｓら（１９７８゜Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ、 　［ｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、　１７：６２１−６３４）も参照されたい。さ らに、無細胞ヘモグロビン調製物が代替赤血球代替物として開発されている。
２．３．ヘモグロビンの化学 天然のヘモグロビンは２本のα鎖および２本のβ鎖からなる四量体として存在す る。各αおよびβ鎖は非共有結合がヘム基に結合している。αおよびβ鎖もまた 水素結合およびファンデルワールス力に起因する非共有結合により結合されてい る。各サブユニットに１つずつの４個のヘム基は酸素４分子を結合できる。これ らのヘム基、すなわち鉄原子が四角平面配位錯体を形成する平らな分子は、完全 な分子で相互に、比較的かなり離れて位置している（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　１ ９７５．　ｉｎ“ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙどＷｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｓ。
Ｉｎｃ、、　Ｎ、Ｙ、　ｐｐ、１４５−１４９）。
ヘモグロビンは赤血球の全タンパク質の約９０％を構成する。全血１００ｍ１は 、ヘモグロビンの結合能力により気体酸素約２１ｍ１を吸収できる。酸素結合と 同等に重要なことは、ヘモグロビンか結合酸素を組織に放出するにも効率かよい ことである。ヘモグロビンの酸素結合および放出能力は、ヘモグロビンの５０パ ーセント飽和を生じる酸素分圧、Ｐ５゜とじてしばしば定量的に表わされる。
酸素の分圧とヘモグロビンの飽和パーセントとの関係は、位置がｐＨにより影響 される（ボーア効果）Ｓ字状曲線として表わされる。所定の酸素分圧で、ヘモグ ロビン溶液のｐＨが高い程、酸素による飽和パーセントか大きくなり、ＰＳＯか 低くなる。すなわち酸素飽和曲線は横軸上を左に移る。逆に、ヘモグロビン溶液 のｐＨか低い程、酸素による飽和パーセントか低くなり、Ｐｓｏが高くなる。
すなわち酸素飽和曲線は横軸上を右に移る。したかってヘモグロビンか肺の相対 的にアルカリｐＨから酸素の乏しい組織の相対的に酸性ｐＨに（嫌気性呼吸によ り乳酸を産生ずる）移動するにつれて、ヘモグロビン分子はその酸素負荷を放出 する傾向を有する。
ヘモグロビン分子またはその構造の変化は酸素結合親和力の変化と関連している 。例えば、２，３ジホスホグリセレート（２，３ＤＰＧ）との結合は酸素とヘモ グロビン間の結合をゆるめ、酸素の組織への放出を促進する。例えば高い探高お よび妊娠中のような酸素伝達の増大が所望される生理学的条件下では２．３　Ｄ ＰＧの血清レベルが上昇する。逆に、ヘム補欠分子団中の鉄イオンがＦｅ（ＩＩ ）からＦｅ　（ＤＩ）に酸化されると、メトヘモグロビンとなった分子は酸素移 転を妨げるように酸素に強く結合する。
２．４．基質なしのヘモグロビン 赤血球代替物として遊離ヘモグロビンを利用しようとして、赤血球溶血物を輸血 により投与している。しかしながら、基質構成物は非常に毒性があり、凝固障害 および関連腎不全を生じることがわかった。■９６７年Ｒａｂｉｎｅｒは基質を 含まないヘモグロビン溶液を調製するために遠心および超遠心法を用いた（Ｒａ ｂｉｎｅｒら、　１，９６７゜Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１２６：１１２７） 　１９７７年までに血漿形体の基質不含ヘモグロビンが調製されている（Ｄｅ　 Ｖｅｎｕｔｏら、　１９７７、　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ。
Ｍｅｄ、　８９：５０９）。
赤血球微環境より取出された基質なしのヘモグロビンは酸素にあまりに強固に結 合しく低いＰ、。）輸血後の循環半減期か短い傾向を示すことかわかった。ヘモ グロビン酸素結合曲線において左側へのシフトを反映する低いＰＩＯは、ある程 度、基質不含ヘモグロビンか赤血球内（７，２）で経験するよりも血漿中（７， ４）て高いｐＨにさらされる結果として生じる。さらにヘモグロビンと２，３− ジホスホグリセレート間の自然結合は、ヘモグロビンか赤血球から取り出された 場合に破壊された。クリアランスに関して、基質不含ヘモグロビンか腎臓により すみやかに除去され、輸血半減期か約１００分にすぎないことが観察された。
Ｐ、。を増大させヘモグロビンをさらに安定化しようとして、数多くの化学的修 飾を基質不含ヘモグロビンに導入している。たぶん基質不含ヘモグロビンの最も 広く用いられている化学的修飾は、Ｐ、。を増大させるためにピリドキサール５ ′−ホスフェートおよびホウ水素化ナトリウムまたはカリウムを利用しているＣ Ｂｅｎｅｓｃｈら、１９７２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１：３５７６）。
基質不含ヘモグロビンの半減期を延ばすために、ヘモグロビンはデキストラン（ Ｃｈａｎｇ、　Ｊ、　Ｅ、ら、　１９７７、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、５５：３９８）　、ヒドロキシエチルデンプン（ＤＨＯ３Ｎｏ、　２，６１６ ．０８６）、セラチン（ＤＥ　ＡＳ　２，４４９．８８５）、アルブミン（ＤＥ 　ＡＳ　２．４４９．８８５）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　（ ＤＥ　３０２６３９８：米国特許第４゜６７０、４１７号、米国特許第４．４１ ２．９８９号：米国特許第４．３０１．１４４号）のような池の巨大分子と結合 される。ポリヘモグロビン（米国特許第４．００１．２００号および第４．００ １．４０１号）を形成するために基質不含ヘモグロビンを架橋したり、または、 例えば２７Ｎ−２−ホルミル−ピリドキサール−５−ホスフェートおよびホウ水 素化物（Ｂｅｎｅｓｃｈら、＋９７５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、６２：１１２３）；たはジアスピリン（ビス３．５−ジブ ロモサリチレートのジエステル：米国特許第４　、５２９．７１９号参照）を用 いてヘモグロビン分子を内部架橋する技術もまた開発された。
基質不含ヘモグロビンの別の修飾はＨＡＤ）（およびＨＡ、Ｄ　Ｐ　Ｉを用いて メトヘモグロビン形成速度を減少させる方法を包含する（Ｓｅｈｇａｌら、１９ ８＋、　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、　３１：１３−１７）　。Ｋｅｉｐｅｒｔ およびＣｈａｎｇ（＋９８５．　Ｂｉｏｍａｔｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ｄｅｖｉｃｅ ｓ　Ａｒｔｉｆ、　Ｏｒｇａｎｓ　１３：］５６）は全血液量の６７パーセント の激しい出血をしたラットを生き返らせるのにピリドキサールホスフェート処理 したポリヘモグロビンの効力を検定し、長期生存を提供して全血に匹敵すること がわかった。
ヒト赤血球代替物として異種からの基質不含ヘモグロビンの使用か示唆されてい る（例えば、米国特許４．６７０．４＋７；　４．５８４．１３０；４．５２９ ．７１９；　４．４１２，９８９；　４，３７７．５１２；　４．３０１，１４ ４．４，０６１，７３６号）。
しかしなから、Ｃｈａｎｇら（１９８７，Ｂｉｏｍａｔｅｒ、　Ａｒｔｉｆ、Ｃ ｅ１ｌｓ　Ａｒｔｉｆ。
Ｏｒｇａｎｓ　１５：４４３−４５２）は、免疫化用量の異種（すなわち種間交 雑）ヘモグロビンがレシピエンド動物による抗体産生と関連していることを明ら かにした免疫学的研究を行った。さらに異種ヘモグロビンを架橋することは免疫 応答を増大し、それによってヒト赤血球代替物として種間交雑ヘモグロビンを使 用することに反対の意見を唱えている。
２．５．赤血球代替物として用いるためにヘモグロビンを修飾する方法 下記は赤血球代替物として用いるためにヘモグロビンを修飾するのに用いられる 数々の方法の概説である。
１９８７年５月８日に出願され、１９８８年１０月１１日に発行されたＢａｎｈ ａｒｄらの米国特許第ｒＪ、　７７７、２４□１号は基質不含のヘモグロビン中 の脱酸素ヘモグロビンの割合を増大するアスコルビン酸、還元グルタチオンまた は還元メチレンブルーのような酸素消費還元剤の使用に関する。ヘモグロビンは ピリドキサールホスフェートまたはイノシトールへキサホスフェートのようなエ フェクター物質によりさらに修飾された。ジアルデヒドを用いて修飾ヘモグロビ ンを架橋し、引き続いてこれをカルボニル基特異的還元剤と反応させた。生成物 は約３６ｍｂａｒのＰ、。をもつと報告された。実験データは生成物メトヘモグ ロビン含ｆ１５．１％、Ｐｓｏ３８．６およびコロイド浸透圧３６．８ｍｂａｒ を示す。
１９８６年２月２１日に出願され、１９８７年６月２日に発行された１ｗａｓａ ｋｉらの米国特許第４．６７０．４１７号は、ヘモグロビンのアミノ基がアミド 結合を介してエーテル含有ポリアルキレンオキシドのカルボキシル基と結合して いる、ポリアルキレンオキシドと結合したヘモグロビンに関する。反応系は酸素 を除き、不活性ガスに置き換えられた。安定剤（例えば亜硫酸ナトリウム、重亜 硫酸ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩ）、ＥＤＴ、ｌ、その他）を最終生成物に添加し 、このものにグルコースおよび／またはマンニトールも添加してメトヘモグロビ ン形成を減少させた。実験データは、種々の生成物のＰＳＯ値か１３．７．６． １および１２ｍｍＨｇであることを示した。２．９２％のメトヘモグロビンか報 告された。
１９８５年３月２９２Ｉに出願され、１９８６年４月２２日に発行されたＢｕｃ ｃｉらの米国特許第４　、５８４．　＋　３０号は、２．３−ジホスホグリセレ ートに似せた試薬により架橋された基質不含ヘモグロビンに関する。実験データ は２６．９５のＰｓｏを有する修飾ヒトヘモグロビンが製造されうることおよび 修飾ウシヘモグロビンか４０．１７ｍｍＨｇのＰ５゜を示すことを示した。
１９８３年５月４日に出願され、１９８５年７月１６日に発行されたＴｙｅらの 米国特許第４　、５２９．７１９号は、真空を用いて脱酸素化され続いて不活性 雰囲気でビス−ジアスピリンエステルと架橋され、その後ピリドキサールホスフ ェートと反応させた基質不合ヘモグロビンに関する。実験データは修飾ヘモグロ ビン生成物が３２ｍｍＨｇのＰ５゜および約２０時間の半減期と関連しているこ とを示した。
１９８２年６月３日に出願され、１９８３年１１月１日に発行されたＩｗａｓｈ ｉｔａらの米国特許第４　、４１２．９８９号はＰＥＧ、ポリプロピレングリコ ールおよびエチレンオキシドとプロピレンオキシドの共重合体からなる群から選 択されたポリマーと結合したポリカルボン酸にアミドを通して共有結合されたヘ モグロビンまたはヘモグロビン誘導体に関する。反応系は脱酸素化されず、実施 例ではピリドキサールホスフェート、カルボニルヘモグロビンおよびグルコース ６−ホスフェート誘導体を含むエフェクター分子が使用され、そしてカルボジイ ミドおよびジメチルホルムアミドのような縮合剤の存在下でヘモグロビンとＰＥ Ｇを反応させた。実験データは実施例の項の修飾ヘモグロビン生成物が３．１− １３．５の範囲のＰ、。および２５０分の最大半減期を有することが示された。
１９８１年６月２６日に出願され、１９８３年３月２２日に発行されたＡｊｉｓ ａｋａおよびｒｗａｓｈｉｔａの米国特許第４．３７７、５１２号はインシュリ ンとの結合により修飾されたヘモグロビンに関する。最大半減期１２０分を報告 した。
１９８０年７月１０日に出願され、１９８１年１１月１７日に発行されたＡ　ｊ 　ｉ　５ａｋａおよび１Ｗａｓｈｉｔａの米国特許第４．３０１．１４４号は臭 化シアンのような縮合剤または塩化シアヌルのような架橋試薬の存在下でヘモグ ロビンとポリアルキレングリコールを反応させることにより製造された修飾ヘモ グロビンに関する。実験例において、１９、５ｍｍＨＩｌ！の最大Ｐ、。および １５０分の最大半減期が報告された。
２．６．　ＰＥＧ化 ＰＥＧ化は酵素およびホルモンのようなポリペプチドを、生理学的に活性のある 非免疫原性水溶性ポリペプチド組成物を生成するためにポリエチレングリコール と結合させる方法である。ポリエチレングリコールはポリペプチドを活性損失か ら保護し、組成物を実質的に免疫原性応答なして唾乳動物循環系に注入できる。
ＰＥＧ化の方法は、ここにそのまま参照により引用する、１９７７年７月２８日 出願で、１９７９年１２月１８日発行されたＤａｖｉｓらの“非免疫原性ポリペ プチド“と題する米国特許第４　、１７９．３３７号に詳細に記載されている。
３、発明の要約 本発明はヘム酸素結合部位の構造完全性を保持する条件下で基質不合ヘモグロビ ンを最初に効果的に脱酸素化しかつ還元し、続いてポリ　（エチレングリコール ）　（ＰＥＧ）のようなポリアルキレンオキシドと結合させる、新規で効率的な 方法により製造される化学的修飾ヘモグロビンに関する。
本発明の特別な好ましい実施態様において、脱酸素化および還元は不活性雰囲気 下、アミノ酸システィンにより行なわれる。別の好ましい実施態様において、ヘ ム酸素結合部位の構造完全性は反応混合物中の高アニオン濃度により保持される 。本発明のさらに好ましい特別の実施態様において、ポリアルキレンオキシドは ポリエチレングリコールである。本発明のさらに好ましい特別の実施態様におい て、ポリアルキレンオキシドはウレタン（カルノくメート）結合を介してヘモグ ロビンに結合される。
本発明の新規ＰＥＧ修飾ヘモグロビン化合物は、優れた酸素運搬能力、半減期延 長、および重要なことは低い免疫原性を示す。本発明の特別な実施態様において 、ＰＥＧ脩飾ウシヘモグロビンは下記の長所を提供する： （ｉ）ウシ源由来のヘモグロビンの使用は、ＰＥＧ−ｂｌ（ｂ生成物による肝炎 、ＨＩＶまたはＨＴＬＶ伝播の危険性を効果的に除去する、（ｉｉ）本発明のＰ ＥＧ−ｂＨｂの酸素結合特性はこれらの化合物を酸素運搬用の効果的な担体とす る、 （ｉｉｉ）本発明のＰＥＧ−ｂＨｂは安定なので、赤血球代替物および容量エキ スパンダーとして臨床上の使用か可能である。
（ｉｖ）　ＰＥＧ−ｂｉｂは流動体の“第三スペース”散布を防ぐ生理学的に便 利なコロイド浸透圧ならびに利尿を育する、（ｖ）　ＰＥＧ−ｂＨｂは比較的安 い価格で多量に入手可能であり、乾燥状態でも溶解状態でも安定である、 （ｖｉ）　ＰＥＧ−ｂＨｂの低い免疫原性はアレルギー性の輸血反応の危険性を 減少させる、 （ｖｉ）赤血球代替物として使用されるＰＥＧ−ｂＨｂは移植片対宿主病の発生 を除（、 （ｖｉ）　ＰＥＧ−ｂｉｂは意外にも低濃度の遊離鉄と関連しているので、鉄毒 性および蓄積の可能性を減少させる、そして（ｉｘ）　ＰＥＧ−ｂＨｂはＨｂ二 量体形成の減少を示す。
