JPH05502886A

JPH05502886A - 細胞内で切断できる残基を含み、細胞が取り込める共役体および複合体

Info

Publication number: JPH05502886A
Application number: JP3510427A
Authority: JP
Inventors: クラーク，ブライアン・アール; デシュパンデ，シュリカント; ナグ，ビシュワジット
Original assignee: アナージェン・インコーポレーテッド
Priority date: 1990-05-14
Filing date: 1991-05-14
Publication date: 1993-05-20
Also published as: US5334391A; CA2059649A1; WO1991018012A1; EP0482185A4; EP0482185A1; US5169934A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

で　できる　４　が　入める丑″　および　ム゛した　への　糸回本出願は１９９０年５月１４日に出願された特許出願第０７１５２３，３３４号の一部継続出願である。この出願も、今では放棄されたが１９８８年６月２３日に出願された特許出願第２１０，５９４号の継続出願であり、そして１９８９年６月２１日に出願された特許出願第３６７．７５１号の一部継続出願である、１９９０年８月３０日に出願された特許出Ｗ５第５７６．０８４号の一部継続出願である、１９９０年１２月２８日に出願された特許出願第０７／６３５．０８４号の一部継続出願であり、これらのすべてはこの言及により本明細書中に含まれるものとする。技−１番−野本発明は細胞が取り込めて、細胞内で切断できる構成物に関したものである。さらに具体的に言うと、本発明は、細胞内で切断できるペプチド−毒素共役体、標的細胞へのそのような共役体の輸送のための複合体、およびそのような共役体および複合体の治療上のおよび診断での利用に関するものである。そのような利用はペプチド−毒素共役体から毒素を細胞内で切断することを頻繁に必要とする。 ■の− リボザイムおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドを含めた多くの細胞毒性の化合物および化学療法剤の実際の治療上のおよび診断での利用には改善された細胞輸送系の発達が必要である。リポソームのおよび生物分解性のミクロスフェアを血流で輸送する系は癌の化学療法剤およびアンファテリシンＢのような抗真菌薬に関して提唱されてきた。これらの輸送系の限界は封入した薬剤の非常に速い放出、および網内系の循環しているおよび固定しているマクロファージによる血流中を循環しているリポソームの無意味な取り込みを含む。Ｈの本発明は診断上または治療上有用な配位子の細胞が取り込めて細胞内で切断できる共役体を提供する。より広い観点から、本発明はＥは薬効で好ましくは毒素であり、Ｚは細胞内で切断できる結合でありそしてＱは任意の有機残基である式Ｅ −Ｚ−Ｑで表わされる共役体を提供する。図４はアトリアマイシイ薬効部、Ｅ、ジスルフィドの切断できる結合２およびペプチド残基Ｑをもつ共役体を示す図である。本発明は標的細胞への共役体の輸送および標的細胞による完全な複合体またはその共役体の取り込み促進するかもしれない残基ＡとＥ−Ｚ−Ｑ共役体の複合体を含む。そのような複合体は、その中でＡは例えば分離した分子または共役体のＱ成分を形成するタンパク質を含むＭＨＣＩタンパク質であってもよい式（Ｅ−Ｚ −Ｑ）Ａで表わされてよい０例えば図８から２Ｉでそのような複合体に言及して、それらを図解している。図２３は本発明に関連した一連の物を示す図である。毒素は切断できるジスルフィドの結合部を介して同種のペプチドに共役している。切断できる共役体は適切なＭ）（Ｃ１分子と複合体を形成する（例の中のＩＡ”については下に記述する。）ＭＨＣＩ＋−（ペプチド毒素）複合体をステップ１に示すように適当なＴ細胞とインキュベートする。ステップ２に示すように３つから成る複合体、（ＭＨＣｎ−（ペプチド−素））−ＴＣＰのペプチド−毒素部分のみがＴ細胞の表面上で取り込まれる。そのあと取り込まれた共役体は例えば還元型グルタチオンによる還元により切断される。放出された毒素はステップ３に示すように細胞に薬効を示す。本発明の別の観点では本発明は、係属中の特許出願第０７１５２３．３３４号に記載されている診断上または治療上有用な配位子の細胞が取り込めて細胞内で切断できる誘導体に具体的に表われている。［本発明の新規な細胞が取り込める誘導体は、その中でＬは細胞内で放出できる結合部であるかまたはそれに含まれて、そしてＸは任意の有機ラジカルである式で表わされるかもしれない、Ｘは細胞に取り込まれるまたは細胞に接着する機能を有することが好ましい。χは検出を可能にする、細胞の機能を修飾するまたはいくつかの他の診断上のまたは治療上の目的を果たしてもよい。」ということをその特許出願は説明している（ｐ、２．１＋、、　１２−２０）。これらの「誘導体」は共役体Ｅ−Ｚ−Ｑの部分集合であり、その中で「Ｌ」は薬効部ｒＥ、に相当し、そして「Ｘ」は共役体のＱの部分に相当する。したがって１つの観点からは本発明はどれがＥ−Ｚ−Ｑ共役体および（Ｅ−Ｚ− ＝Ｑ）Ａ複合体であるかという問題の組み合わせに割り合てられる。共役体の各成分は別の共役体の成分と例えば非共有結合的なまたは共有結合的な会合によって会合または結合する。これらの結合は、ＱおよびＡが同一分子中の異なる部分であるときに効果的であってよい。本発明の別の観点は、Ｅ−Ｚ−Ｑ共役体および（Ｅ−Ｚ−Ｑ）Ａ複合体を調製するための方法から成る。本発明は本発明の共役体および複合体の、およびそのような共役体または複合体を含む構成物の診断上のまたは治療上の利用も含む。本発明の共役体または複合体はそれ自体でまたはリポソームまたは生物分解性のミクロスフェアとの会合物として非経口的に投与されてもよい。定−一一義薬効部一一取り込みに基づいて細胞の代謝を修飾する部分。細胞が取り込めるｍ−細胞の中へ入ることができる。細胞内で切断できる結合−一細胞の取り込みに基づいて切断される結合。共役体−一部の化学的な部分へ細胞内で切断できる結合によって会合させた薬効部。複合体−一細胞への共役体の輸送または細胞による共役体の取り込みを促進する部分と共役体の会合体。ＭＨＣ−一主要紐ｗｉ適合性複合体。ＭＨＣがコードする糖タンパク質は、全細胞の表面に見い出されて細胞障害性Ｔ細胞によって主に認識されるクラスｌ１ｌｉタンパク質およびマクロファージのような補助細胞を含めた多くの細胞の表面に見い出されてヘルパーＴ細胞への抗原の提示に含まれるクラス■糖タンパク質に分類された。単離されたＭＨＣ成分−−ＭＨＣ糖タンパク質または、例えば正常にＭＨＣを発現している細胞膜と会合しないような本来の状態ではないＭＨＣＩ！タンパク質の有効な部分（すなわち、抗原を結合するポケットから成る部分および適当なＴ細胞のレセプターによる認識に必要な配列）。ＩＡ”−−ハツカネズミＭＨＣのＩＡ亜区を形成するタンパク質。ＭＢＰ−一ミニリン基礎タンパク質。ＡＪｌ、２）−−ラットＭＢＰペプチド（１，−１１）に対するマウスの免疫によ４Ｂ３．４）　って調製されて抗原特異性について特色となるネズミＴ細胞の４　Ｂ　３．９　）　クローン、パロ　アルド（Ｐａｌａ　Ａｌｔｏ）、カリフォルニアのスタッフォード大学、パトリシア　ジコーンズ博士（Ｄｒ、ＰａｔｒｉｃｉａＪｏｎｅｓ）から曹与される。ＩＡ”−ＭＢＰベブチドー−ＭＢＰペプチド断片と複合体を形成するＩＡ’タンパク質の共役体。ＩＡ”ＭＢＰベブチドーアドリアマシイシンー−ＭＢＰペプチド−アドリアマイシン共役体と複合体を形成するＩＡ”タンパク質。ＩＡに一〇ＶＡ−アドリアマイソンーーメンドリアルブミンベブチドーアドＩＪアマイシン共役体と複合体を形成するＩＡ”タンパク質。配位子−一細胞表面のレセプターに結合する部分。図−辺一説一朋図１は本発明の化合物において配位子として有用な抗ｌｔ蕩性のアントラキノンの一群を説明する図である。図２は本発明の化合物において配位子として有用な抗腫瘍性のアントラキノンの別の一群を説明する図である。図３Ａから３Ｄは４つのペプチドＡｃＭＢＰ　（１−１４）ＡＬＡ’　、ＡｃＭＢＰ（１１４ＡＬＡ’　Ｃｙｓ”、ＡｃＭＢＰ　（１０１４）ＡＬＡ’　ＡＬＡ ’　ＡＩ−Ａ６およびＯＶＡ　（３２４０３３６）ＣＹＳ”６の配列を示す。図４はアドリアマイソンーベブチド共役体の構造式である。図５はマイコフェノリック−ペプチド共役体の構造式である。図６は遊離のおよびペプチドが結合したアドリアマイシンの存在下でのＡ　Ｊ　＋、　２丁細胞のＬＤｓ。を示す図である。図７はＩＡ’−（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ４−アドリアマイシン〕複合体を用いたＡＪｌ、２Ｔ細胞の殺害を説明する図である。図８はＩＡ’　−（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ４−アドリアマイシン〕複合体を用いた４Ｒ３，９Ｔｉ胞の殺害を説明する図である。図９はマイコフェノリッターＭＢＰペプチドの存在下でのＡＪｌ、２および４Ｒ３，９細胞のＬＤ、、を示す図である。図１０はＩＡ’〜（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ４−マイコフェノリンク〕複合体を用いたＡＪｌ、２細胞の殺害を説明する図である。図１１はペプチドまたはＭＨＣｎをそれぞれ放射ラヘルしたＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体のＭＨＣの部分の取り込みと比較した、ペプチド残基“”ＭＰＢ（１− １４）Ａｔａ４Ｔｙｒ１４”のＴ細胞による取り込みを説明する図である。