JPH05502166A - Immunotherapeutic compositions for the treatment and prevention of AIDS, ARC and HIV infections - Google Patents

Immunotherapeutic compositions for the treatment and prevention of AIDS, ARC and HIV infections

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JPH05502166A
JPH05502166A JP3509989A JP50998991A JPH05502166A JP H05502166 A JPH05502166 A JP H05502166A JP 3509989 A JP3509989 A JP 3509989A JP 50998991 A JP50998991 A JP 50998991A JP H05502166 A JPH05502166 A JP H05502166A
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protein
cells
dna
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JP3509989A
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フィッシャー，リチャード　エイ．
ヘッション，キャサリン
バークリー，リンダ　シー．
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バイオジェン，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

１３、前記宿主が、Ｅ、　ｃｏｌｔＳＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、　ｈ区」！、江 ｇの株、酵母、真菌類、動物細胞、植物細胞、昆虫ＪｌｌｌＩ胞および組織培養 のヒトの細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の単細胞宿主。 ｉａ、請求項１から１０に記載のＤＮＡ配列のいずれかにコードされるポリペプ チド。 １５、請求項１４に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、図４（ カニクイザル）の式ＡＡＩ−ＡＡ４３３のポリペプチド、図４（カニクイザル） の式ＡＡＩ−ＡＡ３７Ｓのポリペプチド、図１５（アカゲザル）の式Ａ＋ｈ〜Ａ Ａ３７５のポリペプチド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡＩ−ＡＡ３７４　（ ＋）ＳＱ２００）のポリペプチド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡＩ−ＡＡ３ ７５　（ｐｓＱ２０５）　（Ｄボッペプチド、図４（カニクイザル）の式ＡＡ＋ −ＡＡ＋ｓｅのポリペプチド、図１５（７カゲザル）の式ＡＡ＋−ＡＡｔａａの ポリペプチド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡ＋−ＡＡ＋ａｓ　（ｐｓＱ２０ ０）のボゾベブｆｌ’、［２３（チンパンジー）の式Ａ＋Ｊ−ＡＡ＋ｓａのポリ ペプチド、および前述のポリペプチドのいずれかの部分、からなる群から選択さ れる、ポリペプチド。 １６、旧Ｖ　ｇｐ１２０に結合する抗体をヒトにおいて誘起する、ヒｌ−ＣＤ４ のアミノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片。 １７、可溶性ヒトＣＤ４の変異体である、請求項１６に記載のアミノ酸変異体。 １８、マウスＣＤ４タンパク質、うｙトｃＤ４タンパク質、ウサギＣＤ４タンパ ク質およびヒツジＣＤ４タンパク質を除く、請求項１９、霊長類ＣＤ４をさらに 除く、請求項１８に記載のアミノ酸変異体。 ２０、霊長類ＣＤ４とヒトＣＤ４とのアミノ酸相違部位に相当する１つ以上の部 位で、ヒトＣＤ４のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドで ある、請求項１６に記載のアミノ酸変異体。 ２１、前記ヒトＣＤ４とのアミノ酸相違部位の１つ以上が、図５．１７．２３お よび２４に示す部位からなる群から選択される、請求項２０に記載のアミノ酸変 異体。 ２２、哺乳類ＣＤ４およびその断片からなる群から選択される、請求項１６に記 載のアミノ酸変異体。 ２３、カニクイザルｃＤ４、アヵゲザルｃＤ４、チンパンジーＣＤ４およびそれ らの断片からなる群から選択される、請求項２２に記載のアミノ酸変異体。 ２４、カニクイザル可溶性ＣＤ４タンパク質、アヵゲザル可溶性ＣＤ４タンパク 質およびチンパンジー可溶性ＣＤ４タンパク質カらなる群から選択される、請求 項２３に記載のアミノ酸変異体。 ２５、請求項１４および１５に記載のポリペプチドからなる群から選択されるボ ッペプチドを製造する方法であって、請求項１２に記載の単細胞宿主を培養する 工程を包含する方法。 ２６、ＨＩＶ　ｇｐ１２０に結合する抗体をヒトにおいて引き起こす、ヒトＣＤ ４のアミノ酸変異体あるいは誘導体を選択する方法であって； （ａ）ヒトＣＤ４あるいはその断片を発現する遺伝子導入哺乳類動物を、ヒトＣ Ｄ４のアミノ酸変異体および誘導体、およびそれらの断片からなる群から選択さ れたもので免疫する工程；（ｂ）該免疫した遺伝子導入哺乳類動物の血清抗体が 旧Ｖｇｌ）＋２０に結合する能力を試験する工程；および（ｃ）該免疫した遺伝 子導入哺乳類動物の血清抗体が旧Ｖｇｌ）１２０に結合する場合に、該アミノ酸 変異体あるいは誘導体を選択する工程； を包含する、方法。 ２７、ヒｌ−ＣＤ４に結合する抗体をヒトにおいて引き起こす、ヒトＣＤ４のア ミノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片を選択する方法であって； （ａ）　ヒＩ−ＣＤ４あるいはその断片を発現する遺伝子導入哺乳類動物を、ヒ ）　ＣＤ４のアミノ酸変異体および誘導体、およびそれらの断片からなる群から 選択されたもので免疫する工程；（＋））該免疫した遺伝子導入哺乳類動物の血 清抗体がヒトＣＤ４に結合する能力を試験する工程：および（Ｃ）該免疫した遺 伝子導入哺乳類動物の血清抗体がヒトＣＤ４に結合する場合に、該アミノ酸変異 体あるいは誘導体を選択する工程； を包含する、方法。 ２８、前記遺伝子導入哺乳類動物がヒトＣＤ４を特徴する請求項２６あるいは２ ７に記載の方法。 ２９、前記ヒｌ−ＣＤ４の発現がリンパ球に特異的である、請求項２８に記載の 方法。 ３０、前記遺伝子導入哺乳類動物かマウスである、請求項２６あるいは２７に記 載の方法。 ３１、前記遺伝子導入マウスがヒト可溶性ＣＤ４タンパク質のアミノ酸変異体で 免疫されている、請求項３０に記載の方法。 ３２、免疫治療的に宵効な量の、請求項１６−２４のいずれかに記載の１つ以上 のヒＩ−ＣＤ４のアミノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片を含有す る薬学的組成物。 ３３、薬学的に許容し得るアジユバントをさらに含有する、請求項３２に記載の 薬学的組成物。 ３４、前記アミノ酸変異体あるいは誘導体が多価である、：１求項３２に記載の 薬学的組成物。 ３５、前記アミノ酸変異体が、図１５クアカゲザル）の式ＡＡ＋−ＡＡ３７Ｓの ポリペプチドである、請求項３２あるいは３３に記載の薬学的組成物。 ３６、請求項１６−２４のいずれかに記載のヒトＣＤ４のアミノ酸変異体あるい は誘導体、またはそれらの断片でヒトを免疫することにより産生される、）ＩＩ Ｖ　ｇｐ１２Ｑに結合する抗体。 明細書 ＡＩＤＳ、ＡＲＣおよびＨＩＶ感染の 治療および予防のための免疫治療用組成物発明の技術分野 本発明は、最初の標的がＴ４“リンパ球である感染物質によって引き起こされる ヒトの疾患を、治療あるいは予防するのに有用な免疫治療用、予防用および診断 用の組成物に関する。 そのような疾患には、後天性免疫不全症候群、ＡＩＤＳ関連複合症（ＡＲＣ）お よびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）　＠染が含まれる。より詳しくは、本発 明は、ヒトＣＤ４のアミノ酸の変異体および誘導体あるいはそのフラグメントを コードするＤＮＡ配列に間する。そしてそれはＨＩＶ　ｇｐ１２０に結合するヒ ト抗体を誘起産生させる。そのようなアミノ酸変異体と誘導体は、本発明の免疫 治療用、予防用、および診断用の組成物に用い得る。本発明はまた、ヒトＣＤ４ のアミノ酸変異体および誘導体を選択するための新規なスクリーニング法にも関 する。それはＨＩＶｇｐ　１２０、ヒトＣＤ４あるいはその両方に結合する抗体 をヒトの中で誘起産生させる。このスクリーニングアッセイにより同定されたア ミノ酸９１体および誘導体は、ヒトに対する治療用、予防用、および診断用の物 質として有用である。 及豆二互呈 ヒトにおいて、■リンパ球として知られている免疫調節細胞のクラスは、２つの 大きな機能的（サブ）クラスに分けられる。第一のクラスは、ヘルパーＴ細胞あ るいはインデュサーＴ細胞を含む。これらはＴ細胞の増殖、リンホカインの放出 、および免疫グロブリン放出のためのヘルパー細胞間の相互作用を媒介する。第 二のクラスは、細胞障害性Ｔ細胞あるいはサプレッサーＴ細胞を含む。これらは 、Ｔ細胞による殺細胞および免疫応答抑制に関与する。リンパ球のこれら２つの クラスは、２つの表面積タンパク質のうちの１つの発現によってお互いに区別さ れる。すなわちＴヘルパー細胞あるいはインデュサー細胞（Ｔ　４　”　ｔＪン パ球）上に発現するＣＤ４　（分子ｊ１５５，０００−６２，０００ダルトン） 、あるいはＴ細胞障害性細胞あるいはサプレッサー細胞（７８°リンパ球）上に 二量体タンパク質として発現する（Ｄ８　（分子量３２，０００ダルトン）であ る。 免疫適生な個体では、Ｔ　４　”　ＩＪンパ球は、免疫系の他の特殊化した細胞 種と相互作用して、感染に対して、免疫性を付与あるいは防御する［ε、　Ｌ、 　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚおよびＳ、Ｆ、５ｃｂｌｏｓｓｔｔｒａｎ、　”Ｔｈｅ　Ｄ ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃ ｅｌｌｓ″、　Ｃｅ１１．１９、ｐｐ、　８２１−２７　（１９８０）］。より 詳しくは、Ｔ４’リンパ球は免疫系を機能させるのに必要な増殖因子の産生を刺 激する。例えば、それらは防御抗体の産生を促進するＢ細胞を刺激する作用をす る。それらはまた、感染したあるいはなんらかの異常な宿生Ｍ胞を攻撃させるた めにマクロファージ（キラー細胞）を活性化し、そして侵入した微生物を寅食し 破壊する単球（スカベンジャー細胞）に誘導する。 ある種の感染物質の最初の標的はＣＤ４表面タンパク質である。これらの物質に は、レトロウィルスのようなウィルスか含まれる。Ｔ４＋リンパ球がレトロウィ ルスであるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）にさらされると、それらは機能を示 さなくなる。結果として、宿主の複雑な免疫防御系は抑制され、そして宿主は広 範囲の日和見感染に感受性となる。この様な免疫抑制は、後天性免疫不全症候群 （ＡＩＤＳ）に履病した患者にみられる。 ＡＩＤＳは重症のあるいは典型的には完全な免疫抑制によって、および広範囲の 日和見感染および悪性腫瘍に対する宿主の感受性によって特徴づけられる疾患で ある。いくつかの場合、ＡＩＤＳは中枢神経系の障害を伴う。ＡＩＤＳの完全に 臨床的な顕現の前に、通常ＡＩＤＳ関連複合症（ＡＲＣ）が現れる。これは、宿 主の全身的なリンパ節障害、発熱、体重の減少などの徴候を伴う症候群である。 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、ＡＩＤＳおよびその前駆症であるＡＲＣの 原図物質であると考えられている［Ｍ、　Ｇ、　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら、 −Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ 　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｅｓ　（）ＩＴＬＶ−１１１）　ＦｒｏＩＩＩＰａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　Ａ ＩＤＳ　Ａｎｄ　Ｐｒｅ−ＡＩＤＳ”、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．　ｐｐ、 　４９７−５０８　（１９８４）］。。 ＡＩＤＳ／ＡＲＣ集団の８５から１００％がＨＩＶに対し血清陽性を示した［Ｇ 、　Ｎ、　Ｓｈａｗら、−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｊｚａｔｔ ｏｎ　Ｏｒ　Ｈｕａ＋ａｎ　Ｔ−Ｃａｌｌ　ムｅｕｋｅｍ１ａ　（Ｌｙｍｐｈｏ ｔｒｏｐｊｃ）　Ｖｉｒｕｓ　ＴｙｐｅＩｌｌ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ａｃｑｕｉｒｅ ｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−、５ｃｉｅ上、 ２２５．　ｐｐ、１１５５−７０　（１９８４）コ　。 °本出願において、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）とは、ヒトＴ細胞リンパ球 関連ウィルスタイプＩ　Ｉ　Ｉ　（ＨＴＬＶ−１ＩＩ）、リンパ節疾患関連ウィ ルス（ＬＡＶ）、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１　（ＨＩＶ−１）およびＡＩＤ Ｓ関連レトロウィルス（ＡＲＶ）を包む、ＡｒＤＳ患者由来の独立の単離物を指 すのに用いられ、これは国際ウィルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　Ｏｎ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　Ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　）の ヒトレトロウィルスサブ委員会によって採用された一般的な用語ＨＩＶのような レトロウィルスのゲノムは、構造タンパク質をコードする３つの領域を含んでい る。ＬＬＩＬｆａ域は、成熟ウィルスのコアタンパク質をコードしている。ＬＬ Ｌ領域は成熟ウィルスＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし ている。ｅｎｖ領域は、ウィルスの外皮膜中および感染した細胞の細胞質膜中に みられる主要糖タンパク質をコードしている。ＨＩＶが標的細胞レセプターへの 結合および細胞膜の融合を引き起こす能力は、このｅｎｖ遺伝子によって制御さ れている。これらの特性は、ウィルスの病原性において、基本的な役割を果たす と考えられている。 つ多量にグリコジル化された大きな外膜タンパク質（ｇｐ１２０）、および、よ り小さい、グリフシル化され得る約３４５個のアミノ酸の膜質適合タンパク質（ ｇｐ４１）とに成熟した形態で切断される前駆体ポリペプチドより発生する［Ｌ 。 Ｒａｔｎｅｒら、−Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ、■ＴＬＶ−１１１”、　Ｎａｔｕｒ ｅ、　３１３．　ｐｐ、　２７？−８４（１９８５）］。 ＨＩＶウィルスの宿主の範囲は、基本的にはＣＤ４表面糖タンパク質を持つ細胞 と関連している。そのような細胞には、Ｔ４”リンパ球および脳細胞が包含され る［Ｐ、　Ｊ、　Ｍａｄｄｏｎら、−Ｔｈｅ　Ｔ４　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅｓ 　Ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｉｓ　Ｅｘｐｒ ｅｓｓｅｄ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｂ ｒａｉｎ−、Ｃｅ１ｌ、　４７、　ｐｐ、　３３３−４８（１９１１５）コ。Ｉ （ＩＶによるヒトの感染によッテ、Ｔ４＋リンパ球は機能を示さなくなる。Ａ　 Ｉ　ＤＳ／ＡＲＣ１ｌｉｆ候群の進行は、表面にＣＤ４を持つＴ４“リンパ球の 減少と相関し得る。このＴ細胞の減少と結果として起こる免疫学的危険は、再感 染周期および細胞が媒介するウィルスの拡散による細胞溶解性の進行との両方が 原因となり得る。加えて、Ｈ１原因であると、臨床観察より示唆されている。 ＣＤ４はＨｒＶに対するＴ細胞表面レセプターの本質的成分である。より詳細に は、ＨＩＶ外膜糖タンパク質（ｇｐ１２０）は、ＣＤ４のエピトープ（ｖｉ数の エピトープンに選択的に結合すると考えられており、宿主細胞への侵入の開始、 および、細胞から細胞へのウィルスの転移および細胞病理学的効果の原因である 細胞膜の融合の遂行にごの相互作用を用いている［Ａ、　Ｇ、　Ｄａｌｇｌｅｊ ｓｈら、−Ｔｈｅ　ＣＤ４　（Ｔ４）　Ａｎｔｉｇｅｎ　ｌ５Ａｎ　Ｅｓ５ｅｎ ｔｉａｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｆｏｒ　Ｔ ｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ”、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２．　ｐｐ 、　７６３−６７　＜１９８４）；　Ｄ、　Ｋｌａｔｚｍａｎｎら、−Ｔ−Ｌｙ ｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｔ４　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ　Ｂｅｈａｖｅｓ　Ａｓ　Ｔｈｅ　 Ｒｅｃｅｐｔ。 ｒ　Ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ＬＡＶ＼Ｎａｔｕｒｅ、３１ ２．１）１１．７６７−６８　（１９８４ン　；　Ｊ、　５ｏｄｒａｓｋｉ　ら 、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２２．　ｐｐ、　４７０−７４　（１９８６）　：Ｊ、 Ｌｉｆｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２３．　ｐｐ、７２５−２８　（１９８６） 　］。 ＨＩＶ感染の過程において宿主は、ウィルスに対する液性および細胞性免疫応答 の両方を開始する。これらの応答には、多くのウィルスの産生物と結合し、中和 効果あるいは抗体依存性細胞障害性機能を示す抗体の出現が含まれる［Ｍ、　Ｇ ｕｒｏｒｆ−Ｒｏｂｅｒｔら、−ＨＴＬＶ−１１ｔ−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　Ａｎ ｄ　ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ−、Ｎａｔｕｒｅ、　３１６゜ ｐｐ、７２−７４　（１９８５）；　Ｄ、Ｄ、Ｆ、Ｂａｒｉｓら、”Ｖｉｒｕｓ 　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｏｆ　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｒｅｐｒｅｓ ｅｎｔｓ　Ｍａｊｏｒ　Ｔａｒｇｅｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ＦｏｒＡｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　Ｉｎ　Ａ（Ｏ５Ｐａｔｉｅｎｔｓ−、５ｃｉｅｎｅ、　２２８．　ｐｐ 、　１０９４−９５（１９８５）　；　Ａ、Ｈ，Ｒｏｏｋら、　”５ｅｒａ　Ｆ ｒｏｍ　ＩＩＴＬＶ−１１１／ＬＡＶ　ＡｎｔｉｂｏｄｙＰｏｓｉｓｔｉｖｅ　 Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　Ｍｅｄｉａｔｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｐｅｎｄｅ ｎｔ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｇａｉｎｓｔ　ＨＴＩ Ｊ−１１１／ＬＡＶ　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　Ｔ　Ｃａ１ｌｓ”、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、、　１３８．　ｐｐ、　１０６４−６８　＜１９８７）］。ＨＩＶ外皮のエ ピトープは、中和抗体応答を誘起させるための重要な決定因子であると確認され ている。そして、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）活性における決定因子には 、ＨＩＶ　ｅｎｖおよびおそらくはｍ−エピトープが含まれる。 ＨＩＶは、感染回路を維持するために、ＣＤ４となお相互作用する新規な変異体 を生ずるごとにより、インビボで中和抗体の影響を免れていると考えられる［　 Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、囮坦、３３１．　ｐｐ、８４−８６　（１９８８）　 （Ｂ、Ｒ，５ｔａｒｃｉｃｈら、Ｃｅ１１．　４５．　ｌ）ｐ、６３７−４８　 （１９８ｆｉ）　；　Ｍ、Ａ１１ｚｏｎら、Ｃｅｌユ、４６．　ｐｐ、６３−７ ４　（１９１１６）；　Ｒ，Ｗｉｌｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８３．　ｐｐ、５０３ｇ−４２（１９８６）　；　Ｂ、Ｈａｈ ｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３２．　ｐｐ、１５４８−５３　（１９８６＞を引用 ）］。 ヒト可溶性ＣＤ４タンパク質を基にした治療剤が、ＨＩＶ関連感染であるＡＩＤ Ｓおよ−びＡＲＣの治療および予防のために提案されている。ヒトＣＤ４の全長 をコードしているＣＤＮＡに対するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は 既に報告されている［　Ｐ、　Ｊ、　Ｍａｄｄｏｎら、−Ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔ ｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｏｆ　Ａ　ｃＤＮ Ａ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｔ４、Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｍｂｅｒ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　１ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ ｌｉｎ　ＧｅｎｅＦａｍｉｌｙ−、Ｃａｌユ、４２　、ｐｐ、９３−１０４　（ １９８５）；　Ｄ、Ｒ，Ｌｊｔｔｍａｎ　ら、−Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ＣＤ４５ ｅｑｕｅｎｃｅ−、Ｃｅ１ｌ、　５５．　ｐｐ、　５４１　（１９８８）］可溶 性ヒ）ＣＤ４タンパク質は、成熟の全長ＣＤ４をアミノ酸３７５位で先端切断し 、膜質通ドメインおよび細胞質内ドメインを分離することによって構築する。こ のようなタンパク質は、組換え法によって産生される［１？、　Ａ、　Ｆｉｓｈ ｅｒら、−Ｉ（ＩＶ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｉｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　Ｉｎ　Ｖｉ ｔｒｏ　Ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４°、　Ｎａｔ ｕｒｅ、’３３１　、　ｐｐ、７６−７８　（１９８８）］。組換え可溶性ヒト ＣＤ４タンパク質（ｒｓＴ４あるいはｒ　ｓ　ＣＤ４）が、ＣＤ４を発現してい る細胞にＨＩＶが感染するのを阻害するブロック機構あるいは競合的結合機構に よって、ＣＤ４／Ｈｒｖ相互作用を都合よく妨害すると考えられている。可溶性 ウィルスレセプターとして作用することにより、可溶性ヒトＣＤ４タンパク質は 、Ｔ４＋細胞にＨｒＶが結合するのを阻害する抗ウイルス治療剤として用い得る 。 ＡＩＤＳおよびＡＲＣを処置しあるいは予防するため提案された他の方法は、Ｈ ＩＶの逆転写酵素を標的とし、それによってウィルスの複製を妨害する抗レトロ ウイルス物質の開発に着眼している。例えば、これらの物質にはスラミン、アジ ドチミジン（ＡＺＴ）およびジデオキシシチジンが含まれる　［Ｈ，Ｍｉｔｓｕ ｙａら、３°−Ａｚｉｄｏ−３’−Ｄｅｏｘｙｔｈ７ｍｉｄｉｎｅ　（ＢＷＡ５ ０９Ｕ）　：　Ａｎ　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ａｇｅｎｔ　Ｔｈａｔ　Ｉｎｈｉｂ ｉｔｓ　Ｔｈｅ　１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｅ ｆｆｅｃｔ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　 Ｔｙｐｅ１１１／Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖ ｉｒｕｓ　Ｉｎ　Ｖｔｔｒｏ−、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２．　ｐｐ、　７０９６−７ １００　（１９８５）；　Ｈ，ＭＵｓｕｙａおよびＳ、ＢｒｏｄｅｒＳ−Ｉｎｈ ｉｂｉｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｆｅｃｔｉｖｔｔｙ　 Ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−ＬｙＩ Ｉｌｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ｌｉｔ／Ｌｙｍｐｈａｄｅｎ ｏｐａｔｈｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　’／１ｒｕｓ　（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／Ｌ ＡＶ）　Ｂｙ　２°、３’−Ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ、８３．　Ｉ）ｐ、１９１１−１ ５　（１９８６）　；　Ｒ，Ｙａｒｃｈｏａｎら、−Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ ｏｎ　Ｏｆ　３°−Ａｚｉｄｏ−３’−Ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、Ａｎ　 Ｉｎｈｉｂｉｔ。 ｒ　Ｏｆ　ＨＴＬＶ−１１１／ＬＡＹ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｔｏ　Ｐａ ｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　。 ｒ　ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ−、Ｌａｎｃｅｔ、ｐｐ、５７ ５−８０　（１９８６）］これらの物質の各々は、インビトロでＨＩＶに対し活 性を示すが、ＡＺＴのみが適切に設計されたブラセボを対照とした臨床試験にお いて、臨床的に有用であることが明らかにされた。ＡＺＴを投与されている患者 の数は増大しているが、この薬剤の低い投与量にしか耐えられない。ＡＺＴのあ る投与量の療法は、リンパ毒性であると報告されているＪ　Ｙａｒｃｈ。 ａｎら、前出）。効果的な量のＡＺＴの投与もまた、顆粒球減少および貧血のよ うな望ましくないそして衰弱させる副作用を伴う。従って、長い期間にわる血液 学的な毒性が、ＡＩＤＳおよびＡＲＣの処置においてＡ、　Ｚ　Ｔの使用を制限 する重要な要因であった［Ｄ、　Ｄ、　Ｒｉｃｈｍａｎら、−Ｔｈｅ　Ｔｏｘｉ ｃｉｔｙ　Ｏｆ　Ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　（ＡＺＴ）　Ｉｎ　Ｔｈｅ　 Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｏｆ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ＡｔＤＳ　Ａｎｄ　 ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ：　Ａ　Ｄｏｕｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ 、　Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｔｒｉａｌ”、　Ｎ、Ｅｎ　、Ｊ 、Ｍｅｄ、、　３１７．　ｐｐ、１９２−９７（１９８７）］。 他の予防法そして治療法は、逆転写以外のウィルスの複製回路の過程に対して抗 レトロウイルス活性を示す物質に基づいている［　ＰＣＴ特許出願Ｗ○８７１０ ３９０３　］。このような方法には、植物アルカロイドであるカスタノスペルミ ンのようなグルコ／ダーゼ阻害剤の投与が含まれる。この阻害剤は、これらの糖 タンパク賃上に、Ｎ−結合したオリゴ糖の正常なプロセシングを妨害することに より、ＨＩＶｇ染細胞の外皮糖タンパク質のグリコリル化を変更する。グルコ／ ダーゼ阻害剤は、細胞表面上で、機能しているＨＩＶ外皮タンノｆり質の発現の 減少をもたらし、そして感染性のウィルス粒子の産生を阻害すると考えられてい る。しかしながら、このような抗レトロウイルス物質は、単独療法として投与さ れたとき、高い投与量では細胞質代謝に対し毒性になり得る。 様々なタイプのワクチンもまた、ＨＩＶ感染に対する潜在的な予防および／ある いは治療物質として研究されている［Ｗ、　Ｃ，Ｇｏｆｆ、　”Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ　Ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｏｆ　ＡＩＤＳ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ−、５ ｃｉｅｎｃｅ、　２４１．　ｐｐ、　４２６−３２　（１９８８）コ。例えば、 マウスモノクローナル抗ＣＤ４抗体によって動物中で誘起された抗遺伝子型抗体 の可能な利用法が研究されている。例えば、Ａ、　Ｇ。 ＤａｌｇｌｅｉｓｈおよびＲ，Ｃ，Ｋａｎｎｅｄｙ、　−Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｔ ｙｐｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｓ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｇｅｎｓ：　Ｉｄｉｏ ｔｙｐｅ−Ｂａｓｅｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ−、Ｖａｃｃｉｎｅ、　６、　１）Ｉ ｌｌ、２１５−２０　（１９８８）；　Ａ、Ｇ、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ら、”Ｔ ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　ＨＩＭ　Ｂａ５ ｅｄ　Ｏｎ　丁ｈｅ　ＣＤ４　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ ｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｈｅｒａｐｙ、５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４　Ａｎｄ　Ａｎｔｉ −１ｄｉｏｔｙｐｅ　Ｖａｃｃｔｉｎｅｓ−、Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｏｎ　ＡＩＤＳ。 ノｕｎｅ　１９８８．　Ｂｏｏｋ　１．　Ａｂｓｔｒａｃｔ　３０６１；　Ａ、 Ｇ、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ら、−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＶ 　ｌ５ｏｌａｔｅｓ　Ｂｙ　Ａｎｔｉ−Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　Ａｎｔｉｂ。 ｄｉｅｓ　Ｗｈｉｃｈ　Ｍｉｍｉｃ　Ｔｈｅ　Ｔ４（ＣＤ４）　Ｅｐｉｔｏｐｅ ：　Ａ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ＡＩＤＳＶａｃｃｉｎｅ−、Ｌａｎｃｅｔ、　Ｎ ｏｖ、　７．１９８７．　ｐｐ、１０４７−５０；　Ｔ、　Ｃ，Ｃｈａｎｈら、 ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｔｙｐｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　 Ｍｉａ＋ｉｃｓ　ＴｈｅＣＤ４　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｂｉｎｄｓ　Ｈｕ ＋ｍａｎ　１ｍｏ＋ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ−。 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４．　ｐｐ、　３８ ９１−９５　（１９８７）；　Ｑ。 Ｊ、５ａｔｔｅｎｔａｕら、−Ａｎｔｉｓｅｒａ　Ｔｏ　Ｌｅｕ３ａ　Ｗｉｔｈ 　Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｔｙｐｉｃＡｃｔｉｖｉｔｙ　Ｒｅａｃｔ　Ｗｉｔｈ　ｇ ｐＨＯ／１３００ｆ　ＨＩＶ−Ｉ　Ａｎｄ　ＬＡＶ−２−、Ｔｈ１ｒｄ　Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｏｎ　ＡＩＤＳ、Ｓｔｏｃｋｈ ｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ、　Ｊｕｎｅ　１９８７．　ｐ、　１６０．　Ａｂｓｔｒ ａｃｔ　ＴＨ，９，４，；およびＲ，Ｃ，Ｋｅｎｒ＋ｅｄｙら、”Ｉｎｔｅｒｎ ａｌ　Ｉｍａｇｅ　Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｔｙｐｅｓ　Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉ ｖｅ　Ｏｆ　Ｈｏｍｏｂｏｄｉｅｓ　Ｍｉｍｉｃ　Ｔｈｅ　ＣＤ４　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌｅ　Ａｎｄ　Ｂｉｎｄ　ｔＴｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　 Ｖｉｒｕｓ−、Ｔｈ１ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ ｅ　ＯＮ　ＡＩＤＳ、Ｊｕｎｅ　１９８７．　ｐ、１．６０．　Ａｂｓｔｒａｃ ｔ　ＴＨ，９，５を参照のこと。 これらの努力にもかかわらず、いまだＡＩＤＳ、ＡＲＣおよびＨＩＶ感染の処置 と予防のための代替の免疫療法物質、方法および戦略が必要とされている。 良肌旦笠丞 本発明は、ＨＩＶ　ｇｐ１２０と結合する抗体をヒトの中で誘起産生するヒトｃ Ｄ４のアミノ酸変異体および誘導体またはそのフラグメントを提供することで上 述した問題を解決する。そのようなアミノ酸変異体と誘導体をコードする組換え ＤＮＡ分子もまた提供される。そして、それらのＤＮＡ分子で形質転換された単 一細胞の宿主も提供される。本発明の゛アミノ酸変異体と誘導体によって誘起産 生させた抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体は、最初の標的はＴ４”リンパ球である感染物 質によって疾患を、例えばＨＩＶ関連疾患であるＡＩＤＳおよびＡＲＣ，引き起 こされたヒトにおいて検出、予防および処置に役立つ。 本発明は上述された１価あるいは多価型であるアミノ酸変異体および誘導体を含 む診断用、予防用、および処置用の組成物もまた提供する。この組成物は、最初 の標的がＴ４＋リンパ球である感染物質によって引き起こされる、例えばＨＩＶ 疾患であるＡＩＤＳおよびＡＲＣのようなヒトの疾患において、検出、予防、お よび処置に有用である。 本発明は１、ＨＩＶ　ｇｐ１２０、ｌ：　）ＣＤ４あルイハソの両方へ結合する ヒト中で誘起産生される抗体をヒトＣＤ４の変異体および誘導体を選択するため に、非ヒトトランスジェニック哺乳類モデルを用いる、新規なスクリーニング法 を、さらに提供する。そのような変異体および誘導体は、それらの抗体を誘起生 産することにより、最初の標的がＴ４”！Ｊリンパ球ある感染物質によって引き 起こされる、例えばＨＩＶに関連した疾患であるＡＩＤＳおよびＡＲＣの　よう な疾患のヒト中で、処置用および予防用物質となる。本発明のスクリーニング法 は、以下の工程を含む。　（１）ヒトＣＤ４あるいはそのフラグメントを発現し ている非ヒトトランスジエニ、ツク補乳動物を、ヒトＣＤ４の変異体または誘導 体で免疫する工程、および（２）免疫した哺乳動物の血清をＨＩＶ　ｇｐ１２０ と結合する抗体、ヒｌ”　ＣＤ４と結合する抗体、あるいはその両方についてス クリーニングする工程。 さらに本発明は、以下の工程を含む合理的なドラックデザイン体系を提供する。 すなわち（１）ヒトＣＤ４および天然の霊長類ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列 を比較する工程；（２）ヒトＣＤ４アミノ酸配列を、ヒトＣＤ４と天然の霊長１ １１ｆｃＤ４タンパク質との間で相違しているアミノ酸部位を１つあるいはそれ 以上変更する工程；および（３）本発明のスクリーニング法でそのアミノ酸変異 体を試験する工程；である。変異体の設計に好ましい天然の霊長類の配列は、カ ニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ）　ＣＤ　４、アカゲザルＣ Ｄ４、チンパンジーＣＤ４である。 ＨｒＶ　ｇｐ１２０と結合する抗体をヒトの中で誘起産生させる合理的なドラッ グデザイン方式から導かれたこれらのヒトＣＤ４のアミノ酸変異体は、本発明の 診断用、予防用および処置用のタンパク質として好適である。 本発明はまた、最も好ましいアミノ酸変異体として、７カゲザルＣＤ４、カニク イザルＣＤ４、チンパンジーＣＤ４およびそれらの可溶性の断片をも提供する。 さらに、それらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列、それらのＤＮＡ配列を含 む組換えＤＮＡ分子、およびそれらの分子で形質転換された単一細胞宿主も提供 する。 殴ｌ旦囚黒呈五里 図ＬＡからＩＣ（図１）は、カニクイザルＣＤ４のサブクロ−ノｐＳＱ１３１、 ｐＳＱ１３４、およびｐｓＱ１３６の構築の概略図である。 図２は、／−ケン／フグ用ベクターｐＮＮ１２の合成ポリリンカーのＤＮＡ配列 を示している。 図３は、ヒトｃＤ４りｏ−７ＤＣ２１３−５から＋７）４０６ｂｐのＮ　ＣＯｒ 　／ＬＬＪＬＭ　ｒ断片のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。 図４は、重複するりａ−７であるｐｓＱ１３１．ｐｓＱ１３４、およびｐＳＱ１ ３６より得られたカニクイザルの全長のＣＤ４タンパク質の混成ヌクレオチド配 列および推定アミノ酸配列を示している。翻訳開始コドンは、１７１−１７３位 のヌクレオチドのメチオニン（Ａ　Ａ−２ｓ）に位ｔし、　成熟Ｎ末端は、２４ ６〜２４８位のヌクレオチドのリジン（Ａ　Ａ　＋　）に位置している。シグナ ル配列開裂部位は、矢印で示されている。 図４において、可溶性カニクイザルＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列は、ＡＡ− ２５から　Ａ　Ａ　３ｖｓとの間に現れている。シグナル配列開裂部位は、矢印 で示されている。 図５は、可溶性カニクイザルＣＤ４タンパク質が可溶性ヒトＣＤ４タンパク質（ ＡＡ−２５−ＡＡ３ＴＳ）　ニ対し、９４．２５０％の類似度および９１．２５ ０％の同一度を持つことを示している。異なったアミノ酸は、星印で示されてい る。シグナル配列開裂部位は、矢印で示されている。 図５およびその後のアミノ酸配列のみを示している図において、アミノ酸は次の ような単一文字コードで示されているＰｈｅ：Ｆ　Ｌｅｕ：Ｌ　ｌｉｅ：Ｉ　Ｍ ｅｔ：ＭＶａ　ｌ：　Ｖ　Ｓｅｒ：　Ｓ　Ｐｒｏ：　Ｐ　Ｔｈｒ：　ＴＡｌａ： Ａ　Ｔｙｒ：Ｙ　Ｈ４ｓ：ＨＧｉｎ：ＱＡｓｎ：　Ｎ　Ｌｙｓ：　Ｋ　Ａｓｐ： 　Ｄ　Ｇｌ　ｕ：　ＥＣｙｓ：ＣＴｒｐ：Ｗ　Ａｒｇ：ＲＧｌｙ：Ｇ図６は、可 溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質および可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク質の クローニングに用いられた、オリゴヌクレオチドプライマーを示している。プラ イマーはすべて、ヒトＣＤ４タンパク質とカニクイザルＣＤ４９ンバク質の間で ヌクレオチド相同性が１００％の領域より選ばれた。図６は、図４中のカニクイ ザルＣＤ４タンパク質のヌクレオチド配列における、各々のプライマーの位置を 記載している。 図７は、ンーケンシング用ベクターｐＮＮＯ８の合成ポリリンｆ２−のＤＮＡ配 列を示している。 図８は、サブクローンｐｓＱ１４６のアヵゲザルＣＤ４タンパク質挿入物のヌク レオチド配列と推定アミノ酸配列を示している。 図９は、ンーケノシング用ベクターｐＮＮ１１の合成ポリリンカーのＤＮＡ配列 を示している。 図１Ｏは、サブクローンｐｓＱ１６２のアカゲザルＣＤ４タンパク質挿入物のヌ クレオチド配列および推定アミノ酸配列を示している。 図１１は、ｐＤＧｌｏｏの構築の概略図を示している。ｐＤＧｌｏｏは、アカゲ ザル（５゛）とヒト（３゛）のキメラの可溶性ＣＤ４タンパク質を哺乳動物で発 現させるベクターである。 図１２は、哺乳類発現ベクターｐＢＧ３４１の図である。 図１３は、ｐＤＧｌｏｏのＣＤ４　ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列および推定 アミノ酸配列を示している。 図１４は、可溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質の哺乳類発現ベクターである、ｐ ＢＧ３４１．　ｒｈＴ４の構築の概略図である。 図１５は、ｐＢＧ３４１．ｒｈＴ４由来の可溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質（ ＡＡ−２５ＡＡ３ｖ５）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示してい る。翻訳開始コドンは、１７０−１７２位のヌクレオチドのメチオニン（Ａ　Ａ −２５）に位置し、成熟Ｎ末端は２４５−２４７位のヌクレオチドのリジン（Ａ Ａ＋）に位置している。 図１６は、可溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質が可溶性カニクイザルＣＤ４タン パク質の４００個のアミノ酸に対し、９９．７５０％の類似度およびと９９．５ ００％の同一度を持つことを示している。異なったアミノ酸は、星印で示されて いる。シグナル配列開裂部位は、矢印で示されている。 図１７は、可溶性ヒトＣＤ４タンパク質が可溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質に 対し、９４．２５４％の類似度と９１．２７２％の同一度を持つことを示してい る。異なったアミノ酸は、星印で示されている。／グナル配列開裂部位は、矢印 で示されている。 図１８Ａ−１８Ｂ（図１８）は、可溶性７カゲザルＣＤ４タンパク質の哺乳類発 現ベクターである、ｐＢＧ３４１Ｊ。 Ｄ、ｒｈＴ４の構築の概略図である。 図１９は、クーマン−ブルー染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真で、ｐＢＧ３ ４１ＪＯＤ、ｒｈＴ４で形質転換されたＣＨＯ細胞に発現させた、精製可溶性γ カゲザルＣＤ４タンパク質を表している。 図２０は、クローンｐｓＱ２０５由来の可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク質（ Ａ　Ａ−２５−Ａ　Ａ３７６）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列示し ている。翻訳開始コドンは、９６−９８位のヌクレオチドのメチオニン（Ａ　Ａ 　−２ｓ）　部位１１１し、成熟Ｎ末端は、１７１−１７３位のヌクレオチドの リジン（Ａ　Ａ　＋ンに位置している。 図２１は、りσ−ンｐｓＱ２０Ｑ（ｌｌｌｌＩ来の可溶性チンパンジーＣＤ４タ ンパク質（Ａ　Ａ−２５〜ＡＡ３ｖａ）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸 配列を示している。翻訳開始コドンは、９６−９８位のヌクレオチドのメチオニ ン（Ａ　Ａ　−２５）　ｔ：位！し、成熟Ｎ末端は１７１−１７３位のヌクレオ チドのリジン（Ａ　Ａ　１）に位置している。 図２２は、クローノｐｓＱ２００由来の可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク質の １２９４個のヌクレオチドが、相当すルクローンｐｓＱ２０５由来の可溶性チン パンジーＣＤ４タンパク質の１２９４＠のヌクレオチドと次の４つの部位で異な っていることを示している。すなわちヌクレオチド２６５位、ヌクレオチド１０ ０７位、ヌクレオチド１２７１位、およびヌクレオチド１２９３位である。これ らの部位は、星印で示されている。 