注目すべきことは、　Ｉｗａｓａｋｉらの米国特許第４　、６７０．４７１号（ １９８６年２月２１日に出願、１９８７年６月２日発行）　、Ｉｗａｓｈｉｔａ らの米国特許第４　、４１２．９８９号（１９８２年６月３日出願、１９８３年 １１月１日発行）およびＩｗａｓｈｉｔａおよびＡｊｉｓａｋａの米国特許第４ ．３０１．１４４号（１９８０年７月１０ＥＩ出願、１９８１年１１月１７０発 行）に記載されている当分野で知られたポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン 複合体は、本発明の修飾ヘモグロビン化合物よりも有意に低いＰ、。値および著 しく高い分解速度をもつと報告された。本発明はポリアルキレンオキシドに結合 され、少なくとも約２０ｍａ＋ＨｇのＰ、。を育する化学的修飾ヘモグロビンを 提供する。
種々の実施態様において、本発明の方法は単量体ヘモグロビン（単官能性ポリア ルキレンオキシドにより修飾された）をもたらす。一方、本発明の方法は、二官 能性ポリアルキレンオキシドにより最初に修飾され、続いて単官能性ポリアルキ レンオキシドによりさらに修飾された重合体ヘモグロビンをもたらす。
本発明は、また、化学処理のまえにヘモグロビンを部分的に脱酸素化することか らなる後続の化学修飾のためにヘモグロビンを調製する方法に関する。部分的に 脱酸素化されたヘモグロビンか化学的に修飾される場合、生したヘモグロビン生 成物は化学的修飾完全脱酸素化ヘモグロビンに比べて高いＰＩＯ値（優れた酸素 伝達能力を示す）をもつことか観察され、前記方法は部分的にこの観察に基づい ている。優れた酸素伝達が可能なヘモグロビンを製造するこにより、本発明は治 療を必要としている患者の酸素輸送に効果的な容量エキスパンダーおよび効率の よい担体であるヘモグロビンを含んでなる医薬組成物を提供する。
３．１．略語 ｂＨｂ　ウシヘモグロビン ＢＳＣ−ＰＥＧ　ポリ　（エチレングリコール）−ビスーＮ−スクシンイミドカ ーポネート デオキシ（ｄｅｏｘｙ）Ｈｂデオキシヘモグロビン２．３　ＤＰＧ　２．３ジホ スホグリセレートＨｂ　ヘモグロビン ＧＳＨ還元グルタチオン メト（Ｍｅ　ｔ　）　−Ｈｂ　メトヘモグロビンオキシ（ｏｘｙ）−Ｈｂ　酸素 化ヘモグロビンＰＥＧ　ポリエチレングリコール ５Ｃ−ＰＥＧ　ポリ　（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカーボネー ト ４、図面の記載 図１＝ヘモグロビン修飾のための５Ｃ−ＰＥＧおよびＢＳＣ−ＰＥＧの使用５、 発明の詳細な説明 本発明は、すぐれた酸素運搬能力、増大した半減期及び低い免疫原性をもつ新規 なポリアルキレンオキシド修飾ヘモグ。ビンに関する。本発明は、また、ポリア ルキレンオキシド修飾ヘモグロビンの製造のための新規方法に関する。本発明の ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビン化合物は、効果的な赤血球代替物とし てそれらを必要とするヒト又は動物において使用することかできる。
限定するものではなく、開示を明りょうにする目的で、本発明は次のサブセクシ ョンに記載される・ （ａｌ　ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンの製造方法：（１）ヘモグロ ビンの還元 （２）修飾に先立つヘモグロビンの部分的脱酸素化（３）結合 （４）二回目の還元 （５）滅菌 （６）ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンの特性化（ｂｌ　本発明の利用 ５．１．ポリアルキレンオキシド修飾非ヒトヘモグロビンの製造方法 ヒト又は非−ヒトのヘモグロビンが本発明により使用できる。
好適な態様において、限定されるものではないが、牛、羊、馬及び豚ヘモグロビ ンを含むいずれかの相応の動物源からの非ヒトヘモグロビンが本発明により使用 てきる。本発明の好適な態様において、牛ヘモグロビン（ｂＨｂ）が使用できる ；牛ヘモグロビンは、簡単に大量に入手でき、そして好適な酸素−結合特性を示 す、ヒトヘモグロビンとは異なり、牛ヘモグロビンは生理学的に有用な酸素親和 性を達成するための、ピリドキサールリン酸のような奏効剤による修飾を必要と しない。
５　、１．１．ヘモグロビンの還元 酸素運搬能力を最適にするために、本発明のヘモグロビンは最初に（ｉ）ヘモグ ロビンを脱酸素化してデオキシヘモグロビン（デオキシＨｂ）を製造する剤及び （ｉｉ）ヘモグロビンを還元してメトヘモグロビン（Ｆｅ（伍）イオンを運搬す るヘモグロビン）含量を減少させる剤で処理される。本発明の好適な特定の態様 では、ヘモグロビンは修飾生成物のＰｓｏを増大させるために修飾に先立って部 分的にのみ脱酸素化される（５．１．１．１節参照、後述）。好ましくは還元は 酸素を含まない不活性雰囲気中において実施される。還元は化学的還元剤又はガ ス交換法のいずれかを使用して達成されつる。ガス交換は、窒素、ヘリウム又は アルゴンのような加圧された不活性気体に対してＨｂ溶液を気体透過性の中空フ ァイバー膜を通して再循環させることにより成功裏になし得る。市販されている 気体透過性膜（いわゆるオキシゲネイター）はポリプロピレン又は酢酸セルロー スから製造されている。既知の酸素除去剤に関連して、種々の化学的還元剤も使 用できる；かかる還元剤には、それらに限定されるものてはないが、アスコルビ ン酸ナトリウム、グルタチオン、Ｎ−アセチルシスティン、及びＮ−アセチルメ チオニンが含まれる；しかしながら、本発明の好適な態様では、システィンがヘ モグロビンを脱酸素化及び還元するために使用される。後記するセクションＩ２ の実施例で示されるように、システィンはメトヘモグロビン及び遊離（ｆｒｅｅ ）鉄の量を最小化しつつ、デオキシヘモグロビンのパーセントを最適化する点で 他の剤よりもすぐれていることか見い出された。
本発明の好適かつ特異的な態様において、牛ヘモグロビンは以下の方法に従かっ て、システィンを使用して還元され得る：市販のソース（バイオピュアー（Ｂｉ ｏｐｕｒｅ）、　ＭＡのような）から得られる牛ヘモグロビン（ｂＨｂ）は、次 のようにして製造されうる。
０、１　Ｍ　Ｎａ−ホスフェート、０．１Ｍ　ＮａＣ１緩衝液中の５〜８％ｂＨ ｂの溶液に、最終濃度が１から１００ミリモル、好ましくは１〜３０ｍＭとなる ようにシスティンを加える。次いて、反応は約０．０１〜０．５ＭＮａＣ１と約 ０．　Ｏ１〜Ｏ，Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｚの存在下、ｐｉ（７，５〜８．５、不活 性雰囲気中で（例えば、窒素雰囲気下で）約４°Ｃにて実施される。反応は、オ キシ〜ｂＨｂを脱酸素化し、　メト−ｂＨｂ　（牛メトヘモグロビン）を還元す るために、１〜６時間、好ましくは１〜２時間進行させる。約６時間後に、オキ シ−ｂ）ｌｂの量は約１％以下とすべきであり、メト−Ｈｂの量は０．５％以下 とすべきである。反応か完了したら、還元されたヘモグロビンは当該分野で既知 のいずれかの方法によりシスティンから分離しうる。本発明の好ましい態様にお いて、３０〜５０にの分子量範囲の限外濾過膜を使用して、システィン並びに二 量体のｂＨｂサブユニットを除去しつる。
５　、１．１．１．修飾に先立つヘモグロビンの部分脱酸素化本発明は、化学的 修飾に先立って、完全にてはなく、部分的にヘモグロビンを脱酸素化することか ら成るヘモグロビンの予備状態調製方法にも関する。当該分野においては、修飾 されるヘモグロビンが化学的修飾の物理的圧力、シアフィルトレージタン（ｄｉ ａｆｉｌｔｒａｅｉｏｎ）及び／又は滅菌濾過及び滅菌に耐えられるようにして 、修飾されたヘモグロビンにデオキシヘモグロビンの構造完全性を付与する目的 で化学的＊飾に先立っである程度脱酸素化することか必要であることか知られて いる。さらに、もしヘモグロビンサブユニットが架橋されなければならないとき は、ヘモグロビンの脱酸素化はアルファ鎖のＬｙｓ９９の反応性部位か架橋剤に アクセス可能とすることか必要であるかもしれない。
本発明は、部分的には、下記のセクションＩ３からＩ５に示される実験結果に基 づくものであり、それによれば、完全てはない部分的な脱酸素化か最良のＰ、。
値と関係することか観察された。本発明により予備状態調整されうるヘモグロビ ンには、ヒト又は非ヒト源、例えば、豚、牛、羊、又は馬に由来する基質を有し ないヘモグロビンか含まれる。脱酸素化のためには、ヘモグロビンは好ましくは 水溶液てあり、約１〜ｌＯパーセントの濃度（Ｗ／Ｖ）である。
好適な特定の態様において、ヘモグロビン溶液は約０．０５〜１．ＯＭＮａＣＩ 、０．０５〜０．５Ｍ　Ｎａ−ホスフェートＮａ、及び０．０１〜０．１ＭＮａ ＨｃＯ，を有するｐＨが約７，４〜８，８の電解質組成物を含み得る。ヘモグロ ビンは、本発明の特別の態様においては、予備状態調製するに先立って十分に酸 素化され得るものであり、予備状態調製はヘモグロビンの脱酸素化を含む。一方 、本発明のある態様においては、予備状態調製のプロセスか一定量の酸素をヘモ グロビンに再導入することから成るように、ヘモグロビンは実質的に脱酸素化さ れていてもよい。脱酸素化されたヘモグロビンの最終パーセントは、本発明によ れば、好適には５０〜８０％の間である。
それゆえ、特定の態様において、本発明は酸化されたヘモグロビンを不活性ガス にさらし、その結果（ｉ）ヘモグロビンから酸素を取り除く、及び（ｉｉ）デオ キシヘモグロビンの最終濃度を約５０〜８０％の間にする、ことから成る方法を 提供する。他の態様において、本発明は脱酸素化されたヘモグロビンを酸素にさ らし、デオキシヘモグロビンの最終パーセントを約５０〜８０％の間とする方法 を提供する。脱酸素化はコントロールが一層容易であるから、前者の方法は後者 のプロセスよりも好ましいかもしれない。
ガス交換は、当該分野で知られているいずれの方法によっても実施しうる。それ に限定されるものてはないが、例えば、ヘモグロビンの脱酸素化はヘモグロビン 溶液を（限定されるものではないか）窒素、アルゴン又はヘリウムのような不活 性気体にさらすことにより実施しつる。これに対して、完全に脱酸素化されたヘ モグロビンは、脱酸素化されたヘモグロビン溶液を酸素にさらすか、又は一定割 合の酸素を含む気体にさらすことにより、部分的に再度酸素化され得る。気体に さらされるヘモグロビンの表面積を最適にすること、及び／又は脱酸素化レベル を溶液を通じて相対的に均一とするためにヘモグロビンを循環させることか望ま しいかもしれない。本発明によれば、溶液中のヘモグロビンの脱酸素化のレベル をモニターできることか重要である。かかるモニターは、デオキシヘモグロビン の所望のレベルか達成されたら、ガス交換プロセスを停止可能とするために連続 的であることが望ましい。それに限定されるものではないか、例えばこのモニタ ーは０５Ｍ３ヘムオキシメーター（Ｈｅｍａｘｉｍｅｔｅｒ、　Ｒａｄｉｏｍｅ ｔｅｒ、：ｌペンハーゲン）により実施しうる。
本発明の好ましい態様において、ガス交換はそれらに限定されるものではないが 、ポリプロピレン又はセルロースアセテート膜を含む気体透過性膜を通して実施 しうる。例えば、ヘキストーセラニーズ（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ） 社のセルガード（Ｃｅｌｇａｒｄ、登録商標）ポリプロピレン多孔中空ファイバ ー装置、アメリカンフルイド（Ａｍｅ−ｒｉｃａｎ　Ｆｌｕｉｄ）社のセル−フ ァーム（Ｃｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ　：登録商標）中空ファイバーオキシゲネーター を含む市販のガス交換装置、又は、隔室を通して気体及びヘモグロビンか循環さ れる他のシ、）ずれの市販の又は市販されていない装置が使用し得る。本発明の 好適な特定の態様において、実質的にオキシヘモグロビンから成るヘモグロビン は、約２００ミクロンの内径の薄い中空ファイバー膜を有するヘキストーセラニ ーズセルガード（登録商標）ポリプロピレンマイクロポーラス中空ファイバーガ ス交換装置を通して、泡形成を最小にするために約１０１０−１Ｏ０／分／ｆｔ ２表面積の流速で、約６％Ｈｂ（ｇ／ｄｌ）の水溶液、０．５Ｍ　ＮａＣ１，０ ，ＩＭ　Ｎａ２ＨＰＯ，及び０．０５ＭＮａＨＣＯ，を約７．８のＩ）Ｈ１約４ 〜６°Ｃにおいて循環させツツ、一方、約５〜２０ｐ、　ｓ、　ｉ、の圧力の窒 素を上記装置に供給することにより脱酸素化できる。ヘモグロビンは好適には約 ５〜３０分間循環され、約５０〜８０パーセントの間のデオキシヘモグロビン最 終パーセントとなる。脱酸素化されたヘモグロビンを製造するための他の方法は 、ヘモグロビン溶液を、それに限定されるものではないが、アスコルビン酸ナト リウム、ニチオン酸ナトリウム及び重亜硫酸ナトリウムを含む化学的還元剤にさ らすことから成る。化学的還元剤の濃度、及び／又は反応時間又は温度は、部分 的に脱酸素化されたヘモグロビン生成物が得られるように調節できる。一方、還 元剤はヘモグロビンを実質的に脱酸素化するために使用でき、次いで、酸素が部 分的に脱酸素化された生成物を形成するために再導入しうる。本発明の好ましい 特定の態様において、ヘモグロビン溶液は化学的修飾を行う約１時間前に１００ ｍＭａ１度の重亜硫酸ナトリウムにさらすことができる。
予備状態調整され、部分的に脱酸素化されたヘモグロビンは、次いで当該分野で 既知のいずれかの方法を使用して化学的に修飾され得る。本発明の好ましい態様 において、予備状態調整されたヘモグロビンは、以下に記載されるように活性化 ポリアルキレンオキシドに結合させて修飾しつる。これに限定されるものではな いが、ポリアルキレンオキシドへの結合に代わる化学的修飾の他の方法はピリド キサールホスフェートとの反応、ジアルデヒドとの反応、２，３−ジホスホグリ セレート（２，３−ＤＰＧ）又は化学的に類似する化合物のような試薬との反応 、又は、ビス−ジアスピリンエステルとの反応である。ヘモグロビンは架橋結合 していないもの、本発明により分子内架橋したもの、又は分子間架橋したもので あってもよい。
得られた修飾ヘモグロビンは、次いで、臨床的に有用なＰｓｏが達成されたこと を確認するために、そのＰ、。値を測定するための試験がなされる。Ｐ、。の測 定方法は、例えば、ヘモキサ−アナライザー（ＴＣＳメディカルプロダクト社、 ハンチングトンバレー、ＰＡ）を使用する方法のような、標準的な分析方法を包 含する。