図１２は試験管内でのＴ細胞の殺害に必要な毒素単独のおよびＩＡゝ　〔ペプチド−毒素〕共役体複合体の濃度を説明する図である。図５．７．９および１０を見よ。図１３はＩＡ’（ペプチド）アドリアマイシン複合体を用いたＴ細胞の殺害のための１つの実験に基づく計画を説明する図である。図１４はリン酸緩衝液または５０％マウス血清中で３７℃でのＩＡ”　−ＣＩ− ］、、２５）ＭＰＢ　（１１４）複合体の安定性を説明する図である。図１５は、二重標識したＣ５−３５）ＩＡ”　−（Ｉｉ２５）ＭＢＰ　（１−１４）複合体のペプチドおよびＭＨＣ１１部分のＴ細胞のクローンによるまたはＭＨＣ■複合体に対するＴ細胞のレセプターをもたないＴリンパ腫細胞による取り込みを説明する図である。図１６は、二重標識したＩＡ’　−ＭＢＰ　（１−１４）複合体のペプチドおよびＭＨＣ１１部分のクローン４　Ｒ３，９による取り込みのアジ化物による阻害を説明した図である。図１７は二重標識したＩＡＫ−ＭＢＰ　（１−１４）複合体のペプチドおよびＭＨＣｎ部分のＴ細胞クローン４Ｒ３，９による取り込みのサイトカラシン已による阻害を説明した図である。図１８は緩衝液単独中でのＭＢＰ　（１−１４）　−（Ｔ−１２５）アドリアマイシン共役体およびＪＡＫ−ＣＭＢＰ　（ＩＩ　４）−（１−１２５）アドリアマイシン〕複合体の安定性を説明する図である。図１９はノチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下におけるＭＢＰ（］−１４）Ａ４−　（１−１２５）アドリアマイシン共役体およびＩＡ’　−［ＭＢＰ　（ｉ −１４）Ａ４−　（１１２５）アドリアマイシン）複合体の安定性を説明する図である。図２０はマウス血清の存在下におけるＭＢＰ　（１−１４）Ａ４−（１−１２５）アドリアマイシン共役体およびＩＡＫ−［ＭＢＰ　（１−１４）Ａ４−ＣＩ− １２５）アドリアマイシン〕複合体の安定性を説明する図である。図２１は放射ラヘルしたアドリアマイシンの取り込まれた形を説明する図である。図２２Ａはアドリアマイシンに共役した１−Ａ′およびＭＢＰ　（１０］、　４）　Ａ４ペプチドを含む複合体を用いてのＡＪｌ、２Ｔ細胞の除去を示す棒グラフである。図２２Ｂは４　Ｒ３，９Ｔ細胞を用いた同し実験の結果を示す。それぞれの図において、阻１は単独での細胞の増殖を表わし、Ｎα２は共役していない複合体とインキュベートした細胞の増殖を表わし、Ｎ１１３はアドリアマイシンと共役した卵白アルブミンのペプチドから成る複合体とインキュベートした細胞の増殖を表わし、そして隅４はアドリアマイシンと共役したＭＢＰ　（１−１４）Ａ４から成る複合体とインキュベートした細胞の増殖を表わす。図２３は、同種のＭＨＣＩ［−Ｃペプチド毒素〕複合体を用いての目標にしたＴ細胞の削除を説明する図である。庇ｔρ公慧楼卑肛旦配説皿本発明は薬効部および他の部分の取り込まれうる共役体を提供する。その共役体は細胞内で切断されることができる。好ましくは薬効部は毒素である。標的細胞への血流中での輸送および細胞の取り込みを促進する部分と、これらの共役体の複合体を提供する。本発明の１つの好ましい！！！ｉ様においては、共役体のみが取り込まれる。その後で毒素は一緒に会合していた部分から細胞によって切断される。Ａ、Ｅ・六　丑′　Ｅ−Ｚ− Ｅ、　ＺおよびＱの部分は共有結合によって、非共有結合性の会合によって、または共有結合でまたは非共有結合で結合したリンカ−によって結合してもよい。薬効部の成分Ｅの選択は細胞内での切断の後に果たすべき機能に基づいて決定される。一般には薬効部はこれらのみに限定されるわけではないが、レセプターの作用薬、レセプターの拮抗薬、成長因子、ドキソルビシンのような抗腫瘍剤、天然のレセプターの配位子であるペプチド、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ポリヌクレオチド、低密度リポタンパク質、α−２−マクログロビン、抗毒素、抗菌剤、酵素■蓄剤および粘膜組織の保持を提供するのに有用な薬効部を含む。様々な癌化学療の配位子および抗真菌の配位子が関連した特許および出版物中に記載されている。本発明において有用なアンスラサイクリン配糖体の薬効部はアントラセン環の構造の隣接した環上に１つのキノンおよびハイドロキノン基をもつアントラキノンの構造を含む。これらの特徴をもつ抗腫瘍性のアントラキノンの２つのグループが図１および２に図解されている。イダルビシンおよびプロムイダルビリンを含むこの型の多くの他の化合物は先行する技術中に記載されている。図１も含めて、グループはドキソルビシン、ダウンマイシン、カルジノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、Ｎ−アセチルダウノマイシン、ルビダゾン、イダルビシン、プロムイダルビシン、および５−イミドダウノマイシンのような多数の臨床上重要な抗腫瘍剤である０表Ｉには図１のＲ１、Ｒ宜およびＲ３部分に関してのこれらの薬剤のいくつかの構造上の変化を示す。アドリアマイシン　Ａ０　〜Ｃｏ−ＣＨｚＯＨ−ＮＨ２ダウノマイシン　＝０　〜Ｃ０−ＣＨ３−ＮＨｚＮ−アセチルアドリアマイシン　−０−ＣＯ−ＣＨｚＯＩ（−ＮＨ−Ｃｏ−ＣＩ（ｉＮ−アセチルダウノマイシン　＝０　−Ｃｏ−ＣＨｓ　−Ｎｆｌ−Ｃｏ−ＣＨｓルビダゾン　＝−０〜Ｃ−Ｎ−Ｎｉ１−Ｃ−Ｃ１（ｆｆｏ　−ＮＨｚ　・５−イミノダウノマイシン　””ＮＨ−Ｃｏ−ＣＨ３−ＮＨｔこの種の薬剤は急性白血病、乳癌、ホジキン病、ホジキン病ではないリンパ腫および肉腫を含む様々な癌に対する抗ｔｔ瘍効果をもっているこ七が知られている。図２に見られるようにアントラセン配糖体の２番目のグループはもっと複雑な（多ｉ体の）アミノグルコシド残基によって表Ｉの化合物から区別される。これらの化合物は表Ｉの類似物と同し一般的な治療上のおよび毒性の性質を共有する。代表的なアントラセンアミノグルコシドを図２に示したＲ、　、Ｒ，およびＲ３グループへの言及とともに表Ｈに列挙した。ミュゼッタマイシン　ＯＨＣ００ＣＲ，Ｈルドルホマイリン　ＯＨＣ００ＣＨｚ　レドノサミンアクランアオマイシン　ＨＣ００ＣＬ　シネルロースマルセロマイリン　ＯＨＣ００ＣＨＩ　２−デオキシフコースダス方ルネメトキンマルセロマイリン　ＯＨＨ２−デオキシフコースダスカル番メトキノルトル本マイシン　ＯＨＨし　ドノサミ　ン好ましい共役体は、リジンのような毒性のペプチド、ジフテリア、ゲロニン、シェードモナス毒素およびアビリンを含む毒素である薬効部を含む。アンチセンスおよびリボザイムＲＮＡのような細胞を破壊するまたは細胞の機能を媒介するオリゴデオキシヌクレオチドは本発明の共有体のための価値ある薬効部の部分を構成する。薬効部の細胞内での切断は好ましくはジスルフィド結合、エステル結合または他の切断できる結合によって達せられ、この結合は薬効部を共役体の残りへ結合させる。そのような切断できる結合の形成のための化学は既知のものである。適切な化学は任意の好ましい配位子の官能基とともに利用のために選択されうる０例えば第一級アミン（−ＮＨ，）置換基、水酸基、またはカルボキシル基のような適切な官能基を既知の化学の方法によってそのような官能基を欠いた配位子へ導入してもよい。本発明の目的のためには、アミン、好ましくは第一級アミンまたはカルボキシル基をもつまたはそれを導入された薬効部が好ましい。共役体の標的細胞への輸送を促進するようにＱ（特許出願第０７１５２３．３３４号ではＸに相当する）を適切に選択する。Ｑ　（Ｘ）の部分は細胞へ取り込まれるまたは接着する機能を提供してもよい。Ｑ　（Ｘ）は検出、すなわちｌ識としての機能を可能にしてもよくまたは促進してもよく、細胞の機能を修飾してもよく、またはＥに加えて診断上のまたは治療上の機能を果たしてもよい。リポソームによる共役体の輸送は、リポソームの二層構造体への共役体の固定を容易にする脂質であるＱ　（Ｘ）の部分によって促進される。ＥおよびＱ　（Ｘ）間の細胞内で切断できる結合は既知の化学の手順によって提供される。で　で　る　人のムジスルフィド結合を形成するために、アミノ基のある配位子をジメチルアセトアミド中で液体状の２，２′−ジチオノビリジンおよび２′−イミノチオレインとともに反応させて、その中でＥは任意の薬効部を表わす反応式Ｉに従った配位子のＮ−〔４−ピリジルジチオブチリミド）誘導体を生産してもよい。化金立Δ 好ましくはＥ−ＮＨ，は図１および図２に示した種類のドキソルビシンのような抗ＬＩＩＩ性のアントラキノンである。Ｅ−ＮＨ，はアンフォテリシンＢ、他の抗真菌剤またはペプチド毒素または−ＮＨ，基のある任意の他の薬則であってもよい。化合物Ａは配位子（薬効部）の、ジスルフィドで結合したペプチドまたは脂質の誘導体（共役体）を生産するために利用される。例えばペプチドの誘導体は、その中でＱは任意のペプチドであるメルカプトペプチドＱ−３Ｈと化合物Ａを反応させることによって反応式■に従って生産されてよい。化金惣Δ　ジメチルアセトアミド溶媒反応式■ 化金宜旦Ｑは好ましくは約５から５０の残基をもつペプチドである。Ｑはアルキル基（Ｒ）であってもよい。約１２から１８の炭素原子をもつＲ基はリポソームの二Ｊｉｉｌ造体中で混和性があり、そして本発明の誘導体がリポソームの輸送系の形で投与されるときに漏れを最小にするための錨として役に立つ。Ｅは好ましくは毒性があるので、取り込まれたときに化合物Ｂの式をもつ化合物は細胞に対して毒性がある。毒性は、ジスルフィドまたは他の適切な結合の切断と１つまたは両方の毒性の部分の必然的な内部での放出によって増強される。