図２３は、りａ−７ｐＳＱ２００　（ＡＡ−２５ＡＡａ７ａ）由来の可溶性チン パンジーＣＤ４タンパク質の３９９個のアミノ酸が、相当するクローンｐｓ０２ ０５由来の可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク質の３９９個のアミノ酸に対し、 ９９．７４９％の類似度と９９．７４９％の同一度を持つことを示している。異 なったアミノ酸は、星印で示されている。シグナル配列開裂部位は、矢印で示さ れている。 図２４は、クローノｐＳＱ２００由来の可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク質（ ＡＡ−２５ＡＡ３？Ｊ）の３９９個のアミノ酸が、相士する可溶性ヒトＣＤ４タ ンパク質（ＡＡ−２５−ＡＡ３７ａ）　（Ｄ　３９９個ノアミノ酸に対し、９９ ．２４８％Ｆ）類似度と９８．９９７％の同一度を持つことを示している。異な ったアミノ酸は、星印で示されている。シグナル配列開裂部位は、矢印で示され ている。 図２５は、ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｋ　Ｓにサブクローンニングされた ヒ１−ＣＤ２ゲノム断片およびｃＤＮＡ断片を示している。 図２６は、ベクターｐｏｌｙ　ｌ１ｌ−１にサブクローンされたヒトＣＤ２　３ ’−隣接ＤＮＡ断片を示している。 図２７は、全長のと）ＣＤ４タンパク質ＤＮＡ配列を含むベクターＰＡＴＹ、６ の構築を示している。 図２８は、ＰＡＴＹ、６中の全長の可溶性ヒトＣＤ４タンパク質配列（ＡＡ−２ ｓ−ＡＡａ３３）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示している。翻 訳開始コドンは、１８４−１８６位のヌクレオチドのメチオニン（Ａ　Ａ−２５ ）に位置し、成熟Ｎ末端は２５９−２６１位のヌクレオチドのリジン（ＡＡｌ） に位置し、そしてそのタンパク質の最後のアミノ酸は、ヌクレオチド１５５５− １５５７位のインロイシン（Ａ　Ａ　ｔ３３）に位置している。 図２９は、ヒトＣＤ４ｈランスジーンの構築を示している。 図３０１Ｌ　ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウス（Ｔ　ｇ）および非トランス ジェニックマウス（ＮＴｇ）の胸腺細胞および肺細胞でのヒトＣＤ４タンパク質 の発現をグラフで示したＦＡＣ３分析である。Ｘ軸は、蛍光強度の対数を示して いる。Ｙ軸は、相対細胞数を示している（リニアスケール）。 図３１は、ＣＤ４トランスジエニツク（Ｔ　ｇ）マウスおよび非トランスジェニ ック（ＮＴｇ）マウスに、ヒトｒＳＣＤを免疫することによって誘起産生された 、抗ヒト組換え可溶性ＣＤ４タンパク質（ｒｓＣＤ４あるいはｒｓＴ４）抗体力 価をグラフで示している。 図３２は、ヒトＣＤ４１−ランスジェニック（Ｔ　ｇ）マウスおよび非トランス ジェニック（ＮＴｇ）マウス由来の血清でヒ１−ＣＤ４を持つ細胞の免疫蛍光染 色を行った結果をグラフで示している。ヒトｒｓＣＤ４で免疫されたマウス（ダ ッシュ線）、および非免疫マウス（陰性コントロール）（点線）の両方の血清で 染色を行った。実線は、蛍光的標識した二次抗体だけでの染色を表す。グラフは 、蛍光強度の対数に対する数相対細胞数をプロットしている。 図３３は、どちらもアカゲザルｒｓＣＤ４で免疫されている、トランスジェニッ ク（Ｔ　ｇ）および非トランスジェニック（ＮＴｇ）マウス由来の抗アカゲザル ｒ　ｓ　ＣＤ４および抗ヒトｒ　ｓ　ＣＤ４の抗体力価をグラフで示している。 図３４は、アカゲザル、ヒト、および活性化したヒト末檎血ゾンバ球を以下の物 質で免疫蛍光染色した結果をグラフで示している＝　（１）ヒトＬｅｕ３ａモノ クローナル抗体（上段点線の陽性のコントロール）；（２）第二工程の試薬のみ （上段実線の陰性のコントロール）；　（３）抗アカゲザルｒｓＣＤ４トランス ジェニックマウスの血清（中段点線）；（４）抗アカゲザルｒ　Ｓ　ＣＤ４非ト ランスジエニツクマウスの血清（下段点線）；および（５）無関係な抗原で免疫 された非トランスジェニックマウスからの血清（中段および下段の実線の陰性の コントロール）。グラフは、蛍光強度の対数に対する相対細胞数をプロ、トシで ある。 図３５は、どちらも７カゲザルｒｓＣＤ４で免疫されているトランスジェニ１り （Ｔｇ）マウスおよび非トランスジェニック（ＮＴｇ）マウスの血清のＨＩＶ　 ｇｐ１２０Ｐｉ合活性をグラフで示している。データは、血清の希釈率に対する 吸光度をプロットしである。 図３６は、どちらともアカゲザルｒｓＣＤ４で免疫されている２匹のトランスジ ェニック（Ｔ　ｇ）マウス（ライン３１３、）（黒丸と黒四角）および２匹の非 トランスジェニ、り（ＮＴｇ）マウス（白丸と白四角）中のヒトｒｓＣＤ４結合 活性（左図）およびＨＩＶ　ｇｐ１２０結合活性（右図）の見かけの速度をグラ フで示している。そして、三角は無関係な抗原で免疫された２匹の陰性コントロ ールマウステアル。データは、免疫後の日数に対する抗体力価をプロットしであ る。 図３７は、トランスジェニック（熱棒）および非トランスジェニック（白棒）ア カゲザルｒ　ｓ　ＣＤ４免疫マウスからの血清のｇｐ１２０結合アフィニティー クロマトグラフィーによって分離された血清画分の、抗ｇｐ１２０結合活性（左 図）、および抗ヒトｒｓＣＤ４結合活性の百分率をグラフで示している。 図３８は、アカゲザルｒ　Ｓ　ＣＤ４を注入したトランスジェニックマウスおよ びコントロールマウスに対スる、抗ｇｐ１２０　１ｇＧ抗体の力価を示している 。 図３９は、表面に組換え体ｇｐ１６０あるいはＬＦＡ−３を発現している、形質 転換されたＣ）（Ｏ細胞の免疫蛍光染色の結果をグラフで示している。染色は以 下の物質で行う。２つの陰性コントロール試薬（Ａ）；　ｇｐ１２０特異的モノ クローナル抗体（Ｂ、ＣおよびＤ）；および無関係の抗原で免疫すれた、ヒトＣ Ｄ４トランスジエニ／クマウス由来の血清（血ｍＡ＞、無関係の抗原免疫の後食 塩水中のＨＩＶ　ｇｌ）１２０投与を行ったヒトＣＤ４　）ランスジェニｙクマ ウス由来の血清（血清Ｂ）、アカゲザルｒｓＣＤ４で免疫し、その後食塩水中の ＨＩＶ　ｇｐ１２０投与を行ったヒトＣＤ４　トランスジェニックマウス由来の 血清（血ａｃ）（ＥおよびＦ）である。 会」堅と１和」Ｊ先駆 本明細書の用語、ｒｃＤ４Ｊとは、天然のＣＤ４遺伝子によりコードされた任意 のＣＤ４タンパク質を意味する。 本明細書の用語、ヒトＣＤ４の「アミノ酸変異体」あるいは「変異体」とは、１ つあるいはそれ以上の部位で、ヒ＋−ＣＤ４と異なるアミノ酸配列を持つポリペ プチド、あるいはそのフラグメントである。そのようなアミノ酸変異体は、合成 的にあるいは、例えば、ヒトｃＤ４遺伝子またはその変異体の突然変異誘発によ る組換えＤＮＡ技術によって生産される。 そのような方法は、当分野では公知である。 本明細書の用語、ヒトＣＤ４の「誘導体」とは、ヒトの中での免疫源となるよう に、例えばノニトロフェノールで共有結合的に修飾されたヒトＣＤ４あるいはそ の断片をいう。本発明の誘導体は、本発明のアミノ酸変異体の誘導体もまた包含 する。誘導体は、ヒトＣＤ４の断片も包含する。 本明細書の用語、「ヒトＣＤ４のアミノ酸変異体あるいは誘導体またはその断片 の免疫療法的な有効量」とは、ＨｒＶ感染を処置あるいは予防する抗ＨＩＶ　ｇ ｐ１２０抗体の充分な力価を誘起する、本発明の１つあるいはそれ以上の免疫原 性ＣＤ４タンパク質の量をＬｌう。 以下に説明される本発明のスクリーニング法に従うことにより、当業者は過度の 実験をすること無しに、個々の変異体あるいは誘導体がＨｒＶ感染のヒトでの診 断、予防、あるいは処置に有用であるかどうかを決定し得ることが判る。さらに 、以下に記載の合理的なドラッグデザイン体系によって、当業者は過度の実験な し、本発明のスクリーニング法によって、ＨＩＶ　ｇｐ１２０および／あるいは ヒトＣＤ４と結合する抗体がヒトの中で誘起産生させることにより、どの変異体 および誘導体が最も好ましいかを、決定できる。 本発明の変異体および誘導体は、抗ＨｙＶ　ｇｐ１２０抗体を誘起産生ずるもの である。そのような変異体およびＸ導体は、本明細書では「免疫原性ＣＤ４タン パク質」という。 本発明のスクリーニング法で試験される好適な変異体は、アミノ酸１位から３７ ５位にほぼ対応する部位間（すなわち、ＣＤ４細胞外領域）に、ヒトＣＤ４と１ つあるいはそれ以上のアミノ酸の相違を持つ。 他の好適な変異体および誘導体は、ＨＩＶ　ｇｐ１２０と結合可能なヒ）ＣＤ４ の可溶性断片と対応するものである。 このような好適な変異体および誘導体は、図２８に示したようなヒトＣＤ４のＡ ＡＩ−ＡＡ３ｖｓ、ＡＡＩ−ＡＡ＋ｓｓ％　ＡＡｌ−ＡＡＩ＋３にほぼ対応する ものを包含する。あるいは、好適な変異体および誘導体は、本明細書で参考文献 として援用するＰＣＴ特許出願ＰＣ丁／ＵＳ８ｇ１０２９４０のＡＡ３−ＡＡ３ ７？、ＡＡ３−ＡＡ１８２、およびＡ　Ａ　３　Ａ　Ａ　ｔ’ｓにほぼ対応する ものを包含する。 Ｌｉｔｔｍａｎ、Ｃｅ１１．５５．　ｐ、　５４１　（１９８８）もまた参考と すべきである。この文献は、ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２９４０の出願日以後に公表 され、ヒトプレＣＤ４の正しい／グナル配列開裂部位を記載している。 好適なアミノ酸変異体には、天然のアミノ酸変異体が包含される。すなわち、非 ヒト補乳動物、好ましくは非ヒト霊長類由来のＣＤ４あるいはその断片である。 最も好ましくは、本発明のスクリーニングアッセイで試験される変異体は、アカ ゲザルＣＤ４、カニクイザルＣＤ４、チンパンジーＣＤ４、およびそれらの可溶 性断片でなる群から選択される。アカゲザル可溶性ＣＤ４　（、図１５のＡＡｔ −ＡＡ　３７５）は、特に好適である。 本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質は、ヒｌ−ＣＤ４およびそれらの断片の変異 体および誘導体のポリマー型も包含する。 例えば、これらのポリマー型は、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒドある いはジメチルスベリミデートのような架橋剤で架橋された、１つあるいはそれ以 上の変異体および／あるいは誘導体を包含する。このようなポリマー型は、組換 えＤＮＡ技術により生じたマルチシストロンｍＲＮＡから産生された、２つある いはそれ以上の順列にあるいは逆向きに隣接する免疫原性ＣＤ４配列を含むポリ ペプチドを包含する。 理論に束縛されることは望まないが、本出願人は、本発明の免疫原性ＣＤ４タン パク質は予防的および治療的であると考えている。なぜなら、それらは抗体の「 第−波」をヒト中で誘起産生じ、これは次にＨＩＶ　ｇｐ１２０と結合する抗遺 伝子型抗体の「第二波」を免疫されたヒトに誘起産生させるためである。 本発明の合理的なドラッグデザイン体系は、以下の工程を包含する：　（１）ヒ １−ＣＤ４および霊長類ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を比較する工程；　（ ２）霊長類ＣＤ４およびヒ）ＣＤ４との開のアミノ酸相違部位に対応する、１つ またはそれ以上の部位のヒトＣＤ４アミノ酸配列を変換する工程；および（３） 以後に説明するスクリーニング法でアミノ酸変異体を試験する工程、である。合 理的なドラッグデザイン体系の第一の工程に用いられる好適な霊長類ＣＤ４タン パク質には、カニクイザルＣＤ４．　アカゲザルＣＤ４、およびチンパンジーＣ Ｄ４とが包含される。 本発明の好適なスクリーニング法は、以下の工程を包含する。（１）ヒトｃＤ４ の変異体あるいは誘導体またはそれらの断片で、ヒトＣＤ４あるいはその断片を 発現しているトランスジェニ、り非ヒト哺乳類動物を免疫する工程、および（２ ）ＨｒＶ　ｇｐ１２０と結合する抗体に関して、免疫した哺乳類動物の血清をス クリーニングする工程、である。本発明の他のスクリーニング法は次の工程を包 含する。　（１）ヒトＣＤ４の変異体あるいは誘導体またはそれらの断片で、ヒ ）ＣＤ４あるいはその断片を発現しているトランスジエニ。 り非ヒト哺乳類動物を免疫する工程、および（２）ヒｌ−ＣＤ４と結合する抗体 に関して、免疫した哺乳動物の血清をスクリーニングする工程、である。本発明 のさらに他のスクリーニング法において、免疫した哺乳動物の血清を、ヒトＣＤ ４と結合する抗体およびＨＩＶ　ｇｐ１２０と結合する抗体の両方に関してスク リーニングに供する。 天然のアミノ酸変異体は、変異体が由来する哺乳類動物以外のトランスジェニッ ク哺乳類で試験されなければならないことを注意されたい。 本発明のスクリーニング法においては、ヒトＣＤ４を発現する任意のトランスジ ェニック非ヒト哺乳類動物が有用であるが、トランスジェニックマウスが好まし い。 ＨｒＶ　ｇｐ１２０と結合する、全長のヒトＣＤ４あるいはヒトＣＤ４の断片を コードするＤＮＡ配列（例えば、ＣＤ４のＡ　Ａ　−２６−Ａ　Ａ　３７５をコ ードするＤＮＡ配列）は、本発明のスクリーニングプロセスで使用するトランス ジェニック哺乳類動物を作成するのに有用である。図２８の全長のヒ）ＣＤ４配 列が好ましい。あるいは、前出のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２９４０ に記載されている任意の全長ヒ）ＣＤ４配列を用い得る。さらに、ヒトＣＤ４を コードしているゲノムＤＮＡを、標準的な方法により単離し、本発明のトランス ジェニック哺乳動物の作成に用い得る。ヒトＣＤ４をコードする合成りＮＡもま た使用され得る。 ヒトＣＤ４あるいはその断片をコードするＤＮＡは、哺乳類動物のゲノムに形質 転換で組み込ませる以前に、両末端を非コード発現制御配列に作動可能に結合さ れなければならない。５−非コードＤＮＡ配列は、利用する特定のトランスジェ ニック哺乳類動物中で機能するプロモーターを含む転写および翻訳調節エレメン トを含むべきである。３−非コードＤＮＡ配列は、利用する特定のトランスジェ ニック哺乳類動物中で機能するボ’Ｊ　Ａ付加部分を含む転写および翻訳調節エ レメントを含むべきである。好ましくは、５°および３°発現調節配列は、トラ ンスジェニック哺乳類動物の骨髄由来の細胞に特異的である。トランスジェニッ ク哺乳類動物中で機能するリンパ球特異的エンハンサ−もまた、ヒトＣＤ４ある いはその断片の発現を増大するのに有用であり得る。 ５−および３°−非コードＤＮＡは、それらの配列がトランスジェニック哺乳類 動物で作動しないため用い得ない場合を除いて、通常ヒトＣＤ４をコードするＤ ＮＡに隣接した配列から由来し得る（特にゲノムＤＮＡがヒトＣＤ４遺伝子の原 料として用いた場合）。あるいは、これらの調節エレメントは、他の遺伝子に隣 接する５−および３°−非コードＤＮＡ領域より誘導され得る。例えば、そのよ うな領域はアデノウィルス、ランパピローマウィルス、シミアンウィルス４０、 あるいはサイトメガロウィルスなどのウィルスに由来し得る。 これらの配列は高度に発現される遺伝子に結合し、そしてこれらの配列はトラン スジェニック哺乳動物で機能するＯ　しかしながら、５′および３°調節配列は 、トランスジェニック哺乳類動物の高度発現遺伝子と結合していることが好まし い。 最も好ましくは、骨髄由来の細胞で特異的に発現している高度発現遺伝子が用い られる。例えば、これらの最も好ましい調節配列は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ３、 リンパ球チロシンキナーゼ、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、インターロイキン−２ 、あるいはインターロイキン−２レセプターの構造遺伝子に隣接するものに由来 し得る。ＣＤ２構造遺伝子に隣接する配列は、特に好ましい。 ヒトＣＤ４遺伝子あるいはその断片、および所望の５゛−および３−非フード配 列のマウスへの形質転換的組み込みは、既知の方法により容易に行われる。例え ばＢ、　Ｈｏｇａｎら、　”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　 Ｅｍｂｒｙｏ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、　Ｃ。 ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８６）を参 照。当業者は、過度の実験をすることなしに、ヒ１−ＣＤ４を発現しているマウ ス以外の非ヒｌ−）ランスジェニック哺乳類動物を産生にこれら既知の方法を適 応し得る。 ヒトＣＤ４変異体あるいは誘導体でのトランスジェニック哺乳類動物の免疫は、 標準的な方法で実施し得る。好ましくは、変異体あるいは誘導体は、完全あるい は不完全７０インドアジユバントのような、アジニバンドと共に投与される。 最初の注入は、トランスジェニック哺乳類動物の体重１ｋｇ当り約２から４　ｍ ｇ　の変異体あるいは誘導体が好ましい。 典型的には、最初の注入の３５から４０日後の内の１日に、トランスジェニック 哺乳動物の体重１ｋｇ当り約２から４ｍｇの変異体あるいは誘導体を、トランス ジェニック哺乳類動物に再び注入し強化する。 免疫したトランスジェニック哺乳類動物は毎週採血し、そして各血液試料からの 血清はＨＩＶ　ｇｐ１２０、ヒトＣＤ４あるいはその両方と結合する抗体に関し てアッセイされる。 ヒｌ−ＣＤ４結合抗体の存在は、特に本来の膜質通フンフォメーシコンのヒトｃ Ｄ４への結合を特異的に検出する任意の方法を用いて検出され得る。好ましくは 、ヒト末梢血リンパ球との結合を、ヒトＣＤ４と結合する抗体を検出するのに用 いられ得る。 ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、標準的な方法によって単離される。好ましい 手順によれば、ヒトＰＢＬのアリコート（約５Ｘ１０５からｌＸｌ０’個の細胞 ）を４°Ｃで３０分間、５０５０−１Ｏ０の緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ ＢＳ）／２％仔牛脂児血清（ＦＣＳ）１０．０２％アジ化ナトリウム）中でイン キュベートし、その中に、免疫したトランスジェニック哺乳類動物由来の血清を １０から１００倍の希釈で入れる。陰性対照として、ヒトＰＢＬの他のアリコー トを、トランスジェニック哺乳類動物と同様の手順でアジュバントのみ（ヒトＣ Ｄ４変異体あるいは誘導体なし）で「疑似的に免疫した」同種の哺乳類動物から の対照血清とインキュベートする。代わりの対照血清は、免疫前のトランスジェ ニック哺乳類動物由来の血清、トランスジェニック哺乳動物と同種の非免疫哺乳 類動物由来の血清、および市販されているトランスジェニック哺乳類動物と同種 のもの由来のＩｇ画分が包含される。 次１．ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｌの各アリコートを、１１１１１の緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ／２ ％　ＦＣ３１０，０２％　アジ化ナトリウム）で３回洗浄する。洗浄したヒトＰ ＢＬの各アリコートを、トランスジェニック哺乳類動物の免疫グロブリンに対し 特異的な蛍光結合抗体（洗浄緩衝ｉｆｆ１１ｍｌ当り約１０から２０μｇ）と４ ℃で約３０分間インキュベートする。例えば、トランスジェニックマウス由来の 血清をテストする場合、Ｆ■ＴＣを結合したヤギ抗マウスＩｇが用いられ得る。 このような蛍光結合抗体は、市販されているが、公知の方法によっても作成し得 る。次に、細胞を上記で述べたように２回洗浄し、そして従来の方法を用いる蛍 光活性化セルソータ＝（Ｆ　Ａ、　ＣＳ　）を用い分析される。一般的にはＨ， Ｍ、　５ｈａｐｉｒｏ、肚と旦二田ヱｍＬｊ±１蛙Ｈ１Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ 、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８５）を参照 のこと。 ＦＡＣ５装置は、特定の蛍光強度（Ｘ軸）を持った細胞の相対数（ｙ軸）を示す ヒストグラムを作成する。コントロール血清とイノキュベートしたヒトＰＢＬに 対するそのようなヒストグラムは、非特異的結合および巨家蛍光のために、比較 的低い蛍光強度に集中したほぼ正常な分布を示す。ヒトＣＤ４と結合する抗体を 含む形質転換体の血清とインキュベートしたＰＢＬは、非特異的な「対照」蛍光 分布を示し、より高い蛍光強度に集中たほぼ正常な分布の細胞をさらに示す。 この２番目のより強く蛍光性の細胞集団の存在は、ヒトＣＤ４へのトランスジェ ニック哺乳類動物由来血清中の抗体の特異的結合の証拠である。 免疫されたトランスジェニック哺乳類動物の血清中のＨＩＶ　ｇｐ１２０と結合 する抗体の存在は、例えばＥＬ、ＩＳＡ、ラジオイムノア、セイなどの標準的方 法を用いて、検出し得る。これらのアッセイに用いるｇｐ１２０は、ＨＩＶに感 染した細胞、ＨＩＶそれ自体、ＨＩＶ　ｇｐ１２０の遺伝子で形質転換し宿主細 胞、または単離されたｇｐ１２０によって提供され得る。好ましくは、ＨＩＶ　 ｇｐ１２０は、ＨＩＶｇｐ１２０遺伝子で形質転換された単一細胞宿主より得ら れる。そのような形質転換細胞は、例えばＬａ５ｋｅｙらの、−Ｎｅｕｔｒａｌ ｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｂｙ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｔｏ　ＡＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇｌ ｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３３．　ｐｐ。 ２０９−１２　（１９８６＞に記載されている。さらに、ＨＩＶ　ｇｐ１２０は 、市販されている。 好ましい手順によれば、ＨＩＶ　ｇｐ１２０と結合する抗体は次のように検出さ れる。マイクロタイタープレート（それぞれ９６ウエル）を約３７℃で約２時間 あるいは約４°Ｃで１晩、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの精製したＨｒＶ　ｇｐ１２ ０　（５０μｌ／ウェル）でコートする。３７℃で２時間のあるｌ、）は４°Ｃ て１晩のコートになんら違いは見られなし）。プレートを洗浄し、次に室温で約 １時間、　ＰＢＳ／１％のウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１０．０１％のＴｗ ｅｅｎ−２０７０，０５％のＮａＮ３でブロックする。血清あるいはＨｒＶ−１ ｇｐ１２０に特異的なマウスモノクローナル抗体の希釈液を各ウェルに添加しく ５０μｌ／ウエル）そしてプレートを約３７°Ｃで約２時間インキュベートする 。血清の希釈液は、ＰＢＳ　／１％のＢ５Ａ１０．０１％のＴｖｅｅｎ−２０１ ０，０５％（７）ＮａＮ３Ｔ行なう。次にプレートを、ＰＢＳｌｏ、　０１％の Ｔｗｅｅｎ−２０１０゜０５％のＮａＮ３でａ＋する。アルカリフォスファター ゼ結合ヤギ抗？”７スｒｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体を、ＰＢＳ／１％のＢ５Ａ１０ ．０１％のＷｅｅｎ−２０１０，０５％のＮａＮ５中でｌ：１．ｏｏｏの最終希 釈率として、各ウェルに加え、そしてプレートを約３７°Ｃで約２時間インキュ ベートシた。プレートを再び一回洗浄し、基質である４−ニトロフェニルフォス フェート（ＰＮＰＰ）（０，１Ｍのグリシノ／１　ｍＭのＺｎＣｌ２／１　ｍＭ のＭｇＣｌ２−６８２０、ｐＨ１０，６中に１０　ｍｇ／ｍ＋）を加えた。４０ ５　ｎｍで吸光度を読む。結果は、標準コントロール抗体に対して５０％結合を 与える希釈の逆数として表される。 本発明はまた、カニクイザルＣＤ４、アカゲザルＣＤ４、チンパンジーＣＤ４、 およびそれらの断片をコードするＤＮＡ配列を初めて提供する。これらの配列は 、本発明の組成物に有用な免疫原性ＣＤ４タンパク質をコードしている。好まし い免疫原性ＣＤ４タンパク質は、アカゲザルＣＤ４、カニクイザルＣＤ４および チンパンジーＣＤ４の可溶性型、例えばＡ　Ａ　ＩＡ　Ａ　３７６である。可溶 性アカゲザルＣＤ４タンパク質が、最も好ましい。 本発明の免疫原性タンパク質ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列、その一 部、またはそれらの合成のあるいは半合成のコピーは、他の動物からｇ％ｌした ｃＤＮＡライブラリ−するいはゲノムＤＮＡライブラリーをそれらの由来源から ＣＤ４遺伝子を単離するために、スクリーニングするためのプローブとして有用 である。例えば、本明細書に開示されている可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク 質および可溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、チンパ ンノーおよびアカゲザルゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニングし、それらの由来源から全長のＣＤ４遺伝子を選択するために用い得る。 本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列、その一部、または それらの合成のあるいは半合成のコピーはまた、他のアミノ酸変異体あるいは誘 導体を調製するための出発物質としても有用である。そのようなアミノ酸変異体 は、例えば部位特異的突然変異誘発のような標準的な方法によって調製され得る 。本発明のＤＮＡ配列は、アミノ酸配列は変わらないが、変化した変異を伴うＤ ＮＡ分子を作成するのに用い得ることもまた理解されるべきである。 本発明の好ましい免疫原性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、以下か らなる群より選択される：（ａ）　ｐＳＱ１３６、ｐｓＱ１３４、ｐｓＱｌ　３ １、ｐＳＱ１４６、ｐｓＱ１６２、ｐＢＧ３４１ＪＯＤ、ｒｈＴ４、ｐＳＱ２０ ０Ｓ　ｐｓＱ２０５、およびｐＤＧｌｏｏのＤＮＡ挿入物： （ｂ）Ｔ１１より約２０℃から２７°Ｃ低い温度、および１Ｍ塩化ナトリウムに 相当する条件下で、前述のＤＮＡ挿入物の１つあるいはそれ以上とハイブリダイ ズするＤＮＡ配列であって、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、およびヒツジ のＣＤ４配列を除く配列；および （ｃ）前述の任意のＤＮＡ配列へ変化するＤＮＡ配列。 好ましくは、本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、以 下からなる群より選択されたポリペプチドをフードする。図４の式Ａ　Ａ　ＩＡ 　Ａ　ａ３３のポリペプチド（カニクイザル）、図４の式ＡＡ＋−ＡＡ３？Ｓの ポリペプチド（カニクイザル）、図１５の式ＡＡ１−ＡＡ３？５のポリペプチド （アカゲザル）、図２３の式ＡＡ＋−ＡＡ３ｖ４（ｐＳＱ２００）のポリペプチ ド（チンパンジー）、図２３の式ＡＡ、−ＡＡ３７ｓ（ｐＳＱ２０５）のポリペ プチド（チンパンジー）、図４の式ＡＡＩ−ＡＡＩＩＩＩＩのポリペプチド（カ ニクイザル）、図１５の式ＡＡＩ−ＡＡ＋ｓａのポリペプチド（アヵゲザル）、 図２３の式ＡＡＩ　ＡＡ＋８１（ｐＳＱ２００）のポリペプチド（チンパンジー ）、図２３の式ＡＡ＋−ＡＡ＋５ｓ（ｐｓＱ２０５）のポリペプチド（チンパン ジー）、および前記のいずれかの一部分。 本発明の最も好ましいアミノ酸変異体をコードするＤＮＡ配列は、以下からなる 群より選択される：（ａ）ｐＢＧ３４１ＪＯＤ、ｒｈＴ４のＤＮＡ挿入物（ｂ） ”ｒｎより約２０°Ｃから２７°Ｃ低い温度、および１Ｍ塩化ナトリウムに相当 する条件下で、前述のＤＮＡ挿入物とハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、 好ましくはマウス、ラット、ウサギおよびヒツジのＣＤ４配列を除く配列；およ び （ｃ）前述のいずれかのＤＮＡ配列に変化するＤＮＡ配列。 本明細書の用語、「可溶性ＣＤ４タンパク質」とは、それ自身を膜中に固定する 能力がないＣＤ４タノバク質である。 このような可溶性ＣＤ４タンパク質には、例えば、膜中にタンパク質を固定する ための細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの充分な部分の両方を欠損したＣＤ ４タンパク質を含む。 あるいは、そのような可溶性ＣＤ４タンパク質は、細胞質トメイノの全てまたは 一部は保持するが、機能的な膜貫通ドメインを欠損しているＣＤ４タンパク質を 含む。 可溶性ＣＤ４タンパク質である免疫原性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡは 、先端切断によって産生され得る。より詳しくは、そのような可溶性ＣＤ４タン パク質は、次のような従来の方法で調製され得る。すなわち、オリゴヌクレオチ ド特異的突然変異誘発、制限酵素切断の後のリンカ−挿入、エキソヌクレアーゼ を使用して、ＣＤ４の全長をコードするＤＮＡまで「チューバック（ｃｈｅｗ　 ｂａｃｋ）Ｊする、あるいはオリゴヌクレオチド特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）である。あるいは、可溶性免疫原性ＣＤ４タンパク質は、固相合成法の ような従来のペプチド合成法によって化学的に合成し得る（Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ、　−５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓ ｉｓ、１．　Ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｏｆ　Ａ　Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄ ｅ−、Ｊ、　Ａｒｒｒ、　Ｃ工υ２ジど工、　８３．　ｐｐ、　２１４９−５４ 　（１９６３））。それらはまた、全長免疫原性ＣＤ４タンパク質のタンパク質 溶解的開裂により調製され得る。 本発明のＤＮＡ配列は、それらにコードされた免疫原性ＣＤ４タンパク質を生成 するために、単一細胞宿主で発現させる。当該分野で良く知られているように、 宿主にトランスフェクトした遺伝子の高レベルの発現を得るために、その遺伝子 は、選ばれた発現宿主で機能する転写および翻訳発現制御配列に作動可能に結合 しなければならない。発現制御配列および目的の遺伝子は、細菌の選択マーカー および複製開始点をさらに含む発現ベクターに含ま神ることが好ましい。 発現宿主が真核細胞である場合、発現ベクターはさらに発現宿主中で有用な発現 マーカーを含まなければならない。 本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列を コードしても、あるいはしなくともよい。もし発現宿主が原核細胞であるときは 、ＤＮＡ配列はシグナル配列をコードしない方が一般的に好ましい。もし発現宿 主が真核細胞であるときは、シグナル配列がコードされているのが一般的に好ま しい。 アミノ末端のメチオニンは、本発明の発現したＣＤ４タンパク質に存在しても、 あるいはしなくてもよい。もし末端のメチオニンが発現宿主によって開裂されな い場合、もし望むならば、標準的方法によって化学的に除去し得る。 様々な発現宿主／ベクターの組合せが、本発明のＤＮＡ配列を発現させのに用い 得る。真核宿主に対し有用な発現ベクターは、例えばＳＶ４０、ウシパピローマ ウィルス、アゾンウィルス、およびサイトメガロウィルスからの発現制御配列を 含むベクターを包含する。細菌宿主に対し有用な発現ベクターは、既知の細菌プ ラスミドを包含する。例えば、ＣｏｔＥＩＳ　ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＥ ９、およびそれらの誘導体を包含するＥ、ｃｏｌｉ［９来のプラスミド、ＨＰＡ 、のような広域宿主プラスミド、例えばＮＭ９８９のような多くのラムダファー ジ誘導体、およびＭ１３、および線状−末鎖ＤＮＡファージのような池のＤＮＡ ファージである。酵母細胞に対し有用な発現ベクターは、２μプラスミドおよび その変異体を包含する。昆虫細胞に対して有用なベクターは、ｐＶＬ　９４１を 包含する。 さらに、　（ＤＮＡ配列と作動可能に結合されたときにその発現を制御する配列 である）任意の広範囲の発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現させるため にこれらのベクターに用い得る。そのような有用な発現制御配列には、前記の発 現ベクターの構造遺伝子と結合した発現制御配列が包含される。 有用な発現制御配列の例には、次のようなものが包含される。 例えば、ＳＶ４０あるいはアゾンウィルスの初期および後期プロモーター、二ｌ 且系、二二且系、１人旦あるいはＴＲＣ系、ラムダファージの主なオペレーター およびプロモーター領域、 13. The host is E. coltSPseudomonas, h-ku”! 13. The unicellular host of claim 12, selected from the group consisting of human cells, yeast, fungi, animal cells, plant cells, insect Jllll cells, and human cells in tissue culture. ia, a polypeptide encoded by any of the DNA sequences according to claims 1 to 10. Chido. 15. The polypeptide according to claim 14, wherein the polypeptide is a polypeptide of formula AAI-AA433 of FIG. 4 (cynomolgus monkey), a polypeptide of formula AAI-AA37S of FIG. Polypeptide of formula A+h ~ A A375 of Figure 23 (chimpanzee), polypeptide of formula AAI-AA374 (+)SQ200) of Figure 23 (chimpanzee), polypeptide of formula AAI-AA3 75 (psQ205) (D boppeptide, Figure 23 (chimpanzee)) 4 (cynomolgus monkey), polypeptide of formula AA+-AAtaa in Figure 15 (7 rhesus monkey), bozobeb fl' of formula AA+-AA+as (psQ20 0) in Figure 23 (chimpanzee), [23( a polypeptide of the formula A+J-AA+sa of a chimpanzee), and any portion of the foregoing polypeptides. polypeptide. 16. Amino acid variants or derivatives of human l-CD4, or fragments thereof, which induce antibodies that bind to old V gp120 in humans. 17. The amino acid variant according to claim 16, which is a variant of soluble human CD4. 18, mouse CD4 protein, horse cD4 protein, rabbit CD4 protein 19. The amino acid variant of claim 18, further excluding primate CD4. 20, one or more regions corresponding to amino acid difference sites between primate CD4 and human CD4 17. The amino acid variant according to claim 16, which is a polypeptide having an amino acid sequence different from that of human CD4 at this position. 21, one or more of the amino acid difference sites with human CD4 are as shown in Figure 5.17.23 and and 24. A different body. 22, mammalian CD4 and fragments thereof. amino acid variants. 23, cynomolgus monkey cD4, rhesus monkey cD4, chimpanzee CD4 and its 23. The amino acid variant according to claim 22, selected from the group consisting of fragments of. 24, cynomolgus monkey soluble CD4 protein, rhesus monkey soluble CD4 protein 24. The amino acid variant of claim 23, wherein the amino acid variant is selected from the group consisting of chimpanzee soluble CD4 protein and chimpanzee soluble CD4 protein. 25, a polypeptide selected from the group consisting of the polypeptides according to claims 14 and 15. 13. A method for producing a peptide comprising the step of culturing the unicellular host according to claim 12. 26, a method for selecting an amino acid variant or derivative of human CD4 that elicits antibodies that bind to HIV gp120 in humans, the method comprising: (a) transgenic mammals expressing human CD4 or a fragment thereof; selected from the group consisting of amino acid variants and derivatives of and fragments thereof. (b) testing the ability of serum antibodies of the immunized transgenic mammal to bind to Vgl)+20; and (c) immunizing with the immunized transgenic mammal. A method comprising: selecting an amino acid variant or derivative when a serum antibody of the offspring-introduced mammal binds to the former Vgl)120. 27. Human CD4 antibodies that cause antibodies that bind to human CD4 in humans A method of selecting amino acid variants or derivatives, or fragments thereof, comprising: (a) transgenic mammals expressing human I-CD4 or fragments thereof; immunizing with a fragment selected from the group consisting of fragments of (+)) the blood of the immunized transgenic mammal; and (C) testing the ability of the serum antibody to bind to human CD4. A method comprising: selecting an amino acid variant or derivative when a serum antibody of a gene-transferred mammal binds to human CD4. 28. The method according to claim 26 or 27, wherein the transgenic mammal is characterized by human CD4. 29. The method of claim 28, wherein the expression of human I-CD4 is lymphocyte specific. 30. The transgenic mammal or mouse according to claim 26 or 27. How to put it on. 31. The method of claim 30, wherein the transgenic mouse is immunized with an amino acid variant of human soluble CD4 protein. 32. An immunotherapeutically effective amount of one or more human I-CD4 amino acid variants or derivatives, or fragments thereof, according to any of claims 16-24. Pharmaceutical composition. 33. The pharmaceutical composition of claim 32, further comprising a pharmaceutically acceptable adjuvant. 34. The pharmaceutical composition according to claim 32, wherein the amino acid variant or derivative is multivalent. 35. The pharmaceutical composition according to claim 32 or 33, wherein the amino acid variant is a polypeptide of the formula AA+-AA37S of the rhesus macaque (Fig. 15). 