５．１．２．結合 還元に続いて、ヘモグロビンは酸素結合部位の構造完全性を維持する条件下で、 活性化ポリアルキレンオキシドと反応させ得る。
本発明の好ましい態様において、かかる条件は高アニオン濃度から成る：特定の 態様においてこのアニオンは塩化物イオンである。
好適な態様において、塩化物イオン濃度は少くとも約１．０Ｍである。第１表に 示されるように、修飾ヘモグロビンのＰｓｏは増大した塩化物イオン濃度に関連 して上昇することか観察された。
本発明によれば、活性化ポリアルキレンオキシドは単官能基又は複数の官能基を 有しつる。第工表において言及された各調製物に対する修飾の程度は約２０％で ある。このパーセントの修飾はヘモグロビンの１分子当たり約９．２のＰＥＧ分 子に相当する。修飾パーセントはＰＥＧにより修飾されたリジンの数によって計 算され、そして、牛ヘモグロビンでは合計４８個の表面リジンに基づくものとさ れ得る。数は、トリニトロペンセンスルポン酸（ＴＮＢＳ）アッセイにより測定 できる（Ｈａｂｅｅｆら、＋９６６、　Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１ ４３２８−３３６）。
第　■　表 ０．１　２４　２４　２２ ０．５　３０　２８　２４ １．０　３２　３０　２９ １．５　３１　３０　３０ ２．０　３２　３０　３０ ヘモグロビンに結合させるために本発明により使用しつるポリアルキレンオキシ ドは、これらに限定されるものではないが、ポリエチレンオキシド、ポリプロピ レンオキシド又はエチレンオキシド及びプロピレンオキシドの共重合体を含む； 本発明のポリアルキレンオキシドは、好適には水溶性である。本発明の好ましい 態様においては、ポリエチレングリコールをヘモグロビンに結合できる。ポリマ ーの好ましい分子量は５００がら４０．０００Ｄａてあり、より好ましくは、１ ．９００から２０．０ＯＯＤａ　テアル。
本分野で知られているいずれの方法も、ポリアルキレンオキシドを活性化し、次 いでヘモグロビンに結合させるために使用できる。例えば、ポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）の水酸基はシアヌル酸クロリドを用いて活性化されうる（Ａｂｕ ｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓ、　１９８１゜Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇ ｓ、”　ｔ（ｏｌｓｅｎｂｅｒｇとＲｏｂｅｒｔｓ編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　 ａｎｄＳｏｎｓ、　Ｎ、Ｙ、　３６７−３８３頁）ニジかしながら、シアヌル酸 ’）口１）’ｒ”（Ｄ毒性のため反応後それを除去するために注意が必要である 。代わりに、ポリマーとコハク酸残基の間のエステル結合は水性媒質中で限られ た安定性を伴うものではあるが（岩崎ら、　１９８７．米国特許第４　、１７９ ．３３７号）、ポリアルキレンオキシドは相応のサクシノイル−Ｎ−ヒドロキノ スクシンイミドエステルを形成させるために誘導体により活性化しつる（Ａｂｕ ｃｈｏｗｓｋ　ｉら、　１９８４．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　７：　１７５−１８６）。
本発明の好ましい態様において、ポリアルキレンオキシドはヘモグロビンのε− アミノ基とウレタン結合を生成させるために活性化させることができ、このウレ タン結合はほとんど加水分解変成を受けない（Ｌａｒｗｏｏｄ及び５ｚｏｋａ、 　１９８４．　Ｊ、Ｌａｂｅｌｌｅｄ　ＣｏｍｐｏｕｎｄｓＲａｄｉｏｐｈａｒ ｍ、　２１：　６０３−６１４）。ウレタン結合は、それらに限定されるもので はないが、ボーチャンプら（Ｂｅａｕｃｈａｍｌ）ら、　１９８３．　Ａｎａｌ ｙｔ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　１３１：　２５−３３）又はベルガーとビシ（Ｂ ｅｌｇｅｒとＰｉｚｚｏ、　１９８８．Ｂｌｏｏｄ、　７１：　１６４１−１６ ４７）に記載されているように、カルボニルジイミダゾール活性化ポリアルキレ ンオキシドを含む、活性化されたポリアルキレンオキシドのカーボネート誘導体 を使用して達成される。好ましくは、ウレタン結合はサリブスキーらによる、１ ９８９年４月１９日に出願された米国特許出願下０７／３４０．９２８号に記載 されているとおりにして形成することかでき、右はすべて参考として本明細書に 取り込まれる。それに限定されるものではないか、例えば、ザリブスキーにより 記載された方法に従かって、メトキシポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシ ンイミトヵ一ホ不−ト（ＳＣ−ＰＥＧ）又は、類似の二官能性のポリ（エチレン グリコール）−ビスーＮ−スクシンイミトカーホ不−ト（ＢＳＣ−ＰＥＧ）をヘ モグロビンに結合させるために使用できる：代わりに、ポリアルキレンオキシド のへテロ三官能性誘導体も使用でき、このものにおいて末端基の一方はＮ−スク シンイミドカーホネートであり、他の末端基は異なる反応性官能基を含む（サリ ブスキーとバラニーか記載、１９８６．　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ 、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　Ｄｉｖ、　Ｐｏ１ｙ。
Ｃｈｅｍ、２７（１）：　ｌ〜２、これはすべて参考として取り入れられる）。
ポリアルキレンオキシドのＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体は、ザリブスキ ーらにより１９８９年４月１９日に出願された米国特許出願下０７／３４０．９ ２８号に記載された方法に従かって製造しつる。
例えば、特定の態様において、５Ｃ−ＰＥＧは次のようにして製造できる： 分子量５０００　（、ユニオンカーバイト、６０ｇ、１２ミリモル）のメトキシ ポリエチレングリコールをトルエン／ジクロロメタン（３・１．２００ｍ１）中 に溶解し、ホスゲンのトルエン溶液（３０ｍｌ、５７ミリモル）で１晩処理する 。次いて、溶液は蒸発乾燥し、ホスゲンの残部は真空除去される。残渣をトルエ ン／ジクロロメタン（２：１、１５０ｍ１）中に再溶解し、固体Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミド（２゜１ｇ、１８ミリモル）で処理し、次いてトリエチルアミン （１，７ｍｌ、１２ミリモル）で処理しつる。３時間後に溶液は濾過し、蒸発乾 燥させる。残留物は温（５０°Ｃ）酢酸エチル（６００ｍｌ）に溶解し、痕跡量 の不溶物を濾過し、そして、ポリマーの沈澱を促進させるために冷却する。濾過 により生成物を集め、再び酢酸エチルから再結晶させる。生成物はＰ２Ｏ５上で 真空下乾燥できる（第１図参照）。
生成物の活性カーボネート含量を測定するために、ポリマー試料はジクロロメタ ン中で測定量のベンジルアミンと反応させ、過剰のアミンはジオキサン中で過塩 素酸により滴定する。
同様に、ＢＳＣ−ＰＥＧは次のようにして製造できる。
分子量４６００のポリエチレングリコール（ユニオンカーバイト、５０ｇ、２１ ．７ミリ当量、ＯＨ）は、前述の５Ｃ−ＰＥＧの製造のための方法に従かって、 ホスゲンのトルエン溶液（５０ｍｌ、　９６．５ミリモル）、及び、次いてＮ− スクシンイミド（３，８，２３ミリモル）とトリエチルアミン（３，２〜Ｉ、２ ３ミリモル）を使用して、対応のビス−Ｎ−スクシンイミドカーボネートに転換 できる。精製後、生成物は白色粉末として得られる。
本発明の特定の態様において、それに限定されるものではないか、モノマー性の Ｈｂは単官能性ＰＥＧにより修飾しつる。本発明の特定の態様において、牛Ｈｂ は以下のようにしてポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカーボネ ート（ＳＣ−ＰＥＧ）で修飾しつる。
前記セクション５．１．１で記載した方法に従かって還元されたｂＨｂは、約０ ．５〜１．５　Ｍ濃度のＮａＣｌと約０．１〜ＨＪ濃度のナトリウムホスフェー トを含有する緩衝液中で、５Ｃ−ＰＥＧ　（分子量１．９００〜１０．０００Ｄ ａ）と反応させ得るｂＨｂに対する５Ｃ−ＰＥＧのモル比は好ましくは約ＩＯ３ １〜５０：１である。反応は、不活性雰囲気下、約７゜５〜８．５のｐＨ１約４ ℃にて、１〜６時間、好適には１〜２時間実施される。観察されたＰ、。と修飾 の程度の関係は、第■表に示される。
（本頁以下余白） 第■表 右にて反応させた　Ｏ，ＩＭ　［ＣＩ−］　２４　２２　２２ＳＣ−ＰＥＧ（５ ０００）−ｂＨｂ　Ｏ，５Ｍ　［Ｃｌ−１２８２４２４一方、限定されるものて はないか、重合性のヘモグロビンは最初にヘモグロビンを二官能性ＰＥＧと反応 させ、次いて単官能性ＰＥＧと反応させることにより製造しうる。本発明の特定 の態様において、次のようにして牛Ｈｂ（ｂｌ（ｂ）は最初にポリ　（エチレン グリコール）−ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカーボネート　（ＢＳＣ− ＰＥＧ）で修飾し、次いで、５Ｃ−ＰＥＧて修飾した。
前記５．１．１セクシヨンに記載されている方法に従がって還元されたｂ）Ｉｂ は、約０．５〜１．５Ｍ１１度のＮａＣＩと約０．１〜Ｉ　Ｍ濃度のリン酸ナト リウムを含有する緩衝液中で１９００〜１０．０００Ｄａの分子量を有するＢＳ Ｃ−ＰＥＧと反応させる。ｂＨｂに対するＢＳＣ−ＰＥＧのモル比は、好ましく は、約１＝１〜５：１である。次いで、反応は不活性気体中て約７．５〜８．５ のｐＨ１約４°Ｃにて、１〜３時間実施しうる。
二官能性ＰＥＧ−修飾ｂＨｂは、単官能性ＰＥＧ−修飾ｂＨｂよりも高いＰ、。
を伴なうことか観察されている。酸素結合親和性は分子内又は分子間架橋の程度 と関連することか見い出された。
（本頁以下余白） 第■表 事すへての反応は、０．１５！Ｊ　［ＣＩ］中で実施される続いて、５Ｃ−ＰＥ Ｇ　（分子量＋９００−１０．０００Ｄａ）は、５Ｃ−ＰＥＧとｂＨｂのモル比 か約５二１〜２０・１となるように添加できる。反応は、同一条件下で約２〜４ 時間続は得る。
ＰＥＧ修飾の量は、反応混合物中のヘモグロビンに対するＰＥＧの割合を変える ことによりコントロールしつる。本発明の特定の態様に従かって、ｂＨｂ表面リ ジンの約１０から２０％は、実質的な血管内保持時間を生しさせるためにＰＥＧ 修飾かなされる。これは、ヘモグロビン１分子に対して約５〜１０　ＰＥ０分子 か結合したものに相当する。重要なことは、架橋の程度は修飾ヘモグロビンの酸 素結合親和性又は半減基を変えるために変更しうることである（後記するセクシ ヨン５．２を参照）。もし高分子量ポリアルキレンオキシドか使用されるならば 、置換の程度は減少させることか望ましいかもしれない。
５　、’１．３．二回目の還元 高いデオキシヘモグロビン含量及び低いメトヘモグロビンレベルを与えるために 、前記５．１．　Ｉセクションに記載された脱酸素化及び還元工程を繰り返され る。例えば、ポリアルキレンオキシドとの反応か完了したら、不活性雰囲気下で 付加的なシスティンを添加して、最終濃度を１からＩｏｏｍＶ　、好適には１〜 ３０ｍＭにする。
修飾ヘモグロビンは本分野で既知のいずれがの方法を使用して他の反応荊から分 離する。好適な実施例において、修飾ヘモグロビンは約７．４のｐＨて相溶性の 緩衝システムに対して限外濾過により分離しつる。
それに限定されるものではないが、安定化剤であるグルコースを修飾ヘモグロビ ン溶液に添加しつる。本発明の好適な態様において、グルコースは約５％の濃度 で添加できる。
５　、１．４．滅菌 ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンは、次に、修飾ヘモグロビンの酸化及 び／又は酸素添加を生じない又は構造の変化を生じない条件下で、当該分野のい ずれがの既知の方法により滅菌しうる。本発明の好適な特定の態様において、修 飾ヘモグロビンは０．２　ミクロンの膜フィルターを使用して滅菌濾過される。
最終生成物は、４°Ｃて気体透過性血液バックに保存しつる。
５　、１．５．ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンの特性化ポリアルキレ ンオキシド修飾ヘモグロビンは、次に、当該分野で既知の方法を使用して化学的 に特性化しうる。例えば、酸素解離曲線はＰ、。値を計算可能とする常法（例え ば、全弁ら、、　＋９７０゜Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　 ２００　：　１８９−１９６）を使用して測定しうる。
測定するのか好ましい他のパラメーターは、メトヘモグロビン含量、粘度、透過 性、ｐ）ｌ及びヒル（Ｈｉｌｌ）定数である２酸素飽和曲線に対するｐＨ変化の 影響は、パーチルか記載したようにして測定しうる（＋９７１．血液酸素解離曲 線・哺乳動物“呼吸と循環”。
Ａｌｔｍａｎ及びＤｉｔｔｍｅｒ編、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　ｆｏｒＥｘｐｅｒｊｍｅｒ＋ｔａｌ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、ベセセダ）。
インビボ試験は、本発明の方法で製造されるポリアルキレンオキシド修飾ｂＨｂ の安定性及び官能特性を測定するために使用しつる。かかる試験は、急性毒性反 応、修飾ヘモグロビンの血液循環時間、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）活性のだ めのアッセイ、蘇生努力におけるポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂの有効性の決 定、及びポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンの免疫原性の評価を含む。
急性毒性試験は、適当な実験動物において実施てきる。好適には、露出範囲が試 験され得る：例えば、　１００％交換した輸血を受けた動物に比較して、５０〜 ７０％交換した輸血を受けた動物を評価する。生命徴候及び視覚観察か記録され るべきてあり、試験するヘモグロビン調製物の一半減期に相当する見積り時間の 後で動物を犠牲にする。常法による組織学的評価は、肺、腎、肝又は脳を含む組 織に対する毒性作用の存在又は非存在を決定するために使用できる。
ポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂの血液循環時間は、例えば、これに限定される ものではないが、修飾Ｈｂを有する交換輸血の後に段階的に集められた血液試料 のプラズマ画分のヘモグロビン濃度を（５４０ｎｍで）モニターすることにより 評価しうる。ヘモグロビン消失は時間の関数としてプロットしうる。
蘇生努力におけるポリアルキレンオキシド修飾＋（ｂの有効性は、実験動物血液 容積の実質的画分（好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上）を６〜 ８％濃度においてポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂで置換し、次いて、試験動物 の生存及び臨床的安定性（例えば、生命徴候）を促進する際のポリアルキレンオ キシド修飾Ｈｂの有効性を決定することにより評価しうる。好ましくは、ポリア ルキレンオキシド修飾ヘモグロビンと他の血液代替物の仔効性の間で比較かなさ れる（例えば、乳汁を分泌したリンゲル液及び／又は全血液）。
ポリアルキレンオキシド修飾ｆ飾Ｈｂの免疫原性は、実験動物にポリアルキレン オキシド修飾Ｈｂを接種し、次いて、免疫沈降（さらには、免疫電気泳動法を含 む）及びＥＬＩＳＡ法を含む通常の免疫ア・ソセイを使用してポリアルキレンオ キシド修飾Ｈｂ特異抗体を試験することにより評価しうる。
５．２１本発明の有用性 安定で、酸素運搬において有効であり、そして非免疫原性であるポリアルキレン オキシド修飾ヘモグロビンを提供することにより、本発明はヒトのみならず動物 （例えば、家畜への使用）における安全で有効な赤血球代替物として使用しうる 。
本発明のポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンは、生理的食塩水を含むいず れかの適当な医薬担体に関連して使用され得る。
適当な担体中のポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンは４°Ｃて６〜８％修 飾されたヘモグロビンの液体調製物にて保存しうる：代わりに、ポリアルキレン オキシド修飾ヘモグロビンは粉末にし得る。更に、ポリアルキレンオキシド修飾 ヘモグロビンは４°Ｃて保存てき、輸血直前に生成物の完全性に損傷を与えるこ となくマイクロ波オーブンを使用して急速に暖めることができる。大事なことは 、ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンの貯蔵の間にオキシヘモグロビンか 存在すると、メトヘモグロビンか加速された速度て生ずるように思われることか 観測されたことである：したがって、貯蔵時間を改善するためには、薬剤組成物 中に酸素除去剤及び／又は還元剤を加えることが望ましい。有効な酸素除去／還 元剤には、限定されるものではないが、システィン、グルコース及びマンニトー ルか含まれる。
本発明により製造されるポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンは、限定され るものではないが、ハイボボレミア（ｈｙｐｏ−ｖｏｌｅｍｉａ）、ショック及 び貧血を含む多くの状態及び異常を治療するために使用できる。本発明のポリア ルキレンオキシド修１１ｉＨｂは、即時の輸血を必要とする急性の状況において 特に有用であることが判明するであろう。例えば、ポリアルキレンオキシド修飾 Ｈｂは３７°Ｃで短時間安定であるから、予め加温された血清代替物の提供は、 すへての血液型に許容でき、大量の輸血を必要とする場合でも低体温症を伴なわ ない即時輸血を提供するために、手術室及び緊急医療施設において維持しうる。
同様に、本発明のポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂは、赤血球細胞変形（例えば 、鎌状赤血球危１１りか生じた状態又は内因性赤血球が不足しているか又は損傷 を受けた状態を治療するために使用しうる。本発明の修飾ヘモグロビンの架橋及 び／又は置換度合を変えることによりヘモグロビン溶液の粘度を変えることがで き、それにより臨床上の使用か促進される。フリーイオンへの露出を減少させる ことにより、本発明のポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂはサラセミアを含む組織 への鉄沈着に関連する赤血球異常の治療において特に有効に使用しつる。
加えて、本発明の修飾ヘモグロビンは赤血球よりも小さいから、赤血球か到達で きない組織に酸素を運搬するために使用しつる。
例えば、本発明のポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンは血栓や狭窄により 障害のある血管を槙断させるのに使用でき、それゆえ、限定されるものではない が、心筋梗塞症、脳梗塞症（卒中）及び糖尿病（乾性種痘を含む）のような末梢 血管症状を含む症状において治療上使用しつる。
本発明の他の態様において、ヘモグロビンとポリアルキレンオキシドとの結合の 程度又は化学修飾前のヘモグロビンの脱酸素化の程度は、ヘモグロビンの酸素結 合親和性をコントロールするのに使用でき、そのことにより、種々の臨床的状態 に相応の分子をデザイン可能とする。例えば組織への最大効率の酸素放出が好都 合である場合、即ち、慢性の閉塞性肺動脈症の患者が自分自身の血液を酸素化し えない臨床的状態においては特に高いＰ、。値を有する修飾ヘモグロビンか望ま しいであろう。人工呼吸具に関連して危機的な急性の臨床条件では、高い酸素含 量をもつ吸気と結合して、生理的なヘモグロビンよりも高いＰ、。を有するポリ アルキレンオキシド修飾ヘモグロビンで部分的に交換された輸血が酸素運搬層を 助けるために使用され得る。同様に、ポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビン で交換され高いＰ、。をもつ輸血は、急性の二酸化炭素中毒に使用しつる。本発 明は、また、自然のへモグロピンよりも一層強固に一酸化炭素（ＣＯ）を結合し 、それゆえ、ＣＯの除去と酸素運搬のための自然のヘモグロビンの遊離を促進す るために使用できるポリアルキレンオキシド修飾ヘモグロビンをデザインするこ とを目的とする。同様に、修飾されたヘモグロビンの粘度は、より大きな又はよ り小さな分子量のポリアルキレンオキシド（それぞれ減少した又は増加した粘度 を生ずる）を使用することにより変化させつる。例えば、低粘度の修飾ヘモグロ ビン溶液は、赤血球変形に苦しむ患者、例えば、鎌状赤血球の患者の治療に用い ることができる。
重要なことは、ヘモグロビンか非ヒトの供給源に由来する本発明の態様において は、本発明のポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂは、肝炎、ＨＩＶ、又はＨＴＬＶ の潜在的な危険を実質的に育しておらず、対宿主性移植片病を引き起こす危険も ないことである。さらに、本発明のポリアルキレンオキシド修飾Ｈｂの低い免疫 原性は、繰り返し輸血を必要とする患者の治療、例えば、血友病のような凝固障 害及び出血異常の患者のための治療に特に望ましい。
６、実施例に単官能性ＰＥＧにより修飾されたモノマー性牛ヘモグロビンの製造 ６．１．材料及び方法 ６　、１．１．牛ヘモグロビン ビオピユーレ（Ｂｉｏｐｕｒｅ、　ＭＡ、）から牛ヘモグロビンを入手し、−２ ０°Ｃて貯蔵した。
６　、１．２．　ポリ　（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカーボネ ートの合成 メトキンＰＥＧは、ユニオンカーバイト及び日本油脂から入手した。上記セクシ ョン５．１．２で記載したようにして、ザリブスキーらによる１９８９年４月１ ９日出願の米国特許第０７／３４０．９２８号に記載の方法に従かってＰＥＧを 活性化した。
６　、１．３．ヘモグロビンの還元 オキシ−ｂＨｂを脱酸素し、メト−ｂＨｂを還元するために、６％の牛ヘモグロ ビンを３０ミリモルの濃度のシスティンと反応させた。反応は、０．１ＭのＮａ Ｃ１と０．１ｖのＮａＨＣＯａの存在下、窒素気下で４°Ｃ０１］Ｈ８にて実施 した。その後、反応は２時間続けた。
最初の還元工程が完了した後、システィン及び二重化したヘモグロビンサブユニ ットを除くために、アミコン社の中空ファイバー膜ＭＷＣＯ＝　３０．０ＯＯＤ ａを使用する限外濾過か行なわれた。
６　、１．４．ポリ　（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカーボネー トとの結合 ＰＥＧ反応に先立って、ヘモグロビン含有溶液は、０．７５ＭのＮａＣ１濃度、 ０．０５ＭのＮａＨＣＯｚ濃度及び０．０５Ｍのリン酸ナトリウム濃度となるよ うに調製した。５Ｃ−ＰＥＧ　（ＭＷ　５０００）を２０＝１のモル比で添加し た。窒素気下で４℃、ｐＨ＝　８．０にて反応を２時間続けた。
６．１．５．　２回目の還元 ５Ｃ−ＰＥＧとの反応か完了した後で、残留するオキシ−ｂＨｂ及びメト−ｂＨ ｂを変換するために３０［１１Ｍの濃度になるようにさらにシスティンを添加し た。２時間したら、Ｏ，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，３０ｍＭ　ＮａＨＣＯ，、５ｍＭ　 ＫＣＩ。
３ｍＭＣａＣｌ２及び０．９　ｍＭ　！ｉ１ｇｃｌｚを含有する溶液に対して限 外濾過を繰り返し、アスコルビン酸ナトリウム（１０ｍＭ）、ｐＨ＝７．４及び グルコースをＰＥＧ−ｂＨｂ溶液に対し最終濃度か５％（Ｗ／Ｖ）になるまで添 加した。生成物は０．２　ミクロンのゼタボール（２ｅｔａｐｏｒ）膜フィルタ ーを使用して濾過滅菌した。
６．２．結果及び論考 上記ＰＥＧ−ｂＨｂのＰｒｏは２９ミリＨｇであった（第■表）。置換度は１５ ％、コロイド浸透性は２４ｍｍ１ｇであり、この生成物はエンドトキシン（ＬＡ Ｌ試験を使用）、パイロンエン（Ｕ、　Ｓ、　Ｐ、）くイロジエン試験を使用） を育しておらず、フエロンンアノセイ法（Ｃａｒｔｅｒ、　１９７１゜Ａｎａｌ ｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、４０：　４５０−４５８）を使用すると遊離（フリー ）鉄を有していないように思われた。７０％交換輸血（７０％　ｅｘｃｈａｎｇ ｅｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）後、ラットに注射されたこの試料の半減期は約９時 間であった（第■表）。ラット血管内におけるメト−ｂＨｂの形成は、未修飾の ヘモグロビンの場合よりも実質的に低かった（第■表）。
７、実施例■：気体透過性膜を使用するヘモグロビンの脱酸素化生ヘモグロビン と５Ｃ−ＰＥＧの製造は、上述のセクション６の実施例■に記載したとおりに実 施した。
ヘモグロビンを還元するために、６％牛ヘモグロビンを気体透過性中空ファイバ ー膜（オキシゲネーターとして市販のもの）を通して、加圧された窒素に対して 再循環し、ヘモグロビンの脱酸素化を生ずるガス交換を達成した。操作は、窒素 雰囲気下で４°Ｃ１ｐＨ８において、０．１　Ｍ　ＮａＣｌと０．　Ｉ　Ｍ　Ｎ ａ２ＨＰＯ，の存在下で実施した。
反応は８０％以上のデオキシＨｂか得られるまで続けた。
次いで、脱酸素化したｂＨｂをＰＥＧに結合させ、次いでアスコルビン酸を添加 せず、グルコースを３９６濃度になる迄添加したことを除いて、セクション６の 実施例Ｉに記載されたようにして２回目の還元を行なった。
このようにして製造された５Ｃ−ＰＥＧ−ｂＨｂの物理化学的特性は、第■表に 示されている。観測されたＰｓｏは２４ｍｍＨｇであり、置換度は１６％であり 、修飾ヘモグロビンの７０パーセント交換輸血をう・メトに与えて測定すると、 インビボにおける修飾ヘモグロビンの半減期は９．６時間であった（第Ｖ表参照 ）。
８、実施例１［Ｉ：３０：ｌのモル比の単官能性ＰＥＧに対するヘモグロビンの 結合 セクション７、実施例■のとおりにして、牛ヘモグロビンか製造され、脱酸素化 され、そして還元された。５Ｃ−ＰＥＧとの結合は、５Ｃ−ＰＥＧ　（ＭＷ　３ ０００）が３０：１のモル比で添加されたことを除き、同様であった。２回目の 還元はセクション７、実施例■の記載のとおりに実施された。
この５Ｃ−ＰＥＧ−ｂＨｂの物理化学的特性は第■表に示されている。観測され たＰ５゜は２５ｍｍＨｇで、置換度は３２％で、ラットにおける７０ツク−セン ト交換輸血で測定された半減期は１２．４時間であった（第Ｖ表参照）。
９、実施例ＩＶ　：　４０　：　１モル比での単官能性ＰＥＧへのヘモグロビン の結合 モル比が４０＝１て５Ｃ−ＰＥＧ　（ｖ’？１２０００）か添加されたことを除 イテ、上述のセクション８、実施例■に記載のとおりにして牛ヘモグロビンを修 飾した。
第■表に示されるように、こうして製造されたヘモグロビンは、Ｐｓｏか２０ｍ ｍＨｇを示し、置換度は５０パーセントであることが測定された。第７表に示さ れているように、ラットの７０パーセント交換輸血の半減期は１３．０時間であ った。
１０、実施例■：最初に二官能性ＰＥＧで修飾され、次に単官能性ＰＥＧて修飾 された、重合性子ヘモグロビンの製造１０．１．材料と方法 ］、Ｏ，１，１，牛ヘモグロビン 牛ヘモグロビンはビオピユーレ、ＭＡから入手し、−２０℃で貯蔵した。
１０．１．２．　ポリ　（エチレングリコール）−ビス−Ｎ−スクシンイミドカ ーボネートの合成 上述のセクション５．１．２に記載のとおり、ザリプスキーらによる１９８９年 ４月１９日出願の米国特許第０７／３４０．９２８号に示されている方法に従か って、ＢＳＣ−ＰＥＧを製造した。
１０、１．３．ヘモグロビンの還元 室素気下、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌと０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓの存在下、４ °Ｃ，ｐＨ＝８．０にて、６パーセント牛ヘモグロビンを３０ｍＭのシスティン と反応させた。反応を２時間続け、その後、上述の６．１．３のようにして、溶 液を限外濾過させた。
１０．１．４．　ＢＳＣ−ＰＥＧとの結合ＰＥＧとの結合に先立って、ヘモグロ ビン−１次いで、５Ｃ−ＰＥＧ含を溶液は、ＮａＣｌカ０．７５Ｍ　ａ６、Ｎａ ＨＣＯｓカ０．５Ｍａ度及Ｕ　’Ｊ　ン酸ｔ　トリウムか０．０５！１１濃度と なるように調節した。ＢＳＣ−ＰＥＧ　（ＭＷ　４６００）を、２・ｌのモル比 （ＢＳＣ−ＰＥＧ　：　ｂＨｂ）で添加した。反応は窒素気下て、４°Ｃ，ｐＨ ＝８にて１時間実施した。次いて、５Ｃ−ＰＥＧ　（ＭＷ５０００）をモル比（ ＳＣ−ＰＥＧ　：　ｂＨｂ）か１０１て添加した。反応は同一条件下でさらに１ 時間続けた。