、の址′　の人拠−１２ス四フイトで　ムした゛キソルビシン　アドリアマイシン　のペプチド悸のム　′°４　よアドリアマイシン塩酸塩（アルドリッチケミカル社、１１０１Ｉ、１７．２μｍｏｌ　）を１０ｐｌのジイソプロピルエチルアミンを含む３．Ｏｄの無水ジメチルアセトアミドに溶解した。２．２’−ジチオジピリジン（アルドリッチ、５０ ■、２２７μ鋤ｏｌ）および２−イミノチオレイン塩酸塩（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）　、１０■、７２．７μ−〇１）をともに１．　Ｏｄ中に溶解し、ポルテックスミキサー上で５分間混合した。ポルテンクスで攪拌しながらアドリアマイシンの溶液を１滴づつ加えた。６時間後に室温で反応産物をリニアグラジェントの溶出（ｆ４媒Ａ：水中で０．１％トリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ：氷水中７０％アセトニトリル中で０．１％トリフルオロ酢酸）を用いてＣＩ８カラムの逆層ＨＰＬＣによって精製した。β−メルカプトエタノールを用いた精製した産物の切断によりＨＰＬＣ？期待される２つのピークが得られた。反応＝性成物Ｎ−（４−ピリジルジチオブチリミド）アドリアマイシンＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した、混合ジスルフィドのアドリアマイシンの誘導体を１５ＩＩｉのポリプロピレン製の遠心管中で０．５　ｄの脱気した水に溶解した。次の構造をもち）ｆＰＬｃ的に単一の合成メルカプトペプチド（１，Ｏｗｇ）　：（Ａ４ペプチド配列）を０．５戚の脱気した水に溶解し、ボルテフクスで攪拌しながらアドリアマイシンの混合ジスルフィドへ加えた。６時間後に室温で、ジスルフィドで結合したペプチド−アドリアマイシン誘導体を上のようにグラジェント溶出、ＣＩ８カラムの逆層ＨＰＬＣによって精製した。ジチオスレイトールを用いたジスルフィドの還元的な切断を行ない、ＨＰＬＣで分析すると期待された最初のメルカプトペプチドおよび４−メルカフトブチリミドのアドリアマイシン誘導体が得られた。反応： ”ＮＯ３ペプチド〜ＳＨ＋アトリアマイノン−Ｎ）ＩＪＪ　Ｃ１１２ＣＨ２ＣＨ２５Ｈｆ（ＰＬＣで精製したジスルフィドで結合したペプチド−アドリアマイシン誘導体はおそらくジスルフィド結合の還元的な切断および毒性のアドリアマイシン部分の内部での放出のためにその誘導体を取り込んだ細胞に対して毒性があった。例−エジスルフィドで　ムしたドキノルヒン！　アドリアマイシン　−′　ｔ”　の人成反応はジスルフィドで結合したペプチド−アドリアマイシン誘導体について記述したものと類催している。例１において記述したアドリアマイシンの中間体を用いる＝Ｎ−（４−ピリジルジチオブチリミド）　ヘキサデシルメルアドリアマイシン　カプタン標準的な技術を用いて、精製したアドリアマイシン−脂質誘導体をリポソーム中へ取り込ませる。一般的にはＰｏｚａｎｓｋｙ、　Ｍ、Ｊ、　（Ｐｏｚａｎｓｋｙ、　Ｍ、　Ｊ、）ら、（１９８４）Ｐｈａｒｔｍａｃｏｌ、Ｒｅｖ、３６　：　２７７−３３６を見よ、細胞によるリポソームの取り込みの後で、取り込まれた誘導体は還元型グルタチオンによって還元的に切断されて、放出された毒性のアドリアマイシンは細胞を殺す。班−１ＡＪ＋、２Ｔ　クローンのアト１アマイシンおよびペプチド−アト１アマイシン共段生ヱ少処理１０’のミニリン基礎タンパク質（ＭＢＰ）−特異的なＴ細胞（クローンＡＪ１．２、スタッフォード大学、バトリシア　ジジーンズ博士（叶、Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｊｏｎｅｓ）から恵与される）をアドリアマイシンまたは例１に記述したような細胞内で切断されうるＡｃＭＢＰ　（１−１４）Ｃｙｓ”−３−５−アドリアマイシン共役体とともに２４時間３７°Ｃでインキュベートした。細胞を洗浄して、ｒｌＬ−２（５ユニット／ｍｉ）とともにマイクロタイタープレート中で培養した。７２時間後に細胞の増殖によって測定される細胞の生存をＭＴＴ比色定置分析（モスフィン、Ｔ、（Ｍｏｓｓｍａｎｎ、Ｔ、）、細胞の生長および生存の測定のための迅速な比色定量分析：増殖とよび細胞毒性の分析への応用、Ｊ、　Ｉ＋ａｍｕｎｏ１．門ｅｔｈｏｄｓ　６５：５５（１９８３））からめた。データ（ＭＴＴ分析での６５０ｎｍの吸光度）を、細胞のインキュベーション培地中のアドリアマイシンまたはアドリアマイシンの共役体の対応する濃度とともに示す、これらのデータから得られるＬＤ、。のデータを図６に示す。毒素の濃度（ｐｓｏｌ／１ｄｌ）　細胞の生存（ＭＴＴ分析、　６５０ｒ＋ｎ）７Ｆリアマイシン　？ＩＢＰ（１−１４）−７トリアマインン　アＦす７マインン　ＭＢＰ（１−１４）−７）リアマイノン０．００　０．００　０．６４５（１００χ）　０．６６８（１００χ）０．０１　０．１０　０．６２２（９６，４χ１１　０．６５６（９８，２χ）０．１．０　１．００　０．５９８（９２，７χ）　０．６６８（１００χ）］、００　１０．０　０．６９１　（１０７ χ）　０．６６９（１００χ）１０．０　＋００　０．６２４（９６，７χ）　０．６７３（１０１χ）１００　１０’　０．５３２　（８２，５χ）　０．５８６（８７，８χ）１０″１０’０．１３０（２０，２χ）０．２７９（４１，７χ）１．０’　１０５　０．０３７（５，７χ）　０．１１２（１６，８χ）ＬＤ、、値：０．２５μＭ（アドリアマイシン）および５．０μＭ　（ＭＢＰ　（１−１４）マイコフェノリフクーペプチド丑′　のム　５を　よマイコフェノール酸（シグマ　ケミカル社、ミザリー州、セントルイス、３２■、１００μｍｏｌ）および臭化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクソニミドエステル（シグマケミカル社、１２■、５０ｇｗｏｌンを、９ｐ１のジイソプロピルユチルアミン（ＤＩＥＡ、アルドリンチケミカル社、５０μ爾ｏ１）を含む２００μｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シグマ　ケミカル社）中に溶解した。反応。マイコフヱノロキシ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−晩室温で放置した後で、５０ｕｌのＤ　Ｉ　ＥＡ　（２７８μｍｏｌ）を含む１００ｐＺのＤＭＳＯ中の５［（２，５μｍｏｌ）のペプチド：の溶液へポルテックスで攪拌しながら加えた。室温で２時間後、マイコフェノキシアセチル化したペプチドを、５０体積の無水酢酸エチル（アルドリッチ　ケミカル社）を加えることによって沈澱させた。ペプチド誘導体を遠心分離によって集めて、酢酸エチルで数回洗浄し、乾燥させた。乾燥した残基を０．１％ＴＦＡ中に溶解し、すぐにプレパラティグＣ１８逆層カラムに通した。純粋な誘導体を得媒Ｂニア０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）、精製したマイコフェノキシアセチル化したペプチドの誘導体の構造（ＬｙｓのＮ−アミノ基に結合している）：を質量分光分析によって確認した。おそらく、毒性のマイコフェノール酸の部分の放出を伴なうエステル結合の細胞内での酵素による加水分解を介して、ＨＰＬＣ的に純粋なペプチド−マイコフェノール酸の誘導体はその誘導体を取り込んだ細胞に対して毒性を示した。図９はこのマイコフェノリンクＭＢＰペプチドの存在下におけるＡＪ＋、２および４Ｒ３，９Ｔ細胞のＬＤ、。を示す。図１Ｏに示した結果は、ＩＡ”−ＭＢＰ　（１１４）Ａ４−マイコフェノール酸エステルの複合体とインキュベートした細胞の（細胞の生存の指標としての）増殖（荀３）は細胞単独のもの（Ｎｃｉ、　１　）または共役していない複合体とインキュベートした細胞のもの（短２）よりも有意に少ないということを示している。その結果は本発明の複合体の、特定のＴ細胞のクローンを特異的に除去する能力をさらに証明する。ペプチドーオ丁ゴヌクレオチド肚′几　のム合成オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを、合成の最後の段階として商業的に入手できるアミンまたはチオールのリンカ−（ミリケン／バイオサーチ（Ｍｉｌｌｉ　Ｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、マサチューセッ゛ン州バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）の試薬一覧表のリンカ−を見よ）を加えた標準的な自動化した合成を用いて、５′末端にアミノ基を含むように既知の方法で合成することができる。合成の終了時にチオールのリンカ−から保護基をはずして直接チオールを形成する。それからチオール基は下に示すように過剰の２．２′−ジチオジビリジェント（アルトリチオール、アルドリッチケミカル有限会社、ウィスコリシン州、ミルウォーキー）との反応によってピリジルジチオ誘導体へ変換される。５′−チ第１ン力一　つオリゴヌクレオチドのＵおよびＱＣ）ＩｚＣＬＣＬ−５Ｔｒｔあるいは、ガウラー（Ｇａｕｒ）ら、オリゴヌクレオチドの５′末端へのチオール基の導入のための簡単な方法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　上ユ（１１）：４４０４　（１９８９）および以下に記載されるようにＮ− スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ、シグマ　ケミカル社、ミザリー州、セントルイス）を用いて、合成オリゴの５′末端の保ｆｆａ＆をはずしたアミンのあるリンカ−を直接ピリジルジチオ誘導体へ変換してもよい：カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）　ら、タンパク質のチオール化および可逆的なタンパク質−タンパク質結合、ＢｉｏｃｈｅｔＪ、土工３　ニア２：３−７２７　（１９７Ｂ）および以下に記載されるようにシスティンをもつペプチドを含めたメルカプタンを共存結合でリンカ−をもつオリゴヌクレオチドへ非対称なジスルフィドの交換によって結合させることができる。