36, the amino acid variant of human CD4 according to any one of claims 16-24 or is produced by immunizing a human with a derivative thereof, or a fragment thereof.) An antibody that binds to II V gp12Q. Description Immunotherapeutic compositions for the treatment and prevention of AIDS, ARC and HIV infections Field of the Invention The present invention relates to the treatment or treatment of human diseases caused by infectious agents whose primary target is T4 lymphocytes. The present invention relates to immunotherapeutic, prophylactic and diagnostic compositions useful for the prevention of diseases such as acquired immunodeficiency syndrome, AIDS-related complex (ARC) and and human immunodeficiency virus (HIV) infection. For more details, please refer to The present invention refers to DNA sequences encoding amino acid variants and derivatives of human CD4 or fragments thereof. And it is a protein that binds to HIV gp120. induce the production of anti-antibodies. Such amino acid variants and derivatives can be used in the immunotherapeutic, prophylactic, and diagnostic compositions of the invention. The present invention also relates to novel screening methods for selecting amino acid variants and derivatives of human CD4. do. It induces production in humans of antibodies that bind to HIV gp 120, human CD4, or both. The antibodies identified by this screening assay 91 amino acids and derivatives are therapeutic, prophylactic, and diagnostic for humans. It is useful as a quality. In humans, the class of immunoregulatory cells known as lymphocytes is divided into two major functional (sub)classes. The first class is helper T cells. or inducer T cells. These mediate interactions between helper cells for T cell proliferation, lymphokine release, and immunoglobulin release. The second class includes cytotoxic or suppressor T cells. These are involved in cell killing by T cells and suppression of immune responses. These two classes of lymphocytes are distinguished from each other by the expression of one of two surface area proteins. It will be done. That is, T helper cells or inducer cells (T 4 ” tJ CD4 (molecular weight: 155,000-62,000 daltons) is expressed on T cytotoxic cells or suppressor cells (78° lymphocytes) (D8 (molecular weight: 32, 000 Dalton) Ru. In immunocompetent individuals, T4'' IJ lymphocytes interact with other specialized cell types of the immune system to confer immunity or protection against infection [ε, L, Rehnherz and S, F, 5cblossttran, "The Differentiation Function of Human T-Cells", Ce11.19, pp. 821-27 (1980)].More specifically, T4' lymphocytes are necessary for the functioning of the immune system. Stimulating the production of growth factors Intense. For example, they act by stimulating B cells, which promote the production of protective antibodies. Ru. They also cause infected or otherwise abnormal host M-cells to attack. It activates macrophages (killer cells) and induces monocytes (scavenger cells) to phagocytize and destroy invading microorganisms. The initial target of certain infectious agents is the CD4 surface protein. These substances include viruses such as retroviruses. T4+ lymphocytes are retrovirus When exposed to the virus, human immunodeficiency virus (HIV), they exhibit functional It will stop happening. As a result, the host's complex immune defense system is suppressed, and the host is exposed to widespread susceptible to a range of opportunistic infections. Such immunosuppression is seen in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). AIDS is a disease characterized by severe or typically complete immunosuppression and host susceptibility to a wide range of opportunistic infections and malignancies. In some cases, AIDS is accompanied by central nervous system damage. The full clinical manifestation of AIDS is usually preceded by the AIDS-related complex (ARC). This is an inn It is a syndrome with symptoms such as generalized lymphadenopathy, fever, and weight loss. Human immunodeficiency virus (HIV) is thought to be the prototype agent of AIDS and its progenitor disease ARC [M, G, Sarngadharan et al. troviruses ()ITLV- 111) FroIII Patients With A IDS And Pre-AIDS", 5science, 224. pp, 497-508 (1984)]. Between 85 and 100% of the AIDS/ARC population were seropositive for HIV [G, N, Shaw, et al. Deficiency Syndrome-, 5cie, 225.pp, 1155-70 (1984). Immunodeficiency virus (HIV) includes human T-cell lymphocyte-associated virus type I II (HTLV-1II), lymph node disease-associated virus Indicates independent isolates from ArDS patients, including ArDS virus (LAV), human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), and AIDS-associated retrovirus (ARV). This is a general term adopted by the Human Retrovirus Subcommittee of the International Committee on Taxonomy of Viruses.The genome of a retrovirus, such as HIV, encodes structural proteins. It includes three areas: Ru. The LLILfa region encodes the core protein of the mature virus. The LLL region encodes the mature viral RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase). The env region encodes the major glycoproteins found in the outer coat of the virus and in the cytoplasmic membrane of infected cells. The ability of HIV to bind to target cell receptors and cause cell membrane fusion is controlled by this env gene. It is. These properties are thought to play a fundamental role in virus pathogenesis. a large, heavily glycosylated outer membrane protein (gp120); It is generated from a precursor polypeptide that is cleaved in the mature form into a smaller, approximately 345 amino acid membrane compatibility protein (gp41) that can be glyphsylated [L. Ratner et al., -Complete Nucleotide 5equence Of The AIDS Virus, ■TLV-111'', Nature, 313.pp, 27?-84 (1985)].The host range of the HIV virus is basically These cells include T4' lymphocytes and brain cells [P, J, Maddon et al. - The T4 Gene Encodes The AIDS Virus Receptor And Is Expressed In The Immune System And The Brain-, Cell, 47, pp, 333-48 (19115). Upon infection of humans with IV (IV), T4+ lymphocytes become non-functional. Progression of the AI DS/ARC1lif syndrome may be correlated with a decrease in T4+ lymphocytes that carry CD4 on their surface. Cell depletion and the resulting immunological risk may result in re-sensitization Both the staining cycle and the progression of cytolysis due to cell-mediated spread of the virus may be responsible. In addition, clinical observations suggest that it is an H1 cause. CD4 is an essential component of the T cell surface receptor for HrV. More specifically, the HIV outer membrane glycoprotein (gp120) is thought to selectively bind to the epitope of CD4 (vi number), leading to initiation of host cell entry and cell-to-cell transfer. This interaction is used to carry out the fusion of cell membranes that is responsible for viral translocation and cytopathological effects [A, G, Dalglej, et al. - The CD4 (T4) Antigen 15An Es5en tial Component Of The Receptor For the AIDS Retrovirus”, Nature, 312. pp, 763-67 <1984); D. Klatzmann et al. ept. r For Human Retrovirus LAV\Nature, 31 2.1) Process of HIV infection. The host mounts both humoral and cellular immune responses against the virus.These responses include antibodies that bind to many viral products and exhibit neutralizing or antibody-dependent cytotoxic functions. Occurrences include [M, Gurorf-Robert et al., -HTLV-11t-Neutralizing Antibodies In Patients With AIDS And AIDS-Related Complex-, Nature, 316゜ pp, 72-74 (1985); D, D, F , Baris et al., “Virus Envelope Protein Of HTLV-III Repres ents Major Target Antigen ForAntibod ies In A (O5Patients-, 5ciene, 22 8. pp, 1094-95 (1985); A. H. Rook et al. “5era From IITLV -111/LAV AntibodyPositive Individuals Mediate Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity Against HTI J-111/LAV Infected T Cals”, J. Immunol., 138. pp. 1064-68 <1987)]. HIV integument Pitopes have been identified as important determinants for eliciting neutralizing antibody responses. And determinants in antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) activity include HIV env and possibly m-epitopes. HIV appears to escape the effects of neutralizing antibodies in vivo by generating new variants that still interact with CD4 in order to maintain the infectious circuit [Traunecker et al., Decoy, 331. pp, 84-86 (1988) (B, R, 5tarcich et al., Ce11.45. l) p, 637-48 (198fi); M, A11zon et al., Cel Yu, 46. pp, 63-74 (19116); R. Willey et al., Proc. Natl. Acad, Set, USA, 83. pp, 503g-42 (1986); B. Hahn et al., 5science, 232. pp, 1548-53 (citing 1986)]. Therapeutic agents based on the human soluble CD4 protein have been proposed for the treatment and prevention of the HIV-related infections AIDS and ARC. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence for the cDNA encoding the full-length human CD4 have been previously reported [P. J. Maddon et al. face protein T4 , A New Member Of The 1mmunoglobin GeneFamily-, Cal. 42, pp. 93-104 (1985); D. R. Ljttman et al. -Corrected CD45 sequence-, Ce. 1l, 55. pp, 541 (1988)] soluble (human) CD4 protein is constructed by truncating mature full-length CD4 at amino acid position 375 and separating the transmembrane and cytoplasmic domains. child Proteins such as [1?] are produced by recombinant methods [1? , A. Fisher et al. -I (IV Infection Is Blocked In Vitro By Recombinant 5 oleble CD4°, Nature, '331, pp, 76-78 (1988)]. Recombinant soluble human CD4 Protein (rsT4 or r s CD4) is expressing CD4. A blocking mechanism or a competitive binding mechanism that inhibits HIV from infecting cells Therefore, it is thought to advantageously interfere with CD4/Hrv interaction. By acting as a soluble virus receptor, soluble human CD4 protein can be used as an antiviral therapeutic agent to inhibit HrV binding to T4+ cells. Other methods that have been proposed to treat or prevent AIDS and ARC have focused on the development of antiretroviral agents that target the reverse transcriptase of HIV and thereby interfere with viral replication. For example, these substances include suramin, adi Contains dothymidine (AZT) and dideoxycytidine [H, Mitsuya et al., 3°-Azido-3'-Deoxyth7midine (BWA5 09U): An Antiviral Agent That Inhibits The 1infecti Vity And Cytopathic Effect Of Human T-Lymphotropic Virus Type111 /Lymphadenopathy-Associated Virus In Vttro-, Proc. Natl, Acad, Sci, USA, 82. pp, 7096-7 100 (1985); H, MUsuya and S, Broder S-Inhibition Of The In Vitro Infectivity And Cytopathic Effect Of Human T-LyI Ilphotropic Vi rus Type lit/Lymphadenopathy-Associated'/1rus (HTLV-III/L AV) By 2 °, 3'-Dideoxynucleosides-, Pro c, Natl, Acad, Scj, USA, 83. I) p, 1911-15 (1986); R, Yarchoan et al. -Administration of 3°-Azido-3'-Deoxythymidine, An Inhibit. rOf HTLV-111/LAY Replication, To Patients With AIDS. r AIDS-Related Complex-, Lancet, pp. 57 5-80 (1986)] Each of these substances is active against HIV in vitro. However, only AZT has been tested in well-designed, bracebo-controlled clinical trials. It has been shown to be clinically useful. Although an increasing number of patients are receiving AZT, they are only able to tolerate low doses of this drug. AZT Noa J Yarch. an et al., supra). Administration of effective amounts of AZT may also reduce symptoms such as granulocytopenia and anemia. with many undesirable and debilitating side effects. Therefore, long-term hematological toxicity has been an important factor limiting the use of A, Z T in the treatment of AIDS and ARC [D, D, Richman et al. - The Toxicity Of Azidothymidine (AZT ) In The Treatment Of Patients With AtDS And AIDS-Related Complex: A Double-Blind, Placebo-Controlled Trial”, N, En, J, M ed, 317. pp, 192-97 (1987)]. Other preventive methods Therapeutic methods are then based on substances that exhibit antiretroviral activity against processes of the viral replication circuit other than reverse transcription [PCT patent application W ○ 8710 3903]. Such methods include the use of plant alkaloids. castanospermi This includes the administration of gluco/dase inhibitors such as This inhibitor works by interfering with the normal processing of N-linked oligosaccharides on these glycoproteins. glycolylation of coat glycoproteins in HIVg-stained cells. Gluco/dase inhibitors are thought to result in a decrease in the expression of functional HIV tegumentary protein on the cell surface and inhibit the production of infectious virus particles. Ru. However, such antiretroviral agents cannot be administered as monotherapy. When administered, high doses can be toxic to cytoplasmic metabolism. Various types of vaccines also offer potential protection against HIV infection and/or [W, C. Goff, "Development and Testing of AIDS Vaccines, 5 science, 241. pp. 426-32 (1988]. Possible uses of anti-genotypic antibodies raised in anti-genotype antibodies are being investigated. For example, A.G. Dalgleish and R.C. Vaccine, 6, 1) Ill, 215-20 (1988); A. G. Dalgleish et al., “Therapeutic Strategies Against HIM Ba5 ed On the CD4 Molecule: Monoclon alAntibody Therapy, 5olable CD4 And Anti-1diotype Vaccines-, Fourth International Conference on AIDS. Noune 1988. Book 1. Abstract 3061; A, G, Dalgleish et al. - Neutralization of HIV l5olates By Anti-Idiotypic Antib. dies Which Mimic The T4 (CD4) Epitope: A Potential AIDS Vaccine-, Lancet, Nov, 7.1987. pp, 1047-50; T, C, Chanh et al. Virus-. Proc Natl, Acad, Sci, USA, 84. pp, 38 91-95 (1987) ; Q. J, 5attentau et al., -Antisera To Leu3a With Anti-1diotypicActivity React With g pHO/1300f HIV-I And LAV-2-, Th1rd Internatio nal Conference On AIDS, Stockholm, Sweden, June 1987. p, 160. Abstract act TH, 9, 4; and R, C, Kenr+edy et al., “Internal Image Anti-1diotypes Representative of Homobodies Mimic The CD4 Molecule An d Bind tTuman Immunodeficiency Virus-, Th1rd International Conference e ON AIDS, June 1987. p, 1.60. See Abstract TH, 9, 5. Despite these efforts, there is still a need for alternative immunotherapeutic agents, methods and strategies for the treatment and prevention of AIDS, ARC and HIV infections. The present invention provides amino acid variants and derivatives of human cD4 or fragments thereof that induce the production of antibodies that bind to HIV gp120 in humans. Solve the problem mentioned. Recombinant DNA molecules encoding such amino acid variants and derivatives are also provided. Also provided are single cell hosts transformed with these DNA molecules. Induced production by the amino acid mutants and derivatives of the present invention The generated anti-HIV gp120 antibody targets infected cells whose initial target is T4” lymphocytes. Diseases caused by quality, such as AIDS and ARC, which are HIV-related diseases. useful for detection, prevention and treatment in humans affected by this disease. The present invention includes the above-mentioned amino acid variants and derivatives in monovalent or polyvalent form. Diagnostic, prophylactic, and therapeutic compositions are also provided. This composition is useful for the detection, prevention, and treatment of human diseases such as the HIV disease AIDS and ARC caused by infectious agents whose initial target is T4+ lymphocytes. and treatment. The present invention uses non-human transgenic mammalian models to select for mutants and derivatives of human CD4 that are induced to produce antibodies in humans that bind to both HIV gp120, l:) and CD4. We also provide novel screening methods. Such mutants and derivatives may induce those antibodies. The first target is T4”!J lymphocytes, which are attracted by certain infectious agents. It is a therapeutic and prophylactic agent in humans for diseases such as AIDS and ARC, which are diseases associated with HIV. The screening method of the present invention includes the following steps. (1) A non-human transgenic or transgenic mammal expressing human CD4 or a fragment thereof is transformed into a mutant or derivative of human CD4. and (2) screening the serum of the immunized mammal for antibodies that bind to HIV gp120, antibodies that bind to human CD4, or both. The process of cleaning. Furthermore, the present invention provides a rational drag design system including the following steps. That is, (1) comparing the amino acid sequences of human CD4 and natural primate CD4 protein; (2) comparing the human CD4 amino acid sequence with amino acid sites that differ between human CD4 and natural primate 111fcD4 protein; and (3) testing the amino acid variant using the screening method of the present invention. The preferred natural primate sequences for mutant design are They are cynomolgus monkey CD4, rhesus monkey CD4, and chimpanzee CD4. A rational drug that induces the production of antibodies that bind to HrV gp120 in humans. These amino acid variants of human CD4 derived from the design method are suitable as the diagnostic, prophylactic and therapeutic proteins of the present invention. The present invention also provides seven rhesus monkey CD4, cynoscus CD4, and Also provided are monkey CD4, chimpanzee CD4 and soluble fragments thereof. Furthermore, DNA sequences encoding those proteins, including those DNA sequences, Also provided are recombinant DNA molecules, and single cell hosts transformed with those molecules. Figures LA to IC (Figure 1) are schematic diagrams of the construction of the cynomolgus monkey CD4 subclonals pSQ131, pSQ134, and psQ136. FIG. 2 shows the DNA sequence of the synthetic polylinker of the pNN12 /-Ken/Fugu vector. Figure 3 shows the DNA and amino acid sequence of the human cD4o-7DC213-5 to +7) 406 bp N COr /LLJLM r fragment. FIG. 4 shows psQ131. psQ134, and the hybrid nucleotide sequence of the full-length cynomolgus monkey CD4 protein obtained from pSQ1 36. The sequence and deduced amino acid sequence are shown. The translation initiation codon is located at methionine (A A-2s) at nucleotide positions 171-173, and the mature N-terminus is located at lysine (A A + ) at nucleotide positions 246-248. Signa The sequence cleavage site is indicated by an arrow. In FIG. 4, the amino acid sequence of soluble cynomolgus monkey CD4 protein appears between AA-25 and AA3vs. The signal sequence cleavage site is indicated by an arrow. Figure 5 shows that the soluble cynomolgus CD4 protein has a similarity of 94.250% and an identity of 91.250% to the soluble human CD4 protein (AA-25-AA3TS). Different amino acids are marked with an asterisk. Ru. The signal sequence cleavage site is indicated by an arrow. In Figure 5 and subsequent figures showing only amino acid sequences, amino acids are designated by single letter codes as follows: P Thr: TAla: A Tyr: Y H4s: HGin: QAsn: N Lys: K Asp: D Glu: ECys: CTrp: W Arg: RGly: G Oligonucleotide primers used for cloning soluble rhesus CD4 protein and soluble chimpanzee CD4 protein are shown. plastic All imers were selected from regions with 100% nucleotide homology between the human CD4 protein and the cynomolgus monkey CD49 protein. Figure 6 shows the crabeater in Figure 4. The position of each primer in the nucleotide sequence of monkey CD4 protein is described. Figure 7 shows the DNA sequence of the synthetic polyrin f2- of the sequencing vector pNNO8. Showing columns. Figure 8 shows the nucleus of the rhesus CD4 protein insert of subclone psQ146. The leotide sequence and deduced amino acid sequence are shown. Figure 9 shows the DNA sequence of the synthetic polylinker of the immunosing vector pNN11. Figure 1O shows the nucleus of the rhesus CD4 protein insert of subclone psQ162. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown. Figure 11 shows a schematic diagram of the construction of pDGloo. pDGloo is Akage Chimeric monkey (5゛) and human (3゛) soluble CD4 proteins were expressed in mammals. It is a vector that makes it appear. Figure 12 is a diagram of the mammalian expression vector pBG341. Figure 13 shows the nucleotide and deduced amino acid sequences of the CD4 DNA insert of pDGloo. Figure 14 shows pBG341., a mammalian expression vector for soluble rhesus CD4 protein. FIG. 2 is a schematic diagram of the construction of rhT4. Figure 15 shows pBG341. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the rhT4-derived soluble rhesus CD4 protein (AA-25AA3v5) are shown. Ru. The translation initiation codon is located at methionine (A A -25) at nucleotide positions 170-172, and the mature N-terminus is located at lysine (A A+) at nucleotide positions 245-247. Figure 16 shows that soluble rhesus CD4 protein is soluble cynomolgus monkey CD4 protein. It shows that it has a degree of similarity of 99.750% and a degree of identity of 99.500% to the 400 amino acids of protein. Different amino acids are indicated by asterisks. The signal sequence cleavage site is indicated by an arrow. Figure 17 shows that soluble human CD4 protein is converted to soluble rhesus monkey CD4 protein. On the other hand, it shows that the degree of similarity is 94.254% and the degree of identity is 91.272%. Ru. Different amino acids are indicated by asterisks. The /gnal sequence cleavage site is indicated by an arrow. Figures 18A-18B (Figure 18) show the mammalian origin of soluble 7 rhesus CD4 protein. The current vector is pBG341J. D, Schematic diagram of the construction of rhT4. FIG. 19 is a photograph of a 5DS-PAGE gel stained with Kooman Blue, depicting purified soluble γ rhesus CD4 protein expressed in CHO cells transformed with pBG3 41JOD, rhT4. Figure 20 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of soluble chimpanzee CD4 protein (AA-25-AA376) derived from clone psQ205. The translation initiation codon is located at the methionine (AA-2s) site at nucleotide positions 96-98, and the mature N-terminus is located at the lysine (AA+) site at nucleotide positions 171-173. , phosphorus psQ20Q (soluble chimpanzee CD4 The nucleotide and deduced amino acid sequences of the proteins (AA-25 to AA3va) are shown. The translation start codon is the methionine nucleotide at positions 96-98. (A A -25) t: place! The mature N-terminus is the nucleotide at positions 171-173. It is located at lysine (A A 1) of Tido. Figure 22 shows that 1294 nucleotides of the soluble chimpanzee CD4 protein derived from clono psQ200 are identical to those of the soluble chimpanzee CD4 protein derived from the corresponding clone psQ205. It differs from nucleotide 1294 of Pansy CD4 protein in the following four positions. It shows that namely, nucleotide position 265, nucleotide position 1007, nucleotide position 1271, and nucleotide position 1293. this These sites are marked with an asterisk. Figure 23 shows soluble tin derived from Ria-7pSQ200 (AA-25AAa7a). The results show that the 399 amino acids of pansy CD4 protein have 99.749% similarity and 99.749% identity to the 399 amino acids of soluble chimpanzee CD4 protein from the corresponding clone ps0205. There is. different Amino acids that have been changed are indicated by an asterisk. The signal sequence cleavage site is indicated by an arrow. It is. Figure 24 shows that the 399 amino acids of the soluble chimpanzee CD4 protein derived from KronopSQ200 (AA-25AA3?J) are compatible with the soluble human CD4 protein. Protein (AA-25-AA37a) (D for 399 amino acids, 99.248% F) similarity and 98.997% identity. different The amino acids that were used are indicated by an asterisk. The signal sequence cleavage site is indicated by an arrow. Figure 25 shows the human 1-CD2 genomic and cDNA fragments subcloned into the vector Bluescript KS. Figure 26 shows the human CD2 3'-flanking DNA fragment subcloned into the vector poly 111-1. Figure 27 shows the construction of the vector PATY,6 containing the full-length CD4 protein DNA sequence. Figure 28 shows the nucleotide and deduced amino acid sequences of the full-length soluble human CD4 protein sequence (AA-2 s-AAa33) in PATY, 6. translation The translation initiation codon is located at nucleotide positions 184-186, methionine (AA-25), the mature N-terminus is located at nucleotide positions 259-261, lysine (AAl), and the last amino acid of the protein is , located at nucleotide positions 1555-1557 inleucine (A At33). Figure 29 shows the construction of the human CD4h transgene. Figure 301L is a FAC3 analysis graphically depicting the expression of human CD4 protein in thymocytes and lung cells of human CD4 transgenic mice (Tg) and non-transgenic mice (NTg). The X-axis shows the logarithm of fluorescence intensity. The Y-axis shows relative cell numbers (linear scale). Figure 31 shows CD4 transgenic (Tg) mice and non-transgenic mice. The graph shows the anti-human recombinant soluble CD4 protein (rsCD4 or rsT4) antibody titer induced by immunizing human rSCD in NTg mice. Figure 32 shows immunofluorescence staining of human CD4-bearing cells with serum from human CD41-transgenic (Tg) and non-transgenic (NTg) mice. The results of coloring are shown in a graph. Mice immunized with human rsCD4 (da Staining was performed with serum from both mice (dotted line) and non-immunized mice (negative control) (dotted line). Solid lines represent staining with fluorescently labeled secondary antibody alone. The graph plots cell number relative to the logarithm of fluorescence intensity. Figure 33 shows transgenic cells, both immunized with rhesus rsCD4. Figure 2 graphically depicts anti-rhesus rs CD4 and anti-human rs CD4 antibody titers from transgenic (Tg) and non-transgenic (NTg) mice. Figure 34 shows rhesus macaque, human, and activated human blood Zomba cells as follows: The graph shows the results of immunofluorescence staining for human Leu3a (1) Human Leu3a mono Clonal antibody (upper dotted line, positive control); (2) second step reagent only (upper solid line, negative control); (3) anti-rhesus rsCD4 transgenic mouse serum (middle dotted line); (4) anti-rhesus monkey r S CD4 non-t Serum from transgenic mice (lower dotted line); and (5) serum from non-transgenic mice immunized with irrelevant antigen (middle and lower solid line negative controls). The graph shows relative cell number versus logarithm of fluorescence intensity. Figure 35 graphically depicts the HIV gp120Pi binding activity of serum from transgenic (Tg) and non-transgenic (NTg) mice, both immunized with rhesus CD4. Data are plots of absorbance versus serum dilution. Figure 36 shows two transgenic animals, both immunized with rhesus rsCD4. Human rsCD4 binding activity (left panel) and HIV gp120 binding in transgenic (Tg) mice (line 313) (filled circles and filled squares) and two non-transgenic, transgenic (NTg) mice (open circles and open squares). Graph the apparent rate of activity (figure on the right). It is shown in f. The triangles represent two negative controls immunized with an unrelated antigen. Lumousteal. Data are plotted of antibody titers versus days post-immunization. Ru. Figure 37 shows transgenic (hot bars) and non-transgenic (white bars) gp120 binding affinity of serum from rhesus monkey rs CD4-immunized mice. The percentage of anti-gp120 binding activity (left panel) and anti-human rsCD4 binding activity of serum fractions separated by chromatography is shown graphically. Figure 38 shows transgenic mice injected with rhesus rS CD4 and Figure 3 shows the titer of anti-gp120 1gG antibody versus control mice. Figure 39 graphically shows the results of immunofluorescence staining of transformed C)(O) cells expressing recombinant gp160 or LFA-3 on their surface. Do it with the substance below. Two negative control reagents (A); gp120 specific mono Sera from human CD4 transgenic/bear mice immunized with clonal antibodies (B, C and D); Human CD4) Lancegeny bear administered with HIV gl) 120 in saline serum from human CD4 transgenic mice (blood ac) immunized with rhesus monkey rsCD4 and subsequent administration of HIV gp120 in saline (E and F). As used herein, the term rcD4J refers to any CD4 protein encoded by the natural CD4 gene. The term "amino acid variant" or "variant" of human CD4 herein refers to a polypeptide whose amino acid sequence differs from human CD4 at one or more sites. Putido, or a fragment thereof. Such amino acid variants may be produced synthetically or, for example, by mutagenesis of the human cD4 gene or variants thereof. produced by recombinant DNA technology. Such methods are known in the art. As used herein, the term "derivative" of human CD4 refers to human CD4 or human CD4 that has been covalently modified, e.g. with nonitrophenol, to serve as an immunogen in humans. A fragment of The derivatives of the present invention also include derivatives of the amino acid variants of the present invention. Derivatives also include fragments of human CD4. As used herein, the term "immunotherapeutically effective amount of an amino acid variant or derivative of human CD4 or a fragment thereof" refers to an amount that induces sufficient titers of anti-HIV g p120 antibodies to treat or prevent HrV infection. The amount of one or more immunogenic CD4 proteins of the invention is determined. By following the screening methods of the invention described below, one skilled in the art can determine, without undue experimentation, that individual mutants or derivatives are suitable for the diagnosis of HrV infection in humans. It can be seen that it is possible to determine whether or not it is useful for diagnosis, prevention, or treatment. Additionally, the rational drug design system described below allows those skilled in the art to avoid undue experimentation. However, by the screening method of the present invention, antibodies that bind to HIV gp120 and/or human CD4 are induced to be produced in humans, thereby determining which mutants and derivatives are most preferable. The mutants and derivatives of the present invention are those that induce the production of anti-HyV gp120 antibodies. Such variants and X-conductors are herein referred to as "immunogenic CD4 proteins". It is said to be "Pak quality". Suitable variants to be tested in the screening method of the present invention have one or more amino acid differences from human CD4 between regions approximately corresponding to amino acid positions 1 to 375 (i.e., in the CD4 extracellular region). have. Other suitable variants and derivatives are those corresponding to soluble fragments of human CD4 that are capable of binding HIV gp120. Such preferred variants and derivatives include those approximately corresponding to human CD4 AAI-AA3vs, AAI-AA+ss% AAl-AAI+3 as shown in FIG. Alternatively, suitable variants and derivatives may be found in PCT patent application AA3-AA37? , AA3-AA182, and those substantially corresponding to AA 3 A At's. Littman, Ce11.55. Reference should also be made to p. 541 (1988). This document was published after the filing date of PCT/US88102940 and describes the correct/gnal sequence cleavage site for human pre-CD4. Suitable amino acid variants include naturally occurring amino acid variants. That is, it is CD4 or a fragment thereof derived from a non-human complemented mammal, preferably a non-human primate. Most preferably, the variants tested in the screening assays of the invention are Geza CD4, cynomolgus CD4, chimpanzee CD4, and their soluble selected from the group consisting of sexual fragments. Rhesus soluble CD4 (AAt-AA 375 in Figure 15) is particularly preferred. Immunogenic CD4 proteins of the invention also include polymeric forms of human CD4 and variants and derivatives of fragments thereof. For example, these polymer types include avidin/biotin, glutaraldehyde, or cross-linked with a cross-linking agent such as dimethyl suberimidate. It includes variants and/or derivatives of the above. Such polymer types are recombinant There are two types of mRNA produced from multicistronic mRNA produced by DNA technology It encompasses polypeptides containing adjacent immunogenic CD4 sequences in or in more permutations or in opposite orientations. While not wishing to be bound by theory, Applicants believe that the immunogenic CD4 proteins of the present invention We believe that protein is both preventive and therapeutic. This is because they induce a “second wave” of antibodies in humans, which in turn bind to HIV gp120. This is to induce the production of a "second wave" of genetic antibodies in immunized humans. The rational drug design system of the present invention includes the following steps: (1) comparing the amino acid sequences of human 1-CD4 and primate CD4 proteins; (2) comparing the amino acid sequences of human 1-CD4 and human 1-CD4; (3) testing the amino acid variants in the screening methods described hereinafter. If Preferred primate CD4 proteins used in the first step of the rational drug design system Cynomolgus monkey CD4. Includes rhesus CD4, and chimpanzee CD4. A preferred screening method of the present invention includes the following steps. (1) A step of immunizing a transgenic or non-human mammal expressing human CD4 or a fragment thereof with a mutant or derivative of human cD4 or a fragment thereof, and (2) Regarding an antibody that binds to HrV gp120. , the serum of the immunized mammal is This is a cleaning process. Other screening methods of the present invention include the following steps: Contains. (1) Mutants or derivatives of human CD4 or fragments thereof, including human CD4 or transgenics expressing human CD4 or fragments thereof. and (2) screening the serum of the immunized mammal for antibodies that bind to human CD4. In yet another screening method of the invention, serum from an immunized mammal is screened for both antibodies that bind human CD4 and antibodies that bind HIV gp120. Serve for leaning. Natural amino acid variants are transgenic animals other than the mammal from which the variant is derived. Please note that the drug must be tested in mammals. In the screening method of the present invention, any transducer expressing human CD4 can be used. Although transgenic non-human mammals are useful, transgenic mice are preferred. stomach. A DNA sequence encoding full-length human CD4 or a fragment of human CD4 that binds to HrV gp120 (e.g., AA-26-AA 375 of CD4). DNA sequences encoding transgenic mammals are useful in creating transgenic mammals for use in the screening process of the present invention. Figure 28 full length h) CD4 layout Columns are preferred. Alternatively, any full-length CD4 sequence described in PCT patent application PCT/US88102940, supra, may be used. Additionally, genomic DNA encoding human CD4 can be isolated by standard methods and used to generate transgenic mammals of the invention. Synthetic RNA encoding human CD4 may be used. The DNA encoding human CD4 or a fragment thereof is operably linked at both ends to non-coding expression control sequences prior to integration into the genome of a mammal by transformation. must be 5-Non-coding DNA sequences are unique to the particular transgene utilized. Transcriptional and translational regulatory elements including promoters that function in nicked mammals should include 3-Non-coding DNA sequences are unique to the particular transgene utilized. Transcriptional and translational regulatory elements containing Bo'JA addition moieties that function in nicked mammals. element should be included. Preferably, the 5° and 3° expression control sequences are specific for cells derived from the bone marrow of nongenic mammals. transgenic Another lymphocyte-specific enhancer that functions in mammals is human CD4. or fragments thereof. 5- and 3°-non-coding DNA can normally be derived from sequences adjacent to the DNA encoding human CD4 (particularly in genomic DNA is the origin of the human CD4 gene (when used as a fee). Alternatively, these regulatory elements may be located next to other genes. It can be derived from adjacent 5- and 3°-noncoding DNA regions. For example, that The viral region can be derived from viruses such as adenovirus, lampapillomavirus, simian virus 40, or cytomegalovirus. These sequences bind to highly expressed genes, and these sequences However, the 5' and 3° regulatory sequences are preferably linked to highly expressed genes in the transgenic mammal. stomach. Most preferably, highly expressed genes that are specifically expressed in bone marrow-derived cells are used. For example, these most preferred regulatory sequences may be derived from those adjacent to the structural genes of CD2, CD4, CD3, lymphocyte tyrosine kinase, MHC class I and II, interleukin-2, or interleukin-2 receptor. Sequences flanking the CD2 structural gene are particularly preferred. The human CD4 gene or fragment thereof and the desired 5'- and 3-non-food sequences. Transformative integration of the strain into mice is readily accomplished by known methods. example B. Hogan et al., "Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual", C. ld Spring Harbor Laboratory (1986). Light. Those skilled in the art will know without undue experimentation that mice expressing human 1-CD4 Applying these known methods to produce non-human (non-human) transgenic mammals other than transgenic I can respond. Immunization of transgenic mammals with human CD4 variants or derivatives can be performed using standard methods. Preferably, the variant or derivative is complete or is administered with adiniband, such as Incomplete 70 Indoadjuvant. The initial injection is preferably about 2 to 4 mg of the variant or derivative per kg of body weight of the transgenic mammal. Typically, the transgenic mammal is reinjected with about 2 to 4 mg of the variant or derivative per kg of body weight of the transgenic mammal for enrichment one day out of 35 to 40 days after the initial injection. Immunized transgenic mammals are bled weekly, and serum from each blood sample is tested for antibodies that bind to HIV gp120, human CD4, or both. assayed. The presence of HiI-CD4 binding antibodies can be detected using any method that specifically detects binding of native transmembrane funfomesicon to human CD4. Preferably, binding to human peripheral blood lymphocytes is used to detect antibodies that bind to human CD4. I can stay. Human peripheral blood lymphocytes (PBL) are isolated by standard methods. According to a preferred procedure, aliquots of human PBL (approximately 5 x 105 to 1 Incubation in infant serum (FCS) (10.02% sodium azide) into which serum from the immunized transgenic mammal is placed at a 10- to 100-fold dilution. As a negative control, another aliquot of human PBL The cells are incubated with control serum from a conspecific mammal that has been "mock-immunized" with adjuvant only (without the human CD4 variant or derivative) in a similar manner as the transgenic mammal. An alternative control serum is the pre-immune transfected serum. Serum from nicked mammals, non-immune mammals of the same species as the transgenic mammals Included are serum from analogous animals and Ig fractions from homologous commercially available transgenic mammals. Next 1. Each aliquot of mPBL is washed three times with 11111 buffer (PBS/2% FC310,02% sodium azide). Each aliquot of washed human PBL is incubated with a fluorescently conjugated antibody specific for the immunoglobulin of the transgenic mammal (approximately 10 to 20 μg per 1 ml of wash buffer iff) for approximately 30 minutes at 4°C. For example, when testing serum from transgenic mice, goat anti-mouse Ig conjugated to FTC can be used. Such fluorescent-conjugated antibodies are commercially available, but they can also be produced by known methods. Ru. Cells were then washed twice as described above and fluorescently washed using conventional methods. Analyzed using a photoactivated cell sorter (FA, CS). See generally H, M, 5 hapiro, 肚 and Tanita E mLj±1 frog H1 Alan R, Li5s, Inc., New York, New York (1985). The FAC5 instrument creates a histogram showing the relative number of cells (y-axis) with a particular fluorescence intensity (x-axis). human PBL inoculated with control serum. Such a histogram for contrast shows an approximately normal distribution centered on relatively low fluorescence intensities due to non-specific binding and macrofluorescence. PBLs incubated with serum of transformants containing antibodies that bind human CD4 show a non-specific "control" fluorescence distribution, further showing an approximately normal distribution of cells concentrated at higher fluorescence intensities. The presence of this second, more strongly fluorescent cell population indicates that transfection into human CD4 Evidence of specific binding of antibodies in serum from nicked mammals. The presence of antibodies that bind to HIV gp120 in the serum of immunized transgenic mammals can be determined by standard methods such as EL, ISA, Radioimmunoa, Sei, etc. can be detected using a method. The gp120 used in these assays is sensitive to HIV. infected cells, HIV itself, and host cells transformed with the HIV gp120 gene. cells, or isolated gp120. Preferably, the HIV gp120 is obtained from a single cell host transformed with the HIV gp120 gene. It will be done. Such transformed cells are described, for example, in Lakey et al., -Neutralization Of The AIDS Retrovirus By Antibodies To A Recombinant Envelope Glycoprotein-, 5science , 233. pp. 209-12 (1986). Additionally, HIV gp120 is commercially available. According to a preferred procedure, antibodies that bind to HIV gp120 are detected as follows. It will be done. Microtiter plates (96 wells each) are coated with 5 μg/ml purified HrV gp12 0 (50 μl/well) in PBS for about 2 hours at about 37° C. or overnight at about 4° C. No difference was observed between 2 hours at 37°C and overnight coating at 4°C). The plates are washed and then blocked with PBS/1% bovine serum albumin (BSA) 10.01% Tween-2070, 05% NaN3 for approximately 1 hour at room temperature. Add serum or a diluted mouse monoclonal antibody specific for HrV-1 gp120 to each well (50 μl/well) and incubate the plate at about 37° C. for about 2 hours. Serum dilutions are made in PBS/1% B5A 10.01% Tveen-201 0.05% (7) NaN3T. The plate is then a+ in PBSlo, 01% Tween-2010, 05% NaN3. alkaline phosphater Ze-conjugated goat anti? 7s rgG (Fc-specific) antibody at a final dilution of l:1.ooo in PBS/1% B5A10.01% Ween-2010, 05% NaN5. to each well and incubate the plate at approximately 37°C for approximately 2 hours. Betshita. The plates were washed once again and the substrate 4-nitrophenylphosphate (PNPP) (10 mg/m+ in 0.1 M glycino/1 mM ZnCl2/1 mM MgCl2-6820, pH 10.6) was added. added. Read the absorbance at 40 5 nm. Results are expressed as the reciprocal of the dilution giving 50% binding relative to the standard control antibody. The present invention also provides for the first time DNA sequences encoding cynomolgus monkey CD4, rhesus monkey CD4, chimpanzee CD4, and fragments thereof. These sequences encode immunogenic CD4 proteins useful in the compositions of the invention. preferred Immunogenic CD4 proteins are soluble forms of rhesus CD4, cynomolgus CD4 and chimpanzee CD4, such as AA IAA 376. soluble Most preferred is the male rhesus CD4 protein. DNA sequences encoding the immunogenic protein CD4 protein of the invention, parts