１０．１．５．　２回目の還元 ＢＳＣ−ＰＥＧ及び５Ｃ−ＰＥＧとの反応か完了した後、残留するオキシーｂＨ ｂとメト−ｂｌ（ｂを除去するためにｌ０ｍＭの濃度でさらにシスティンを添加 した。２時間後に、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１，０，１！１１　ＮａＨＣＯ，、５ｍＭ 　ＫＣＩ、３ｍＭ　ＣａＣｌ２及び０．９　ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む溶液に対し て限外濾過を行ない。
ｐ）Ｉ＝７．４７スコルビン酸ナトリウム（ｌｏｍＭ）とグルコースを最終濃度 か５％（Ｗ／Ｖ）になるようにＰＥＧ−ｂＨｂ溶液に添加した。生成物は、０． ２ミクロンのゼタボール膜フィルターを用いて濾過滅菌した。
＋０．２．結果及び論考 上記ＰＥＧ−ｂＨｂのＰｓｏは３２ｍｍＨｇてあった。置換度は１０パーセント 、コロイド浸透性は２２ｍｍＨｇであり、生成物は上記方法を使用するエンドト キシン、パイロジエン及び遊離鉄を含有していなかった。
７０パーセントの交換輸血の後においてラットに注射されたこの実施例のものの 半減期は１９時間であった。この実施例のものは、ラットにおいて１２％の血管 内メトｂＨｂ形成を伴なっていた。
（本頁以下余白） 第■表 ＰＥＧ−Ｈｂの化学 実施例　コントトル　Ｉ　ＩＩ　Ｉ［、ＩＶ　Ｖ修飾％　０　１５　１５　３＋ 　５０　６Ｈｂに対するＰＥＧ５の平均Ｎａ０７．２７．７　１４．９　２４　 ３．８ＰＥＧ−ＨＩ）の全分子量（ＫＤ）　６４．５　１００．５　１０３．５ 　１０９．２　＋１２．５　７６．５濃度（％）　５．５　５，０　５．７　５ ．５　５．４　５．０Ｐｓｏ　（ｍｍＨｇ）　２５　２２　２５　２５　２０　 ２７メトＨｂ　（％）　＜５　６　＜５　＜５　＜５　２粘度（ＣＩ））　３． ０　３．６　４．５　３．８　３．２　４．０浸透圧（ｍｍＨｇ）　２２　２４ 　２２　２２　２２　２０ヒル（Ｈｉｌｌ）係数　２．４　２．５８　２．２　 ２．０５　１．８　２．２遊離鉄　（ミクロ　ｇ／ｄＬ）　２４　ＮＤ　２７　 ２０　２０　ＮＤ付加物 アスコルベート（ｍ！Ｊ）　０　１０　０　０　０　１０デキストロース（％） ３　５　３　３　３　５エンドトキシン（ＥＵ）　＜、１　＜、１　＜、１　＜ 、１　＜、１　＜、＋１１、実施例■：インビポ研究 実施例Ｉ−■に従って製造されたヘモグロビンの７０％変換輸血を与えられたラ ット又はコントロールのラット（自然の牛ヘモグロビン）のインビボの研究は、 第Ｖ表に示されている（カッコの中の数は輸血されなかったラットで得られた数 値である）。呼吸率かわずかに減少上血圧はコントロールに比較して最大約３５ ３５％増大し、交換輸血に対して良好な生理的応答を示していることに注意され たい。
ラットのインビボのデータ（７０％交換輸血において）中間時点でのメトーＨＭ ％ン　１６．５　２９．３　５．８　１３．８　１８．０　１２．０１２、実施 例■、牛ヘモグロビン溶液中の還元剤１２、１．材料及び方法 システィン、グルタチオン、Ｎ−アセチルシスティン、Ｎ−アセチルメチオニン 及びアスコルビン酸ナトリウムを含む試験還元剤の各々３０ｍＭを、不活性雰囲 気下で、ｐＨ＝７．４及び４℃にて、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、Ｏ，Ｉ　Ｍ 　ＮａＨＣＯｓ及びＯ−Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含む５％の牛ヘモグロビン溶液に添 加した。２０時間後に、デオキシヘモグロビン（ｄｅｏｘｙ　Ｈｂ）　、メトＨ ｂ及び遊離鉄濃度を測定した。メトＨｂとデオキシＨｂ濃度は、　０５Ｍ３ヘム オキシメーター（ラジオメーター）を使用して、遊離鉄はフエロジンアツセイ法 （Ｃａｒｔｅｒ。
＋９７１．　ＡｎａｌＹｔ、　Ｂｉｏｃｅｈｍ、　４０：　４５０−４５８）に より測定した。
１２．２．結果 試験したすべての還元剤のなかで、システィンか最高のデオキシヘモグロビンレ ベル及び最低のメトヘモグロビンレベルを有しており、試験した還元剤のいずれ かのうちで低い遊離鉄を伴なっていた。システィンの効率は、恐らく、酸素除去 剤及び還元剤として機能しうることによるものであろう。
第■表 デオキシＨｂ（％）９７．６　９６．７　９．７　０　０メトＨｂ（％）　０． ８　４．＋　１１．９　１８．８　１９．６１３、実施例■　ガス交換によるヘ モグロビンの部分的脱酸素化、及び単官能性活性化ポリエチレングリコールを使 用するその修飾 牛ヘモグロビンはビオピユーレ、ボストン、ＭＡから購入し、０．５　Ｍ　Ｎａ Ｃｌ、Ｏ，ｌ　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ，及び０．０５Ｍ　ＮａＨＣＯ３を含有させて 、６％濃度（ｇ／ｄｉ）に調整した。最終ｐＨは７．８に調節し、全処理中の温 度は４〜６°に維持した。当初約９４〜９６％のすキンＨｂを含有していたこの 溶液の脱すキシ化は、窒素を充填した気相を育するＨｂ温溶液含む密閉管を準備 し、Ｇ−２４０／Ｉ　１／セルガート（登録商標）ガス交換装置を通してＨｂ温 溶液循環する一方で、ファイバーの外側空間にはｌＯｐ、　ｓ、　ｉに加圧した 窒素を連続的に給気することにより実施された。脱酸素化の工程は、デオキシＨ ｂパーセントが２０．３５、５０．７０．９０又は９５パーセントになるまで、 市販の０５Ｍ３ヘムオキシメーター（ラジオメーター、コペンハーゲン）を使用 して続けられた。
脱酸素化による予備状態調整に続いて、ポリエチレングリコール−スクシンイミ ジルカーボネート（ＳＣ−ＰＥＧ、　Ｍ、Ｗ、５１４１）を注意深＜Ｈｂ温溶液 加えた。
５Ｃ−ＰＥＧは、１個の活性化末端、即ち、スクシンイミジルカーボネートをも つ単官能性ＰＥＧポリマーである。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドはヘモグロビ ンのリジンとの反応において脱離基となる。５Ｃ−ＰＥＧ　：　Ｈｂのモル比は １２：１である。粉末ＰＥＧは均一な混合物とするためにＨｂ溶液中で急速に混 合され、ＰＥＧ−反応は１−１／２−２時間続けられた。この間に、反応管はデ オキシＨｂのレベルを維持するために空気に触れないように注意深く保持された 。ＰＥＧ修飾か完了した後、再びデオキシＨｂのレベルを測定した（第■表参照 ）。
精製は、アメリカンフルイド社、Ｒｉｃｈｂｏｒｏ、　ＰＡから購入したＭ、　 Ｗ、カットオフが５０ｋＤである中空ファイバー限外濾過装置を用いて実施した 。慣用の正接平面限外濾過膜に比較してこの装置の利点は、６％ＰＥＧ−Ｈｂ溶 液のような粘性のタンパク質溶液の操作か容易なことである。精製に続いて、ヘ ムオキサ−アナライザー（ＴＣＳメディカルプロダクト社、ハンチングトンバレ ー、　ＰＡ）によりＰＥＧ−ＨｂのＰ、。を決定した。第■表に示されるように 、最大のＰ、。
値は修飾に先立ってデオキシＨｂのパーセントが５０〜７０％であるときに得ら れた。ＨＰＬＣクロマトグラムによれば、こうして製造されたＰＥＧヘモグロビ ンは、唯一個の四量体物質から成り、重合性はヘモグロビンか実質的に存しない ことか見い出されているので、極めて均一なものであるように思われた。１個の Ｈｂ分子に結合されたＰＥＧ残基の平均数は、約７．７であることか見い出され た。この生成物の測定した粘度は、６０４５（ｇ／ｄ、ｌ）かつ３７°Ｃにおい て４．２ｃｐてあり、このコロイド浸透圧は２４ｍｍＨｇであることが見い出さ れた。
第■表 ２０　１８　１８　１．７ ３５　３３　１８　１．７ ５０　４８　２４　２．０ ７０　６ｇ　２８　２．２ ９０　８８　２２　２．０ ９５　９２　２２　２．０ 本自然の基質不含ｂＨｂ（ビオピユーレ、ボストン、ＭＡ　から入手）は、Ｐ５ ゜か２８ｍｍＨｇて、ヒル係数は２．３である。
１４、実施例■：化学的還元剤でヘモグロビンを部分的に脱酸素化し、単官能性 の活性化されたポリエチレングリコールを使用しての修飾 ６％の牛ヘモグロビン（上述、セクション５）は、化学的還元剤である重亜硫酸 ナトリウムを使用して脱酸素化され、次いて、上記セクション１３に記載の単官 能性的に活性化された５Ｃ−ＰＥＧを用いて修飾した。第１表は、ＰＥＧ化する 前に種々の濃度の重亜硫酸ナトリウムにさらすことにより予備状態調整したヘモ グロビンを用いて製造したＰＥＧ−ヘモグロビンのＰ５゜及びヒル係数を示す。
重亜硫酸ナトリウムか添加された後、ＰＥＧ化する前に一時間放置すると、脱酸 素化は安定化した。第１表に示されているように、７５９６デオキシＨｂである 予備状態調整されたヘモグロビンを製造するために、ヘモグロビンを１００ｍＭ 重亜硫酸ナトリウムにさらした時に、最適Ｐ、。及びヒル傾向値か測定された。
第１表 ３０　５９　１８．５　１．８ ５０　６３　１９、Ｏ１，８ １００７５２８、０２，２ ＋７５　９５−１００　２４．０　２．０１５、実施例Ｘ：ガス交換によるヘモ グロビンの部分的脱酸素化、及び二官能性的に活性化されたポリエチレングリコ ールを使用する修飾 架橋ヘモグロビンを得るために、二官能性的に活性化されたポリエチレングリコ ール、即ち、ボリニチレングリコールービスースクシンイミジルカーポネート　 （ＢＳＣ−ＰＥＧ、　！ｉ１．Ｗ、５０００）ヲＢＳＣ−ＰＥＧ：Ｈｂか２．５ ：ｌのモル比で使用した外は、本質的に前記セクション１３て記載したようにし て、３パーセントの牛ヘモグロビン溶液を製造し、脱酸素化し、そして修飾した 。ＨＰＬＣ分析によれば、約５０％のＩ（ｂ生成物は重合しているように思わＦ Ｌ（Ｈｂ２分子にＰＥＧ　］分子が結合）、他の５０％はＰＥＧにより分子内架 橋した四量体ヘモグロビンであるように思われた。この生成物の６％（ｇ／ｄｉ ）溶液の粘度は、３７°Ｃて４．５であり、コロイド浸透圧は２０ｍｍＨｇであ ることか見い出された。修飾前及びその後のデオキシＨｂのパーセント及び修飾 ヘモグロビンのＰ、。も前記セクション５に記載されているようにして測定され た（第■表参照）。最高のＰ５゜値は修飾前において６１及び７６％のデオキシ Ｈｂｉ：関連して測定された。
本発明は、本明細書に記載された特定の態様による範囲に限定されるべきてはな い。実際に、本明細書に記載された事項に加えて本発明の種々の修飾は前述の記 載及び付属の図面から当業者には明らかになるであろう。かかる修飾は、特許請 求の範囲内にあることか意図される。
ここでは種々の文献か引用されているか、これらの開示は全面的に参考として取 り入れられる。
１ｂ）′ｒｂ−（′ＮＨ２）。
マ ＦＩＧＵＲＥ　１ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の７第１項） 平成４年５月２２日

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. １．化学的に修飾されたヘモグロビンの製造方法であって：（ｉ）ヘモグロビン の還元および脱酸素化を行い；そして（ｉｉ）工程（ｉ）の還元・脱酸素化ヘモ グロビンを活性化ポリアルキレンオキシドに、ヘム酸素結合部位の構造完全性を 保持する条件下で結合させる； ことを含んでなる方法。
  2. ２．システインを使ってヘモグロビンの還元および脱酸素化を行う、請求項１の 方法。
  3. ３．システインの濃度が約３０ｍＭである、請求項２の方法。
  4. ４．高アニオン濃度を用いて、ヘム酸素結合部位の構造完全性を保持する条件を 整える、請求項１の方法。
  5. ５．アニオンが塩化物イオンである、請求項４の方法。
  6. ６．ポリアルキレンオキシドがポリ（エチレングリコール）からなる、請求項１ の方法。
  7. ７．ポリアルキレンオキシドがポリ（エチレングリコール）からなる、請求項２ の方法。
  8. ８．ポリアルキレンオキシドがポリ（エチレングリコール）からなる、請求項３ の方法。
  9. ９．ポリアルキレンオキシドがポリ（エチレングリコール）からなる、請求項４ の方法。
  10. １０．ポリアルキレンオキシドがポリ（エチレングリコール）からなる、請求項 ５の方法。
  11. １１．ポリアルキレンオキシドとヘモグロビンをウレタン結合によって結合させ る、請求項１の方法。
  12. １２．ポリアルキレンオキシドとヘモグロビンをウレタン結合によって結合させ る、請求項２の方法。
  13. １３．ポリアルキレンオキシドとヘモグロビンをウレタン結合によって結合させ る、請求項３の方法。
  14. １４．ポリアルキレンオキシドとヘモグロビンをウレタン結合によって結合させ る、請求項４の方法。
  15. １５．ポリアルキレンオキシドとヘモグロビンをウレタン結合によって結合させ る、請求項５の方法。
  16. １６．ポリ（エチレングリコール）とヘモグロビンをウレタン結合によって結合 させる、請求項６の方法。
  17. １７．ポリ（エチレングリコール）とヘモグロビンをウレタン結合によって結合 させる、請求項７の方法。
  18. １８．ポリ（エチレングリコール）とヘモグロビンをウレタン結合によって結合 させる、請求項８の方法。
  19. １９．ポリ（エチレングリコール）とヘモグロビンをウレタン結合によって結合 させる、請求項９の方法。
  20. ２０．ポリ（エチレングリコール）とヘモグロビンをウレタン結合によって結合 させる、請求項１０の方法。
  21. ２１．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−Ｎ− スクシンイミドカーボネートである、請求項１の方法。
  22. ２２．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−Ｎ− ルスクシンイミドカーボネートである、請求項２の方法。
  23. ２３．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−Ｎ− スクシンイミドカーボネートである、請求項３の方法。
  24. ２４．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−Ｎ− ルスクシンイミドカーボネートである、請求項４の方法。
  25. ２５．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−Ｎ− ルスクシンイミドカーボネートである、請求項５の方法。
  26. ２６．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−ビス −Ｎ−スクシンイミドカーボネートである、請求項１の方法。