５′−アミンリンカ−をもつオリゴヌクレオチドの°　′１および０ＣＨｚＣＨＪＨ□ ＳＯ−オリゴ−０Ｈ３′ Ｏ−ＣＨ，ＣＨＪＩＣＣＨ，ＣＩＩｚＳ−Ｓヘブ−Ｊ−１’〇−オリゴー０８３ ′ このようにして、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびリポザイムを含むオリゴヌクレオチドをペプチド、例えばＴ細胞の抗原決定基へ共役させ複合体は、その中でＥ−：Ｚ−Ｑが上に記載したような共役体であり、Ａは共役体の標的細胞への輸送および共役体の標的細胞による取り込みを促進する部分である、式（Ｅ−Ｚ−Ｑ）Ａによって表わされる。ＱおよびＡは別個でもよく、同じ分子の成分の部分でもよい。好ましいへの部分は、細胞表面のレセプター、例えばＭＨＣｎ分子、上皮成長因子のような成長因子、トランスフェリンおよびトランスコバラミン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｉ　Ｌ−３、ＩＬｉのようなサイトカイニン、およびＴＧＦα、への結合の後に取り込まれる配位子を含む。Ｅ−Ｚ−Ｑ共役体は例えば非共有結合性のまたは共有結合性の会合または共有結合によってへの部分へ会合または共役してもよい。Ｅ−Ｚ−Ｑ共役体のＱの部分は複合体のＡの成分の上の結合部位へ挿入されたまたは加えられた別個の部分であってもよい。あるいはＱの部分は本発明の複合体のＡの部分に由来して、もし好ましいならば修飾後にそれへ再び挿入されてもよい。したがって毒性のペプチドを、認識に基づいたＡ成分と非共有結合的にまたは共有結合的に次に会合する共役体のＱ成分を提供するために既知の方法で合成してもよい。あるいはペプチドの部分はＭＭＣ分子から分離されて共役体のＱの部分として使用されてもよく、またはＭＨＣ分子中の元のペプチドの部分を置き代えるために使用できる別のペプチドを合成してもよい。したがって本発明の別の観点はその中でＢが（Ｅ−Ｚ−Ｂ）Ａ共役体複合体のＡの部分または成分である弐Ｅ−Ｚ−Ｂで示されてもよい共役体を含む。そのようなＥ−Ｚ−Ｂ共役体の複合体の式はそれが由来するまたはそれが一緒に会合するべきＡの部分の残りの成分とＢの共役体の部分の組換えまたは置換を事実上必然的に伴う。有名なので、ＭＮＣ分子に基づく共役体および複合体を例として挙げる。ＭＨＣ分子は、既知の方法で分離または単離されて、好ましいならば修飾されて、そしてその後に本発明の共役体のＱの部分として用いられてもよいペプチドの成分を含む、あるいは残りのＭＢＣ分子と結合するまたはＭＨＣ分子中の空のペプチドのポケットに結合する合成ペプチドを合成してＱの部分として用いてもよい。複合体はそのようなペプチドを結合することまたは再結合することによって形成されて、それが由来したＭＨＣ分子の残りまたはＭＨＣ分子の空のポケットとともに共役体のＥ−Ｚ成分へ結合する。そのような複合体の形成を次の概略中で説明してもよい：１、遊離のペプチドの結合部位をもつＭＨＣ分子Ｍを提供すること。２、その中でＢが前記ＭＨＣ分子分子の遊離の結合部位へ結合するペプチドであるＥ−Ｚ−Ｂ共役体を形成すること。３、Ｅ−Ｚ、−Ｂ共役体をＭｌ（Ｃ分子量にＥ−Ｚ−Ｂ　（Ｍ）を形成するように結合することによって複合体Ｅ−Ｚ−Ｂ　（Ｍ）を形成すること。共役体の部分が複合体のＱの成分に対する親和性をもっているならば、−ｉに共役体−複合体を簡単なインキュベーションで調製してもよい６例えばペプチド− 毒素共役体のペプチドの部分は非共有結合で適切なＭＨＣ１１分子へ親和性の相互作用によって結合することができる。あるいはその共役体は、カルボジイミドが媒介する脱水作用によって形成されるアミド結合を介して共有結合で結合してもよい、これはカルボキシル基およびアミノ基を存する化合物を結合させるための標準的な方法である。図２３で説明するように、本発明は、Ｅ−Ｚ−Ｂ　（Ｍ）　複合体の投与はその複合体のＥ−Ｚ−Ｂ部分のみの細胞の取り込みをもたらすという重要な発見を含む。したがってこの型の複合体はすべての種類の薬効部のための優れたそして意外と効果的な輸送系を提供する。図２３を見よ。例えば化学療法の薬効部を含む共役体を既知の方法で、インキュベーションによって本発明の複合体を提供するための選ばれたＡの部分と会合させてもよい。上に記述したペプチド−オリゴヌクレオチド共役体を適切なＭＨＣＵ分子と複合体を形成させて、適切なまたは「限定したＪＭＨＣＩＴ対立遺伝子に結合されるときのみにペプチドを認識するＴ細胞レセプターをもつＴ細胞とインキュベートしてもよい。次のデータおよび例に示すように、ペプチドとよびペプチド−毒素誘導体は、Ｘが同起源のペプチドへ共役した任意の化学的な部分である「同起源の、ＭＨＣＩＩ−（ペプチド−Ｘ）複合体を特異的に結合するこれらのＴ細胞によって取り込まれる。したがって、アンチセンスのデオキシリボヌクレオチドの類個体およびリボザイムは例えばそれによって不活性化されるまたは削除される自己反応性のＴ細胞によって特異的に目標にされてもよい、ツッケルマン（Ｚｕｃｋｅ−ｒｍａｎ）　ら、チオールの特異的なプローブの合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの３′末端への結合のための効果的な方法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　上５　（１３）：５３０５−５３２１　（１９８７）に記載された技術を用いて、同様な反応を、オリゴヌクレオチドの３′末端に導入したチオール基について行なってもよい、配位子の部分かレセプターへ結合したときに取り込まれる、細胞内で切断できる共役体を形成するために、アンチセンスのヌクレオチドも同様な反応で細胞表面のレセプターのメルカプト基をもつタンパク質の配位子へ結合させてもよい、この例は、活性化したＴ細胞上のＩ　Ｌ−２レセプターへ結合したときに取り込まれるＩ　Ｌ−２である。したがって細胞内で切断できるＩＬ−２−アンチ−ＩＬ−２Ｒヌクレオチド共役体を用いて、Ｉ　Ｌ−２レセプターの遺伝子をアンチセンスのヌクレオチドの標的とすることによって活性化したＴ細胞を不活性化してもよい。ＩＡ”−ペプチド　ｌ−１２５アドリアマイシン　人　の看　１ＭＢＰ、（１− １４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン共役体を以下のようにして調製した＝０．５％オクチルグルコピラノシド（ＯＧ）およびＰ　Ｈ７，５の０．０２％７’；化ナトリウムを含むＰＢＳ中のＴＡ”の溶液（０，８＋＋＋ｇ／ｄ）　２５０ｐｉへ（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン〕共役体の用時調製したＰＢＳ溶液（６■／ＩＩｉ、モル濃度でＩＡｌに対して５０倍過剰）５０〃を加えて、得られた溶液を３７°Ｃで穏やかに撹拌しながら４８時間インキュベートした。　８０００−１２０００以下の分子量の物を除去する透析膜を用いて、次に溶液をｐ　Ｈ７，４の１リツトルのＰＢＳに対して透析した。６時間後および２４時間後に緩衝液を交換し、透析を４８時間続けた。Ｔ細胞と混合するため←用いる直前に透析したサンプルを透析から回収した。いくつかの実験では複合体をざらにＲＰＭＩ培養培地に対して透析した。同じ方法をＩＡ菖−（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ”　Ａ’　Ａ’−（ｒ−１２５）７）’リアマイシン〕複合体の調製のために用いた０例において言及するすべてのＴＡ”−ペプチド複合体をまったく同し方法で調製した。斑−−ＭＩＡ莢−ＣＩ−１，２５］ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’複合体（用いたペプチドの２７．５％のＩＡ’）を９．６■／ｉでｐｌ（７，２のリン酸緩衝液中でまたはリン酸緩衝液中の５０％の正常なＡＪマウス血清中において３７°Ｃで示した時間だけインキュベートした。インキュベートしたサンプルを同し量だけシリカゲルＴＬＣにスポットした。展開後にＭＨＣ−ペプチド複合体に対応する原点の乾燥させたスボントを削り取り、ガンマ−カウンターで測定した。０時間に得られる放射活性ＭＢＰ　（１−１，４）Ａ’　！（Ｄ体を８Ｎ準的なりロラミンＴの方法により　＋２Ｓ１で標識した。親和性を利用して精製したＩＡ”を供給者が推薦する手順（アマンヤム社）により（Ｓ−３５）ＢｏｃメチオニンでＩｆｆ！した。二重標識した〔５−３５］ＩＡＫ−（Ｉｉ２５）ＭＢＰ　（１ｉ４）Ａ’ 複合体（ＭＢＰ（１−１４）Ａ′については８．８　Ｘ　Ｉ　Ｏ５ｃｐｓ／Ｊ！ｇ、ｔ：ｉよびＩＡ’については１．９８　Ｘ　１０５ｃｐ＋＊／　ｕｇ　）を標識した成分から調製した。ＲＰＭＩ中の二重標識した複合体（１，９ｔｒｇ、用いたペプチドの１８％）を１．　Ｏｄの血清を含まないＲＰＭＩ培地中で５ＸＩＯ’個のＭＢＰに特異的なりローンである４Ｒ３，９ハツカ不ズミＴ細胞（刺激後１０日）または５Ｘ１０’個のＴ細胞レセプター陰性のＢＷ５１４７ハツカネズミＴリンパ腫細胞（どちらもスタッフォード大学、パトリノア　ジューンズ博士（叶。Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｊｏｎｅｓ）から恵与された）とともにインキュベートした。