thereof, or synthetic or semi-synthetic copies thereof can be obtained from g%l cDNA libraries or genomic DNA libraries from other animals. It is useful as a screening probe to isolate the CD4 gene from its source. For example, the soluble chimpanzee CD4 protein disclosed herein The DNA sequence encoding the soluble and soluble rhesus CD4 protein is Screening of human and rhesus macaque genomic DNA or cDNA libraries. can be used to select full-length CD4 genes from their source. DNA sequences encoding the immunogenic CD4 proteins of the invention, portions thereof, or synthetic or semi-synthetic copies thereof may also be used with other amino acid variants or derivatives. It is also useful as a starting material for preparing conductors. Such amino acid variants can be prepared by standard methods such as site-directed mutagenesis. It should also be understood that the DNA sequences of the present invention can be used to create DNA molecules with altered mutations, although the amino acid sequence remains the same. Preferred DNA sequences encoding the immunogenic CD4 protein of the present invention are as follows: selected from the group consisting of: (a) DNA inserts of pSQ136, psQ134, psQl 3 1, pSQ146, psQ162, pBG341JOD, rhT4, pSQ20 0S psQ205, and pDGloo; (b) approximately 20°C to 27°C below T11; Hybridize with one or more of the DNA inserts described above under conditions corresponding to low temperature and 1M sodium chloride. and (c) a DNA sequence that changes to any of the aforementioned DNA sequences, preferably excluding mouse, rat, rabbit, and sheep CD4 sequences. Preferably, the DNA sequence encoding the immunogenic CD4 protein of the invention is and a polypeptide selected from the group consisting of: Polypeptide of formula A A IA A a33 in Figure 4 (cynomolgus monkey), formula AA+-AA3 in Figure 4? S polypeptide (cynomolgus monkey), polypeptide of formula AA1-AA3?5 in Figure 15 (rhesus monkey), polypeptide of formula AA+-AA3v4 (pSQ200) in Figure 23 (chimpanzee), polype of formula AA, -AA37s (pSQ205) in Figure 23 (chimpanzee), a polypeptide of formula AAI-AAIII in FIG. 15 (rhesus macaque), polypeptide of the formula AAI AA+81 (pSQ200) of FIG. 23 (chimpanzee), polypeptide of the formula AA+-AA+5s (psQ205) of FIG. 23 (chimpanzee), g), and any part of the foregoing. The DNA sequence encoding the most preferred amino acid variant of the invention is selected from the group consisting of: (a) pBG341JOD, rhT4 DNA insert; (b) a temperature about 20°C to 27°C below rn. , and a DNA sequence that hybridizes with the aforementioned DNA insert under conditions corresponding to 1M sodium chloride, preferably excluding mouse, rat, rabbit and sheep CD4 sequences; and (c) a DNA sequence that changes into any of the aforementioned DNA sequences. As used herein, the term "soluble CD4 protein" is a CD4 protein that does not have the ability to anchor itself in a membrane. Such soluble CD4 proteins include, for example, CD4 proteins lacking both the cytoplasmic domain and a sufficient portion of the transmembrane domain to anchor the protein in membranes. Alternatively, such soluble CD4 proteins include CD4 proteins that retain all or part of the cytoplasmic domain but lack a functional transmembrane domain. DNA encoding immunogenic CD4 protein, which is a soluble CD4 protein, can be produced by truncation. More specifically, such soluble CD4 tan Proteins can be prepared in a conventional manner as follows. That is, oligonucleotides DNA encoding the full length of CD4 can be "chewbacked" using code-directed mutagenesis, restriction enzyme cleavage followed by linker insertion, exonucleases, or oligonucleotide-specific polymerase chain reaction. Alternatively, soluble immunogenic CD4 protein can be chemically synthesized by conventional peptide synthesis methods such as solid phase synthesis (R, B, Merrifield, -5 solid Phase Peptide 5 synthesis, 1. The 5-ynthesis of A Tetrapeptid e-, J. Arrr, C. 83. pp. 2149-54 (1963)). They are also prepared by proteolytic cleavage of the full-length immunogenic CD4 protein. The DNA sequences of the invention can be expressed in a single cell host to produce the immunogenic CD4 protein encoded by them. To obtain high-level expression of a gene, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that are functional in the chosen expression host.The expression control sequences and the gene of interest are Preferably, the expression vector further contains a selectable marker and an origin of replication. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further contain an expression marker useful in the expression host. The DNA sequence encoding the immunogenic CD4 protein may or may not encode a signal sequence. If the expression host is a prokaryotic cell, it is generally more likely that the DNA sequence does not encode a signal sequence. Preferable.If expression inn When the host is a eukaryotic cell, it is generally preferred that a signal sequence is encoded. Yes. The amino-terminal methionine may or may not be present in the expressed CD4 proteins of the invention. If the terminal methionine is not cleaved by the expression host, If desired, it can be removed chemically by standard methods. A variety of expression host/vector combinations may be used to express the DNA sequences of the invention. Expression vectors useful for eukaryotic hosts include, for example, vectors containing expression control sequences from SV40, bovine papillomavirus, azone virus, and cytomegalovirus. Expression vectors useful for bacterial hosts include known bacterial proteins. Includes lasmids. For example, broad host plasmids such as E. coli [9] plasmids, HPA, including CotEIS pcRl, pBR322, pME 9, and derivatives thereof; many lambda plasmids such as NM989; M13, and other DNA phages such as M13, and filamentous-stranded DNA phages. Expression vectors useful for yeast cells include the 2μ plasmid and variants thereof. Vectors useful for insect cells include pVL941. Additionally, any of a wide variety of expression control sequences (sequences that, when operably linked to a DNA sequence, control its expression) can be used in these vectors to express the DNA sequences of the invention. Such useful expression control sequences include the expression control sequences described above. Expression control sequences associated with the structural genes of the current vector are included. Examples of useful expression control sequences include the following. For example, the early and late promoters of SV40 or Azone virus, the 2l and system, the 22 and system, the 1rindan or TRC system, the main operator and promoter region of lambda phage,

【ｄコートタンパク質の制御領域、３−フォスフォグ リセレートキナーゼあるい他の解糖系酵素に対するプロモーター、Ｐｈｏ５のよ うな酸性フォスファターゼのプロモーター、酵母α接合系のプロモーター、およ び原核あるいは真核細胞またはそれらのウィルスおよびそれらのウィルスの組合 せの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列である。 様々な単一細胞宿主細胞が、本発明のＤＮＡ配列を発現させのに有用である。こ れらの宿主は、良く知られている真核宿主および原核宿主を包含する。例えば、 Ｅ、ｃｏｌｉ、　Ｐｓｅｕｄｏ□０工、Ｂａｃｉｌｔｕｓ、江匹匹ど三笠、菌類 、酵母細胞、の株、塗封肚肛り葺ユ旦二立（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＨＯ およびマウス細胞のような動物細胞、Ｃ０３Ｉ、ＣＯ３７、Ｂ５Ｃ１、Ｂ５Ｃ４ ０およびＢＭＴＩＯのようなアフリカミドリザル細胞、およびヒト細胞、および 組織培養での植物細胞である。動物細胞での発現に対しては、我々はＣＨＯ細胞 およびＣＯ３７細胞を用いる。 全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに等し くよく機能するとは限らないことは、もちろん理解されなければならない。さら に、全ての宿主が同じ発現系で等しくよく機能するとは限らない。しかしながら 、当業者は過度の実験をすることなしに、そして本発明の範囲からそれることな しに、これらのベクター、発現制御配列、および宿主の中から選択をなし得る。 例えば、ベクターをその中で複製しなければならないため、ベクターを選択する ときには、宿主も考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数 を制御する能力、および抗生物質マーカーのようなベクターにコードされた池の タンノイク質の発現もまた考慮しなければならない。 発現制御配列の選択において、様々な要因もまた考慮しなければならない。例え ば、その配列の相対的強度、その制御能力、および特に可能な２次構造を考慮し て、本発明ＤＮＡ配列との適合性、が包含される。単一細胞宿主は、選ばれたベ クターとの適合性の検討、本発明のＤＮＡ配列にコードされる生産物の毒性、そ れらの分泌特性、正確に免疫ＣＤ４タンパク質を折りたたむ能力、それらの発酵 上または培養上の要求、および本発明のＤ　Ｎ　Ａ配列によりコードされた産生 物の宿主からの精製のし易さ、により選択しなければならない。 これらのパラメーター内で、当業者は様々なベクター／発現制御配列／宿主の組 合せを選択し得る。この組合せは、例えばＣＨ○細胞あるいはＣＯ３７細胞のよ うな、発酵あるいは大規模な動物培養で、本発明のＤＮＡ配列を発現させる。 本発明のＤＮＡ配列にコードされた免疫原性ＣＤ４タン７　ＸＩり質は、発酵あ るいは細胞培養から単離され得、様々な従来の方法のいづれかを用いて精製され 得る。当業者は、本発明の範囲から外れることなしに、最も適切な単離および精 製方法を選択し得る。実質的に純粋な可溶性アカゲザルＣＤ４タンパク質は、下 記により提供される。 本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質は、最初の標的がＴ４゛す７３球である感染 物質により引き起こされた疾患を、予防し処置しそして診断するための、予防用 、処置用、および診断用の組成物として有用である。そのような疾轡には、Ａｌ ＤＳ、ＡＲＣｌおよびＨＩＶ％染が包含される。 本発明の好ましい薬学的な組成物は、免疫原性ＣＤ４タンパク質として、カニク イサルＣＤ４、アカゲザルＣＤ４、チノバンジーＣＤ４、あるいは前述のいづれ かの可溶性断片の１つあるいはそれ以上を含む。免疫原性ＣＤ４タンノ〈り質と して、可溶性アカゲザルＣＤ４タノ／　Ｎ＜り質（特にＡＡＩ−ＡＡ３７５）を 含有する薬学的組成物が最も好ましい。 本発明の薬学的組成物は、ＡＩＤＳ、ＡＲＣおよびＨｒＶ感染の予防、および処 置のためにさらに別の治療剤を含有する。例えば、免疫原性ＣＤ４タンパク質を 、ＡＺＴ、ＨＰＡ−２３、フォスフオノフオるメート、スラミン、リノぐビリン およびジデオキシ／チジンのような、逆転写酵素をプロ６．りする抗レトロウイ ルス物質、あるいはＨＩＶプロテアーゼを阻害する物質、と組み合わせて用い得 る。さらに本発明の薬学的組成物は、αインターフェロン、βインターフェロン およびγインターフェロンを含むインターフェロンのような抗ウイルス物質、あ るいはカスタノスベルミノのようなグルコ／ダーゼ阻害剤、をさらに包含し得る 。さらに、１あるいはそれ以上の免疫原性ＣＤ４タンパク質を、２つあるいはそ れ以上の前記治療用物質との組み合わせで用い得る。そのような複合療法は、低 用量の投与治療物質を有利に用い、その結果様々な単一治療で起こり得る細胞障 害を防ぐ。 本発明の薬学的組成物は、免疫原性ＣＤ４タンノくり質、あるいはそれらのポリ マー型（あるいは複数のポリマー型）を１つあるいはそれ以上を免疫療法的に効 果的な量で、および好ましくは薬学的に許容できるキャリアー、を含む。 本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば錠剤、丸剤、粉 末、液体溶液、分散あるいは懸濁液、リポソーム、坐剤、注射および注入溶液の ような、固体、半固体、および液体の投与形態が包含される。好ましい形態は、 意図する投与、および治療用の様式に依存する。 本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質は、それが投与されたヒト中で抗ＨＴＶ−ｇ ｐ１２０抗体を誘起産生ずるために、予防的および／あるいは治療的であるとい う我々の考えに基づくと、本発明の好ましい薬学的組成物は、ヒトの免疫に用い る他のタンパク質およびポリペプチドと類似である。従って、本発明の組成物は 、好ましくは不完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウム、ムラミル化 ペプチド′、油中水エマルノヨ／、あるいはＩ　Ｓ　ＣＯＭのような薬学的に許 容できるアジュバントを包含する。投与の好ましい様式は、筋肉内、皮内あるい は皮下経由である。最も好ましくは、その組成物はアジュバントとして油中水エ マルジョンあるいは水酸化アルミニウムを含み、筋肉内に投与される。 本発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質（あるいは複数の免疫原性ＣＤ４タンパク質 ）の免疫療法的に効果的な量はとりわけ免疫スケジュール感作の計画、投与した 特定の免疫原性ＣＤ４タンパク質（あるいは複数の免疫原性ＣＤ４タンパク質） の相対的免疫原性、用いた任意のアジユバノドの活性、免疫原性ＣＤ４タ／バク 質（あるいは複数の免疫原性ＣＤ４タンパク質）が他の治療物質と組み合わされ て投与されているかどうか、およびその被験体の免疫状態、に依存することは、 当業者には明かである。 ＨＩＶ感染、ＡＲＣあるいはＡＩＤＳの処置のだめの単独治療における、免疫治 療的に効果的な量および免疫スケジュールは次のようである：′ｆｔＬ験体１人 当り約０．０１から１０゜０ｍｇで、好ましくは０．１から１．０ｍｇの、免疫 原性ＣＤ４タンパク質の最初の注入（アジュバントを伴う）、引き続いて被験体 １人当り約０．００１から１．Ｏｍｇで、好ましくは０．０１から０．１ｍｇの 、免疫原性ＣＤ４タンパク質の何回かの追加免疫（アジュバントを伴う）。好ま しくは、追加免疫は最初の注入後４週間の間、あるいはＨＩＶ　ｇＱ１２０と結 合する抗体が検出されるまではｌｉ４開に約１回、次に６ケ月間、あるいは臨床 的または実験的に改善の兆しが明かとなるまでは、１ケ月に１回行う。しかしな がら、より低いあるいはより高い投与量、および他の免疫スケジュールを採用し 得ることも認識されなければならない。 ＨＩＶ感染、ＡＲＣあるいはＡＩＤＳの予防のためには、上述した処置方法が用 いられる。しかしながら好ましくは追加免疫の注入は、最初の注入から約１およ び６ケ月後に行い、次に２〜５年毎に追加免疫が行われる。 免疫原性ＣＤ４タンパク質の多価のおよび／あるいは誘導体化した重曹は、それ らがより免疫原性である場合は、より低い投与量で効果的であることが必要とさ れ得る。 サルあるいはチンパンジーＣＤ４タンパク質あるいはその断片である本発明の免 疫原性ＣＤ４タノバク質はまた、現性モノクローナル抗体あるいはポリクローナ ル抗体に基づいているＳｒｖアッセイ系の感度を増大するのにも用いられ得る。 より詳細には、本発明の可溶性サルＣＤ４あるいは可溶性チンバフジ−ＣＤ４タ ンパク質を、微量にしか存在していない場合でも、アッセイでより容易に検出さ れるようにＳｒＶをＪ縮する試験血漿の前処理に用いられ得る。あるいは、可溶 性サルＣＤ４または可溶性チンパンジーＣＤ４タンパク質ハ、血清中の抗ＳＩＶ 抗体の検出に用い得る。例えば、可溶性サルＣＤ４タンパク質は、酵素のような 指示物質と結合し、そして抗ＳＩＶ血清抗体を検出するＥＬｒＳＡアッセイに用 い得る。 本発明はまた、不発明の免疫原性ＣＤ４タンパク質で免疫したヒトが産生するＨ ＩＶ　ｇｐ１２０と結合するヒト抗体も提供する。そのような抗ＨＩＶ　ｇｐ１ ２０抗体は、ＨＩＶに感染したヒトの受動的な免疫療法および免疫予防に有用で ある。そのような受動的な免疫感作に対する投与法は、他の受動的免疫療法のそ れと類似である。 本発明がよりよく理解されるために、次の実施例が以後に設けられている。これ らの実施例は、例証のみを目的とするものであり、いかなる方法によっても発明 の範囲を制限するものとして解釈されない。 実施例■　−λ　ｔｌｏカニクイザル末梢　リンパ球ｃＤＮＡライプカニクイザ ルの血Ｆ＆（ＥＧ＆Ｇ　Ｍａｓｏｎ、　ＭＡ＞から、リンパ腑分Ｈ溶ｉｆ（ＬＳ Ｍ）（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ、　Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ，Ｃａｔ、ＮＯ ，３５４２７＞を用いた密度勾配遠心により、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離 した。 次に、このＰＢＬ細胞から総１’ｌＮＡをグアニジニウムイソチオンアネート／ 塩化セ／ウム法［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ ｎ、　ｐ、１９６　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）　（１９８２）；　Ｊ、　Ｍ。 Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ 　Ａｃｔｉｖｅ　Ｒ４ｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｆｒｏｍ　５ｏｕｒｃｅ ｓ　Ｅｎｒｉｃｈｅｄ　Ｉｎ　Ｒ４ｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ”、　Ｂｉｏｃ匡畦■ ユ、　１８．　ｐｐ、　５２９４−５２９９　（１９７９）］を用いて調製した 。ポリＡ″’　ｍＲＮＡは、オリゴｄＴ−カラムのクロマトグラフィーで分離し た。５　μｇのポリＡ’　ＩＩＩＲＮＡ（５００ｎｇ／ｕ　ｌ）をＣＨ３Ｈｇ０ Ｈ（２，５ｍＭ＞中で、室温で１０分間変性させた。次いで、１／１０容のβ− メルカプトエタノール（０，７Ｍ）を加え、室温で５分間インキュベートした。 第一および第二のｃＤＮＡ鎖合成はｃＤＮＡ合成キット（ＢｅｔｈａｓｄａＲｅ ｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ 、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８２６７ＳＡ＞を用いて、製造者の指示するプロトコー ルに従い行った。 二本鎖ｃＤＮＡをリンカ−３５／３６Ｋに標準的方法を用いてつないだ。リンカ −３５／３６には、以下の配列のＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔ　Ｉ用リンカ−／アダプタ ーである： ５°　ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ３゜３°　ＧＣＴＣＧ ＡＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧ　５゜このリンカ−は５°にＥｃｏＲＩによる突 出部を有し、３°に平滑末端を有する。このリンカ−は、Ｍ、　Ｄ、　Ｍａｔｔ ｅｕｃｃｉおよびＭ、　Ｉ（、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの、−Ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｓ　Ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ　ＯｎＡ　Ｐｏｌ ｙｍｅｒ　５ｕｐｐｏｒｔ−、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１０３． 　ｐｐ、３１８５−９１　（１９ａｔ）に記載された方法に従い、ＤＮＡ　／ン セサイザー（Ａｐｐｔｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　３８０Ａ、　Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）で合成した。つないだｃＤＮＡを精製し、そして５０ ０　ｂｐより大きい断片を、セフアゾ、ジスＧ１５０カラム（５ｍｌ）を通す、 ０．ＯＩＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩｌｏ、　４ＭのＮａＣｌ１０．０１　ＭのＮａ２ ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）中でのり（１７トグラフイーで選別した。過剰のリンカ −は、５ｅｔｅｃｔ　４Ｌスピンカラム（５Ｐｒｉｍｅ　−３Ｐｒｉｍｅ、　Ｐ Ａ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　５３０１−９９３２６０）を通す遠心分離により、製 造者の指示するプロトコールに従い処理し除去した。 第一のカニクイザルＰＢＬ　ｃＤＮＡライブラリーを以下のように調製した。５ ｅｌｅｃｔ　ＪＬカラムから溶出したｃＤＮＡを、５μｇのＥｃｏＲｌ−消化し たバクテリオファージλｇｔｌｏと共にエタノール沈澱させた［Ｊ、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、１．　ｐ、２．４１（Ｃｏｌ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）　（１ ９８９）］。沈澱した物質を、１６°Ｃで一晩、０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７ ，８）１０．０１　ＭのＭｇＣｌ２１０．０３　ＭのＮａＣ１１０，００１Ｍの スベルミジ７１０．２　ｍＭのＥＤＴＡｌｏ、　００２Ｍ（７）ジチオスレイト ール（ｒ　１）ＴＴＪ　）１０．２５から１　ｍＭのＡＴＰ／ｌ　ｍｇ／ｎｌウ ン血清アルブミノ（ｒＢｓＡＪ　）中で、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）でつなＬｌだ。ライゲ ーンｇン反応混合物の分注物を、Ｇｉｇａｐａｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｃ Ａ、Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２００２１３＞中で、製造者の指示したプロトコールに 従イパッケージングした。 ０．２％のマルトースを補い、そして０．０１　ＭのＭｇ５Ｏ，に調整したＬｕ ｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中で生育させたＥ、ｃｏｌｉ　ＢＮＮ１０２細胞の 飽和した（１０９細胞／ｌ１１１より多い）培養物を調製した。この培養物の６ 　ｍｌを感染させるために、パッケージングしたファージを用い、この感染した 培養物を０．ＯＩＭのＭｇ５Ｏａを補ったＬＢ中の０．７％トンプアガー３００ 　ｍｌに加え、細胞混合物をアガー／ＬＢ７０．０１ＭのＭｇＳＯ４を含んだ６ 枚のプレート（２１ｘ２１　ａｍ）に蒔いた。このプレートを約７時間、３７° Ｃでインキュベートし、プラークを増殖させた。次に、ファージを５０　ｍｌの ＴＭ（Ｑ、ＯＩ　ＭのＴｒ　１ｓ−ＨＣＩ　（＋）Ｈ７，４）１０．０１　Ｍ　 ＭｇＣ１ｚ）で溶出し、ＣｓＣ１−分画し精製した。 ブラークハイプリダイゼーショ／スクリーニングでλｇｔＬ。 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ヒトＣＤ４のＤＮＡ断片を 用いた。詳細には、３０枚の１５０　＋＋ｕａディツシュの各々に、全体でｌに １０’プラークフオーミングユニツト（ＰＦＵ）を蒔いた。ニトロセルロースフ ィルター上にプラークリフトを２つ取ったｏ　Ｗ、　Ｄ、ＢｅｎｔｏｎおよびＲ ，Ｗ、Ｄａｖｉｓの、−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ＯｆＬａｍｂｄａ　ｇｔ　Ｒｅｃ ｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｃ１ｏｎｅｓ　Ｂｙ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｏ　 ＳｉｎｇＩｅ　Ｐｌａｑｕｅｓ　Ｉｎ　５ｉｔｕ−、５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６ ．　ｐ、　１８０　（１９７７）に記載された方法を用い、ヒトＣＤ４のクロー ニングされた配列の、６９４　ｂｐＰｓ±ｌ／Ｐｖｕｌｌの５°断片で、フィル ターをスクリーニングした。ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８ｇ１０２９４０に記 載の、ベクターｐ１７０−２の〜６９４　ｂｐのＰｓｔｌ／Ｐｖｕｌ　Ｉの断片 が使用し得る。 ２回のスクリーニングおよびプラーク精製の二重実験で陽性のものが８つ得られ た。次にλｇｔｌＯミニブレノブＤＮＡを調製し、それを兆佳１で消化した。最 も長いｃＤＮＡ挿入物（〜２　ｋｂ）を有する１つのクローン２５Ｂを選択した 。図ＩＡに示した様に、クローン２５ＢをＮｏｔｌでｌ角化し、カニクイザルの ＣＤ４をコードしている領域の部分を含んだ約２　ｋｂのＮｏｔ　Ｉ／Ｎｏｔ　 Ｉ断片を切り出した。この断片を、Ｎｏｔｌ−消化し仔つ／腸アルカリフォスフ ァターゼ（ｒｃＩＡＰＪ　）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で、 製造者の指示したプロトコールに従い処理した、シーケン７ング用プラスミドｐ ＮＮ１２にサブクローニングした。得られた構築物をｐｓＱ１３１と呼ぶ。 ンーケンシング用プラスミドｐＮＮ　１２は、市販されているプラスミドｐｔｌ ｃ８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から制限酵素消 化により合成ボＩＪ　リンカ−を除去し、使用し易い制限酵素部位を有する新し い合成片に置き換え、構築した。複製開始点を提供し、アンピンリン耐性を付与 する、ｐＵＣプラスミドに共通の２５　ｋｂの骨格構造は変えないで残した。ｐ ＮＮｌ　２の新規合成部分を図２に示した。 ９ＳＱ１３１のＣＤ４挿入物のヌクレオチド配列は、Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍお よびＷ、　Ｃ１１ｂｅｒｔの、”Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｆｏｒ　Ｓｅｑｕ ｅｎｃｉｎｇ　ＤＮＡ−、Ｐ−ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、　７４．　ｐｐ、　５６０−６４　（１９７７）に従い決定した。ヒト ＣＤ４タンパク質のヌクレオチド配列と比較することで、この〜２　ｋｂ挿入物 はカニクイザルのＣＤ４をコードしている領域の全ては含まないことが分かった 。さらに、このライブラリーから単離された他のクローンには、ＣＤ４をコード している領域の全てを宵するものはなかった。従って、プライマー伸長ｃＤＮＡ ライブラリーを、以前に単離していたカニクイザルのＰＢＬのポリＡ”　ｍＲＮ Ａから構築した。 実施例■−カニクイザルのプライマー　ｃＤＮＡライブラリーの合成およびスク リーニング ｐｓＱ１３１の挿入物の配列に基づき、全て製造者の指示したプロトフールに従 い、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　３８０Ａ）を用 い、アンチセンスオリゴヌクレオチドブライマー７４ＡＩＤ１１８を合成し、そ してアクリルアミド電気泳動で精製した。Ｌ、　ＪＭｃＢｒｉｄｅ（前出）も参 照。Ｔ４ＡＩ０１１８の配列は：５’　ＴＧＧ　ＧＣＣＡＴＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ 　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＴＧＴ　ＴＧＧ　３°、　である。 製造者の指示したプロトコールに従い、’Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）の存在下で 、ＡＴＰを用いてオリゴヌクレオチドをリン酸化した。 ２０　μｇのカニクイザルＰＢＬのポリＡ”　ｍｔｌＮＡをＣＨ３Ｈｇ０Ｈ（２ ，５ｍＭ）中、室温で１０分間、変性させた。次に１７１０容の０．７Ｍのβ− メルカプトエタノールを加え、室温で５分間インキュベートした。 第一のｃＤＮＡ鎖の合成は、２００　ｐｍｏｌのキナーゼ処理したＴ４ＡＩＤ１ １８（７）添加により特異的に開始した。０．０６２５　ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，３）１０．７５　Ｍ　ＫＣＩ／　０．００１５　Ｍ　ＥＤＴＡ中で６ ８℃で５分間、５５°Ｃで７分間、そして４２℃で５分間、プライマーをｍＲＮ Ａとアニールさせ、そして生成物をエタノール沈澱させた。 ｃＤＮＡの合成およびリンカ−のライゲーションは、上述ノように行った。製造 者の推奨する方法に従い、過剰のリンカ−を６Ｌスピンカラム（５Ｐｒｉｍｅ　 −３Ｐｒｉｍｅ、　ＰＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　５３０１−０４７３８＞で除去 した。このｃＤＮＡを１μｇの社旦Ｒ１−消化したλｇｔ１０とつなぎ、上述の ようにパッケージングした。全て上述の通りに、パッケージングされたファージ で１　ｍｌのＥ、ｃｏｌｊ　ＢＮＮ１０２を感染させ、細胞をプレート（２１ｃ ｍ　ｘ　２１　ｃｍ）に蒔き、そしてファージストックを作成した。 上述と同様に、１．０００．０００のファージを蒔き、プラークハイブリダイゼ ーションスクリーニング用に：Ａ製した。このライブラリーを２つのプローブで スクリーニングした。第一のプローブＴ４ＡＩＤＯ８は、以下の配列である：５ °ＣＴＧ　ＡＧＴ　ＧＧＣＴＣＴ　ＣＡＴ　ＣＡＣＣＡＣＣＡＧ　ＧＴＴ　３’ 。 Ｔ４ＡＩＤＯ８は上述のように合成した。Ｔ４ＡＩＤＯ８によるスクリーニング で９つの二重陽性が得られた。ミニブレ、プ分析の後、これらの内で最も大きい クローン２４からの挿入物（〜９００　ｂｐ＞を、図ＩＢに示すように７−ケン ンング用にｐＮＮ１２へサブクローニングした。このサブクローンをｐｓＱｌ　 ３４と呼んだ。 ２つの別のクローン、クローン３６およびクローン３５が、カニクイザルの伸長 ライブラリーをヒトＣＤ４クローンＤＣ２］、３−５の４０６　ｂｐのＮ　ｃ　 ｏ　ｌ　／　■上ＭＩ断片でスクリーニングすることにより見いたされた。ＤＣ ２１３−５のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図３に示す。クローン ６からの挿入物はｐＮＮ１２にサブクローニングし、得られた構築物を１）ＳＱ Ｉ３に呼んだ。図ＩＣを参照。 同様に、クローン３５からの挿入物はｐＮＮ１２にサブクローニングされ、得ら れた構築物をｌ＋５Ｑ１３５と呼んだ。ベクターｐｓＱ１３６（＋）ＳＱ１３５ の全ておよびそれ以外を含む）は、得られ配列決定された内では最大の５′クロ ーンであった。得られたサブクローンには、カニクイザルＣＤ４をコードする領 域の全長を含むものはなかった。 図４に示したカニクイザルＣＤ４の全長のＤＮＡ配列は、３つの重複するサブク ローン（５′から３゛への順に）ｐＳＱ　１３６、ｐｓＱ１３４およびｐｓＱ１ ３１から寄せ果めた合成配列である。サブクローンｐｓ０１３６は、図４のヌク レオチド１−５６０およびヌクレオチド１１８２−１３４２を含む。サブクロー ン１）ＳＱ１３４は、図４のヌクレオチド４６７−１３４１を含む。サブクロー ンｐｓＱ１３１は、図４のヌクレオチド９９８−３０６４を含む。図４にはカニ クイザルＣＤ４の全長の推定アミノ酸配列（ＡＡ−２ｓ−ＡＡａ３３）も示した 。図５は、可溶性カニクイザルＣＤ４（ＡＡ−２ｓ−ＡＡａｖｓ）は、プラスミ ドｐＧＢ３９１からの可溶性ヒトＣＤ４（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８１０２ ９４０）（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｕｔｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　ＭＤ、ＩＶｌ　１０１５１） に対し、９４．２５０％の類似度および９１．２５０％の同一度を有することを 示している。図５では、一致しないアミノ酸は星印★でマークした。 実施例■−可可溶性アカザザルＤ４のクローニング可溶性アヵゲザル（Ｍａｃａ ｃａ　ｍｕｌａｔＬａ）ＣＤ４は、Ｐ、　Ｊ、　Ｎｅｖｍａｎらの、＋Ｅｎｚｙ ｍａｔｉｃ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｓｐｅｃ ｉｆｉｃ　Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ　Ｕｓｉｎｇ　Ｔｈａ　Ｐｏ１ｙｔｎｅ ｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ−、Ｌ工■に同じようにクローニング した。アカゲザルＣＤ４の可溶性領域は、ヒトＣＤ４とカニクイザルＣＤ４の細 胞外部分゛をコードする領域とで１００％のヌクレオチド相同性を示す領域から 選択されたオリゴヌクレオチドブライマーを用いてクローニングした。 これらのオリゴヌクレオチドブライマーは、上述のように合成した。クローニン グに用いたこれらのオリゴヌクレオチドブライマーは全て、上述のように、ポリ ヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを用いて５゛をリン酸化した。これらのオリ ゴヌクレオチドを図６に示した。 細胞外領域のクローニングは、３つの工程で行った。第１に、アカゲザルの可溶 性ＣＤ４の５゛領域を、特異的に開始される逆転写酵素反応、次いで第−鎖ｃＤ ＮＡのＰＣＲ増幅により、、　ｍＲＮＡから作成した。第２に、重複した３′領 域を、類似の逆転写酵素／ＰＣＲ増幅法で作成した。クローニング法の第３の工 程は、３“断片に停止コドンリンカ−を結合させることである。最後にこの断片 をンーケンンング用のベクターにクローニングした。 ヘハリン添加したアカゲザルの血液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａ Ｉ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｃｅｎｔｅｒより入手）からのＰＢＬを調製し、そして上 述のカニクイザルＣＤ４用に記載したのと同じ方法によりこれらのＰＢＬから全 ＲＮＡを分離した。ポリＡ“ｍＲＮＡを作成するほど充分には全ＲＮＡが得られ なかったため、アカゲザルの全ＰＢＬ　ＲＮＡの５μｇを、１０μｌのＣＨ３８ ｇ０Ｈ（２，５ｍＭ）中で１０分間室温で変性させ、そして次いで室温で５分間 、１μｌのβ−メルカプトエタノール（０，７Ｍ）とインキュベートし反応停止 した。 アカゲザルＣＤ４の細胞外部分をコードする領域の５°−末端部分を得るため、 オリゴヌクレオチドＴ４ＡＩＤ１５６（図６）を用いて、アカゲザルのＰＢＬ　 ＲＮＡに逆転写酵素反応を行い、第−鎖ｃＤＮＡの合成を開始した。ｃＤＮＡ合 或は、０．０５　ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８，３）１０．００３ＭのＭｇＣｌ２７０ ．０７５　ＭのＫＣｌ１０．０１．　ＭのＤＴＴ７０．５　ｍＭのｄＮＴＰ混合 物１５０　ｐｍｏｌのＴ４ＡＩＤ１５６ブライ？　−１５００１ＪのＭＭＬＶ逆 転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）中で、最終反応容量５０μｌで、１時間３７℃で行った。 チューブを水上に置き反応を停止した。 ポリメラーゼチェインリアクンヨン（ＰＣＲ）増幅用には、５０ｐｍｏｌのＴ４ ＡＩＤ１５６プライマーおよび１００　ｐｍｏｌのＴ４ＡＩＤ１４８プライマー （図６）を混合し、そして５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）中で乾燥させ、 次に５０μｌのＰＣＲ希釈バッファー（０，０２５ＭのＫＣＩおよび０．０２％ のゼラチン）を加え、乾燥したオリゴヌクレオチドを再懸濁させた。この混合物 を、停止させた逆転写酵素反応物（前の、ｆラグラフ参照）に加え、そして９４ ℃に２分間加熱した。この混合物を、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　 ＤＮＡサーマルサイクラ−中で３７℃に冷却し・　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｕヨ」工巨 から単離されたＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）ｌ　μｌ（５単位） を加えた。増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラ−中で３０サイクル行った一１分間 、９４°Ｃで２０秒間；３分間、３７℃で２０秒間；そして７２℃で１０分間。 コノＰＣＲ産物は、ＴＡＥハノ７　ｙ　（０，０４ＭのＴｒｉｓ−酢酸１０．０ ０１ＭのＥＤＴＡ）中で、１％ＧＴＧアガロースゲル（”Ｓｅａｋｅｍ−）（Ｆ ＭＣＭａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）で分離し た。適切な断片（約５４０ｂｐ）を切り已し、そしＴｏ、ｏｌ、ＭのＴｒｉｓ− ＣＩ（ｐＨ８＞１０．００１　Ｍ）ＥＤＴＡを含んだ透析チューブ中で１００　 Ｖで１時間、２本の電極の間のＴＢＥハノ７　ｙ　（０，０８９ＭのＴｒｉｓ− ポウ酸１０．０８９Ｍのポウ酸７０．００２ＭのＥＤＴＡ）中で、電気溶出した 。この適切な大きさの断片は、プライマーに隣接させたカニクイザルのＣＤ４　 ＤＮＡ配列（図４および６を参照）と比較することにより確認した。１５秒間極 性を反転させ、次いで溶出したＤＮＡを２０μｇのキャリアーｔＲＮＡの存在下 でエタノール沈澱させた。 このＰＣＲ断片を、Ｓｍａｌで消化し、製造者のプロトコールに従い、ＣＩＡＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で直線化されたベクターを脱リン 酸化し、ンーケンンング用のプラスミドｐＮＮＯ８にクローニングした。