  27. ２７．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−ビス −Ｎ−スクシンイミドカーボネートである、請求項２の方法。
  28. ２８．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−ビス −Ｎ−スクシンイミドカーボネートである、請求項３の方法。
  29. ２９．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−ビス −Ｎ−ルスクシンイミドカーボネートである、請求項４の方法。
  30. ３０．活性化ポリ（エチレングリコール）がポリ（エチレングリコール）−ビス −Ｎ−スクシンイミドカーボネートである、請求項５の方法。
  31. ３１．活性化ポリアルキレンオキシドがポリアルキレンオキシドの活性カーボネ ート誘導体である、請求項１の方法。
  32. ３２．活性化ポリアルキレンオキシドがポリアルキレンオキシドの活性カーボネ ート誘導体である、請求項２の方法。
  33. ３３．活性化ポリアルキレンオキシドがポリアルキレンオキシドの活性カーボネ ート誘導体である、請求項３の方法。
  34. ３４．活性化ポリアルキレンオキシドがポリアルキレンオキシドの活性カーボネ ート誘導体である、請求項４の方法。
  35. ３５．活性化ポリアルキレンオキシドがポリアルキレンオキシドの活性カーボネ ート誘導体である、請求項５の方法。
  36. ３６．工程（ｉ）においてヘモグロビンを部分的に脱酸素化して、デオキシヘモ グロビンのパーセントが少なくとも約５０パーセントで、８０パーセントを越え ないようにする、請求項１の方法。
  37. ３７．工程（ｉ）においてヘモグロビンを約３０ｍＭの濃度のシステインで還元 し、次いで工程（ｉｉ）において約ＩＭの塩化物濃度でポリ（エチレングリコー ル）−Ｎ−スクシンイミドカーボネートに結合させる、請求項１の方法。
  38. ３８．工程（ｉ）において気体透過性膜を通すガス交換によりヘモグロビンを脱 酸素化する、請求項１の方法。
  39. ３９．工程（ｉｉ）においてヘモグロビンをポリ（エチレングリコール）−Ｎ− スクシンイミドカーボネートに約３０：１のモル比で結合させる、請求項３８の 方法。
  40. ４０．工程（ｉｉ）においてヘモグロビンをポリ（エチレングリコール）−Ｎ− スクシンイミドカーボネートに約４０：１のモル比で結合させる、請求項３８の 方法。
  41. ４１．工程（ｉ）においてヘモグロビンを約３０ｍＭの濃度のシステインで還元 し、次いで工程（ｉｉ）において約ＩＭの塩化物イオン濃度でポリ（エチレング リコール）−ビス−Ｎ−スクシンイミドカーボネートに結合させる、請求項１の 方法。
  42. ４２．ヘモグロビンを脱酸素化して、デオキシヘモグロビンのパーセントが少な くとも約５０パーセントで、しかも約８０パーセントを越えないようにすること からなる、化学的修飾に先立ってヘモグロビンを予備状態調整する方法。
  43. ４３．酸素化ヘモグロビンを不活性ガスにさらして、（ｉ）ヘモグロビンから酸 素を取り除き、かつ（ｉｉ）デオキシヘモグロビンの最終パーセントが少なくと も約５０パーセントで、しかも約８０パーセントを越えないようにすることから なる、化学的修飾に先立ってヘモグロビンを予備状態調整する方法。
  44. ４４．気体透過性膜を通して不活性ガスに酸素化ヘモグロビンをさらす、請求項 ４３の方法。
  45. ４５．気体透過性膜がポリプロピレン膜である、請求項４４の方法。
  46. ４６．気体透過性膜がセルロースアセテート膜である、請求項４４の方法。
  47. ４７．酸素化ヘモグロビンを有効濃度の化学的還元剤にさらして、（ｉ）ヘモグ ロビンから酸素を取り除き、かつ（ｉｉ）デオキシヘモグロビンの最終パーセン トが少なくとも約５０パーセントで、しかも約８０パーセントを越えないように することからなる、化学的修飾に先立ってヘモグロビンを予備状態調整する方法 。
  48. ４８．化学的還元剤がアスコルビン酸ナトリウムである、請求項４７の方法。
  49. ４９．化学的還元剤が二チオン酸ナトリウムである、請求項４７の方法。
  50. ５０．化学的還元剤が重亜硫酸ナトリウムである、請求項４７の方法。
  51. ５１．重亜硫酸ナトリウムの有効濃度が約１００ｍＭである、請求項５０の方法 。
  52. ５２．２０ｍｍＨｇより大のＰ５ｏを有する、ポリアルキレンオキシドに結合さ れたヘモグロビンからなる、化学的修飾ヘモグロビン。
  53. ５３．ポリアルキレンオキシドがポリ（エチレングリコール）である、請求項５ ２の化学的修飾ヘモグロビン。
  54. ５４．ヘモグロビンが分子内架橋されている、請求項５２の化学的修飾ヘモグロ ビン。
  55. ５５．ヘモグロビンが分子間架橋されている、請求項５２の化学的修飾ヘモグロ ビン。
  56. ５６．ヘモグロビンがポリアルキレンオキシドにウレタン結合によって結合され ている、請求項５２の化学的修飾ヘモグロビン。
  57. ５７．ヘモグロビンがポリアルキレンオキシドにウレタン結合によって結合され ている、請求項５３の化学的修飾ヘモグロビン。
  58. ５８．適当な製剤学的担体中に請求項５２の化学的修飾ヘモグロビンを含んでな る医薬組成物。
JP3501516A 1989-11-22 1990-11-21 効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビン Expired - Lifetime JP2907300B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44055389A 1989-11-22 1989-11-22
US440,553 1989-11-22
US616,129 1990-11-20
US07/616,129 US5234903A (en) 1989-11-22 1990-11-20 Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH05504133A true JPH05504133A (ja) 1993-07-01
JP2907300B2 JP2907300B2 (ja) 1999-06-21

Family

ID=27032457

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3501516A Expired - Lifetime JP2907300B2 (ja) 1989-11-22 1990-11-21 効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビン

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5234903A (ja)
EP (1) EP0502113A4 (ja)
JP (1) JP2907300B2 (ja)
KR (1) KR920702232A (ja)
AU (1) AU642692B2 (ja)
CA (1) CA2069402A1 (ja)
HU (1) HUT61031A (ja)
WO (1) WO1991007190A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002514207A (ja) * 1997-02-28 2002-05-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 無細胞系による酸素輸送の最適化のための方法と組成物
JP2012529531A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 プロロング ファーマシューティカルズ，エルエルシー ヘモグロビン組成物
JP2015514718A (ja) * 2012-04-03 2015-05-21 サンガート， インコーポレイテッド スクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物およびタンパク質のニトロキシル化のためのその使用のための方法
JP2016521258A (ja) * 2013-03-15 2016-07-21 サンガート， インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド吉草酸ヘモグロビン接合体
US10172949B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10172950B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854209A (en) * 1995-03-23 1998-12-29 Biopure Corporation Method for oxygenating tissue having reduced red blood cell flow
US5955581A (en) * 1986-11-10 1999-09-21 Biopure Corporation Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute
US5753616A (en) * 1986-11-10 1998-05-19 Biopure Corporation Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute
US5312808A (en) * 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5650388A (en) * 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5478806A (en) * 1989-11-22 1995-12-26 Enzon, Inc. Enhancement of antitumor therapy with hemoglobin-based conjugates
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
ATE168014T1 (de) * 1991-11-08 1998-07-15 Somatogen Inc Hämoglobine als arzneimittelabgabesystem
US5264555A (en) * 1992-07-14 1993-11-23 Enzon, Inc. Process for hemoglobin extraction and purification
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU6029594A (en) * 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
NZ262349A (en) * 1993-03-16 1996-05-28 Hemosol Inc Chemically modifying haemoglobin by crosslinking with a polyaldehyde produced by ring opening oxidation of a saccharide; for use in a blood substitute
US20050181976A1 (en) * 1993-05-10 2005-08-18 Ekwuribe Nnochiri N. Amphiphilic oligomers
US5807831A (en) * 1993-08-16 1998-09-15 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5767089A (en) * 1993-08-16 1998-06-16 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5840701A (en) * 1993-08-16 1998-11-24 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5817632A (en) * 1993-08-16 1998-10-06 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5741893A (en) * 1993-08-16 1998-04-21 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5804561A (en) * 1993-08-16 1998-09-08 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
TW381022B (en) 1993-08-16 2000-02-01 Hsia Jen Chang Compositions and methods utilizing nitroxides to avoid oxygen toxicity, particularly in stabilized, polymerized, conjugated, or encapsulated hemoglobin used as a red cell substitute
US5725839A (en) * 1993-08-16 1998-03-10 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules for ERI or MRI
US5824781A (en) * 1993-08-16 1998-10-20 Hsia; Jen-Chang Compositions and methods utilizing nitroxides in combination with biocompatible macromolecules
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US6242417B1 (en) * 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
US5629384A (en) * 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5691452A (en) * 1995-03-23 1997-11-25 Biopure Corporation Method for preserving a hemoglobin blood substitute