５時間３７゛Ｃでのインキュベーションの後に、細胞をＲＰＭＩ培地で徹底的に洗浄し、集めて小さな塊として、Ｉ−１，２５の放射活性をガンマ−カウンターで測定した。次に細胞をシンチレーション液体の入ったバイアルへ移して、５ −３５の放射活性をベータカウンターで測定した。細胞が取り込んだＭＢＰ　（１−１４）Ａ’ペプチドまたはＩＡ’の分子数はチャネルを補正して測定したｃｐｍ値および二重標識した複合体の各部分の比活性から計算した。細胞の一部を二重標識した化合物とともに０．２％アジ化ナトリウムまたは４μＭサイトカラシンＢを含む培地中でもインキュベートした。その結果は、Ｔ細胞に結合したＭＨＣｎ−ペプチド複合体のペプチドの部分のみが取り込まれることを示す、この取り込みはアジ化物によって阻害されるが、サイトカラシンＢによ、では阻害されず、したがってエネルギーに依存するが、微細繊維が媒介しない取り込みの過程を示唆する。図１５は二重標識した（Ｓ−３５］　ＩＡ”　ＣＩ　１２５）ＭＢＰ　（１１４）複合体のペプチドおよびＭＨＣＩＩの部分のＴ細胞クローンまたはＴリンパ腫による取り込みを説明する図である。ＵＩ６は、二重標識したＩＡ’−ＭＢＰ　（１−１４）複合体のペプチドおよびＭＨ（ｌの部分のクローン４Ｒ３，９による取り込みのアジ化物による阻害を説明する図である。図１７は二重標識したＩＡ’−ＭＢＰ　（１−１４）複合体のペプチドおよびＭＨＣｎの部分のＴ細胞クローン４Ｒ３，９による取り込みをサイトカラシンＢが阻害しないことを説明する図である。射−一■ ＭＢＰ　１−１４　Ａ’　ｌ−１２５７Ｆ’７マイシｙ丑′　および［ＡＫ−ＭＢＰ　１−１４　Ａ”　ｌ−１２５アトテアマイシン　人　の　′の安定性・−ベル　るー・−〇゛　＋１ポルトン−ハンター（Ｂｏｌ　ｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）の試薬（５００ｍＣ１、アマジャム社、イリノイ州６０００５、アーリングトン　ハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ）、２６３６サウスクリアーブルノク　ドライブ（Ｓｏｕｔｈ　Ｃ１ｅａｒｂｒｏｏｋ　Ｄｒｉｖｅ））を過剰のヒドラジンと一晩インキュベーションしてそのヒドラジドへ変換した。過剰のヒドラジンは、反応混合液をアルゴンガスで室温で乾燥させることにより除去した。この乾燥させた残基へ３０％塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ塩酸１ｄを加えて、産物をｌＬｄの酢酸エチルで抽出した。抽出物を次に２０％塩化ナトリウムを含むｌＯ％重炭酸ナトリウム１〆で処理した。有機層を分離して最終濃度が０．０１％になるようにＴＦＡを加えた。この？８液を使用するまで４°Ｃで保存した。ペプチド−アト１アマイシン丑′　の　・−ベル室温でアルゴンを用いて薫発させることにより酢酸エチルを（１−１２５）ヒドラジド試薬から除去した。ペプチド−アドリアマイシン共役体を酢酸に溶解し、この溶液を無水の放射ラベルの試薬へ加えて、６時間インキュベートした。次に共役体を酢酸エチルで沈殿させることにより過剰の試薬を除去した。沈殿させて乾燥させたラベルしたペプチド −（１−１２５）アドリアマイシン共役体を酢酸に再び溶解し、酢酸エチルで再び沈殿させた。沈殿をヘプタンで洗浄して乾燥させた。ラベルしたペプチド−アドリアマイシンを乾燥させたまま４“Ｃで保存した。ＴＡ”　−ＭＢＰ　１−１４　Ａ４−　ｒ−１２５７Ｆ’７マイシン　へ９調製３７°Ｃで４８時間ＰＢＳ中でＩＡ”を過剰のＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン共役体とまたはＩＡ”をＭＢＰ　（１−１４）Ａ ’　Ａ’Ａ６　（Ｔ−１２５）アドリアマイシンと混合することにより複合体を形成した。ＰＢＳに対する徹底的な透析により過剰のペプチド−（１−１２５）アドリアマイシン共役体を複合体から除去した。息遣■安定性Ω研究血液をＡＪマウスから得て、室温で凝血させた。血清を遠心によって分離した。ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン共役体またはＩＡ’［ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン〕複合体を血清と混合して、加温したインキュベーター中で５％二酸化炭素とともに３７ °Ｃでインキュベートした。ペプチド−（ｒ−１２５）アドリアマイシン共役体の％切断を得るためにサンプルの一部をシリカゲルＴＬＣで分析した。切断は緩衝液およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液中でも分析した。図１８は、ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシンペプチド−毒素共役体はジスルフィド結合の所で緩衝液中ではわずかに切断されるだけであることを示す、このペプチド−毒素共役体がＭＨＣＩｒと複合体を形成して、ＩＡ”　−（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）７１’す７？イシン〕複合体を形成しているときにはジスルフィド結合は緩衝液中で切断されない。図１９は、緩衝液中に還元剤、ジチオスレイトールが含まれているときにはＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシンペプチド−毒素共役体は迅速にとてもよく切断されることを示す、しかしペプチド−毒素が複合体、ｔなｈちＩＡ”−（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）７Ｆ’Ｊ７マイシン）複合体に取り込まれたときにはジスルフィド結合は還元をはるかに受けづらい。図２０は、ペプチド−毒素共役体は血清の存在下でジスルフィド結合の所で切断されるが、ＭＨＣＩＩ−（ペプチド毒素〕複合体中のペプチドおよび毒素の部分の間のジスルフィド結合は血清中で還元に対してまったく安定であることを示す。血清は低濃度の、還元剤として作用できるシスティンおよびグルタチオンを含んＭＨＣクラス■−ペプチド−、人　のペプチド−−の。　の　・な爪ユ込立夫よグ切斯この例は、関連したＭＨＣクラス■−ペプチド−アドリアマイシン複合体のＴ細胞への結合およびペプチド−毒素の部分の取り込みに続いて、ペプチドおよびアドリアマイシンの間のジスルフィドの結合部が細胞内で切断されることを示す。Ｔ細胞：　ＩＡ’　−ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’に特異的なＴ細胞クローン４Ｒ３，９゜複合体１、ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン、関連した（ＭＢＰ）ペプチド−毒素の共役体２、ＭＢＰ　（１−１４）Ａ”Ａ’　−Ａ”　−（ｒ−１２５）アドリアマイシン、無関係の（メントリアルブミン）ペプチド−毒素の共役体３、ＩＡ蒐−［ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン〕複合体、Ｔ細胞クローンが認識する関連したＭＨＣクラスＩＩ−（ペプチド−毒素〕複合体４．１Ａ”　−ＣＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　Ａ’　−Ａ’　−（Ｉ−１２５）アドリアマイシン〕、Ｔ細胞クローンが認識しない無関係のＭＨＣクラスＵ−Ｃペプチド−毒素〕複合体５．１Ａ”　−ＣＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン〕複合体＋−千万個の細胞複合体（１９，０００ＣＰ　Ｍ　）を細胞とともにまたは細胞なしで０．５　ａｔ！のＲＰＭＩＩ６４０中で５時間３７℃で加湿したインキュベーター中で５％二酸化炭素とともにインキュベートした１次に複合体とインキュベートとした細胞を１０１ｄのＰＢＳで３回洗浄した。溶液または（３００ｐ／中の）細胞へ１０ｐｌのＴＣＡを含む８００ｐ７のアセトニトリルを加えた０次にサンプルをよく混合し、微小遠心機で高速度で遠心した。上清をとっておき、ベレットを０．１％ＴＣＡを含む８０％水性アセトニトリル１紙で再び抽出した。次に上清を真空遠心機で濃縮した。残渣を５１１／の水性アセトニトリルに熔解し、放射活性を測定した。次にサンプルをシリカゲルＴＬＣシートにスポットして、ブタノール、酢酸：水−１００：１０：３０の上層で展開した。図２１は放射ラベルしたアドリアマイシンおよびアドリアマイシンの形成に関係したデータを反映している。図２１に言及するとバー１および２は、関連したＩＡに−（ＭＢＰ（１１４）Ａ ’　−（１−１２５）アドリアマイシン共役体の４Ｒ３，９Ｔ細胞クローンとのインキュベーション後に得られる細胞抽出物のＴＬＣから計算した：１、遊離の（１−１２５）アドリアマイシン誘導体（誘導体の切断後の構造を本明細書の１４ページに示す）２、（切断されてない）ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシン共役体対照のバー３および４は、無関係の複合体。＋Ａ’−（ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　Ａ’　Ａ＾−（１−１２５）アトリアマイノン〕の４Ｒ３，９Ｔ細胞クローンとのインキユベーシヨンの後に得られる細胞抽出物のＴＬＣから計算した：３、（＞１２５）アトリアマイノン誘導体（この誘導体の切断後の構造を本明細書の１４ページに示す）。