ｐｌＪ ＮＯ８は、プラスミドｐｌＪｃ８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｊｃａｌｓ）から合成ポリリンカーを制限酵素消化で除去し、そして新しい合成 片に置き換えることで構築した。転写開始点およびアンピノリン耐性を提供する 、ｐＵＣプラスミドに共通の２５　ｋｂの骨格は変化せず残った。ｐｌＪＮＯ８ の新規合成部分を図７に示した。ＰＣＲ断片およびｐＮＮＯ８のライゲーション は、０．０５　ＭノＴｒｉｓ（ｐＨ７，８）１０．０１　ＭのＭｇＣｈｌｏ、０ ３　ＭのＮａＣ１１０，００１Ｍ（７）　スヘルミジン１０．２ｍＭのＥＤＴＡ ｌｏ、００２　ＭのＤＴＴｌｏ、　２５からｌ　ｍＭのＡＴＰ／１ｍｇ／ｍ　ｌ のＢＳＡ中で、１６℃で一晩、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼと共に行った。 このライゲー／ヨン混合物を、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞の形質転換に用い、 そして形質転換体をアンビンリン（５０μｇ／ｍｌ）ヲａんだＬＢ寒天に蒔いた 。得られた２４のコロニーを生育させ、アルカリミニプレノブＤＮＡの凪１消化 物の電気泳動により分析した。これらのコロニーの２つが、正しい大きさの挿入 物（即ち、約５４０　ｂｐ）を含んでいた。これらのコロニーから単離されたプ ラスミドの１つｐｓｑｉ４６をＣｓＣ１の密度勾配遠心分離で精製し、そしてＭ ａｘａｍ／Ｇｉ　１ｂｅｒｔに従い配列決定した。　Ｉ）ＳＱ１４６のアカゲザ ルのＣＤ４挿入物のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図８に示した。 アカゲザルのＣＤ４の細胞外部分をフードする領域の３−末端部分を得るために 、オリゴヌクレオチドＴ４ＡＩＤ１５０（図６）を用いて第−鎖ｃＤＮＡの合成 を開始した。ＰＣＲ増幅を、プライマー丁４ＡＩＤ１５０およびＴ４ＡＩＤ１７ ８（図６）を用いて行った。適切なＰＣＢ断片（〜８０ｏ　ｂｐ）をゲル精製し た。全ての工程は前述したように行った。 精製したＰＣＲ断片は、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で処 理して、平滑末端とし、そして、以下の配列；５’　ＴＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　 ＴＧＴ　ＧＣ３３°ＡＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＣＧＣＣＧＧ　５’のリ ンカ−／アダプターＴ４ＡＩＤ１８２／１８３とつないだ。Ｔ４ＡＩＤ１８２／ １８３は、停止コドンＴＧＡを５゛末端に、内部にＩ＋１部位を、そし−ケノ／ ング用のプラスミドｐＮＮ　ｌ　１につないだ。ｐＮＮｌｌは、ｐＵＣ８（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から合成ポリリンカーを制 限酵素消化で除去腰　そして新しい合成片で置き換えることで構築した。ｐＮＩ Ｊｌｌの新規合成部分を図９に示した。このライゲー／ヨン混合物をＥ、ｃｏｌ ｉ　ＪＡ２２１の形質転換に用いた。ミニブレノブ分析は、得られた２４のコロ ニーに対して行った。これらの内の４つ、ｐｓＱ１５９、ｐｓＱ１６０、ｐｓＱ １６１およびｐｓＱ１６２は正しい大きさの断片（即ち、約ａｏｏ　ｂｐ）を含 んでいた。サブクローンＩ）ＳＱ１６２の７カゲザルのＣＤ４挿入物のヌクレオ チド配列および推定アミノ酸配列を図１０に示した。 実施例Ｖ−可可溶性アカザザル−ヒトキメラＤ４　ＤＮＡ配ダ配合１んだ哺乳類 細胞の発現ベクターの　築 図１１に示したように、可溶性アカゲザルーヒトキメラＣＤ４ＤＮＡ配列を哺乳 類細胞の発現ベクター中で構築した。この構築物では、ＣＤ４コード領域の５° 末端はアカゲザルのＣＤ４　ＤＮＡで、そして３末端はヒ）ＣＤ４ＤＮＡである 。 さらに詳細には、哺乳類の発現ベクターｐＢＧ３４１［Ｒ，Ｍ、　Ｋｒａｍｅｒ ら、−５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　Ｏｆ　Ａ　Ｈｔ＋ ｍａｎ　Ｎｏｎ−Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ａ２− 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４、ｐｐ、　５７６８−７５　’（ １９８９）］（図１２）をυユ１１およびしりで消化し、プロモーター領域およ びＮｏｔｌクローニング部位を含んだ１　ｋｂの断片を単離した。 アカゲザルのＣＤ４プラスミドｐｓＱ１４６を、凪１およびト上Ｍｌで消化し、 図８のｌから４９９位のアカゲザルＣＤ４ヌクレオチドトソれに先行する４４個 のベクターヌクレオチドを含んだ５４３　ｂｐの断片を単離した。 ヒトＣＤ４発現ベクターｐＢＧ３９１（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴｌＵＳＳＲ１０２ ９４０）（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ。 ＭＤ、ＩＶＩ　１０１５１＞をＢｙＭＩおよびＡａｔｌｌで７肖化した。こ（Ｄ プラスミドは１つはＣＤ４配列中に、そしてもう１つはベクター中に２つの…Ｍ １部位を含んでいる；　しかし、これらの部位の突出部分は異なる。２１４７　 ｂｐのＡａｔｌｌ／釘工ＭＩ断片（ベクター配列を含む）、および２３２４　ｂ ｐの■ＭＩ／ＢｓｏＭ［断片（可溶性ヒトＣＤ４の３°末端およびベクター配列 を含む）を単離した。 可溶性アカゲザルーヒト牛メラＤＮＡ配列を含んだ発現ベクターを構築するため に、以下の断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼでつないだ： 口１」１− ｐＢ０３４１　〜ｌ　ｋｂ　υユＩＩ／匙」Ｉｐ、５Ｑ１４６　０．５４３　ｋ ｂ　酌ユＩ／ｂ！ＭｌｐＢＧ３９１　２．３２４　ｋｂ　Ｂｓ上Ｍｌ／も阻Ｍ＋ ｐＢＧ３９１　２．１４７　ｋｂ　Ｂｓ工Ｍｌ／Ａｉ匹１１゜得られたキメラプ ラスミドｐＤＧ１００を図１１に示した。図１３は、ｐＤＧｌｏｏのＣＤ４　Ｄ ＮＡ挿入物のヌクレオチド配列およヒ推定アミノ酸配列を示している。図１３で は、ヌクレオチド１−４８９はアカゲザルＣＤ４配列に相当し、ヌクレオチド４ ９０−１２９８はヒトＣＤ４配列に相当している。 Ｇ、Ｃｈｕらの、−ＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａＬｉｏｎ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ｅｆｆ ｉｃｉｅｎｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ ｌｓ　Ｗｉｔｈ　ＤＮＡ″、　Ｎｕｃｌｅ＋ｃ　ＡＣｌｄＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、１５．　ｐｐ、　１３１１−２５　（１９８７）に記載されているプロトコー ルに従い、ｐＤＧｌｏｏでＣＯ３７細胞を形質転換した。ポリクローナルノ’７ 　サ＃　Ｆｔ、　’ニートＣＤ４ｆｆｎ清（９３５）を用いたウェスタンプロッ ト分析で検出すると、ｐＤＧｌｏｏにフードされている可溶性キメラアカゲザル ／ヒトＣＤ４は、マウス抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体０ＫＴ４ａおよび０Ｋ Ｔ４（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で免疫沈降し得たが、　Ｌ ｅｕ３ａ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ではし得なかったくデータは示 に久ム二二！且 Ａ、　中１発現ベクターＢＧ３４１．、　ｒｈＴ４図１４に、可溶性アカゲザル ｃＤ４（ＡＡ−２ｓ−ＡＡ３ｖｓ）をコードする哺乳類細胞の発現ベクターの構 築を示す。 アカゲザルーヒトキメラブラスミドｐＤＧ１００をＨｉｎｄｌｌｌおよびＢＨＭ ｌで順次消化し、そして５７２　ｂｐのアカゲザルＣＤ４の５”断片を単離した 。ベクターｐｓＱ１．６２を、貼上Ｍ１および凪１で順次消化し、そして８００ 　ｂｐの可溶性アカゲザルＣＤ４の３°末端を単離した。 発現ベクターｐＢＧ３４１を、Ｈｉｎｄｌｆｌおよび回佳１で順次消化し、そし てＣＩＡＰで処理し、そして４．８　ｋｂのベクター断片を単離した。 これら３つの断片をＴ４リガーゼでつなぎ、発現ベクターｐＢＧ３４１、　ｒｈ Ｔ４を作成し、実施例Ｖに記載したように、これをＣＯ５−７細胞（ＡＴＣＣ： 　１６５１＞中にトランスフェクトした。 図１５は、ｐＢＧ３４１．　ｒｈＴ４からの可溶性アカケザルＣＤ４のヌクレオ チド配列および推定アミノ酸配列を示している。図１６は、可溶性７カゲザルＣ Ｄ４が、可溶性カニクイ”ｊ’ルｃＤ４（図４）に対して９９．７５Ｑ％の類似 度および９９．５００％の同一度であることを示している。図１７は、可溶性ア カゲザルＣＤ４が、可溶性ヒトＣＤ４（ｐＢＧ３９１から、前出）に対して９４ ．２６４％の類似度および９１２７２％の同一度であることを示している。図１ ６および１７のアミノ酸の不一致は星印でマークしである。 Ｂ、＝な　ベクターＢＧ３４１ＪＯＤ、　ｒｈＴ４ｐＢＧ３４１．　ｒｈＴ４の アカゲザルのＣＤ４挿入物を、ＤＨＰＲ−のチャイニースハムスター卵巣（ＣＦ ＩＯ）細胞中での可溶性アカゲザルＣＤ４の安定な発現用の他の構築物を作成す るために用いた。この構築物をｐＢＧ３４１ＪＯＤ、　ｒｈＴ４と呼んだ。 図１８Ａに示したように、ｐＢＧ３４１．　ｒｈＴ４　（１０ｔｔ　ｇ）をＮｏ ｔｌで解裂しく１５０　ｍＭのＮａＣ１／１０　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ７，９＞／１０　ｍＭのＭｇＣｌ２７１００　μｇ／ｍｌのゼラチン７０．０１ ％のトリトンＸ−１００中で）、そして可溶性アカゲザルＣＤ４をコードする１ 、３５７　ｋｂの断片を、低融点のアガロースの電気泳動で単離した。ｐＢＧ３ ４１（図１２）をＡａｔｌＩおよび兆」１で消化し、〜１　ｋｂの断片を単離し た。この断片を、ｐＪＯＤ−ｓの６．７５０　ｋｂのＮｏｔｌ／Ａａｔｌｌ断片 （ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１４１ｇ）とつなぎ、そして得られたプ ラスミドをｐＢＧ３４１．　ＪＯＤと呼んだ。プラスミドｐＢＧ３４１．　ＪＯ Ｄ（１０Ｍｇ）を凪１で解裂し、５“末端をＣＩＡＰで脱リン酸化し、モして直 鎖化したプラスミドＤＮＡを低融点アガロース電気泳動で単離した。直鎖化した ｐＢＧ３４１、　ＪＯＤを、可溶性アカゲザルＣＤ４をコードする１、３５７　 ｋｌ）のＮ。 ｔｌ／Ｎｏｔｌ断片とつなぎ、得られたプラスミドをｐＢＧ３４１ＪＯＤ、　ｒ ｈＴ４（図１８詩と呼んだ。 このプラスミドをＤＨＰＲ−のＣＨＯ細胞中ヘエレクトロポーレ−ンＭ／でトラ ンスフェクトし、５００　ｎＭのメトトレキセートの存在下で生育した細胞を選 択した（欧州特許出願東３４３．７８３号を参照）。さらに詳細には、ｐＢ３４ １ＪＯＤ、ｒｈＴ４（２００Ａ！、ｇ）ヲ、５０ｍＭのＫＣＩ／１０　ｍＭのＴ ｒｉｓ−）１ｃＩ（ｐＨ７，５）／１０　ｍＭのＭｇＣ１□／ｌ　ｍＭのＤＴＴ 巾でυ、１＋１で解裂した。解裂したＤＮＡを、エタノール沈澱し、そしテ０． ８ｍｌのＬＸ　ＨｅＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，０５＞／１３７　ｍ ＭのＮａＣ１１５ｍＭのＫＣｌ１０．７　ｍＭのＮａ２ＨＰＯａ／６　ｍＭのデ 牛ストロース）中に再懸濁した。ＤＩ（ＦＲ−Ｃ）１０細胞［Ｇ、　ｌ１ｒｌａ ｕｂおよびり、　Ａ、　Ｃｈａｓ：ｎの、１ｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｃｈｉｎ ｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　０ｖａｒｙ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｕｔａｎｔｓ　Ｄｅｆｉｃ ｉｅｎｔ　Ｉｎ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ａｃｔｉ ｖｉｔｙ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ、７７、ｐｐ、４２１６−２０　（１９８０）フ を、４　ｍＭのグ／レタミンおよび１０％の透析したつ／胎児血清を補ったα“ 改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で５０％フンフルーエンスまで生育させた。 細胞をトＩＪプシン処理し、そして次にトリプシンを不活性化するために新鮮な 培養培地を加えた。細胞を４分間遠心分離（〜２０００　Ｘ　ｇａｖ）した。細 胞（約Ｉ　Ｘ　１０７）を、Ａａｔｌｌで解裂したｐＢＧ３４１　ＪＯＤ、　ｒ ｈＴ４を含んだ０８ｍ１のＩ（ｅＢｓ中に再懸濁した。 この試料をＢｉｏＲａｄのエレクトロポーレーションキュベ、トに移し、Ｂｉｏ Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ装蓋を用いて、静電容量を９６０μＦｄ、およ び電圧を２９０ｖにセットして、エレクトロボーレープタンした。４　ｍＭのグ ルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を補ったα”　ＭＥＭＩＯｍｌ中に移す前に 、細胞を１０分間水上に置き、そして３枚の１００　ａｕ１１組織培組織培養デ ィノン路中た。 細胞を３日間インキュベーター（３７°Ｃおよび５％の００２）中で培養し次に ４　ｍＭのグルタミンおよび１０％の透析したウシ胎児血清を補ったα−ＭＥＭ （ヌクレオチドを欠いたαゝＭＥＭ）中に分割した。５日後に、細胞に４　ｍＭ のグルタミン、１０％の透析したウシ胎児血清および５００　ｎＭのメトトレキ セートを補ったα−ＭＥＭ（Ａ択培地）を与えた。３日から４日毎に選択培地を 交換し、そして細胞の過剰生育がないかプレートを調べた。生育した細胞を、可 溶性アカゲザルＣＤ４の産生に関して、以下に記載するようにして７ノセイした 。Ｃ）ｔｏ　ｒｈｅｓｕｓ　５００．２１と名付けた細胞株を可溶性アカゲザル ＣＤ４の産生で選択した。この細胞株は、約５ｐｇ／細胞／日ノ可溶性アカゲザ ルｃＤ４（図１５　（７）ＡＡＩ−ＡＡ３７５）を産生ずる。 実施例■−ロ泊　えアカゲザルＣＤ４の　および上述した形質転換したＣＩ（Ｏ 細胞により産生された可溶性アカゲザルＣＤ４は、以下のように定置した。 １ｍｍｕｌｏｎ　ｔｌの９６〜ウエルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅ ｃｈ、ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を、０．０５Ｍの重炭酸ナト リ’７ムバツフアー、ｐｉ（９，０中の５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４モノクロー ナル抗体１．１）７（５０μｍ／ウェル）でコートし、そしてプレートを４℃で 一晩イノキュヘートしたａ　ＩＤ７　（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、のＰａｔｒｉｃ ｉａ　Ｃｈｉｓｈ。 １１１から贈与された）は、ヒトＣ［）４の細胞外領域に結合するマウスモノク ローナル抗体である。ヒｌ−ＣＤ４の細胞外領域に結合する他の市販されている モノクローナル抗体も、ＩＤ７の機能的代替物となり得る（例えば、ＯＫ丁４Ａ あるいはＬｅｕ３Ａ）。 使用前に、）Ｄ？モノクローナル抗体を以下のように精製した。 １Ｄ７腹水をＰＢＳで希釈しくＶ／Ｖ）、そしてタンパク質を４０％の硫酸アン モニウムで沈澱させた。この沈澱物をＰＢＳに溶解しＰＢＳで透析した。製造者 の指示した物質および方法で、Ａｆｆｉ−ｇｅｌプロティンＡ　ＭＡＰＳ　ＩＩ キット（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、１５３−６１５９）を用い抗体を精製 した。精製した抗体は、大量のＰＢＳで透析し、そして分割した抗体分注物を一 ７０°Ｃで貯蔵した。 以下の全ての工程は、特に記載しない限り室温で行った。 プレートを、０．０５％のＴｖｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄した。プレートを、 ２％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液（２％　ミルク／ＰＢＳ）で２時間ブロックした（２ ００μｌ／ウエル）。次いで上述のように洗浄した。 次に、２％ミルク／ＰＢＳで種々の希釈濃度にした馴化培地の試ｐ（５０μｍ／ ウェルンを加え、３から４時間プレートをインキュベートし、そして上述のよう に洗浄した。次に、２％ミルク／ＰＢＳで１／１０００に希釈した西洋ワサビペ ルオキシダーゼ結合抗ＣＤ４モノクローナル抗体を加え（５０μｍ／ウェル）、 １５時間インキュベートし、次いでプレートを上述のように洗浄した。ＨＲＰ− 結合物は、市販のＨＲＰ＜ＢｏｅｈｒＩｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、ヒト ＣＤ４の細胞外領域に結合するマウスモノクローナル抗体（Ｂｊｏｇｅｎ、Ｉｎ ｃ）Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｃｈｉｓｈｏｌｍから贈与された）と結合させることで 作成した。このモノクローナル抗体は上述のように精製した。ヒトＣＤ４の細胞 外領域に結合する他の市販されているモノクローナル抗体ぐ例えば、０ＫＴ４） も、Ｒ能的代替物となり得る。 最後に、１００μｌ／ウエルの０−フェニルエチレンジアミン（ＯＰＤ）’（Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（Ｏｙ４　ｍｇ／ｍｌ）を加え、２０から３０分間イン牛 ユベートし、そして次に１００μｌ／ウエルのＩＮ　Ｈ２Ｓ０Ａを加えて発色を 停止させた。４９０　ｎｍの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｔｈｅｒ ｍｏｍａｘ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、　Ｍｅｎｌｏｖ　Ｐａｒ ｋ、　ＣＡ）で測定し“　この物質は潜在的腫瘍誘起物質であるため、廃棄前に ：５ｏｇのに２　Ｃｒｏ７．２５ｍ１の１０　Ｎ　Ｈ２Ｓ０ａ、１４５　ｍｌの Ｈ２０の溶液で無毒化しなければならない。 実施例■−組いえアカゲザル可溶性ＣＤ４のＰ′可可溶性アカザザルＣＤ４（図 １５のＡＡＩ−ＡＡ３７Ｓ）を、上述のように、安定に形質転換した細胞株Ｃ） １０　ｒｈｅｓｕｓ　５（１０，２１から精製した。 この形質転換体は、生育培地（１０％のラン胎児血清、１　ｍＭの１−グルタミ ン、５００　ｎＭのメトトレキセート、１５０　μｇ／ｍｌのストレプトマイシ ン、および５０℃１ｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補ったα−改変Ｅａｇｌｅ“Ｓ 培地ン中でフンフルーエンスになるまで生育させた。細胞を、３７℃で１ＯＬの Ｎｕｎｃ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｙ（ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏａｎａｌｙｔｉ ｃａｌ、　Ｎａｔｉｃｋ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、 　１３９４４６）中で培養した。コ／フルーエンスになった時に、使用した培地 を捨てて、そして細胞に８Ｌの産生培地（１０％の替わりに１％のつ／胎児血清 を含んだ生育培地）を与えた。産生培地は、３７℃でさらに３日から４日間馴化 を続けた。馴化培地を回収し、そして細胞に８Ｌの新鮮な産生培地を与え、そし て３７°Ｃでさらに３日から４日間インキュベートした。このサイクルを全部で ４０回繰り返した。回収した馴化培地に最終濃度０．０２％となるようにアジ化 ナトリウムを加えた。次に、ＳＱ　Ｌに蓄積されるまで、４℃でこの馴化培地を 貯蔵した。以下の全ての工程は、４°Ｃで性カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　Ｃａｔ。 Ｎｏ、　ＭＳＬ　ＩＯ３０２）で濾過し、モして等容の３０　ｍＭの酢酸ナトリ ウム（ｐＨ５，５＞で希釈した。 希釈した馴化培地（１００Ｌ＞を、２５０　ｍｌのＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ ａｓｔ置０装樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　Ｃａｔ、　Ｎ ｏ、　１７−０５１１−０１’）を充填し、１５　ｒｎＭの酢酸ナト「ノウム（ ｐＨ５，５）で予め平衡化した５ｕｐｅｒｆｌｏ−２５０カラム（Ｓｅｐｒａｇ ｅｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｓａｎ　Ｌｅａｄｒｏ、　Ｃａｌ＋ｆｏｒｎｉａ、　Ｃａ ｔ、　Ｎｏ、　１０−０２５０−００３に約５から１ＯＬ／ｈｒでかけた。この カラムをカラム［の約５倍の２０　ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ８，５）で、 ５から１０　Ｌ／ｈｒの流速で溶出した。残ったタンパク質（アカゲザルｒｓＣ Ｄ４を含む）を、カラム体積の５倍から６倍の２０　ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ（ ｐＨ５，５＞および１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ溶出バッファーで、２ からＳ　Ｌ／ｈｒの流速で溶出した。溶出の間、２０ｍ１のフラク／＝Ｉンをと り、２８０　ｎｍの吸光度を測定した。２１１０　ｎｍに顕著な吸光度を有する フチ２フ に分注しく各駒１５０　ｍｌ）、その内の４つを凍結し、使用まで一８０℃で保 存した。凍結しなかった分注物は、以下に記載するようにモノクローナル抗ＣＤ ４アフィニティーカラムのアフィニティークロマトグラフィーにただちにかけた 。 アフィニティ試薬として用いられた、実施例■に記載の抗ＣＤ４モノクローナル 抗体ＩＤ７は、腹水として供与された。腹水（７４　ｍｔ．）を、飽和硫酸アン モニウム（６０　ｍｌ＞と混合し抗体を沈澱させた。この沈澱を１．０．’００ ０　Ｘ　ｇａｖで３０分間遠心分離しペレットとし、そして７０　ｍｌの１．Ｏ ｍＭｈリエチルアミン（ｐＨ　７．６）に再懸濁させた。口の再懸濁させた硫酸 アンモニウム画分を、１０ｍＭｈリエチルアミン（ｐＨ　７．６）で−晩透析し た。 透析した画分は、予め１０ｍＭ）リエチルアミン（ｐＨ　７．６）で予め平衡化 しておいた３０　ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　Ｉｎｃ．、Ｐｉ ｓｃａｔａｖａｙ．　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ．　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１７−０５ １０−Ｏｆ）にかけた。コのカラムを、カラム体積の約５倍の平衡バッファーで 洗浄し、１０ｍＭ）リエチルアミン（ｐＨ　７．６）を含むＯ．ＯＭから０．３ Ｍの直線的な濃度勾配の塩化ナトリウム５００−ｍｌで、４０　ｍｌ／ｈｒで溶 出した。フラクション（各４から５ｍｌ＞をとり、そしてドデシル硫酸ナトリウ ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析し、そしてクー マノ−ブルー染色した。抗体を含んだフラクションをプールした。溶出プール（ ２８０　ｎｍの吸光度測定で約７７　Ｂのタンパク質を含んた１０８　ｌｌ１ｌ ）をＡｍ１ｃｏｎ限外ｌａセルで２１　ｍｌに濃縮（２８０ｎ１１１の吸光度測 定で約５３　ｍｇのタンパク質を含んでいる）した。 限外濾過物を０．１Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ　８．　０）７０．　５　Ｍの 塩化ナトリウムで一晩透析し、そして次にＡｍ　１ｃｏｎｔｉ外濾過セル中でＩ Ｑ　ｍｌ（２８０ｎｍの吸光度測定で約５１　ｍｇのタンパク質を含んでいる） に濃縮した。 精製したＩＤ７モノクローナル抗体（５１ｍｇの抗体を含んだ１０ｍ１）を、製 造者の指示書に従い、４ｇのＣＮＢｒ−ＳｅｐｈａｒＣＮＢｒ−５ｅｐｈａｒｏ ｓｅ（Ｓｉ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、　Ｃａｔ、　 Ｎｏ、　Ｃ９１４２）と結合させ、１２　ｍｌの誘導体化した樹脂を得た。この 樹脂（１２ｍｌ）をカラムに先順しリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した。 保存しておいた１５０　ｍｌのＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ溶出物をこのカラムに通 した。 次にこのカラムを、カラム体積の約５倍のＰＢＳ、カラム体積の約５倍の０．５ Ｍの塩化ナトリウムを捕ったＰＢＳ、およびカラム体積の約５倍のＰＢＳで順次 洗浄した。アカゲザルｒｓＣＤ４を、カラム体積の約５倍の５０　ｍＭグリ／ン ／）ＩｃＩ（ｐ）ｌ　３．０）／２５０　ｍＭ塩化ナトリウムでアフィニティー カラムから溶出した。フラクションく各Ｉ　ｍｌ）を、溶出したタンパク質をた だちに中和するために、７５μｍの０．５　Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，２＞を含 んだチューブに採取した。 ２８０　ｎｍに顕著な吸収を有するフラクションをプールし、そして−８０℃で 保存した。別の１５０届１のＳ−３ｅｐｈａ：ｏｓｅ溶出物に対してもこのアフ ィニティー精製工程を行った。典型的なアフィニティーカラム溶出プールは、４ から５ｍｌの容量で、１から２ｍｇのクンバク質を含んでいた。 ケル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のクーマノ−ブルー染色による分析では、上述の精製 プロトコールで、実質的に純粋なアカゲザルｒｓＣＤ４が得られた。図１９に示 すように、この精製したアカゲザルｒ　５ＣＤ４は、５ＯＳ−ＰＡＧＥ上で相対 移動度が４８および５２　ｋＤａのダブレットとして展開された。図１９で、レ ーン＃１はＢＩ’ｌＬ製の高分子ＪｌｉＦ色マーカマ−カーｔ、Ｎｏ、　６０４ ’１ＬＡ）を含み、そし７：レー７＃２および＃３は各々非還元の、および還元 された、５ｇｇの７カゲザルＣＤ４を含む。このダブレットは、精製による人工 産物とは考えられない。なぜなら、形質転換したＣＨＯ細胞のパルスチェイス実 験で、アカゲザルｒｓＣＤ４が同じ移動度のダブレットとして細胞外に分泌され ることが判明したためである（データは示さない）。 他ノ抗ＣＤ４モノクローナル抗体を、上述の精製プロトコール中のＥＤＴと置き 換え得る。このような抗体には、０ｒｔｈｏ　Ｐｈａｒ。 ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙから市販さ れている、０ＫＴ４および０ＫＴ４ａが含まれる。 このプロトコールは、精製されるＣＤ４変異種をアフィニティーカラム結合させ るために選択された抗ＣＤ４抗体を用いれば、他のＣＤ４変異種の精製に容易に 適用し得ることは当業者には引回溶性チンパンジーＣＤ４を、アカゲザルＣＤ４ の場合と実質的に同じ様式で、前出のＰ、　Ｊ、　Ｎｅｗｍａｎらの文献に記載 された逆転写酵素／ＰＣＲ増幅法増幅−て、クロー二／グした。第−鎖の合成用 の逆転写酵素反応は、２つの異なったプライマー二可溶性カニクイザルＣＤ４配 列の３“末端から調製した特異的なオリゴヌクレオチドおよび非特異的なオリゴ ４丁、を用いて行った。 培養した、ヒトへマグルチニ７　（ｒＰＨＡＪ　）刺激したチンパンジーＰＢＬ （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｃｅｎｔｅｒ のＤａｖｉｄ　ＷａｔｋＩｎｓから供与された〉を得て、上述のように全ＲＮＡ を調製した。 ＣＤ４の合成を開始するためにＴ４ＡＩＤ１５０（図６）を用いて、第−鎖ｃＤ ＮＡの合成用の逆転写酵素反応を行った。第−鎖の合成を開始するために非特異 的なオリゴｄＴ（１２から１８ヌクレオチド〉も用いた。各バッチのＤＮＡに対 して、Ｔ４ＡＩＤ１４８（図６）およびＴ４ＡＩＤ１５０をプライマーとして用 いて、ＰＣＲ増幅を行った。１分間、９４℃で２０秒：３分間、５５℃で２０秒 ；および７２℃で４分間、の３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。 得られたＰＣＲ断片をＥ、ｃｏｌｉ　Ｐｏｌ　１のフレノウ断片（Ｎｅｗ　Ｅｒ ＋ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｄＸＴＰｓとインキュベートして、これ らを平滑末端とした。次にこの断片をゲルＰＩ製し、Ｓｍａ　Ｉで消化して、Ｃ ＩＡＰで処理したンーケンシング用プラスミドｐＮＮＯ８に平滑末端をつないだ 。 次にこのヘクターを、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１の形質転換に用いた。 得られたコロニーを、Ｎｏｔｌ−を白化したアルカリ性ミニブレツブＤＮＡのゲ ル電気泳動で分析した。丁４Ａ　ＩＤ１５０で開始したＰＣＢのｃＤＮ’Ａから 得られた１つのクローン（ｐｓＱ２０５）およびオリゴ−ｄＴで開始されたｃＤ ＮＡの１つのクローン（ｐｓＱ２００＞を配列決定した。ｐＳＱ２０５の可溶性 チンパンジーＣＤ４挿入物のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（ＡＡ− ２ｓ−４へＡ３７Ｓ）を図２０に示す。ｐｓＱ２００の可溶性チンパンジーＣＤ ４挿入物のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（ＡＡ−２５−ＡＡ３７Ｊ ）を図２１に示す。 図２２は、ｐｓＱ２００およびｐｓＱ２０５のＣＤ４挿入物のヌクレオチド配列 を比較したものである。ｐＳＱ２００およびｐＳＱ２０５にコードされた、可溶 性チンパンジーＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列を、図２３で比較した。 図２２および２３では、一致しないヌクレオチドおよびアミノ酸は各々、星印で マークした。図２３に示したように、これらのアミノ酸配列は９９．７４９％の 類似度および９９．７４９％の同一度を示した。 図２４は、ｐＳＱ２００からの可溶性チノパンツ−ＣＤ４配列は、可溶性ヒトＣ Ｄ４（ｐＢ０３９１からの、前出）に対して、９９．２４８％の類似度および９ ８．９９％の同一度を有することを示している。一致しないアミノ酸は、星印で マークした。 （以下余白） Ｘ−ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウスによるヒトＣＤ４タンパク質を発現し 、従ってヒトＣＤ４タンパク質に寛容なヒトのような動物における、組み換え可 溶性アカゲザルＣＤ４　（ｒアカゲザルＣＤ４Ｊ　）の免疫原性を評価するため に、我々は、ヒトＣＤ４　トランスジェニックマウスによる実験を行った。この 観点では、ヒトＣＤ４　）ランスジェニックマウスによって、ヒトにおけるアカ ゲザルｒｓＣＤ４のアミノ酸変異体に対する免疫応答の予想ができる。ヒトＣＤ ４トランスジェニ、り７＋７スモデルは、ＣＤ４分子の変異体に対する免疫応答 から治療的利益が得られるかどうかを確かめるための系を提供する。 １１−トＣＤ４導入遺伝子のｃＤＮＡをマウスの授精胚に直接顕微注射すること により、ヒトＣＤ４を胸腺細胞および肺臓細胞の両方の表面に発現するトランス ジェニックマウスを作製した。本発明のヒトＣＤ４　トランスジェニックマウス の作製に使用された方法は、Ｂ、ＨｏｇａｎらのＭａｎｉ　ｕ　ａｔｉｎ　Ｔｈ ｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒ　ｏ　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８６）ｉこｇ８載されている。 Ｔ細胞に特異的なヒｈ　ＣＤ４の発現を達成するために、ヒトＣＤ２遺伝子の調 節エレメントの制御下にあるヒトＣＤ４　ｃＤＮＡで構成される導入遺伝子を構 築した［Ｇ、　Ｌａｎｇらの°Ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅＯｆ　Ｔｈｅ　Ｈｕ ｍａｎ　ＣＤ２　Ｇｅｎｅ　Ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｔ ｒａｎｇｅｎｉｃＭｉｃｅ−１ＥＭＢＯ，Ｊ、、　７．　ｐｐ、　１６７５−８ ２　（１９８８）；　Ｄ、　Ｒ，Ｇｒｅａｖｅｓらの−Ｈｕｍａｎ　ＣＤ２　３ ’−Ｆｌａｎｋｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｃｏｎｆｅｒ　Ｉ（ｉｇｈ−Ｌｅ ｖｅｌＴ　Ｃｅ１ｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、　Ｐｏ５ｉｔｉｏｎ−Ｉｎｄｅｐｅｎ ｄｅｎｔ　Ｇｅｎｅ　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　Ｍｉｃ ｅ−、Ｃｅ１ｌ、　５６．　ｐｐ、　９７９−８６　（１９８９）を参照１゜我 々の開始材料は次のものからなる：（１）５°側フランキング配列およびコード 配列からなるヒトＣＤ２遺伝子の断片（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ 　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳＴｈｅ　Ｒｉｄｇｅｖａｙ。 Ｍｉｌｌ　Ｈｉｌｌ、　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｎｌ２１ＡＡのＤｉｍｉｔｒｉｓ　Ｋｉ ｏｕｓｓｉｓ博士からの贈与）を有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳベクター（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　（図２５）：　（２）３’側フランキング配列からな るヒトＣＤ２遺伝子断片ぐＫｉｏｕｓｓｉｓ博士からの贈与）を有するｐｏｌｙ 　ｌｌｌ−１ベクター（図２６）；および（３）全長ヒトＣＤ４タンパク質をコ ードするＤＮＡを有する、サブクローンＰＡＴＹ、６（図２７）。これらの材料 をさらに詳細に以下のように説明する。 図２５に示すように、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳベクターは、ＣＤ２のコード 領域の直接上流の５゛側フランキングＤＮＡである〜５ｋｂのゲノムＤＮＡから なる、５ａｌｌ／Ｂａｍ旧　ヒトＣＤ２断片；　ヒトＣＤ２遺伝子の第１エクソ ンおよび第１イントロンからなる〜０．２ｋｂのゲノムＤＮＡ断片；およびヒｌ −ＣＤ２遺伝子の残りの部分を宵する〜１゜８ｋｂのｃＤＮＡ断片（インドロン ２−４は欠如）を有していた。図２７に示す５ａｉｌ／ＢａｍＨＩ断片は、実質 的に、上述のＬａｎｇの図ＩＡ（５つのエクソンおよび４つのイントロンを有す る、ヒトＣＤ２遺伝子の構成を図説している）；上述のＧｒｅａｖｅｓのｐ９８ ０および図３　（ＣＤ２−Ａ）　（最初のイントロンを除（すべてのイントロン ）に記載されている。図２５に記載のブコトコールは、以下の点で上述の文献と 異なる。上述のＬａｎｇの図ＩＡおよび上述のＧｒｅａＶｅｓの図３　（ＣＤ２ −Ａ）に示しである塗１部位を、部位特異的変異導入によって壊し、５ａｌｌ部 位に変えた。さらに、Ｓａｃ部位を壊して図２５に示すＥｃｏ旧部位に変えた。 このＥｃｏＲ１部位は、ＣＤ２遺伝子の５°非翻訳領域にある。最後に、ＣＤ２ 遺伝子の第２エクソンのＥｃｏＲＶ部位［上述のＬａｎｇの図ＩＢを参照］を壊 して終止コドンに変えた。図２５に示されているこの終止コドンは、導入遺伝子 中でのＣＤ２タンパク質の発現を防ぐ。 図２６に示すように、ｐｏｌｙ　ｌｌｌ−１ベクターは、ヒトＣＤ２遺伝子の３ ゛側フランキングＤＮＡの〜５．５Ｋｂの■旧／Ｘｂａｌ　ＤＮＡ断片を含んで いた［上述のＧｒｅａｖｅｓの図３　（ＣＤ２−Ｂ）を参照］。 全長ヒトＣＤ４をコードするＤＮＡを有するサブクローンＰＡＴＹ、　６を図２ ７に示すように、プラスミドｐＢＧＬ７８Ａ［ＰＣＴ特許出願　ＰＣＴ／ＵＳ８ ８１０２９４０１およびｐＢ０３７８［ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２ ９４０］から構築した。ＰＡＴＹ’、　６のヒｌ−ＣＤ４遺伝子の配列を図２８ に示す。 図２９に示すように、ＰＡＴＹ、　６を、ヒ）　ＣＤ４遺伝子の５°側非翻訳領 域中および３′側非翻訳領域中で切断するＬＬＬ［Ｉで消化し、末端を平滑にす るためにフレノウ断片で処理した。ＥｃｏＲＩ’Ｊンカーを付加し、ヒｌ−ＣＤ ４のｃＤＮＡを有する２、８ｋｂの断片を単離した。この断片を、Ｂｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ　ＫＳのＣＤ２遺伝遺伝列配５°非翻訳領域にある唯一のＥｃｏＲ１部 位に挿入した。この部位では、ＣＤ４ｃＤＮＡは、ＣＤ２遺伝子の５゛フランキ ングＤＮＡのすぐ上流に位置するエレメントの制御下にあった。次に、この構築 物をＸｂａｌで？ｔｊｌ化シ、ソｌ、　ｒＢａｍＨｌ　テ部分消化して、１ｏｋ ｂのＢｌｕｅｓｃｒｆｐｔ　ＫＳ断片を単離した。ｐｏｌｙ　ＩＩ＋−１からの 〜５．５ｋｂの石旧／犯胆１断片を、１０ｋｂのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ断 片に、ＣＤ２遺伝子の３°側フランキングＤＮＡの制御エレメントがヒトＣＤ４ 　ｃＤ）ＪＡの下流になるようにに挿入した。最後に、得られた構築物を５ａｌ ｌおよび凪１で消化して、ヒ）　ＣＤ４導入遺伝子を単離した。 ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウスを、実質的に上述のＦｌｏｇａｎによる記 載のように作製した。特に、４　マウス授精胚は（Ｃ５７ＢＬ１５ＸＣＢＡ／Ｊ ）系統の雌マウス（Ｎａｔｉｏｒ＋ａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄ ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｍｉｌｌ　Ｈｉｌｌ、　Ｌｏｎｄｏｎで繁殖し た）から単細胞期に単離した。ヒｌ−ＣＤ４導入遺伝子を含む溶液を所定の卵の 前核に顕微注射した。操作で生き残った卵を養母の卵管に戻した。誕生時に子の ゲノムをサザンブロノト分析［例えば、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、、９８．　ｐｐ、　５０３−５１７　（１９７５）を参照］ニ供して 、導入遺伝子を有する子を同定した。次に、導入遺伝子を有する個体を繁殖させ てトランスジェニックマウスの系統を確立した。このようにして確立したトラン スジエニ、り系統を、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスと順次戻し交配して維持した （）ａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｍ Ｅ）　ｏ　トランスジェニックマウスの２つの独立した系列、３１０系および３ １３系をさらなる研究用に選んだ。３１０系は、比較的少ないコピー数のヒトＣ Ｄ４導入遺伝子（約２コピー／細胞）を有し、３１３系は、より高いコピー数の 導入遺伝子（１０コピー／細胞より多い）を有する。 免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、３１０系および３１３系の細胞表面 でのヒｌ−ＣＤ４導入遺伝子の発現を検出した。３１０系マウスおよび３１３系 マウス、および非トランスジエニ、りＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスから胸 腺細胞および肺臓細胞を調製した。 マウスから胸腺を取り出し、２ＸＩＯ−５２−メルカプトエタノール、２ｍＭ　 Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌ　ペニンジンＧ、１００　Ａｔｇ／＋ａ１ス トレプトマイシンＧ、および１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ 　１６４０培地（これより「完全ＲＰＭ＋Ｊとする）中に置いた後、胸腺をスラ イド（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、、　Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ 、　ＰＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１２−５４４−２）のつや消しされた側の間で はさ反で圧して、単細胞懸濁液を作った。胸腺細胞を完全ＲＰＭＩで洗浄し、９ インチのバスンールビベノトの首部につめた綿栓を通して大きな破片を取り除い た。次いで細胞数を数えた。 肺臓を取り出した後、十文字型に切って刻み、次いで肺臓をスライドのつや消し された側でつぶして単細胞？ｌ！濁液を作って、肺臓細胞を調製した。完全ＲＰ ＭＩ中で一度洗浄した後、赤血球を、Ｂ、　Ｂ、　Ｍｆｓｈｅｌｌ　＆　Ｓ、　 Ｍ、　Ｓｈ：１ｇ１ｍ、　５ａｌａｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ１ｌ ｕｌａｒ　ｔｍｍｕｎｏｌｏ　（Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒ ａｎｃｉｓｃｏ）　（１９８０）に記載の方法に準じて、溶血用ゲイズ溶液（Ｈ ｅｍｏｌｙｔｉｃ　Ｇｅｙｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）で溶解した。綿栓をつめたパ スツールピベ、トを通して破片が混じっていない生存細胞を回収した。次いで肺 臓細胞を数えた。 ヒトＣＤ４の細胞外領域に特異的なマウスモノクローナル抗体ＦＩＴ（Ｊ、＊識 Ｌｅｕ３ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　７２ ３６）、あるいはネガティブコノトロール抗体としてＦＩＴＣ標識正常マウスＩ ｇＧ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　−Ｓｉｍｕｌｔｅｓｔ−ｒｅａｇ ｅｎｔ、Ｃａｔ、Ｎｏ、９５−００１２）を用いて、免疫蛍光染色を行った。５ ＸＩＯ５個の胸腺細胞あるいは肺臓細胞を、製造元が指定する濃度のＦＩＴＣ結 合Ｌｅｕ３ａあるい装置ＴＣ結合マウスＩｇＧと共に、２％ウン胎児血清および ００２％ＮａＮ３を補充したＰＢＳ　（総量１００μｌ）中でインキュベートし て染色を行った。細胞を水上で約３０分間インキュベートし、同じ緩衝液で３回 洗浄し、次いでＦＡＣ３ｔａｒ蛍光励起セルソーターで分析した。 ［ｍ３０は、ＦＩＴＣ−Ｌｅｕ３ａ　（点線）および不ガティブコントロールノ ＦＩＴｃ−マウスＩｇＧ　（実線）で染色したヒトＣＤ４　）ランスジェニック マウス（３１０系および３１３系）および非トランスジェニックマウス（Ｃ５７ ＢＬ／６系統）の肺臓細胞および胸腺細胞の蛍光強度の対数に対する相対細胞数 （リニヤ−スケール）を示す。蛍光強度の対数は、細胞当りの染色された分子の 密度を反映する。非トランスジェニックコントロール細胞ハ、ヒトＣＤ４が発現 していないことを示した。対照的に、３１０系および３１３系の両者は、胸腺細 胞にヒトＣＤ４分子を発現し、３１３系はほとんどの細胞に高いレベルのタンパ ク質を発現した。末梢リンパ球、例えば肺臓細胞は、３１３系マウスのみで有意 なレベルのヒトＣＤ４を産生した。多くの場合胸腺でのＴ細胞の発達過程で免疫 寛容が成立しているので［５ｐｒｅｎｔらの１ｍｍｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、。 １．０１．　ｐ、１．７３　（１９８８）を参照】、我々は、両方の系がヒトＣ Ｄ４タンパク質による免疫に寛容であると考えた。そこで、両方の系を用いて、 ヒトｒｓＣＤ４およびアカゲザルｒｓＣＤ４の免疫原性を以下に述べるように調 べた。 ＸＩ−ヒトｒｓＣＤ４での　０試 ヒトＣＤ４の発現によりトランスジェニックマウスのヒトＣＤ４「自己タンパク 質」に応答する能力が害されているかどうかを調べるために、我々はトランスジ ェニックマウス（３１０系）および非トランスジェニックマウスをヒトｒｓＣＤ ４で免疫して、ヒトＣＤ４に対する抗体の産生を調べた。本明細書での全ての投 与およびアッセイに用いたヒトｒｓＣＤ４は、ＴｏＩＩＩＨａｇｅｍａｎ博士、 Ｂｊｏｇｅｎ、Ｉｎｃからの贈与である。ヒトｒｓＣＤ４の配列はＰＣＴ／ＵＳ ！１８１０２９４０に公開されている。 トランスジェニックマウスは、０．２ｍｌの完全フロインドアシュパット　ぐＣ ＦＡ）　（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃｏ、、　Ｄｅｎｖｅｒ　Ｃｏ、　 Ｃａｔ、　Ｎｏ、　ｃｓ１４ｓｏ）に乳化させた５０μｇのヒトｒｓＣＤ４を腹 腔内（ｉ、　ｐ、　）に投与されるか、あるいはＣＦＡ　（０，２ｍ１．）中の ５０７１ｇのヒトｒｓＣＤ４を２つに分け、各々を後肢足隨（０，０５ｍ１／足 蹟）に投与された。フントロールの非トランスジェニックマウスを、関連のない 抗原であるＣＦＡ中の５０μｇブタインスリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，Ｃａｔ、　Ｎｏ、１３５０５）　（ ０，２ｍｌ、　ｉ、ｐ、）で免疫した。免疫の７．１４．２４および４０日後に マウスから採血し、ヒトｒｓＣＤ４でコートしたプレート上でＥＬ［ＳＡにより 、上述のように血清試料のＩｇＧ特異的抗ヒトｒｓＣＤ４抗体の存在を分析した 。