US6271351B1 (en) 1995-03-23 2001-08-07 Biopure Corporation Method for preserving a hemoglobin blood substitute
US6288027B1 (en) 1995-03-23 2001-09-11 Biopure Corporation Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap
US6150507A (en) * 1995-03-23 2000-11-21 Biopure Corporation Method for producing a purified hemoglobin product
US6610832B1 (en) 1995-03-23 2003-08-26 Biopure Corporation Preserving a hemoglobin blood substitute with a transparent overwrap
US5895810A (en) * 1995-03-23 1999-04-20 Biopure Corporation Stable polymerized hemoglobin and use thereof
US5585484A (en) * 1995-04-19 1996-12-17 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Hemoglobin crosslinkers
US5929031A (en) * 1995-05-02 1999-07-27 Baxter Biotech Technology Sarl Storage stable hemoglobin solutions
US5868868A (en) * 1995-06-19 1999-02-09 Alcon Laboratories, Inc. Peg-modified proteases and methods of use in contact lens cleaning
US5741894A (en) * 1995-09-22 1998-04-21 Baxter International, Inc. Preparation of pharmaceutical grade hemoglobins by heat treatment in partially oxygenated form
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
US5814601A (en) * 1997-02-28 1998-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems
US5900402A (en) * 1997-05-29 1999-05-04 Enzon, Inc. Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
US20040122414A9 (en) * 1997-09-22 2004-06-24 Hurst William S. Contoured tubing closure
US6214594B1 (en) 1998-05-08 2001-04-10 University Of California Size enhanced fibrinolytic enzymes: limitations of plasma inactivation
KR100316154B1 (ko) * 1999-03-26 2001-12-12 노광 폴리에틸렌글리콜－헤모글로빈 결합체
US20070166292A1 (en) * 1999-04-14 2007-07-19 Breonics, Inc. System for exsanguinous metabolic support of an organ or tissue
JP3466516B2 (ja) * 1999-09-07 2003-11-10 科学技術振興事業団 安定保存可能な酸素輸液剤
US6894150B1 (en) 1999-10-01 2005-05-17 Ross Walden Tye Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin
US6180598B1 (en) * 1999-10-07 2001-01-30 Deanna J. Nelson Covalently modified hemoglobin having low temperature-dependent oxygen-binding function
US6623972B2 (en) * 2000-06-09 2003-09-23 Bayer Corporation Automated method for detecting, quantifying and monitoring exogenous hemoglobin in whole blood, plasma and serum
DE10031744A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-17 Sanguibio Tech Ag Mit Blutplasma verträgliche, vernetzte und mit Polyalkylenoxiden konjugierte Säugetierhämoglobine als künstliche medizinische Sauerstoffträger, ihre Herstellung und ihre Verwendung
DE10031742A1 (de) * 2000-06-29 2002-01-17 Sanguibio Tech Ag Verfahren zur Herstellung künstlicher Sauerstoffträger aus kovalent vernetzten Hämoglobinen mit verbesserten funktionellen Eigenschaften durch Vernetzung in Anwesenheit chemisch nicht reagierender Effektoren der Sauerstoffaffinität der Hämoglobine
DE10031740A1 (de) 2000-06-29 2002-02-14 Sanguibio Tech Ag Künstliche Sauerstoffträger aus vernetztem modifizierten Human- oder Schweinehämoglobin mit verbesserten Eigenschaften, Verfahren zu ihrer technisch einfachen Herstellung aus gereinigtem Material in hohen Ausbeuten, sowie deren Verwendung
US6747132B2 (en) 2000-11-29 2004-06-08 Apex Biosciences, Inc. Methods for the synthesis of a modified hemoglobin solution
US6974447B2 (en) * 2001-04-17 2005-12-13 Baxter International Inc. High gas barrier receptacle and closure assembly
JP2004538264A (ja) 2001-04-18 2004-12-24 ノースフィールド ラボラトリーズ 安定化ヘモグロビン溶液の保管のための可撓性容器システム
US7019117B2 (en) 2001-07-19 2006-03-28 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Size enhanced hemoglobins: surface decoration and crosslinking of the protein with polyoxy alkylene glycols
US7038016B2 (en) * 2001-08-21 2006-05-02 Apex Bioscience, Inc. Methods for purification of an activated PEG solution and for the synthesis of a modified hemoglobin solution
US20050164915A1 (en) 2002-04-01 2005-07-28 Sangart, Inc. Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
SI1465643T1 (sl) 2002-01-11 2008-06-30 Sangart Inc Postopki in sestavki za transport kisika z visokoafiniteto za kisik
US20030153491A1 (en) * 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
AU2003205144B2 (en) * 2002-01-15 2008-09-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions to reduce scattering of light during therapeutic and diagnostic imaging procedures
CA2476288A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Biosynexus Incorporated Enzyme disruption of bacterial biofilms
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
JP3912206B2 (ja) * 2002-07-05 2007-05-09 株式会社日立製作所 筒内直接燃料噴射装置用燃料ポンプ
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040072729A1 (en) * 2002-10-10 2004-04-15 Sunbio Inc. High oxygen affinity PEG-hemoglobin as treatment for brain stroke
DE60336018D1 (de) * 2002-12-23 2011-03-24 Einstein Coll Med Nicht-hypertensive pegylierte hämoglobine und deren herstellungsverfahren
US7655618B2 (en) * 2002-12-27 2010-02-02 Diobex, Inc. Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
NZ541365A (en) * 2002-12-27 2009-09-25 Diobex Inc Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
US20100221237A1 (en) * 2003-03-26 2010-09-02 Biosynexus Incorporated Enzyme disruption of bacterial biofilms
CN1208346C (zh) * 2003-04-09 2005-06-29 中国科学院过程工程研究所 血红蛋白－人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法
DE10352692A1 (de) * 2003-11-12 2005-06-23 Sanguibiotech Gmbh Verwendung hypo-onkotischer Lösungen in das Blut addierbarer, hyperpolymerer Hämoglobine zur Behandlung eines Lungenödems
US7521174B2 (en) * 2003-12-05 2009-04-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Universal red blood cells, methods of preparing same, and uses thereof
EP1708752B1 (en) * 2004-01-27 2012-02-22 University Of Southern California Polymer-bound antibody cancer therapeutic agent
WO2005103080A2 (en) * 2004-04-21 2005-11-03 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Stable oxidation resistant powdered hemoglobin, methods of preparing same, and uses thereof
CN101039684A (zh) * 2004-08-31 2007-09-19 桑格特公司 使用氧载体组合物增强血液动力稳定性的方法
JP2006164312A (ja) * 2004-12-02 2006-06-22 Hitachi Ltd 半導体装置およびそれを用いた磁気記録再生装置
WO2006096774A2 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 Sangart, Inc. Composition and methods for delivering carbon monoxide (co) and nitric ozide (no) co to tissue using heme proteins as carriers
WO2008021577A2 (en) 2006-01-24 2008-02-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Polymerized hemoglobin media and its use in isolation and transplantation of islet cells