４、（切断されてない）ＭＢＰ　（１−１４）Ａ３Ａ’−Ａ６−（＋−１２５）アドリアマイシン共役体図２１は、Ｔ細胞クローンのみが同起源のＭＨＣｎ−（ペプチド−毒素〕複合体の関連したペプチド−毒素の共役体の部分を取り込むことを示す。さらには取り込まれたペプチド−毒素の共役体、ＭＢＰ　（１−１４）Ａ’　−（１−１２５）アドリアマイシンはジスルフィド結合の所で完全に切断されて、細胞内で遊離のアドリアマイシンの誘導体（１４ページを見よ）を産する。ＩＡ”−ペプチドの複合体の取り込みを研究するために、ＭＨＣＩ［およびペプチドの部分を別々にｌＸ５Ｉでラベルして、ラベルした部分の１つまたはもう１つを用いてそれぞれ、２つの複合体を調製し、遊離のペプチドを除去するためにＲＰＭＩに対して徹底的に透析した。次に、抗原で刺激後１０日のＴ細胞をラベルした複合体で５時間インキュベートし、その後細胞を培養培地で徹底的に洗浄した。結合した放射活性をシンチグラフィーで測定した。次に細胞表面に結合した複合体を除去するために細胞をｐＨ３の緩衝液を用いて４°Ｃで（細胞の生存力を失なわせずに）洗浄し、細胞をシンチグラフィーで再び検査した。もし複合体が結合しているが、内部ではない所で結合しているならば、Ｔ細胞光たりの結合した複合体の数は細胞表面のＴ細胞のレセプターの数取下であると期待した（細胞光たり２０．０００および４０，０００の間であると他の人は見積もっている）。結果は、複合体の同起源のペプチドの部分がＩＡ”の部分よりも好んで取り込まれることを指摘している。ＩＡ’と複合体を形成する対照の物の起源のペプチドははるかに取り込まれづらいので、取り込みは同起源のペプチドに特異的である。実験を数回繰り返して、同し結果を得た。さらに、ＩＡ”の部分を３５３で放射ラベルし、ペプチドの部分を１１Ｓ７で放射ラベルした二重標識したＭＨＣＩＩ−ペプチドの複合体を用いた実験を行なった０図１５に示すこの実験の結果は前の実験、すなわち同起源のＭＨＣＩＩ−ペプチドの複合体のペプチドの部分は取り込まれるが、ＭＨＣｎの部分は取り込まれないということを明確に確認する。図１２はこの現象の概略図である。細胞の生存力を損わない濃度でアジ化物が阻害することが示すように取り込みの過程はエネルギーに依存するようである。取り込み実験の結果は、アドリアマイシンおよびマイコフェノール酸のような小さな代謝拮抗物質である毒素は、次にＭＨＣＩＩ分子と複合体を形成するペプチドに結合したことを示唆した。得られた複合体を、自己免疫に含まれる自己反応性のＴ細胞の細胞質へ毒素を特異的に輸送するために用いた。倒−−ＸＡＪｌ、２Ｔ　のＴＡ”ＭＢＰ　１−１４　Ａ４７ド■アマイシン　八　によゑ段憲１００４の親和性を利用して精製したＩＡ’（またはＩＡ’）を１６７屑のそれぞれのアドリアマイリンーペプチド（モル濃度で５０倍過剰）とともに１ｄ中で３７°Ｃで４８時間インキュベートした。過剰の結合しなかったペプチドをＲＰＭｌ培地に対する徹底的な透析により除去した０次に透析したサンプルを１×１０６個のＡＪｌ、２Ｔ細胞と（全体積１ｍ）混合し、３７’ｃ／Ｃｏ、で２４時間インキュベートした。結合しなかった複合体を細胞の洗浄により除去した。処理した細胞を９６個のウェルのあるマイクロタイタープレート中に、２００ｐ／中に１０’個の細胞／ウェルの細胞の密度でそして最終濃度５ユニツト／ｌ１ｌｉ！のｒｌＬ２の存在下で培養した。増殖を７２時間後にＭＴＴ比色定量分析により測定した。図７はＩＡ”　−ＭＢＰ−Ａｄ複合体のみがＡＪｌ、２Ｔ細胞を効率的に殺害したことを示す。バー３の実験で用いた０ＶＡ（メントリ）アルブミン（ペプチド）をＡＪｌ、２Ｔ細胞は認識しなかった。 ±−−Ｘ± ４Ｒ３，９Ｔ　のＩＡＫ−ＭＢＰ　１−１４　Ａ４７ドｉアマイシン　人　によゑ殺１１００４の親和性を利用して精製したＩＡＫ　（またはＩＡ’）を１６７ｇのそれぞれのアドリアマイシン−ペプチド（モル濃度で５０倍過剰）とともにＬｄ中で３７°Ｃで４８時間インキュベートした。過剰の結合しなかったペプチドをＲＰＭｌ培地に対する徹底的な透析により除去した０次に透析したサンプルを１× １０’個の４　Ｒ３，９Ｔ細胞と（全体積１ｄ）混合し、３７℃／Ｃｏ□で２４時間インキュベートした。結合しなかった複合体を細胞の洗浄により除去した。処理した細胞を９６個のウェルのあるマイクロタイタープレート中に、２００ｐｌ中に１０’個の細胞／ウェルの細胞密度でそして最終濃度５ユニ・アト／ｄのｒｌＬ２の存在下で培養した。増殖を７２時間後にＭＴＴ比色定量分析により測定した。図８は、ＩＡ’　−ＭＢＰ　（１−１４）Ａ４アドリアマイシン複合体のみが４Ｒ３，９Ｔ細胞を効率的に殺害したことを説明する図である。例−ｘｎこの例は、細胞内で切断できる結合を介したＭＢＰ　（１−１４）Ａ４に共役したアドリアマイシンを用いての、ＭＢＰに特異的なＡＪｌ、２および４　Ｒ３，９Ｔ細胞の試験管内での削除を証明する。ＩＡＫをモル濃度で５０倍過剰のＭＢＰ（１−１４）Ａ４−アドリアマイシンとともに２４時間３７℃でインキュベートした。無関係の対照標準として、ＯＶＡ　（３２４−３３５）−アドリアマイシンを同様にＩＡ’と複合体を形成させた。結合していないペプチド−アドリアマイシン共役体をＲＰＭＩ培地に対する徹底的な透析によって除去した。ＡＪｌ、２または４Ｒ３，９細胞をＩＡ’またはＩＡ”−（ペプチド−アドリアマイシン）複合体とともに１６時間３７°Ｃでインキュベートした。結合していない複合体を除去するために細胞を洗浄して、上に記述したようにＩＬ−２を含む培養培地中で培養した。７２時間後に、細胞の増殖を上に記述したようにＭＴＴ比色定量分析によって測定した。複合体中で用いたペプチド−アドリアマイシン共役体は、ペプチドおよびアドリアマイシンの部分の間の細胞内で切断できるジスルフィド結合を用いて調製した。細胞内で切断できる化合物の調製を、１９９０年５月１４日に出願された共有されている係属中の特許出願第０７１５２３．３３４中で一般的に教示されているようにして行なった。本発明の共役体の調製は次のようであった：ドキソルビシン塩酸塩（アルドリッチ　ケミカル社、ウィスコンシン州、ミルウォーキー、２０ｍｇ、３４．３μ＋ｗｏｌ）を１００ｐＺのコリジン（アルドリッチ　ケミカル社、７５７μｍｏｆ）を含むＬｄの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シグマケミカル社、ミズーリ州、セントルイス）に溶解した。２−イミノチオレイン（ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ閤−１ｃａｌ　Ｃｏ、）　、イリノイ州、ロックフォード、１０■、７２　μｍｏｌ）および２．２−ジチオジピリジン（アルドリッチ　ケミカル社、７５■、３４０μ■ｏｌ）を１ｄの無水ジメチルスルホキシドに溶解した。後の溶液を一滴づつボルテックスミキサ反応液を、リニアグラジェント溶出（溶媒Ａ：０．１％水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；溶媒Ｂエフ０％水性アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）を用いたプレパラティブＣＩ８カラムの逆層ＨＰＬＣによって直接精製した。過剰のβ−メルカプトエタノールを用いた精製した産物の切断により、ＨＰＬＣ分析中で期待した産物が得られた。精製した産物の質量分析によって期待した構造を確認した。ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥したアドリアマイシン−混合ジスルフィド誘導体（２，３■）を１５ｄのポリプロピレン製遠心管中で０．５ｍの脱気した水に溶解した０次の構造をもつＨＰＬＣ的に純粋な合成メルカプトペプチド（１■）：ＨＣＩ（、Ｃ０ＮＩＩ−＾１ａ−５ｅｒ−Ｇ　ｉｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｈ１ｓ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−bｙｓ−ＯＨを０．５−の脱気した水に溶解し、ポルテックスで撹拌しながらアトリアマイノン−混合ジスルフィドの溶液へ加えた。室温、暗所で６時間後に、ジスルフィドで結合したペプチド−アドリアマイシン誘導体を上で記述したようにプレパラティブＣＩ８カラムのグラジェント溶出の逆層ＨＰＬＣにより精製した。過剰のジチオスレイトールを用いたジスルフィド結合の還元的な切断により、逆層ＨＰＬＣの分析中で期待したメルカプトペプチドおよび４−メルカプトブチリミドドキソルビシン誘導体が得られた。ペプチド−アドリアマイシンの誘導体の期待した構造を質量分析で確認した。おそらく毒性のアトリアマイノンの部分の放出を伴うジスルフィド結合の細胞内での還元的な切断によって、ＨＰＬＣで精製したジスルフィドで結合したペプチド−アドリアマイシンの誘導体はその誘導体を取り込んだ細胞に毒性を示した。ＩＡＫ−（ペプチド−アドリアマイシン）複合体を用いた試験管内でのＴ細胞の削除の結果を図２２Ａおよび２２Ｂに示す、（ペプチド−アドリアマイシンとともにＩＡ’の使用量の約２０％と仮定して）約１■のアトリアマイノンを含む約１２０ｆｆ１ｇの正味のＩＡゞ−（ペプチド−アドリアマイシン）複合体と等価のヒトにおける投与量でクローンＡＪ１．２の約８５％の細胞の削除（Ｎα４、図２２Ａ）および４　Ｒ３，９クローンの約５０％の削除（ＮＣＬ４、図２２Ｂ）をもたらした。アドリアマイシンを癌の患者に１日当たり１５■までの投与量で経口投与する。処方ガスぴ且与本発明の共役体および複合体をそれ単独でまたはリポソームまたはミセルの型で投与すると都合がよい、そのような構成物の調製法は一般的に伝統的なリポソームの調製法に従う、伝統的な方法で形成される単層状のおよび多層状のリポソームが本発明において有用である。