４０日ロー全てのトランスジェニックマウスにＲＩＢ＋アジュバント　（ＲＩ ＢＩ　Ｉａｍｕｎｏｃｈ＋ｖ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ−、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｌＭＴ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｒ−７３０）中の５０μｇのヒトＣＤ４　（０， ２ｍ１．　ｆ、ｐ、）で追加免疫したＱ　）／トロールマウスは、ＲＩＢＩ　（ ０，２ｓ１．　ｉ、ｐ、）のみで追加免疫した。免疫後５４．６３および７６日 ロー再び採血し、抗ヒｈ　ｒｓＣＤ４抗体の存在を調べるために、血清試料を再 び上述のようにヒトｒｓＣＤ４でコートしたプレート上でＥＬＩＳＡによりアッ セイした。 前述のεＬＩＳＡアッセイは、以下のようになされた。最初に、９５ウエルポリ ビニルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ６、Ｃ ｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ、Ｃａｔ、Ｎｏ、００１−０１０−２１０１）　を、Ｐ ＢＳ中ｓａｇ／ｍｌのヒ）　ｒｓＣＤ４　（５０μｌ／ウエル）（マウスの免疫 に使用したものと同じｒｓＣＤ４）で、３７℃で２時間あるいは４℃で一晩コー トした。３７°Ｃで２時間コートした場合と４°Ｃで一晩コートした場合とでは 差はなかった。、５ｋａｔｒｏｎ　Ａ／Ｓマイクロプレートウｙｔ　ｙ　７ｗ　 −ＴニブＬ／−トラ４−５回洗浄し、次いでＰＢＳ／１％Ｂ５Ａ１０゜０１％Ｔ ｗｅｅｎ−２０１０，０５％ＮａＮ５（〜２５０μｌ／ウェル）で１時間、室温 でブロックした。緩衝液を除いた後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ７０．０２％Ｔｗｅｅ ｎ−２０１０，０５％ＮａＮａ中の希釈血清（５０μｌ／ウエル）あるいは、上 述のＣＤ４の細胞外領域に特異的なスタンダードのマウスモノクロ−ナル抗ヒト ＣＤ４抗体く同緩衝液中５０μｌ／ウエル）を各ウェルに加えた。プレートを３ ７℃で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳｌｏ。Ｏ１％Ｔｖｅｅｎ−２０１ ０，０５％ＮａＮ３で４−５回洗浄した（Ｓｋａｔｒｏｎ　Ａ／Ｓマイクロプレ ートウオッシャ−）。次に、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗マウスＩ ｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、 　’／１ｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１１　Ｓ−０５５ −０７１）　（５０μｌ／ウエル、ＰＢＳ／Ｌ％Ｂ５Ａ１０．０２％　Ｔｗｅｅ ｎ−２０１０，０５％　ＮａＮ３での最終希釈比１／１０００）を加え、プレー トを３７°Ｃで１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄しく５ｋａｔｒ ａｎ　Ａ／Ｓマイクロプレートウオッシャ−で４−５回）、そして基質４−ニト ロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　７３８−３５２）を ウェルに加えた（０．１Ｍグリシン／１ｍＭ　ＭｇＣｌ２／１ｍＭ　ＺｎＣｌ２ ・６Ｈ２０，Ｉ）ＨＩｏ、６に溶かしたｌｏｎｇ／ｚｌ溶液１５０μＩ）。スタ ンダードの抗体の最高希釈物に最大に結合した後の４０５ｎｍでの吸光度を測定 した。 前述のアッセイに用いたマウスモノクロ−ナル抗ヒトＣＤ４抗体２−５−２Ｅ６ を次の手順で作製した。しかし、この方法で作製されたいかなるマウスモノクロ −ナル抗ヒトＣＤ４抗体も前述のア、セイに有用である。最初に、２匹のＢａ１ ｂ　Ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌｍｌｌ１ｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓ ｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、ＣＦＡで１＝１に乳化した１０’Ｏμｇのヒトｒｓ ＣＤ４で免疫した（１ｐ）。２週間後、片方のマウスをＰＢＳ中の７５μｇのヒ トｒｓＣＤ４で追加免疫しくｉ、ｐ、）、もう一方のマウスをＩＦＡで１・１に 乳化した７５μｇのヒトｒｓＣＤ４で追加免疫した（　ｉ、　ｐ、　）。追加免 疫して１ケ月後、両方のマウスを、ＰＢＳ中の５０μｇのと）　ｒｓＣＤ４で静 脈から追加免疫した。この追加免疫の３日後に、ミエローマ細胞との融合のため に、両方のマウスからの肺臓細胞をプールした。融合は、Ｗ、　Ｇｏｄｊｎｇ編 、Ｍｏｎｏｃ）ａｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａ ｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　１９８３）に記載の標準法に従ってなされた。 融合細胞から得た上清で２つの平行したアッセイを行い、両方のアッセイに陽性 の反応を示す抗体を選択した。そのようなアッセイの１つは、実質的に上述した ような、ヒトｒｓＣＤ４をコートしたプレート上でのＥＬＩＳＡを含む。詳細に は、上清をヒトｒｓＣＤ４でコートしたプレートに加えた後、パーオキシダーゼ 標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えた。他のアッセイは、実質的に上述したよう な、スタンダードヤギ抗マウスＩｇでコートしたプレート上でのＥＬＩＳＡを含 む。詳細には、上清をこれらのプレートに加えた後１２Ｊ−ｒｓＣＤ４　（ヒト ）を加えた。 図３１は、トランスジェニックマウスでのヒトＣＤ４の発現がヒトｒｓＣＤ４に 対する寛容を成立させるかどうかを決定するために使用されたＥＬ＋ＳＡアッセ イの結果を示す。図３１は、トランスジェニックマウス（３１０系）および非ト ランスジェニックマウスの免疫後の種々の時期における抗ヒトｒｓＣＤ４抗体の 血清抗体価を表す。抗体価は、スタンダードモノクローナル抗ヒトｒｓＣＤ４抗 体の結合量の５０％の結合を示す血清の希釈倍数の逆数として対数座標上に表す 。黒くぬりつぶした記号は、最初にＣＦＡ中のヒトｒｓｃＤ４で免疫した個々の トランスジェニックマウスく黒四角、足跡に投与したもの；黒丸、１ｐ、投与し たもの）を表す。白い記号は、最初にＣＦＡ中のヒトｒｓＣＤ４で免疫した個々 の非トランスジェニックマウスを表す（臼四角、足鍍投与；白丸、ｉ、ｐ投与） 。ネガティブコントロールマウス（スナわち、無関連の抗原を投与された非トラ ンスジェニックマウス）は、黒い三角で表されている。独立したアッセイで、ネ ガティブコントロールである、同じ無関連な抗原で免疫したトランスジェニック マウスで、同一の結果を得た（データは示されていない）。 このアッセイは、ヒトＣＤ４１−ランスジェニックマウスおよび非トランスジェ ニックマウスの両方が、ヒトｒｓＣＤ４に対する一次抗体応答を上げたことを示 すが、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウスの反応は、非トランスジェニックマ ウスのそれよりも有意に低かった。二次免疫（４０日口の追加免疫）により、非 トランスジェニックマウスでヒトｒｓＣＤ４に対する高い抗体化の強い免疫反応 を得た。対照的に、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウスは、ヒ）　ｒｓＣＤ４ での二次免疫において、いかなる反応増加も示さなかった。その代わり、それら の抗ヒトｒｓＣＤ４抗体価は二次免疫後低下した。従って、トランスジェニック マウスでのヒトＣＤ４の自己構成要素としての発現によって、それらのマウスの ヒ）　ｒｓＣＤ４に対する免疫応答を起こす能力を著しく害し、ヒトＣＤ４を発 現する動物と発現しない動物との反応性リンパ球のレパートリ−の差を反映した 。 さらに別のアッセイでは、２匹のヒトＣＤ４　トランスジェニックマウス（３１ ３系）および２匹の非トランスジェニックマウスを、ＣＦＡに乳化させた５０μ ｇのヒトｒｓＣＤ４　（０，２ｍ１．　ｉ、　ｌ）、　）で免疫した後、３５日 ロー不完全フロインドアジユバント（ＩＦＡ）　（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕ ｍ　Ｃｏ、、　Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｃｏ、　Ｃ３＃１４５１）中の５０μｇのヒト ｒｓｃＤ４　（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）で免疫した。ネガティブコントロール トシて、２匹の非トランスジェニックマウスを５０μｇのブタインスリン（無関 連の抗原）で免疫（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）　Ｌ、た後、３５日巨にＩＦＡ単 独で（０，２ｍ１．　ｉ、　ｐ、　）免疫した。６匹のマウス全てを血清をとる ために採血し、Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａ ｓｓ　Ｗｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　ＮＹ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２５８０ １）を使用した以外は上述と全く同じように、ＥＬＩＳＡで血清試料の抗ヒトｒ ｓＣＤ４抗体をアッセイした。用いられたＤｙｎａｔａｃｈとＣｏｒｎｉｎｇの マイクロタイタープレートには有意な差はなかった。このアッセイから得た結果 は、図３１に示す実験データと一致シ、従って、ヒトＣＤ４トランスジエニツク マウスはヒトＣＤ４タンパク質に寛容であるという観察を支持する。 さらに、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウスのヒトｒｓＣＤ４に対する抗体反 応を、ヒトＣＤ４産生細胞の免疫染色により分析し、天然の膜質通型のヒトＣＤ ４分子を認識する抗体をヒトＣＤ４産生細胞が産生ずるかどうかを、決定した。 ５ＸＩＯ５ヒトＪｕｒｋａｔ細胞（Ａｍｅｎｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｆｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　Ｃａｔ、　Ｎ ｏ、　ＴＩＢ　１５２）を、血清を１０分の１の置含む１００μｌのＰＢＳ／２ ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）　１０．０２％ＮａＮ５中でインキュベートした。こ の血清は、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウス（３１０系）あるいは非トラン スジェニックマウス（ＣＳ７ＢＬ／６）から免疫後２４日ロー取った血清、ある いはネガティブコントロールとして、免疫していないヒトＣＤＩランスジェニッ クマウス（３１０系）からのとった血清である。免疫は、上述と全く同様に行っ た（すなわち、５０μｇのヒトｒｓＣＤ４／ＣＦＡ；０．２ｍｌ　ｔ、ｐ、）。 氷上で３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳ１０．０２％ ＮａＮ３で洗浄した。次に、ＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウスＩｇ（ＦＩ＋ｔ、）試 薬（Ｃａｐｐｅｌｌ、　Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏａ＋ｅｄｉｃａｌ、　ＷｅｓｔＣ ｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１３１１−１７４４）を加え（製 造元の指定の通りにＰＢＳ／２％　ＦＣＳｌｏ、０２％Ｎａｐｓで）、そして細 胞をさらに２０分量水上でインキュベートした。細胞を２回洗浄し、次いでＦＡ ＣＳｔａｒ蛍光励起セルソーターで分析した。 図３２は、このＦＡＣＳ分析を、蛍光強度の対数に対する相対細胞数（リニアー スケール）をプロア１−したヒストグラムを示す。実線は、２番目の工程の試薬 −ＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウスＩｇ（コントロール）のみで染色された細胞を示 す。ダ・７シユ記号の線は、ヒトｒｓＣＤ４で免疫されたヒトＣＤ４トランスジ エニツクマウス（Ｔｇ）およびヒトｒｓＣＤ４で免疫された非トランスジェニッ クマウス（ＮＴｇ）由来の血清で染色された細胞を示す。 点線は、免疫されていない非トランスジェニックマウス（コントロール）由来の 血清で染色された細胞を示す。 ＦＡＣＳ分析は、ヒトｒｓＣＤ４での免疫によりヒトＣＤ４　トランスジェニッ クマウス中に誘起された１次抗体が、天然の、膜質通型のヒトＣＤ４分子を認識 しないことを示した。抗体は、ヒトＣＤ４の可溶性の形態に独特なエピトープの みを認識するようである。従って、ヒトｒｓＣＤ４に対するヒトＣＤ４　トラン スジェニ。 クマウスの反応および非トランスジェニックマウスの反応との間には明かな違い がある。非トランスジェニックマウスに対して明かに対照的なのは、トランスジ ェニックマウスは、天然の、膜質通型ＣＤ４が有する「自己Ｊエピトープに対す る免疫反応を起こさないことである。 ｘｎ−の　′　・　け アミノ酸変異体であるアカゲザルｒｓＣＤ４が、ヒトＣＤ４　）ランスジェニッ クマウス中で免疫応答を引き起こすかどうかを調べるために、トランスジェニッ クマウス（３１０系）および非トランスジェニックマウスを、ＣＦＡに乳化させ た５０μｇのアカゲザルｒｓＣＤ４　（上述のように産生じ、および精製された ）　（０，２ｍｌ、ｉ、ｐ、）で免疫した。これらのマウスを免疫後４３日ロー ＩＦＡに乳化させた５０μｇのアカゲザルｒｓＣＤ４　（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ 、）で追加免疫した。独立した別のアッセイでは、ヒトＣＤ４トランスジエニツ クマウス（３１３系）および非トランスジェニックマウスを、上述のようにアカ ゲザルｒｓＣＤ４で免疫した。これらのマウスを、免疫後３５日ロー、上述のよ うに追加免疫した。両方のアッセイにおいて、血液を採取し、免疫後の種々の日 数における血清試料を、アカゲザルｒｓＣＤ４を認識する抗体およびヒトｒ　５ ＣＤ４を認識する交叉反応性抗体についてＥＬＩＳＡで分析した。 ＥＬＩＳＡアッセイは、実施例ＸＩに記載のように、アカゲザルｒｓＣＤ４ある いはヒトｒｓＣＤ４　（５μｇ／ｍｌ、　ＰＢＳで希釈）でコートサれたプレー トで行った。 ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図３３に示す。示されている抗体価は、以下のよう に決定された。ヒトｒｓＣＤ４に反応する血清では、抗体価は、スタンダードの モノクローナル抗ヒトｒｓＣＤ４抗体の結合量の５０％の結合を示す血清希釈比 の逆数で表す（実施例Ｘ■を参照）。しかし、このモノクローナル抗体は、アカ ゲザルｒｓｃＤ４でコートしたプレートに結合しなかった。従って、ヒトｒｓＣ Ｄ４でコートしたプレートおよびアカゲザルｒｓＣＤ４でコートしたプレートに 結合する非トランスジェニックマウスの抗アカゲザルｒｓＣＤ４ポリクローナル 血清の抗体価の高いものを、抗アカゲザルｒｓＣＤ４抗体アッセイのスタンダー ドに用いた。詳細には、スタンダードに使用されたのは、ＣＦＡ中の５０μｇの アカゲザルｒｓＣＤ４で免疫し、４３日百にＩＦＡ中のアカゲザルｒＳＣＤ４で 追加免疫した非トランスジェニックマウスからの血清であった。血清を２次免疫 応答後７日目（すなわち、免疫後５０日ローに採取した。実験用血清の抗アカゲ ザルｒｓＣＤ４抗体価は、７カゲザルｒｓＣＤ４をコートしたプレートで決定し 、スタンダードの非トランスジェニックマウスポリクローナル抗アカゲザルｒｓ ＣＤ４血清の結合量の５０％の結合を示す血清希釈比の逆数として表した。 γカゲザルｒｓＣＤ４特異的抗体として得た抗体価を、ヒトｒｓＣＤ４特異的抗 体の抗体価と直接比較し得る値に変換するために、変換定数を確立した。これは 、スタンダードポリクローナル抗アカゲザルｒｓＣＤ４血清を、ヒ）　ｒｓＣＤ ４でコートしたプレートおよびアカゲザルｒｓＣＤ４でコートしたプレートで平 行してアッセイして、各々の形態のｒｓＣＤ４との相対結合能力を直接測定する ことにより、なされた。抗アカゲザルｒｓＣＤ４血清は、ヒトｒｓＣＤ４に対す るより２倍よくアカゲザルｒｓＣＤ４に結合すると決定した。すなわち、ヒトｒ ｓＣＤ４でコートしたプレートへのスタンダード抗アカゲザルｒｓＣＤ４血清の 結合は、２倍に希釈した血清のアカゲザルｒｓＣＤ４でコートしたプレートへの 結合と同等である、ということである。従って、スタンダードの血清の抗アカゲ ザルｒｓＣＤ４抗体価は、その抗ヒトｒｓＣＤ４抗体価の２倍であった。全ての 実験用抗アカゲザルｒｓｃＤ４血清の抗体価は、スタンダードポリクローナル抗 アカゲザルｒｓＣＤ４血清との比較により、調整した。 図３３では、０ローにＣＦＡ中のアカゲザルｒｓＣＤ４で免疫し、４３日ローＩ ＦＡ中のアカゲザルｒｓＣＤ４で追加免疫した、ヒトＣＤ４　トランスジェニッ クマウス（３１０系）　（Ｔｇ）を黒い印で表し、非トランスジェニックマウス （ＮＴｇ）を白い印で表す。個々のマウスは、四角あるいは丸で表す。白い三角 は、無関連の抗原としてＯローにＣＦＡに乳化させたフ′タインスリン（５０μ ｇ）（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）で免疫し、４３日ローＩＦＡ単独（０，２ｍ１ ．　ｉ、ｐ、）を投与した非トランスジェニックマウスの反応を表す。左のパネ ルは、免疫後の種々の日数における血清の抗アカゲザルｒｓＣＤ４抗体価を示す 。右のパネルは、免疫後の種々の日数における抗ヒトｒｓＣＤ４抗体価を示す。 ３１３系トランスジエニツクマウスでの独立したアッセイから得た結果は、図３ ３に示す実験データと矛盾しなかった。 図３３に示したように、ヒトＣＤ４　）ランスジェニックマウスおよび非トラン スジェニックマウスをアカゲザルｒｓＣＤ４で免疫すると、免疫原（アカゲザル ｒｓＣＤ４）を認識する抗体およびヒトｒｓＣＤ４を認識する抗体を誘起こした 。これらの結果は、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウスが、非トランスジェニ ックマウスの応答に匹敵する抗７カゲザルＣＤ４免疫応答を起こし得ることを示 す。さらに、この結果は、アカゲザルｒｓＣＤ４での免疫化が、ヒトＣＤ４　） ランスジェニックマウスの「寛容を破る」ことに成功したことを証明する。なぜ ならば、ヒトＣＤ４トランスジェニ、クマウスおよび非トランスジェニックマウ スの両者は抗体価の高い、ヒトｒｓＣＤ４に結合する抗体を産生じたからである 。 さらにアカゲザルｒｓＣＤ４で免疫したヒトＣＤ４）ランスジェニックマウスお よび非トランスジェニックマウスの血清を、天然の、膜質通型のヒｌ−ＣＤ４を 認識する抗体について分析した。 免疫蛍光染色を、正常ＣＤ４ゝリンパ球の原料として正常アカゲサル末梢血リン パ球（ＰＢＬ）　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｃｅｎｔｅｒ。 ５ｏｕｔｈｂｏｒｏ、　ＭＡ）および正常ヒトＰＢＬ　（健康な提供者から得た ）で行った。 アカゲザルＰＢＬおよびヒトＰＢＬは、以下のようにして分離した。血液（１０ ｍ１）をＲＰＭＩ−１６４０培地（補充していない）で２倍に希釈し、５０ｍ１ のチューブ中の３ｍｌのリンパ球分離用培地（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ 、　Ｄｕｒｈａｍ、　ＮＣ，Ｃａｔ、　Ｎｏ　３６４２７）に、室温で重層した 。チューブを室温で３０分間、４００ｘｇａｖで遠心した。ＰＢＬをインターフ ェイスから採集し、そして染色する前に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ１０．０２％Ｎａ Ｎ３で３回洗浄した。 さらに、分裂促進因子ファイトへマグルチニン（ＰＩ（Ａ）にさらすことにより 刺激した後、組み換えインターロイキン２（ＩＬ−２）で維持されたヒトＰＢＬ 　（すく上に記載のように調製された）も染色した。なぜならば、これらの細胞 は、少し異なる形態のヒトＣＤ４分子を表すかもしれないからである。活性化ヒ トＰＢＬは、以下のように調製した。正常ヒトＰＢＬ　（ｔｏｏｌの完全ＲＰＭ Ｉ中２ＸＩＯ６細胞／ｍｌ）を、Ｃｏ５ｔａｒ　Ｔ−２５フラスコ（Ｃｏ５ｔａ ｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、Ｃａｔ、Ｎｏ、３０２５）　に、ｌＡｔｇハ １のＰＨＡ　（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　 Ｍｌ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　３１１０−５７−３）とともに入れた。細胞を、加 湿した、５％ＣＯ２インキュベーターで３７°Ｃで３日間培養した。３日後、細 胞を完全ＲＰＭＩ培地で１ｘｌＯ６細胞／ｍｌの密度に調整し、組み換えＩＬ− ２（ｒｌＬ−２）　（ｒ−Ｔ細胞成長因子、ヒト、ｒｈＴＣＧＦ、　Ｌｏｔ　Ｎ ｏ、　ＮＰ　６００３ＳＯ９，５０ｍＭ酢酸中２．１ｘ１０６単位／ｍｇ、Ｂｉ ｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡにより製造、−７０°Ｃで 保存）を２０単位／ｍｌになるように加えた。新鮮なｒｌＬ−２を３日毎に加え 、１ｘｌＯ’細胞／ｍｌの密度で細胞を維持するように、必要に応じて細胞密度 を調整した。細胞を総じて３−４週間、培養した。この期間内で使用された細胞 の間に明かな違いはなかった。 蛍光染色を、３Ｘ１０５ＰＢＬ　（アカゲザル、ヒトあるいは活性化されたヒト のＰＢＬ）および、アカゲザルｒｓＣＤ４で免疫したトランスジェニックマウス および非トランスジェニックマウスの血清（１０分の１の希釈）を用いて、実施 例Ｘに記載のように行った。ヒトＴ細胞およびアカゲザルＴ細胞の両方のＣＤ４ を認識するモノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ、　Ｄｉｃｋｉｎｓ ｏｎ、　ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、　ＣＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　６３２０） を染色のポジティブ）　７　トａ　−ルとして（製造元の指示通り）用いた。Ｆ ＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎ ｏｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１ １５−０１５−０７１）を、第二の工程の試薬として使用した。染色された細胞 を、実施例Ｘに記載のように、ＦＡＣＳで分析した。 図３４は、以下のアカケザル、ヒトおよびヒトＰＨＡ活性化ＰＢＬの蛍光染色を 示す。　（１）ポジティブコントロールＬｅｕ３ａモノクローナル抗体（上図、 点線）、　（２）第二工程の試薬単独、すなわちネガティブコントロール染色（ 上図、実線）、（３）トランスジェニックマウスの抗アカゲザルｒｓＣＤ４血清 （ＮＴｇ）　（中口、点線）、（４）非トランスジェニックマウスの抗アカゲザ ルｒｓＣＤ４血清（ＮＴｇ）　（下図、点線）および（５）ＣＦＡ中のブタイン スリンで免疫腰　ＩＦＡ単独で追加免疫した非トランスジェニックマウスの血清 、すなわちネガティブコントロール染色（下図および中口、実線）である。全て の血清は、２次反応後１９日目（すなわち免疫後６２日ロー由来のものである。 この実験は、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウス血清および非トランスジェニ ックマウス血清の両方が、天然の、膜質通型アカゲザルＣＤ４を認識する抗体を 含んでいることを示す。しかし、非トランスジェニックマウス血清のみが、分離 されたばかりの新鮮なヒトＰＢＬあるいは活性化ヒトＰＢＬのいずれかの天然の 、膜質通ヒｌ−ＣＤ４を認識する抗体を含んでいた。 ｘｍ−Ｈ＋ｖＱ染の　法あるいは几　としての可次に、ＨＩＶの感染の予防およ び処置に有用な抗体、例えばＨｌｖを認識する抗体が、アカゲザルｒｓＣＤ４に よる免疫化によって引き起こされるかどうかを調べた。このような抗体を引き起 　−こすことは、免疫ネットワークの存在を支持する観察に基づいて可能である と考えられている（すなわち、抗体による抗イデイオタイプ抗体の誘起）［例え ば、１．Ｍ、Ｒｏｉｔｔらの１ｍｍｕｎ。 皿、ｐｐ、１０．１−１０．１１　（Ｇｏｗｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ）（１９８５）］を参照）。概して、抗原は、次に抗イデイオタイプ 抗体を引き起こし得る特定の可変領域構造（イディオタイプ）を有する抗体を引 き起こす。ある種のそれらの抗イデイオタイプ抗体は、元の抗原に構造的に関連 し、そのため元の抗原とイディオタイプ抗体への結合において競合する。さらに 詳細には、ＣＤ４免疫原で引き起こされた抗体（抗ＣＤ４抗体）は、特定の特異 性（イディオタイプ構造）を有し、そしてイディオタイプ抗体の内部イメージで ある抗イデイオタイプ抗体を引き起こす。それらの抗イデイオタイプ抗体は、構 造的に免疫原ＣＤ４に似ており、ＣＤ４のようにＨＩＶに結合する。 瓦−影ｈΣｌヒゴ」口し創１と一二ｉ乙この可能性をテストするために、実質的 に実施例ＸＩに記載のように、精製旧Ｖ　ｇｐ１２０　（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ ）でコートしたプレート上で、アルカリホスファターゼＩｎヤギ抗マウスＩｇＧ 特異的検出試薬、その後に基質ＰＩＩＩＰＰを使用してＥＬＩＳＡアツセイを行 った。このアッセイの結果を図３５に示す。これは、トランスジェニックマウス （３１０系）　（Ｔｇ）および非トランスジェニックマウス（ＮＴｇ）をどちら も実施例Ｘ■のようにフロインドアジュバントに乳化させたアカゲザルｒｓＣＤ ４で免疫および追加免疫して得た血清の旧Ｖ　ｇｐ１２０への結合活性を示す。 グラフは、血清の希釈比に対する４０５ｎｍでの吸光度を示す。黒丸は、１次抗 アカゲザルｒｓＣＤ４応答の１０日ローすなわち免疫後１０日ローの血清を表す 。黒三角は、２次抗アカゲザルｒｓＣＤ４応答の７５目（免疫後５０日日目の血 清を表す。黒四角は、２次応答の１９日５ぐ免疫後６２日日目の血清を表す。白 丸は、２次応答の２８日５ぐ免疫後７１日口）の血清を表す。 このアッセイは、アカゲザルｒｓＣＤ４で免疫すると、ヒトＣＤ４トランスジエ ニツクマウスでｇｐｌ　２０への結合活性が引き起こされることを証明する。ア カゲザルｒｓＣＤ４で免疫した非トランスジェニックマウスでは、そのような活 性はほとんど、あるいは全く引き起こされなかった。図３５に示すデータは、ア ヵゲザルｒｓＣＤ４で免疫した、２つの他のヒトＣＤ４トランスジエニツクマウ ス（３１０系）および４つの他の非トランスジェニックマウスから得た結果と同 様である。さらに、ＣＦＡ中のブタインスリン、その後ＩＦＡで免疫したＴｇお よびＮ７ｇマウスがらのコントロール血清には検出可能なｇｐ１２０結合活性は 見い出されなかった（データは示されていない）。 図３６は、２つの３１３系トランスジエニツクマウス（黒丸および黒四角）およ び２つの非トランスジェニックマウス（白丸および白四角）の、ヒトｒｓＣＤ４ への結合活性（左のパネル）および旧Ｖ　ｇｐｔｚｏへの結合活性（右のパネル ）の出現の動態を示す。これらのマウスは、ＣＦＡ中の５０μｇのアカゲザルｒ ｓＣＤ４　（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）で免疫した後３５日ローＩＦＡ中のアカ ゲザルｒｓＣＤ４５０μｇ（０，２ｍ１．　ｉｐ、）で追加免疫したものである 。図３６はさらに、２つのネガティブコントロールマウス（１匹はトランスジェ ニック、もう１匹は非トランスジェニ、２り）（黒三角および白三角）の、ヒト ｒｓＣＤ４および旧ｖ　ｇｐｔｚｏへの結合活性を示す。これらのマウスは、Ｃ ＦＡ中のブタインスリン５０μｇ　（０，２ｍｆ、ｉ、ｐ、）　テ免疫し、免疫 後３５日口重１ＦＡ　（０，２１１Ｉｌ、　ｉ。 ｐ、）で追加免疫した。データは、抗ヒｈ　ｒｓＣＤ４抗体価および抗ｇｌ）１ ２０抗体価〈実施例ＸＩに記載のように、ヒトｒｓＣＤ４でコートしたプレート によるＥＬＩＳＡ、および、上述のようにｇｐｔｚｏでコートしたプレートによ るＥＬＩＳＡで測定）を、免疫後の日数に対してプロットしたものである。 抗ｇｐ１２０結合活性の力価は、スタンダードのｇｐ１２０特異的モノクローナ ル抗体（抗旧Ｖ−１ｇｐ１２ＯＮ、配列特異的、中和抗体）（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｗｉｌｍｉ ｎｇｔｏｎ。 ＤＥ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　ＮＥＡ−９３０５）のｎｇ等価物／ｍｌとして表さ れている。 トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスの両方が、ヒトｒ ｓＣＤ４に交叉反応する抗体を産生してアヵゲザルｒｓＣＤ４に反応したが、ア カゲザルｒｓＣＤ４で免疫したトランスジェニックマウスのみが、有意な抗旧ｖ 　ｇｐ１２０結合力価を示した。ｇｐｔｚｏへの結合活性は、アカゲザルｒｓＣ Ｄ４に対する１次応答の後期あるいは２次応答の初期に現れた。２次応答の進行 期間中に、抗ｇｐ１２０力価は横ばいになるか、あるいはわずかに増加した。 ｇｐｔｚｏへの特異的結合活性の出現および、それが７カゲザルｒｓＣＤ４で免 疫したトランスジェニックマウスの血清に独特であることは、衝撃的である。我 々は、ｇｐｔｚｏへの特異的結合活性がｇｌ）１２０分子に対して特異的な結合 部位を宵する抗体によるものであり、そして免疫原あるいはその断片に結合した 後にｇｐｔｚｏに結合する、アカゲザルｒｓＣＤ４に対して特異的な抗体による ものではないことを証明したかった。そのような可能性は、起こりにくい。なぜ ならば、トランスジェニックマウスおよび非導入マウスの両者は、抗ｒｓＣＤ４ 抗体を作るが、トランスジェニックマウスのみか、有意なｇｐｔｚｏに特異的な 結合活性を有するからである。それでもやはり、実際にヒトＣＤ４トランスジエ ニツクマウスでｇｐ１２０特異的抗体を引き起こすことを証明するために我々は ２つの独立した方法を取った。これらの方法を以下に示す。これらは次のことを 証明する；　（１）　ｇｐ１２０特異的抗体は、トランスジェニックマウスの抗 アカゲザルｒｓＣＤ４血清に含まれるｒｓＣＤ４特異的抗体から分離し得る；お よび（２）　ｇｐ１２０特異的１特異的１細産生Ｂ細胞ゲザルｒｓＣＤ４で免疫 したトランスジェニックマウスで活性化されていた。 Ｂ、１（ＩＶ　１２（１，”、　の　百アカゲザルｒｓＣＤ４で免疫したヒトＣ Ｄ４　トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスから採取し た血清をｇｌ）１２０アフイニテイーカラムで分画し、ｇｐ１２０特異的抗体を 精製し、そして全血清中の他の活性成分からそれを分離した。 ｇｐｌ　２０アフイニテイーカラムを、以下のようにＲ製した。製造元の勧める 手順に従って、Ｏ，ＩＭホウ酸ナナトリウム１０３Ｍ　ＮａＣ１（ｐ）Ｉ　８． ４）中の５　Ａ２＄８／四ｌの濃度の精製したｇＰＩ２０　（ｉｏｌｌ）を０、 ３ｇの臭化／アン活性化セファロース４Ｂ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｂ　Ｎｏ。 Ｃ−９１４２）に結合した。結合効率を５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で調べて、９５パ ーセントより大きいことがわかった。樹脂を５容量の５０ｍＭグリシン１０．５ Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ３，０）で洗浄した後、５容量の２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ ｌｏ、５Ｍ　ＮａＣ１１０，０２％アジ化ナトリウムで洗浄し、そして後者の緩 衝液中４°Ｃで保存した。 ｇｌｌ１１２０特異的抗体の回収を目的とする「大量」分画実験に使用した血清 は、ヒトＣＤ４トランスジエニツクマウス（３１３系）および非トランスジェニ ックマウスから取った全血１（１００μｍ）であり、これらのマウスはどちらも Ｏ日目にＣＦＡ中のアヵゲザルｒｓＣＤ４５Ｑｕｇ　（０，）！ｍ１．　ｉ、ｐ 、）で免疫し、３５日５にＩＦＡ中のアカゲザルｒｓＣＤ４５０μｇ　（０，２ ｍｌ、　ｉ、ｐ、）で追加免疫した。 使用された特異血清は、免疫後４９日口のものであった。ＰＢＳ　（ｐＨ７，５ ）　（９００μｍ）を、血清試料各１００μｌに加えた。各希釈血清試１１２０ μｌを出発材料の代表としてとっておいた。 各試料の残り（９８０μ■）を、２５０μＩのｇｐｔｚｏを結合させたセファロ ース（上述のように調製）に、１．７ｍｌのエビチューブ（＾ｍｅｒｉｃａｎ　 ＢｉｏａｎａＬｙｔｉｃａｌ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　７０２８００）中で加えた 。このエビチューブの蓋をし、室温で３時間、ＴＥＫ−ＰＲＯｔｕｂｅ　ｒｏｅ ｋｅｒ　（ＣＡｔ、　Ｎｏ、　Ｒ４１８５−１０）で揺らした。次いで樹脂を沈 澱させるために、１０．０００ｘｇＡりで５秒間遠心した。結合していない物質 を含む上澄みを除去した。ｇｌ）１２０−セファロース（結合した物質を含む） を、グラスウールをつめた２ｍｌのプラスチックピペットで作ったカラムに移し 、３ｘ０．５ｍＩ　ＰＢＳを、自然重力で流して洗浄した。１回の洗浄当り５０ ０μｍのＰＢＳｌｏ、　５Ｍ　ＮａＣｌで２回洗浄し、そして１回の洗浄当り５ ００μｌ１７）ＰＢＳで２回、最後の洗浄を行った。次に、結合した物質をカラ ムから、１００μｌの５０ｍＭグリシン（ｐＨ３，０）　／２５０　ｌ１Ｍ　Ｎ ａＣ１／１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡで溶出した。６つの溶出フラクション（〜１００ μｌ／フラク／−Ｊン）を各カラムから採集した。各々のフラクションを、採取 直後に７．５μｍの０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，２）を加えて中和した。 とっておいた出発材料、「結合しなかった分画」　（すなわち最初の血清とのイ ンキュベージコン後の上澄み）、ＰＢＳ洗浄物、および溶出したフラクションを 、ｇｐ　ｌ　２０、ヒトｒｓＣＤ４およびアカゲザルｒｓＣＤ４の各々でコート したマイクロタイタープレートでのＥＬＩＳＡにより、実施例ＸｊｌＬ　Ｘ＋お よびＶｌ＋で各々記載したようにアッセイした。抗体価あるいは相対濃度を実施 例Ｘｌｌに述べたように算出し、各フラクション中のｇｐ＋　２０％異的抗体あ るいはｒｓＣＤ４特異的抗体のａ度を出した。各フラクションの抗体単位の総量 は算出し得る。なぜならば、抗体濃度は測定され、そして各フラクンヨ／の総容 量がわかっているからである。ごの実験の結果を図３７に示す。左のパネルは、 ｒ　５ＣＤ４　テ免疫したトランスジェニックマウス（黒い棒）および非トラン スジェニックマウス（白い棒）からの種々のフラクションの抗ｇ＋）１２０結合 活性のパーセントを示す。右のパネルは、種々のフラクションの抗ヒトｒｓＣＤ ４活性のパーセントを示す。 出発材料の結合活性を１００％と定義する。 トランスジェニックマウスの抗アカゲザルｒｓＣＤ４血清のｇｐ１２０特異的結 合活性の約６０％が、ｇｌ）１２０−セファロースに露呈したことで取り除かれ た。他のデータは、単にｇｌ）１２０−セファロースの量を増加させることによ り、ｇｌ）１２０への特異的結合活性をより多く取り除き得たことを提言してい る。なぜならば、このカラムで同じ血清試料の少量を展開させると１００％のｇ ｐ１２０への結合活性がとり除かれたからである（データは示されていない）。 ＰＢＳ洗浄液中には無視し得る程度のｇｐ１２０特異的結合活性しかなかった。 しかし、かなりの量のｇｐ１２０特異的結合活性をカラムから溶出した。対照的 に、ヒ）　ｒｓＣＤ４に特異的な抗体は、ｇｐ１２０カラムには結合せず（１ｎ ｇ／ｍｌより少ない）、そシテ溶出フラクション中には、ヒト抗ｒｓＣＤ４活性 は本質的に検出されなかった。アカゲザルｒｓＣＤ４特異的結合活性の結果はこ れと一致する（データは示されていない）。これらのデータは、ヒトＣＤ４　ト ランスジェニックマウスの抗アカゲザルｒｓＣＤ４血清中のｇｌ）１２０特異的 結合活性が、ｇｐ１２０特異的抗体によるものであり、そして抗ｒｓＣＤ４抗体 に仲介されないことを示す。 Ｃ，ＨＩＶ−１２０塩の ｇｌ）１２０特異的抗体が、アカゲザルｒｓＣＤ４で免疫したヒトＣＤ４トラン スジエニツクマウス中で実際に誘起されるかどうかを決めるのに使用する２番目 の方法は、次の仮説に基づいている。 もしアカゲザルｒ　５ＣＤ４への応答が、ｇｌ）１２０に特異的な１ｇレセプタ ーを有するＢ細胞を刺激し、抗ｇｐ１２０抗体を分泌させるならば、アカゲザル ｒｓＣＤ４で先に免疫され、次いでｇｌ）　１２０抗原そのものを投与されたマ ウスは、単に抗ｇｐ１２０への１次応答だけではなく、追加免疫されたｇｌ）１ ２０応答を起こすと考えられる。この仮説を試験するために、アカゲザルｒｓＣ Ｄ４でプライムされた（０日月にＣＦＡ中のアカゲザルｒｓＣＤ４５０μｇ（０ ，２ｍ１．　ｉ、　ｐ、）、３５日目にＩＦＡ中のアカゲザルｒｓＣＤ４５０μ ｇ（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、））ヒトＣＤ４　トランスジェニックマウス（３１ ３系）に、免疫後７５０目に生理食塩水中のｇｐ１２０５０μｇ（０，２ｍｌ、 　ｉ、ｐ、）を投与した。生理食塩水でｇｌ）１２０を投与する根拠は、生理食 塩水中の抗原の投与は、タンパク質抗原に対する強い１次免疫応答を引き起こす ′には十分でないが、動物が先にプライムされている場合の応答を追加免疫し得 るからである。 この実験には２匹のフントロールマウスが含まれている。 １匹のトランスジェニックコントロールマウス（３１３系）に、０日月にＣＦＡ 中のブタインスリン５０μｇ　（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）を投与した後３５日 目にＩＦＡ単独（０，２ｍ１．　ｉ、　ｐ、　）を投与し、次いで７５日目に生 理食塩水中のｇｐ１２０５０μｇ　（０，２ａ＋１．　ｉ、ｌ１ｌ）を投与シタ 。２四回のトランスジェニックコントロールマウス（３１３系）には先に免疫せ ず、７５日目に生理食塩水中のｇｐ１２０５０μｇ　（０，２１１１１，ｉ、Ｉ ）、）を投与した。この実験の結果を図３８に示す。これは、固相ＥＬＩＳＡに より測定された抗ｇｐ１２０１ｇＧの抗体価を示す。 我々は両方のコントロールマウスが、生理食塩水中で投与されたｇｐｉ２０に対 する実質的な１次応答を起こさなかったことを見い出した。しかし、フロイント アジ二、ｚＨント中のアカゲザルｒｓＣＤ４でプライムされたトランスジェニッ クマウスは、ｇｐ１２０／生理食塩水の投与に応答して、有意に増加したレベル のｇｐ１２０特異的抗体価を産生じた。さらに、もしそれが単に１次抗ｇｐ１２ ０応答によるものならば、この抗体価は予想よりはるかに高い。この結果は、ア カゲザルｒｓＣＤ４への暴露が、次のｇｐ１２０そのものへの暴露により引き起 こされるｇｐ１２０への応答をプライムしたことを示す。この結果はまた、アカ ゲザルｒｓＣＤ４での免疫化により引き起こされたｇｐ１２０への結合反応を増 加させる方法を示す。 Ｄ、１６０を発　している細胞の　“′染我々ハ次に、ヒトＣＤ４トランスンエ ニノクマウスのアカゲザルｒｓＣＤ４での免疫化により引き起こされた抗ｇｌ） １２０抗体が、ｇｐ１２０を発現している細胞を認識し得るかどうかを調べた。 免疫染色は、組み換えｇｐ１６０をその表面に発現している形質転換したＣＨＯ 細胞（Ｉｎ　Ｉ／ｊｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。 Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　ＭＤ、ＩＶＩ−１０２３６）で行い、コントロール集団 として、組み換えＬＦＡ−３を発現している形質転換されたＣＨＯ細胞を用いた ［ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１９２４］。 接着性であるＣＨＯ細胞を染色のために５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ　（ｐＨ７゜ ５）で５分間、３７℃で処理して培養フラスコから剥した後、細胞を含有する培 養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ　Ｔ−７５あるいはＴ−１５０）をたたき、懸濁した 細胞を５００１１の円錐型チューブに採集した。 細胞を２回、冷たい染色用緩衝液（ＰＢＳ／２％　ＦＣＳｌｏ、０２％ＮａＮ５ ）で洗浄した。染色は、上述に記載のように、５ｘｌＯ’個の細胞（染色用緩衝 Ｐ＆ｓｏμｍ中）を、最終希釈１／１０の種々の血清とともにインキュベートし た。ポジティブコントロールとして、ＤｕＰａｎｔ抗旧’／−１ｇｐ１２ＯＮマ ウスモノクローナル抗体を１０Ｆｇ／＋１の濃度で使用した。ネガティブコント ロールとして、　ＭＯＰＣ−２１（ＩｇＧ＋、ｋ）が産生ずる、インタイブが一 致している無関連のマウスミエローマ抗体（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ 、　Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、　ＳＣ）をＩＯμｇ／ｍｌの濃度で使用した。４° Ｃで３０分間インキュベートした後、細胞を染色用緩衝液で３回洗浄した。次に 、細胞を４°Ｃで３０分間、染色用緩衝液で１７２０に最終希釈したＦＩＴＣ標 識ヤギ抗マウスＩｇ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｃ ａｔ、Ｎｏ、　１１５−０１６−０６２）とともにインキュベートして、細胞表 面に結合したマウス抗体を検出した。次に細胞をＦＡＣＳ分析した。その結果を 図３９に示す。 図３９Ａは、組み換えｇｐ工ａｏを発現しているＣＩ（Ｏ細胞の、ネガティブコ ントロール試薬ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇ　（ＦＩＴＣ−Ｇα　Ｍｌｇ）のみ （実線）による染色あるいは、ＭＯＰＣ−２１１ｇ　（γ＋ｋ）およびＦＩＴＣ −ヤギ抗マウスＩｇ（点線）による染色の結果を示す。 これらの２つのネガティブコントロールによる染色は同一であった。 図３９Ｂ（左）は、ｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体（αｇｐｉ２０ｍＡｂ ）（実線）による組み換えｇｐ１６０ｃ）１０細胞の染色が、無関連のＭＯＰＣ −２１ネガテイブコノトロ一ル抗体（点線）による染色に比べて強い蛍光強度へ 移動することを示す。対照的に、組み換えＬＦＡ−３Ｃ）ｔｏ細胞（図３９Ｂ、 右）のｇｐｌ　２０特異的抗体による染色およびコントロールＭＯＰＣ−２１抗 体による染色は区別がつかない。 組み換えｇｐ１６０　ＣＨＯ細胞のｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体による 染色は、図３９Ｂに比べて、抗体価が１μｇ／ｍｌ　（図３９０）に、さらに０ １Ｆｇ／ｍｌ　（図３９Ｄ）に低下するにつれて減少した。 マウス血清による染色を図３９Ｅおよび３９Ｆに示す。ＣＦＡ中のブタインスリ ンＳｏｕ　ｇ　（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）をＯ日月に投与され、ＩＦＡのみ（ ０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）を３５日目に、そしてｇｐ１２０／生理食塩水（０， ２ｍ１．　ｉ、ｐ、）を７５日目に投与されたトランスジェニックマウスからコ ントロールマウス血清ＡおよびＢを得た。血清Ａはこのマウスから７５日目に、 ｇｐ１２０／生理食塩水で追加免疫する前に採取腰血清Ｂは免疫後１０１０１日 目ｐ１２０／生理食塩水生理食塩水追加免疫後２６取目た。図３８のグループＩ Ｉに示すように、このマウスは、弱い１次抗ｇり１２０応答のみを示した。図３ ９Ｅは、２つのコントロール血清（ＡおよびＢ）が、組み換えｇｐ１６０−ＣＨ ○細胞の染色において区別がつかないことを証明する。 ３番目の血清（血ｆｆ１ｃ）を、０５目にＣＦＡ中のｒｓＣＤ４５０Ｆｇ　（０ ，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）で免疫腰３５５目にＩＦＡ中のアカゲザルｒｓＣＤ４５ ０μｇ　（０，２ｍ１．　ｉ、ｐ、）で追加免疫し、そして７５日目に生理食塩 水中のｇｐ１２０　（０，２ｍ１．　ｉ、Ｉ）、）を投与した、トランスジェニ ックマウス（３１３系）から得た。血清Ｃをこのマウスから、ｇｐ１２０／生理 食塩水の投与後２６日目に分離した。図３８のグループ（に示すように、このト ランスジェニックマウスは、高い力価の抗ｇｌ）１２０応答を起こした。興味深 いことに、血清Ｃは、ＤｕＰｏｎｔ　ｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体によ る染色で観察された蛍光強度に匹敵する移動を示し、コントロール血清Ｂより強 い蛍光強度で染色した（図３９Ｆを参照）。血／！ＩＣの染色は、ｇｐｌ、６０ を発現しているＣＨＯ細胞に特異的であった（図３９Ｆ、右を参照）。 上述の実験は、細胞表面のｇｐ１５０分子を認識するｇ＋）１２０特異的抗体が 、アカケザルｒｓＣＤ４で免疫することにより、ヒトｒｓＣＤ４トランスンエニ 、クマウスに引き起こされることを証明する。 Ｅ、感染　アッセイ ヒトＣＤ４１−ランスジェニックマウスがアカゲザルｒｓＣＤ４に応答して産生 ずる抗体の潜在的治療効果を調べるために、トランスジェニックマウスの血清を ２つのインビトロのアッセイの各々に供した。