US20090004159A1 (en) * 2006-01-24 2009-01-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells
US7795401B2 (en) 2006-09-06 2010-09-14 National Chung Cheng University Modified hemoglobin with allosteric effector conjugated
US7504377B2 (en) * 2006-10-23 2009-03-17 Ikor, Inc. Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin
US7494974B2 (en) * 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
FR2917292B1 (fr) 2007-06-18 2014-06-13 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'une hemoglobine pour la preparation de pansements, et pansements ainsi prepares
EP2223086B2 (en) 2007-12-14 2016-06-01 Biotium Inc. Fluorescent compounds - labeling dyes
US8021858B2 (en) * 2008-09-22 2011-09-20 Sangart, Inc. Method for making polyalkylene oxide modified hemoglobin
US9114109B2 (en) * 2009-06-16 2015-08-25 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Five-coordinate neuroglobin and use thereof as a blood substitute
US8273857B2 (en) * 2009-09-22 2012-09-25 Jen-Chang Hsia Compositions and methods of use of neurovascular protective multifunctional polynitroxylated pegylated carboxy hemoglobins for transfusion and critical care medicine
US8658434B2 (en) * 2009-10-28 2014-02-25 Biotium, Inc. Fluorescent pyrene compounds
US8697128B2 (en) * 2009-12-18 2014-04-15 Bae Systems Information And Electronic Sytems Integration Inc. Carbide-derived-carbon-based oxygen carriers
AU2011220885A1 (en) 2010-02-25 2012-09-06 Sangart, Inc. Methods for preparing PEG-hemoglobin conjugates using reduced reactant ratios
US8609815B2 (en) 2010-09-02 2013-12-17 Sangart, Inc. Methods for preparing stable deoxygenated PEG-hemoglobin conjugate solutions comprising an antioxidant
CN104379160A (zh) 2012-03-29 2015-02-25 桑加特公司 双阿司匹林交联聚乙二醇化血红蛋白
WO2016077825A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 Aima Biotech Conjugated proteins
US11504417B2 (en) 2017-07-18 2022-11-22 VirTech Bio, Inc. Blood substitutes comprising hemoglobin and methods of making
JP2020533416A (ja) * 2017-09-12 2020-11-19 メディカル・テクノロジー・アソシエイツ・ザ・セカンド・インコーポレイテッドＭｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｉ， Ｉｎｃ． エンドトキシンフリーヘモグロビン系薬物物質を製造するためのシステム及び方法、並びに、エンドトキシンフリータンパク質の精製方法
WO2022184005A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Billion King International Limited Thiosuccinyl-crosslinked hemoglobin conjugates and methods of use and preparation thereof
WO2023086152A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 Ohio State Innovation Foundation Systems and methods for the production of methemoglobin and its derivatives

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5716815A (en) * 1980-07-02 1982-01-28 Ajinomoto Co Inc Oxygen transporting agent for artificial blood
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
DE3144705C2 (de) * 1981-11-11 1983-12-08 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, vernetzten Hämoglobinpräparates mit hoher Sauerstoff-Transportkapazität, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte Hämoglobinpräparat
US4529719A (en) * 1983-05-04 1985-07-16 Tye Ross W Modified crosslinked stroma-free tetrameric hemoglobin
FR2551660B1 (fr) * 1983-09-13 1986-11-14 Centre Nat Rech Scient Hemoglobine modifiee chimiquement, sa preparation, solutions aqueuses en contenant et leur utilisation
DE3340592A1 (de) * 1983-11-10 1985-05-23 B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen Konjugate makromolekularer verbindungen an haemoglobine, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
US4584130A (en) * 1985-03-29 1986-04-22 University Of Maryland Intramolecularly cross-linked hemoglobin and method of preparation
EP0206448B1 (en) * 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8710598D0 (en) * 1987-05-05 1987-06-10 Star Medical Diagnostics Ltd Hemoglobin based blood substitute
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002514207A (ja) * 1997-02-28 2002-05-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 無細胞系による酸素輸送の最適化のための方法と組成物
JP2012529531A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 プロロング ファーマシューティカルズ，エルエルシー ヘモグロビン組成物
JP2016074710A (ja) * 2009-06-09 2016-05-12 プロロング ファーマシューティカルズ，エルエルシー ヘモグロビン組成物
JP2018021032A (ja) * 2009-06-09 2018-02-08 プロロング ファーマシューティカルズ，エルエルシー ヘモグロビン組成物
US10080782B2 (en) 2009-06-09 2018-09-25 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10172949B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10172950B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10772937B2 (en) 2009-06-09 2020-09-15 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10780148B2 (en) 2009-06-09 2020-09-22 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
JP2015514718A (ja) * 2012-04-03 2015-05-21 サンガート， インコーポレイテッド スクシンイミド活性化されたニトロキシル化合物およびタンパク質のニトロキシル化のためのその使用のための方法
JP2016521258A (ja) * 2013-03-15 2016-07-21 サンガート， インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド吉草酸ヘモグロビン接合体

Also Published As

Publication number Publication date
EP0502113A1 (en) 1992-09-09
JP2907300B2 (ja) 1999-06-21
AU6957691A (en) 1991-06-13
US5234903A (en) 1993-08-10
HUT61031A (en) 1992-11-30
KR920702232A (ko) 1992-09-03
HU9201701D0 (en) 1992-08-28
AU642692B2 (en) 1993-10-28
WO1991007190A1 (en) 1991-05-30
EP0502113A4 (en) 1993-03-31
CA2069402A1 (en) 1991-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH05504133A (ja) 効果的で、安定した、非免疫原性の赤血球代替物としての化学的修飾ヘモグロビン
US5386014A (en) Chemically modified hemoglobin as an effective, stable, non-immunogenic red blood cell substitute
KR100964604B1 (ko) 산소 친화도가 높은 개질된 헤모글로빈을 포함하는 산소 전달용 조성물 및 방법
JP2983544B2 (ja) 非細胞性赤血球代替品
US6323320B1 (en) Acellular red blood cell substitute
JP4382877B2 (ja) 安定重合化ヘモグロビン代用血液
US6083909A (en) Haemoglobin-hydroxyethyl starch conjugates as oxygen carriers
JP6668515B2 (ja) ジアスピリン架橋ｐｅｇヘモグロビン
US20100105606A1 (en) Methods for making high oxygen affinity modified hemoglobin for oxygen transport
CN104411807B (zh) 琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及其用于蛋白质硝酰化的使用方法
JP6657070B2 (ja) ポリアルキレンオキシド吉草酸ヘモグロビン接合体
US6894150B1 (en) Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin
US20060247423A1 (en) Hemoglobin conjugate and the preparation method and its use
JP2689023B2 (ja) ヘモグロビンオリゴマーに基づく組成物及びその製造方法
Szczepiorkowski et al. Red blood cell substitutes
MXPA99000402A (en) New agents of transfer of oxygen, conjugates of hemoglobin-hydroxyethylamidon that contain them, processes for its preparation and its use as substitutes sanguin