中性のまたは負に帯電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールを一般的に含む脂質を形成する小胞が適切である。ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）から成る小胞が好ましく、既知の方法で調製されてもよい。例えばとみた、　Ｔ、（Ｔｏ＋ｗｉｔａ、Ｔ、）ら（１９９０）　、紅匹匡Ｌ」故ト石ｌ−にぷ−　ｌ１且：１８５ｉ９０を見よ。脂質を形成する小胞を適当て有機溶媒または溶媒系において取り込ませて、真空中または不活性ガス中で乾燥させて脂質の１膜を形成させるのが１つの好ましい方法である。誘導体が薄膜を形成する脂質の中に含まれる。脂質の溶液中の誘導体の濃度は、リポソーム中の薬物の最終的な最大濃度がモル濃度で過剰になるようにすることが好ましい。乾燥させた脂質／薬物の薄膜を生理学的に両立しうる媒体、好ましくは生理的塩類溶液で水和する。脂質を水和して、大きさが典型的には約０．５ミクロンから小さくても約１０ミクロンまで及ぶ多層の小胞（ＭＬＶｓ）の懸濁液を調製する。一般的に、上の手順で調製したＭＬＶｓの大きさの分布を、振盪しながらもっと迅速に脂質の薄膜を水和させることによって大きさをより小さい方へずらすことができる。小胞の大きさの分布が、約１ミクロンより小さいそして好ましくは約０．０５から０．５ミクロンの間、そしてもっとも好ましくは約０．０　Ｏ５および０．２ミクロンの間の範囲になるものを選択するために、リポソームのＭ濁液を一定の大きさにしてもよい、大きさを一定にすることによってより大きなリポソームを除去し、最適な薬物動力学的な性質をもつ一定の大きさの範囲のものを生産することができる。多くの既知の方法がリポソームの大きさおよび大きさの不均一性を小さくするために利用できる。リポソームの懸濁液を水浴型または投げ込み型超音波装置のいずれかによって超音波処理することで、約０．０５ミクロンの大きさよりも小さい小さな単層の小胞（ＳＵＶｓ）にまで連続的に大きさを小さくすること゛ができる。既知の超音波処理の手順を、リポソームの大きさを約０．２ミクロン以下にまで小さくするのに好んで用いる。ホモジェナイズすることは、大きなリポソームをより小さなものへ断片化する剪断のエネルギーに顧る別の方法である。典型的なホモジェナイズの手順では、選択した典型的には約０．１および０．５ミクロンの間の大きさのリポソームを観察するまでＭＬＶｓを標準的な懸濁液のホモジェナーザーの中を繰り返し循環させる。両方の方法において粒子の大きさの分布を伝統的なレーザービームの粒子の大きさの識別力によってモニターすることができる。リポソームを細孔のあるポリカーボネートの膜を通過させることは、膜の孔の大きさに依存するが、平均が約０．１および１ミクロンの間の範囲になる比較的よく大きさのそろった分布にまでリポソームの大きさを小さくする効果的な方法である。典型的には、好ましいリポソームの大きさの分布に達するまで懸濁液を数回繰り返し膜に通す。リポソームを連続的により小さくなる孔の膜へ通し、リポソームの大きさを徐々に小さくしてもよい。遠心分離およびゲル濾過法は１ミクロンよりも小さい選択したしきい値以下の大きさ粒子があるリポソームの懸濁液を生産するために移用できる他の方法である：これらの２つの方法はともに大きな粒子の小さな物への変換よりもむしろより大きなリポソームの優先的な除去を含む。リポソームの収量は対応して減少する。投与は全身性で、注射、好ましくは静脈注射で投与するので、投与の注射の径路と両立できる処方を使用してもよい。適切な処方はレミントンの′Ｒｅｌｌ−１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　、マンク出版社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａ| ｎい、ペンシルバニア州、フィラデルフィア、１７版（１９８５年）中に見られ、その内容はこの言及により本明細書中に含まれるものとする０本発明の共役体または複合体および薬剤学的に有効な担体から成る様々な薬剤学的な構成物を調整することができる。薬剤学的な構成物は様々な薬物の輸送系に適している。薬剤の輸送の本発明の簡単な概観には、この言及によりその内容が本明細書中に含まれるものとするランガー（Ｌａｎｇｅｒ）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　１５２７−１５３３（１９’　９０　）を見よ、実験動物のハツカネズミに対して１０−５００ｇの投与量の水準で有効である：したがって約０．５■／ｋｇから２５■／ｋｇを示唆する。本発明の共役体または複合体から成る薬剤学的な組成物について、投与量は例えば特定の複合体、投与の方法、治療するべき疾病およびその程度、患者の総体的な健康および状況および指示する医師の判断に依存して変わるだろう、薬剤学的な組成物を非経口、一過性の、経口または噴霧器または皮膚を通過させる局所投与して予防および／または化学療法のために使用する。薬剤学的な組成物を、投与の方法に依存して、様りな単位剤形で投与できる。例えば経口投与に適した単位剤形は散剤、錠剤、丸薬およびカプセルである。薬剤学的な組成物を静脈注射によって投与することが好ましい、したがって本発明は、条件に合った担体、好ましくは水性の担体に溶解したまたは懸濁した複合体の溶液から成る静脈注射の投与のための組成物を提供する。様々な水性の担体、例えば水、緩衝剤を含む水、０．４％塩水、および同様な物を用いてもよい。これらの組成物を伝統的なよく知られた滅菌のための技術で滅菌してもよくまたは無菌的に濾過して除菌してもよい。得られる水性の溶液を利用できる形状で包装する、または凍結乾燥し、凍結乾燥した調製物を無菌の水性の溶液を投与前に組み合わせてもよい。組成物はｐＨの調製および緩衝剤、強壮調製剤、湿潤剤および同様な物のような適性な生理学的な条件に要求される薬剤学的に条件の合った補助剤、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールオレアート、などを含んでもよい。共役体または複合体の濃度を大きく変えることができる、すなわち重量比で０．０５％以下から、通常用いる約１％または１％以上そして１０から３０％までであり、選択した投与の特定の方法に従って主に液体の体積、粘性などによって選択するだろう。上に記述したように、複合体をリポソームの調製物を介して輸送してもよい。固体の組成物に対しては、例えば調剤用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サンカリンナトリウム、タルり、セＩレロース、グルコース、蔗糖、炭酸マグネシウム、および同様の物を含む伝統的な無毒の固体の担体を用いてもよい。経口投与に対しては、薬剤学的に条件の合う無毒の組成物を、上に列挙したこれらの担体のような標準的に使用する任意の補助剤および一般的には１０−９５％の活性性分を導入することによって形成する。噴霧器による投与に対しては、共役体または複合体を界面活性剤および高圧ガスとともに精密に分割した型で提供するのが好ましい、もちろん界面活性剤は無毒でなければならず、高圧ガスに溶けるのが好ましい。そのような薬則の代表は、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リルン酸、オレステリン酸およびオレイン酸のような６から２２個の炭素原子を含む脂肪酸の、例えばエチレングリコール、グリセロール、エリトリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトールから誘導されるヘキシトール無水物、およびこれらのエステルのポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体のような脂肪族の多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合または天然のグリセリドのような混合エステルを用いてもよい。界面活性剤は重量比で構成物の０．１％−２０％、好ましくは０．２５−５％を占めてもよい。構成物の残りは通常高圧ガスである。液化させた高圧ガスは環境の条件では典型的には気体であり、圧力をかけて圧縮する。適当な液化させた高圧ガスの中には、ブタンおよびプロパンのような５個までの炭素を含む低級アルカン；および好ましくはフッ素化したまたはフン素化合物および塩素化したアルカンがある。上の物の混合物も用いてもよい。噴霧器を生産するにあたり、適当な弁を取り付けた容器を精密に分割した化合物および界面活性剤を含む適当な高圧ガスで満たす。したがって成分は、弁の活動によって放出されるまで高圧に保たれる。共役体または複合体を含む構成物を予防および／または治療のために投与することができる。治療のための使用においては、構成物を既に疾病にかかっている患者へ上に記述したように、疾病の症状および合併症を治療するまたは少なくとも部分的に抑えるのに十分な量を投与する。これを果たすのに適当な量を７治療上効果的な用量」と定義する。この使用に効果的な量は疾病の程度および患者の体重および一般的な状態に依存するだろう。予防のための使用においては、本発明の共役体または複合体を含む組成物を特定の疾病にかかりやすいまたはさもなくばその危険にある愚者へ投与する。そのうよな量を「予防上効果的な用量」であると定義すイ１゜この使用において正確な量は健康および体重という愚者の状態に再び依存する。経口投与の方法に対しては、本発明の共役体および複合体を錠剤、カプセル、飴、トローチ剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液および水性の懸濁液、および同様な物の型で用いてもよい。錠剤の場合には、用いることのできる担体はラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩を含む、デンプンのような様々な崩壊剤、およびステアリン酸マグネシウム、ラウリン酸ナトリウムｇ酸塩およびタルクのような潤滑剤を錠剤中で一般に用いる。カプセルの型の経口投与に対しては、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子のポリエチレングリコールである。経口投与の使用で水性の懸濁を要求するときには、一定の甘味料および／または芳香剤を加えることができる。この発明の共役体を診断のための分析においても使用してもよい；この場合には使用する構成物の量は、リポソームに結合した誘導体のサンプル中の標的成分に対する感度に依存するだろう。ＦＩＧ、　３Ａ　とＭ旺壬旦込μ４Ａｃｅｔｙｌ−ＮＨ−ＡＬＡ−９ＥＲ−ＧＬＮ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＨＩＳ−ＧＬＹ−９ＥＲ−ＬＹＳ−ＴＹＲ−ＮＨ２ＦＩＧ、３Ｂ　Ａｃ樹Ｐ±且迫μ匁正１４Ａｃｅｔｙｌ−ＮＨ−ＡＬＡ−５ＥＲ−ＧＬＮ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−８ＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＨＩＳ−ＧＬＹ−５ＥＲ−ＬＹＳ−ＣＹＳ−ＮＨ２Ａｃｅｔｙｌ−ＮＨ−ＡＬＡ−９ＥＲ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−９ＥＲ−ＧＬＮ−ＦＩＧ、　３Ｄ　ＯＶＡ　４−３３　ＣＹＳ３３６Ｈ２Ｎ−９ＥＲ−ＧＬＭ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＨＩｓ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＨＩＳ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＡＳＮ−ＣＹＳ−ＮＨ２浄書（白書に＝更なし）ＦＩＧ、４ＦＩＧ、５浄ｉ１

【内容に変更なし】

〔アトリア７ノノ不存在またはＭＢＰ−アトリア７ノノ］ｏＭＦＩＧ、６浄書（内Ｇにユ丈なし）［マイフフエノリック−ＭＢＰ３　ｐＭ浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、１０浄書（内容に変更なし）実験番号実験番号　複合体取込み（Ｔ細胞当たり分子）ｊｌ−１２５１Ａｋｌ−ＭＢｆ’ ［１−１４１Ａ４　１Ａｋ−［１−１２５？ｖＬＢＰｉｌ−１４１Ａ４１　２４．０００　４１０，０００２　’　、２Ｂ、０００　５００，０００３　２７．０００　５４０．０００ＦＩＧ、ｌ＋浄書（内容に変更なし）アトリアマイ７ノ　０．５μＭ　５μＭ　Ｏ，３μＭマイコフエル−ト　ＮＤ　５０μＭ　Ｏ１３μＭＦＩＣｙ、１２浄書（内容に変更なし）実験計画アドリアマイシンを開裂可能なジスルフィド結合によってペプチドに付加した。 ↓ ＩＡｋｔ、３７°Ｃで２４時間５０倍モル過剰のアドリアマイリンーペプチドとインキュベートした。 ↓ イクステンシブ透析によって未結合ペプチド−アドリアマイシンを除去した。 ↓ 細胞クローを３７℃／Ｃｏ、出１６時間ＩＡｋ（アドリアマイシン−ペプチド）複合体とインキュベートした。 ↓ 細胞を洗って未結合複合体を除去した。 ↓ ＦＩ（，１３浄！’（内容、こ変更ないイノ干ユヘーＸ／、〕Ｑ　間（時１’、Ｉ＋　）ＦＩＧ、１５　ｉ　Ｔリッパ層ＢＷ５１４７　（ＴＣＲなし）２　Ｔ＠胞クり−ノ４Ｒ３９浄硼（内容に変更なしンＦＩＧ、１６浄書（内容に又更なし）１７７１ｆｆ）Ｊ７Ｑ！：＋：ｊＭ、Ｍｆ、にｌ。：）　、　丑、−：　’、、Ｆｆ、）　：　：、’、　７．；４　Ｗ；：：：：ｊＣＦｌｌｌＭＢＰ　（＋、 −１４）−（＋−１，２５）アトリアマイツノ共役体■　１＾　−［ＭＢＰ　（１，−１４）−（１−１，２５）アドリアマイノンコ複合体ＦＩＧ、　１９浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　２０浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）要　約　書治療上または診断上有効な残基の細胞内取り込み可能で細胞内切断可能な共役体および複合体が記載されている。そのような残基の放出のための新規なシステムが提供される。手続補正ｌＦ坊幻１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３３５２平成　３年特許願第５１０４２７号２、発明の名称細胞内で切断てきる残基を含み、細胞が取り込める共役体および複合体３、補正をする者事件との関係　特許出願人名　称　アナ−ジエン・インコーホレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　平成　４年１０月２０日　溌送日）６、補正の対象（１）８願大の代表音名を記載した国内書面（２）委任状及び翻訳文（３）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｅが薬効部の部分、Ｚが細胞内で切断できる結合そしてＱが有機的な部分である式Ｅ−Ｚ−Ｑで示される、細胞が取り込めて細胞内で切断できる共役体。
２．薬効部Ｅがレセプターの作用薬、レセプターの拮抗薬、成長因子、抗腫瘍剤、オリゴヌクレオチド分子、抗体、抗真菌剤、または酵素またはタンパク質の機能の阻害剤である、請求項１で定義された共役体。
３．前記の薬効部Ｅが化学療法剤である、請求項１で定義された共役体。
４．Ｑがオリゴヌクレオチド分子である、請求項１で定義された共役体。
５．Ｑがアンチセンス分子またはリボザイムである、請求項１で定義されるような共役体。
６．Ｑが別の有機的な部分の結合部位によって認識される成分であり、そして共役体中に存在するＱ成分が前記の他の有機的な部分の前記の結合部位と結合できる、請求項２で定義された共役体。
７．前記のＱ成分かペプチドであり前記の他の有機的な部分がＭＨＣ分子である、請求項１で定義された共役体。
８．ＱがＭＨＣ分子、ＩＬ−２分子、ＩＬ−４分子およびｌＬ−６分子またはＴＧＦの分子の非共有結合性のまたは共有結合性の結合部位によって認識される部分である、請求項１で定義された共役体。
９．ＱがＭＨＣ分子の結合部位によって認識されるペプチドである、請求項１で定義された共役体。
１０．Ｑが合成ペプチドである、請求項９で定義された共役体。
１１．Ｑが有機的な部分から由来する成分であり、そして前記の共役体中に存在する前記のＱ成分がそのままでまたは修飾後にそれが由来した部分の残基と組み換えることのできる、請求項１で定義された共役体。
１２．前記の他の有機的な部分がＭＨＣ分子である、請求項１１で定義された共役体。
１３．ＱがＭＨＣ分子のペプチドの成分である、請求項１１で定義された共役体。
１４．ＱがＭＨＣ分子の化学的に修飾されたペプチドの成分である、請求項１１で定義された共役体。
１５．Ｅ−Ｚ−Ｑが請求項１で定義された共役体であり、そしてＡが有機的な部分である、式（Ｅ−Ｚ−Ｑ）Ａで示される複合体。
１６．Ａが前記のＥ−Ｚ−Ｑ共役体の標的細胞への輸送および前記の共役体の標的細胞による取り込みを促進する有機的な部分である、請求項１５で定義された複合体。
１７．Ａか細胞のレセプターの表面へ結合した後に取り込まれる配位子である、請求項１６で定義された複合体。
１８．Ａが成長因子、サイトカイニン、低密度リボタンパク質またはα−２−マクログロブリンである、請求項１５で定義された複合体。
１９．前記の成長因子が上皮成長因子、トランスフェリンまたはトランスコバラミンであり、そして前記のサイトカイニンがＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６またはＴＧＦαである請求項１８で定義された複合体。
２０．前記のＥ−Ｚ−Ｑ共役体のＱ成分が前記の複合体の部分の成分である、またはあってもよくて、前記の共役体中に存在する前記のＱ成分が、それがその成分であるまたは成分でおってもよい前記のＡ部分の部分と組み換えることができる、請求項１５で定義された複合体。
２１．前記のＱの成分がペプチドであり、そして前記Ａ成分が前記Ｑ成分に対する結合部位を含むＭＨＣ分子である、請求項２０で定義された複合体。
２２．薬効部の成分Ｅが化学療法剤であり、そしてＡの成分が標的細胞の表面のレセプターに対する配位子を含むＭＨＣ部分である、請求項１５で定義された複合体。
２３．標的細胞の試験管内での殺害のための方法であって；前記の標的細胞に対して細胞毒性を有する薬効部Ｅを選択すること；Ｅが前記の薬効部であり、Ｚは細胞内で切断できる結合部であり、ＱがＭＨＣ分子の結合部位によって認識されるペプチドであり、そしてそれが前記のペプチドの成分として前記のＭＨＣ分子と結合できる、式（Ｅ−Ｚ−Ｑ）で示される共役体を形成すること；Ｅ−Ｚ−Ｑが上記共役体であり、ＡはＱに対する結合部位をもつＭＨＣ分子である、式（Ｅ−Ｚ−Ｑ）Ａで示される前記の複合体を形成すること；および前記の薬効部による治療が必要なときに前記の複合体を投与すること；からなり、前記複合体は上記共役体を前記の標的細胞へ効果的に輸送し；該共役体は輸送後に前記の標的細胞によって取り込まれ；該共役体は取り込みの後で前記の標的細胞によって細胞内で切断されて前記の標的細胞に毒性を有する薬効部Ｅを放出する方法。