第一アッセイでは、旧■の感染力 の阻害を測定した。第ニアノセイでは、ＨＩＶに感染した細胞間での融合細胞形 成の阻害を測定した。 感染力測定のために、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆらの−ｔ（ＴＬ’／−１１ｌ −ｎｅｔ＋ｔｒａｌｉｚｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔ ｓ　Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　Ａｎｄ　ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ −９Ｎａｔｕｒｅ、　３１６．　ｐ、　７２　（１９８５）に記載の方法に基づ いてマイクロア、セイを行った。詳細には、補充されたＲＰＭｌ　（１０ｍＭ　 ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６，８）および２ＩＩＩＭグルタミンを含有し、２０％ノＦ ＢＳを補充した、ＲＰＭｌ　１６４０培地）中（２０μｌ）　ｔ’ノＨＴＬＶ− １１１Ｂ株の１００７ＣＩＤｓａを、２０μ＋の希釈してｔ）なし１マウス血清 あるいはヒトｒｓＣＤ４　（ポジティブコノトロール）に加えた。血清試料およ びヒトｒｓＣＤ４の両方を滴定した。４℃で１時間インキュ、−ト後、室温で１ ５分間インキュベートし、補充したＲＰＭＩ（１０μｌ）中（７）４ＸｌＯ’個 ノ０８１６６細胞を、ＨＴＬＶ／血清およびＨＴＬＶ／ｒｓＣＤ４の試料各４０ μｌに加えた。Ｃ８１６６は、ＣＤ４”形質転換ヒト―帯血すンパ球株［Ｊ、　 ５ｏｄｒｏｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２２．　ｐｐ、　４７０−７４　（１ ９８６）］である。３７℃で１時間インキュベート後、各混合物の分注物を３つ のウェル（１５μｌ／ウエル）に入れ、そして各ウェルの総量を、補充したＲＰ ＭＩ培地で２００μｍにした。少なくとも５日後に、融合細胞の存在（＋）ある いは非感染（−）について、ウェルを視覚的に評価した。 上述のように行われた独立した３つのマイクロアッセイで、４つのトランスジェ ニックマウスの抗アカゲザルＣＤ４血清試料および１つの非トランスジェニック マウス抗アカゲザルＣＤ４ｆｆｌｌ清試料を測定した。各アッセイには、独立し たコントロール血清試料が含まれた。これらのコントロール試料は、ＣＦＡ中ノ 無関連の抗原（蛾チトクロームＣ）で免疫され、ＩＦＡ中の同じ抗原で追加免疫 された非トランスジェニックマウスから採取した［Ｒ，Ｈ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ、 −Ｋｅｙ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇ ｅｎ　Ｉｎ　Ａｓ５ｏｃｉａ口ｏｎ　Ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　 Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｌ１ ｌｐｌｅｘ−、Ａｎｎ、　Ｒｅｖｓ、Ｉｍｍｕｎ、、　３．　ｐｐ。 ２３７−６１　（１９８５）を参照〕。各アッセイで、コントロールマウス血清 は、１／１６あるいはそれより高い希釈で感染力を阻害した。 トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニック−マウスの抗アカゲザル ＣＤ４血清ではどちらでも、ｌ／１６あるいはそれより高い希釈で防御効果は観 察されなかった。 我々は次の理由により、これらの観察が決定的でないと考える。正常マウス血清 の特徴である非特異的阻害効果によって、トランスジェニックマウスの抗アカゲ ザル血清の分析は、１／１６より高い希釈に限定された。すなわちインビトロの 条件では防御効果を証明するには低すぎる抗体価しか含有し得るない希釈である 。さらに、示されたように、アッセイは、抗ｇｌ）１２０抗体による阻害活性お よび／あるいは抗腫貫通型ＣＤ４抗体を検出し得た。それにもかかわらず、抗腫 貫通型ＣＤ４抗体を含有し、先に融合細胞アッセイで強い阻害活性を示した非ト ランスジェニックマウスの抗ヒトｒｓｃＤ４血清は、このアッセイでは、部分的 にさえ感染力を阻害し得なかった。従って、ヒトｒｓＣＤ４は、Ｆ！Ａ害のポジ ティブコントロールを確かに提供するが（約１μｇ／ｍｌの濃度において）、マ ウス血清の抗体価は、これらのアッセイ条件では、感染を阻害するには低すぎ得 る。（１／１６希釈の場合、抗体濃度のＥＬＩＳＡによる概算に基づいて、抗ｇ ｐ１２０抗体価は１μｇ／ｍ　ｌより低いと考える）。我々が行ったアッセイで は、単に「＋」（融合細胞が存在）あるいは「−」（感染していない）と、評偏 した。現時点では、感染のレベルの差を定量する方法あるいは反応速度の遅れを 検出する方法はない。最後に、我りの分析は、研究室株ＨＴＬＶ−１１１Ｂに限 られた。ｕ＋ｖ５者からの単離様を用いるアッセイは、より包括的結果を生み得 る。 さらに、Ｂ、　Ｄ、ＷａｌｋｅｒらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８４、　ｐｐ、　８１２０−２４　（１９８４）の記載の ように、トランスジェニックマウスの抗アカゲザルＣＤ４血清を、ＨＩＶに感染 したＨ９細胞および感染していないＣ８１６６細胞との間の融合細胞形成を阻害 する能力について試験した。詳細には、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨａ、ａ＞ および２ｍＭグルタミンを含み、２０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ　１６４０培 地１００μｌ中で、慢性的に）ＩＴＬＶ−１１１Ｂに感染した５ｘｌＯ３個のＨ ９細胞を、トランスジェニックマウスの抗アカゲザルＣＤ４血清試料とともに３ ７℃、５％ＣＯ２下で３０分間インキュベートした。　（Ｈ９細胞は、ＡＩＤＳ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇ ｒａｍ、ＮＩＨｌＢｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤから入手し得る。）次に、ｌｏｏμ ｌの培地中の感染していないＣ８１６６細胞１５ｘｌＯ３個を、各ウェルの最終 量が２００μｌになるように加え、５％ＣＯ２下、３７°Ｃでインキュベートし 、Ｃ８１６６細胞を加えた後２時間および２４時間目に、ウェル当りの総融合細 胞数を数えた。平行した共培養（ｃｏ−ｃｕＨｉｖａｔｉｏｎ）ニハ、ＣＦＡ中 の無関係の抗原（ブタインスリン）　ＣＦＡ中で免疫し、ＩＦＡで追加免疫（ネ ガティブコントロール）した非トランスジェニックマウス血清、あるいはｔｏ− ０，６２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（ポジティブコントロー ル）を用いた。 コントロールに比べて、融合細胞の５０％の減少をポジティブな結果と考えた。 ２つの独立したアッセイを上述のように行った。１つのアッセイでは、１つのト ランスジェニックマウスの抗アカゲザルＣＤ４血清試料は、阻害活性を示し、２ つの非トランスジェニックマウスの抗アカゲザルＣＤ４血清試料も同様であった 。第二の実験では、同じトランスジェニックマウスの抗血清および同じ非トラン スジェニックマウスの抗血／ｌｌ（抗ヒト膜貫通型ＣＤ４抗体を含有）は、阻害 効果を示さなかった。 本発明による微生物および組み換えＤＮＡ分子は、１９９０年４月２６日にイン ビトロインターナ／ヨナルインフーボレーテノドカルチャーコレクション、Ｌｉ ｔｉｉｃｕｍ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託された培養物で実証 され、次のように認定される；１）ＳＱ１３１　／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２ １ｐｓＱ１３４　／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１ｐｓＱＩ３６　／　Ｅ、　ｃ ｏｌｉ　ＪＡ２２１ｐｓＱ１４６　／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１ｐｓＱ１６ ２　／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１ｐｓＱ２０５　／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ ２２１ｐｓＱ２００　／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　；Ａ２２１ｐＤＧＩ００　／　Ｅ、 　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１１）ＢＧ３４１ＪＯＤ、ｒｈＴ４／　Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ＪＡ２２１これらの培養物は、各々、受託番号ＩＶＩ　１０２４３−１０２５１ を割り当てられた。 これまでに本発明の実施態様を数多く述べてきたが、我々の基本的実施態様を変 えて、本発明の方法および組成物を使用する他の実施態様を提供し得ることは、 明かである。従って、本発明の範囲が、代わりの実施態様および、前述の本明細 書およびここに添付する請求の範囲によって定義される変形のすべてを含むこと 、そして、本発明が実施例によって本明細書に提示された特定の実施態様に限定 されないことは、理解される。 ｃｏ４ＦＩＧ、　／Ａ ＦＩＧ、　／Ｅｌ ５仁）で 口 ４０１　ＧＣＴＴＣＡ　４０６ ｕＬｅｕ ＦＩ６．３ Ｆ／Ｇ、４Ａ Ｆ／Ｇ４Ｂ 省 、！ｌ’Ｑ１４６の７ｆ）ゲ１１しＣＤ４主辱ルベ中ＷｕＡｓ　ｐ　Ｓ　ｅ　ｒ Ａｓ　ｐＴｈ　ｒＴｙ　ｒ工１ｅｃｙｓＧ　１ｕＶａｌＧ　１ｕＡｓｎＬｙｓ　 ＬｙｓＧ　ｌｕＧ　１ｕＶａｌＧｌｕＬｅｕＬｅｕＶａ　１ＰｈｅＧ　１ｙＬｅ ｕＴｈｒＡｌａＡｓｎＳｅｒＡｓｐＴｈ　ｒＥ　ｉ　ｓ　ＬｅｕＬｅｕＧｌｕＧ ｌｙＧｌｎＳｅｒＬｅｕＴｈｒＬｅｕＰｒｏＴｒｐＡｒｇＡｌａＰｒｏＬｅｕＶ ａｌＦＩＧ　θ ＦＩｏ、　１２ ｐｏＧ＋ａｏのＣＤ４　ｊ！八へ ｅｔＡｓ ＦＩＧ、／３Ａ Ｇ　ｌｙＧ　ｌ　ｕＬｅｕＴ　ｒ　ｐＴｒｐＧ　１ｎＡｌａＧ　ｌｕＡｒｇＡｌ ａｓｅ　ｒｓｅ　ｒｓｅ　ｒＬｙｓ　Ｓｅ　ｒＴｒｐ工１ｓｐＰｒｏＬｙｓＬｅ ｕＧ１ｎＭｅｔＧｌｙＬｙｓＬｙｓＬｅｕＰｒｏＬｅｕ日１ｓＬｅｕＴｈｒＬｅ ｕＰｒ。 Ｇ　ｌｎＡ　１ａＬｅｕ　Ｐ　ｒｏＧ　１ｎＴｙ　ｒＡ　ｌａＧ　１ｙｒｅ　ｒ Ｇ　１ｙＡｓｎ　ＬｅｕＴｈ　ｒ　ＬｅｕＡｌａＬｅｕＧ　■ ｕＡ　１ａＬｙｓＴｈ　ｒＧ　１ｙＬｙｓ　ＬｅｕＨｉ　ｓＧ　１ｎＧ　ｌ　ｕ Ｖａ　１ＡｓｎＬｅｕＶａ　ｌＶａｌＭｅ　ｔＡｒｇＡｒ　ＬｙｓＡｒｇＧ　１ 　ｕＬｙｓＡ　１ａＶａｌＴ　ｒｐＶａｌＬｅｕＡｓｎ　Ｐ　ｒｏＧ　１　ｕＡ ｌａＧ　ｌｙＭｅ　ｔＴ　ｒ　ｐＧＩｎ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＬｅｕＳｅ　ｒＡｓ　 ｐｓｅｒＧｌｙＧ　１ｎＶａｌ　ＬｅｕＬｅｕＧ　ｌ　ｕ　Ｓｅ　ｒＡｓ　ｎ工 １ｅＬｙｓＦＩＧ、／３Ｂ ｐ　１３Ｇ３４１．ル丁４ザー号τ＄傅１θア勺ゲザ１しくｊ）’ＡＦ／θ１５ Ａ ｇＡｌａｓｅ　ｒ　５ｅｒＳｅｒＬｙｓ　Ｓｅ　ｒＴ　ｒｐｌ　ｌ　ｅＴｈ　ｒ ＰｈｅＡｓ　ｐＬｅｕ　ＬｙｓＡｓｎＬｙｓＧ　１ｕＶ１　ｕＶａｌＡｓ　ｎＬ ｅｕＶａ　ｌＶａｌＭｅ　ｔ　ＡｒｇＡ　１ａＴｈ　ｒＧ　１ｎＰｈｅＧｌｎＧ 　１ｕＡｓｎＬｅｕＴｈ　ｒＣｙｓＧｌｕＶａ　ＩＴｒｐＧ　ｌｙＰ　ｒｏＴｈ ｒＳｅｒ　Ｐ　ｒｏＬｙ　ｓ　ＬｅｕＴｈ　ｒＬａｕｓｅｒ　ＬｅｕＬｙｓＬｅ ｅｕＡｓｎ　Ｐ　ｒｏＧ　１ｕＡｌａＧ　１ｙｒｅ　ｔＴｒｐＧ　１ｎＣｙｓＬ ｅｕＬｅｕＳｅ　ｒＡｓｐ　５ｅｒＧ　１ｙＧｌｎＦＩＧ、１５Ｂ １７０１　ＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴｒＴ ＣＣＴＴＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴｒ　１７５０Ｆ／Ｇ１５Ｃ ４０５１σｍτＡＡＡＴＣＡＡＴ（πＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＭＣＴ ｒＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴｒＡＣ４１００ＦＩＧ、１５Ｅ ＦＩＧ、１５Ｆ ＦＩＧ、　／６ ア４）２′ザル〆７°テト°ｔすや二タイザ！レバづ一升ｐ゛ＦＩＧ、／７ 二戸ベフマＩ：鉗γシブ′ザルペブチμ゛Ｆｌに、　１８Ｂ １ｎＣｙｓ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｓｅ　ｒＡｓ　ｐ　Ｓｅ　ｒＧ　ｌｙＧ　１ｎＶａ ｌ　ＬｅｕＬｅｕＧ　ｌ　ｕ　Ｓｅ　ｒＡｓ　ｎＩ　１ｅＬ凵@ｓ Ｖａ　ｌ　Ｌｅｕ　ＰｒｏＴｈｒＴｒｐＳｅｒＴｈｒＰ　ｒｏＶａｌＧｌｎＰｒ ｏＭｅ　ｔＡｌａＬｅｕＩ　ｌｅＦＩＧ、２０Ｂ 呈引二ｊ二王と耽り盛Σ匹匹−− ＦＩＧ、２／Ａ ＦＩＧ２／Ｂ Ｆ／６２２Ｂ ＦＩ６．２２０ Ｆ／Ｇ、２３ Ｐｓｑ２００・ペグテＦオ亨Ｐｓｑ２０５．ベア７）”Ｆ／θ２４ Ｐｓｑ２００．ｒ：ブチ）　＃ｅ−Ｆ　ＡデテＦＦ／θ２５ 糞麦濃１コＣＤ２タンハ′２噴の、イ芹も糺奢戸万ぐ。 ３′燐捧　）四 ＩＧ２７ ＦＩ６．２９Ｂ ↓ダ　らｇＣξ仝Ｃ含π、ｔｙｚ　当Ｉ４入遣づり Ｈ斥栖氾 ９九〜い汁聚 ｆｌｙ’π’　１０２　１ｔ）３ 榮先充崖のオサぞ（ 登充分崖・づ我 ＥσｊＯ’　７０２ｆｔ）３ 隆り葺崖＝ｌ村駁 πθ　／ｌ）ｆ　／ｌ）２　ぴ ・す丸斥浅の刀玖 ＦＩＧ、　３／ θ　７　７４　、；’４　４０　５４　６３　てえ竣桂才攻 ＦＩＧ、　３２Ａ 菅凡ブモ度の肘君（ 毫九りへの７→俣 扼アカグプ）シト体Ｄ午九体イの 条光５芝りめ＃杖 栄光ブ９への士刊久 ヒト　ｈｌＳ 栄り落友の対表 璧ｙｆ、、５紘八つ対し 唖九簿度の対鉄 Ｆ／に　３５Ａ 泗４寺状Ａ ７ａ　？ｔｌ−ｓど１２４　千看イン畳ノ乙丁主却え９Ｐ／２θ料令ヲカｒＬ トランスフレ７トこにＴ； ＦＩＧ３９Ｇ 肛 後天性免疫不全症候群、Ａ　ＩＤＳ関連複合症（ＡＩ？Ｃ）およびヒト免疫不全 ウィルスの感染を含む、Ｔ４”リンパ球を主要な標的とする感染物質により起こ る、ヒトの疾病の処置あるいは予防に有用な、免疫治療用、予防用および診断用 の組成物。ＨＩＶｇｐｌ　２０に結合する抗体をヒトにおいて引き起こすヒトＣ Ｄ４のアミノ酸変異体および誘導体、あるいはそれらの断片をコードするＤＮＡ 配列。そのようなりＮＡ配列は、本発明の免疫治療用、予防用および診断用の組 成物に有用である。後天性免疫不全症候群、ＡＩＤＳ関連複合症およびヒト免疫 不全ウィルスの感染を含む、Ｔ４”Ｊンパ球を主要な標的とする感染物質により 起こるヒトの疾病の処置層、予防用あるいは診断用として有用であって、Ｈ１／ 　ｇｐ１２０、ヒトＣＤ４あるいはその両方に結合する抗体をヒトにおいて引き 起こす、ヒトＣＤ４のアミノ酸変異体および誘導体を選択するための新規なスク リーニング法。 １−−Ａ、ｌｌｃ、鴫Ｎ−ＰｃＴ／Ｕｓ９１１０３４６゜[Regulatory region of d-coat protein, 3-phosphog Promoters for lysate kinase and other glycolytic enzymes, such as Pho5. promoter of eel acid phosphatase, promoter of yeast α-mating system, and prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses and combinations of these viruses. Other sequences known to control the expression of other genes. A variety of single cell host cells are useful for expressing the DNA sequences of the invention. child These hosts include the well-known eukaryotic and prokaryotic hosts. for example, E, coli, Pseudo□0techniques, Bacillus, Edarido Mikasa, fungi , yeast cells, strains of insect cells, such as Nyūfūkōrifukuyūdan eriri (SF9), CHO and animal cells such as mouse cells, C03I, CO37, B5C1, B5C4 African green monkey cells such as 0 and BMTIO, and human cells, and Plant cells in tissue culture. For expression in animal cells, we use CHO cells. and CO37 cells are used. All vectors and expression control sequences are equivalent to express the DNA sequences of the invention. Of course, it must be understood that it does not always work perfectly. Sara Furthermore, not all hosts function equally well with the same expression system. however , one skilled in the art can determine without undue experimentation and without departing from the scope of the invention. However, one can choose among these vectors, expression control sequences, and hosts. For example, selecting a vector because the vector must be replicated within it Sometimes the host must also be considered. Number of copies of a vector, its number of copies the ability to control vector-encoded ponds, such as antibiotic markers. Tannoic expression must also be considered. Various factors must also be considered in the selection of expression control sequences. example for example, considering the relative strength of the sequence, its controllability, and especially possible secondary structures. This includes compatibility with the DNA sequences of the present invention. Single cell hosts are examination of compatibility with the vector, toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, etc. their secretory properties, their ability to precisely fold immune CD4 proteins, and their fermentation. or culture requirements and production encoded by the DNA sequences of the invention. The selection should be based on the ease with which the product can be purified from the host. Within these parameters, one skilled in the art will be able to use various vector/expression control sequence/host combinations. You can choose to match. This combination is useful for example in CH○ cells or CO37 cells. The DNA sequences of the invention are expressed in fermentation, fermentation, or large-scale animal culture. The immunogenic CD4 protein 7XI protein encoded by the DNA sequence of the present invention can be or can be isolated from cell culture and purified using any of a variety of conventional methods. obtain. Those skilled in the art will be able to determine the most appropriate isolation and purification methods without departing from the scope of the invention. You can choose the manufacturing method. Substantially pure soluble rhesus CD4 protein is Provided by: The immunogenic CD4 protein of the invention can be used in infections where the initial target is T4.73 cells. prophylactic for preventing, treating and diagnosing diseases caused by substances; are useful as , therapeutic, and diagnostic compositions. For such lesions, Al Includes DS, ARCl and HIV% staining. A preferred pharmaceutical composition of the present invention uses cynoscus nigra as the immunogenic CD4 protein. isal CD4, rhesus CD4, chinobanzi CD4, or any of the above. containing one or more of the following soluble fragments. Immunogenic CD4 protein and soluble rhesus CD4/N protein (especially AAI-AA375). Most preferred are pharmaceutical compositions containing. The pharmaceutical composition of the present invention is useful for the prevention and treatment of AIDS, ARC and HrV infections. It also contains additional therapeutic agents for treatment. For example, immunogenic CD4 protein , AZT, HPA-23, phosphonofluormate, suramin, linogubilin and dideoxy/tidine, reverse transcriptase pro6. antiretroviral Can be used in combination with a virus substance or a substance that inhibits HIV protease. Ru. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention comprises alpha interferon, beta interferon, and antiviral agents such as interferons, including gamma interferon. or gluco/dase inhibitors such as castanosvermino. . Furthermore, one or more immunogenic CD4 proteins can be It may be used in combination with more than one of the above therapeutic substances. Such combined therapy is Advantageously, dosages of therapeutic substances can be used to advantageously reduce the cytotoxicity that can occur with a variety of single treatments. prevent harm. The pharmaceutical composition of the present invention contains immunogenic CD4 protein or polypeptides thereof. One or more polymer types (or polymer types) are immunotherapeutically effective. and preferably a pharmaceutically acceptable carrier. Compositions of the invention can be in various forms. These include, for example, tablets, pills, powders, powders, liquid solutions, dispersions or suspensions, liposomes, suppositories, injections and infusion solutions. Solid, semi-solid, and liquid dosage forms, such as, are included. The preferred form is It depends on the intended administration and mode of treatment. The immunogenic CD4 protein of the invention provides anti-HTV-g in humans to which it is administered. To induce the production of p120 antibodies, it may be prophylactic and/or therapeutic. Based on our belief, the preferred pharmaceutical compositions of the present invention are suitable for use in human immunization. similar to other proteins and polypeptides. Therefore, the composition of the present invention , preferably incomplete Freund's adjuvant, aluminum hydroxide, muramylated Peptides, water-in-oil emulsions, or pharmaceutically acceptable substances such as ISCOM. Includes adjuvants that can be used. Preferred modes of administration are intramuscular, intradermal or is via subcutaneous route. Most preferably, the composition contains water in oil as an adjuvant. It contains a emulsion or aluminum hydroxide and is administered intramuscularly. The immunogenic CD4 protein (or multiple immunogenic CD4 proteins) of the present invention ) was administered in an immunotherapeutically effective amount, especially in the immunization schedule sensitization planning. A specific immunogenic CD4 protein (or immunogenic CD4 proteins) Relative immunogenicity of CD4 protein, activity of any adjuvant used, immunogenicity of CD4 protein protein (or immunogenic CD4 proteins) in combination with other therapeutic agents. depending on whether the drug is being administered and the immune status of the subject. It will be clear to those skilled in the art. Immunotherapy in monotherapy for treatment of HIV infection, ARC or AIDS The therapeutically effective dose and immunization schedule are as follows: 'ftL 1 subject Approximately 0. 01 to 10°0mg, preferably 0.0mg. 1 to 1. 0mg of immunity Initial injection of native CD4 protein (with adjuvant), followed by subject Approximately 0.0 per person. 001 to 1. Omg, preferably 0. 01 to 0. 1mg of , several boosts of immunogenic CD4 protein (with adjuvant). Like Alternatively, the booster immunization may be given for 4 weeks after the first injection, or when combined with HIV gQ120. approximately once every 4 days, then for 6 months, or clinically until matching antibodies are detected. Repeat this once a month until there are clear signs of improvement either objectively or experimentally. However However, lower or higher doses and other immunization schedules may be employed. Gains must also be recognized. For the prevention of HIV infection, ARC or AIDS, the treatment methods described above can be used. I can stay. However, preferably the booster injection is about 1 and 2 hours after the first injection. A booster immunization is given 6 months later and then every 2 to 5 years. Multivalent and/or derivatized polyvalent and/or derivatized immunogenic CD4 protein, If the drug is more immunogenic, a lower dose may be needed to be effective. It can be done. The immune system of the present invention is a monkey or chimpanzee CD4 protein or a fragment thereof. Epidemiogenic CD4 tanobacteria can also be detected by current monoclonal antibodies or polyclonal antibodies. It can also be used to increase the sensitivity of Srv assay systems that are based on molecular antibodies. More specifically, the soluble monkey CD4 or soluble chimbafuji-CD4 protein of the present invention proteins that are more easily detected by assays, even when they are present in trace amounts. It can be used to pre-treat test plasma to reduce SrV so as to reduce SrV. Or soluble Soluble monkey CD4 or soluble chimpanzee CD4 protein, anti-SIV in serum Can be used to detect antibodies. For example, soluble monkey CD4 protein is an enzyme-like Used in ELrSA assay to bind indicator and detect anti-SIV serum antibodies I can. The present invention also relates to H produced by humans immunized with the immunogenic CD4 protein of the invention Also provided are human antibodies that bind IV gp120. Such anti-HIV gp1 20 antibodies are useful for passive immunotherapy and immunoprophylaxis in humans infected with HIV. be. The administration method for such passive immunization is similar to that of other passive immunotherapies. It is similar to this. In order that the invention may be better understood, the following examples are provided below. this These examples are for illustrative purposes only and may not be used to invent the invention in any way. shall not be construed as limiting the scope of. Example ■ -λ tlo cynomolgus monkey peripheral lymphocyte cDNA Leippus cynomolgus monkey From Le's blood F & (EG & G Mason, MA>, lymphatic fluid H lysis if (LS M) (Organon Teknika, Durham, NC, Cat, NO Separate peripheral blood lymphocytes (PBL) by density gradient centrifugation using did. Next, total 1'lNA from these PBL cells was treated with guanidinium isothionanate/ Ce/ium chloride method [T, Maniatis et al., Molecular C1oni n, p, 196 (Cold Spring Harbor Laborat ory) (1982); J, M. Chirgwin et al. - Isolation Of Biologically Active R4bonucleic Ac1d From 5source s　Enriched　In　R4bonuclease'',　Bioc匡畦■ Yu, 18. pp, 5294-5299 (1979)] . Poly A″’ mRNA was separated by oligo dT-column chromatography. Ta. 5 μg of poly A' III RNA (500 ng/ul) was added to CH3Hg0 Denatured for 10 min at room temperature in H (2,5 mM). Then, 1/10 volume of β- Mercaptoethanol (0.7M) was added and incubated for 5 minutes at room temperature. First and second cDNA strand synthesis was performed using a cDNA synthesis kit (BethasdaRe search Laboratories, Gaithersburg, MD , Cat, No. 8267SA> according to the manufacturer's instructions. I followed the rules. Double-stranded cDNA was ligated to linker-35/36K using standard methods. linker -35/36 has a linker/adapter for EcoRI/Not I with the following sequence. - is: 5° AATTCGAGCTCGAGCGCGGCCGC3°3°GCTCG AGCTCGCGCCGGCG　5゜This linker has a bump with EcoRI at 5゜. It has a protrusion and a blunt end at 3°. This linker is M, D, Matt eucci and M, I (, Caruthers, -The 5ynthe sis Of Oligodeoxypyrimidines On A Pol ymer 5upport-, J, Am, Chem, Soc,, 103. DNA/link according to the method described in pp. 3185-91 (19at). Sesizer (Apptied Biosystems, 380A, Fost Synthesized by er C1ty, CA). Purify the ligated cDNA and Pass fragments larger than 0 bp through a Cefazo, DiS G150 column (5 ml). 0. OIM Tris-HCIlo, 4M NaCl 10. 01 M Na2 Glue in EDTA (pH 7,4) was screened with 17 tograph. Excess linker - is 5ect 4L spin column (5Prime -3Prime, P A, Cat, No. 5301-993260). It was treated and removed according to the manufacturer's instructions. The first cynomolgus monkey PBL cDNA library was prepared as follows. 5 The cDNA eluted from the select JL column was digested with 5 μg of EcoRl. ethanol precipitated with bacteriophage λgtlo [J, Sambr. ook et al., Molecular C1onin, 1. p, 2. 41 (Col. d Spring Harbor Laboratory Press) (1 989)]. The precipitated material was incubated at 16°C overnight at 0.5°C. 05M Tris (pH 7) ,8)10. 01M MgCl210. 03M NaC110,001M Suberumiji 710. 2mM EDTAlo, 002M(7) dithiothlate Rule (r　1)TTJ　10. 25 to 1 mM ATP/l mg/nl T4 DNA ligase (NewEng Land Biolabs, Beverly, MA) and Tsuna Ll. Reige Aliquots of the reaction mixture were prepared using Gigapak (Stratagene, C. A, Cat, No. 200213>, according to the manufacturer's instructions. It was packaged accordingly. 0. Supplemented with 2% maltose and 0. Lu adjusted to 01M Mg5O, E.coli BNN102 cells grown in ria Broth (LB) A saturated (>109 cells/l111) culture was prepared. 6 of this culture Use the packaged phage to infect the infected The culture was reduced to 0. 0.0 in LB supplemented with OIM Mg5Oa. 7% Tompu Agar 300 Add the cell mixture to agar/LB70. 6 containing 01M MgSO4 The cells were plated on two plates (21 x 21 am). This plate was heated at 37° for about 7 hours. The plaques were grown by incubation at C. Next, add phage to 50 ml of TM (Q, OI M's Tr 1s-HCI (+) H7,4) 10. 01　M　 It was eluted with MgC1z) and purified by CsC1-fractionation. λgtL in Braak hybridization/screening. To screen the cDNA library, human CD4 DNA fragments were Using. In detail, each of the 30 150++ua dishes, totaling l. 10' plaque forming units (PFU) were seeded. Nitrocellulose foam Two plaque lifts were taken on the filter o W, D, Benton and R , W. Davis, -Screening OfLambda gt Rec ombinant C1ones By Hybridization To SingIe Plaques In 5itu-, 5science, 196 ．． Human CD4 was cloned using the method described in J. P., 180 (1977). A 5° fragment of 694 bp Ps±l/Pvul of the scanned sequence was used as a filter. screened. Described in PCT patent application PCT/US8g102940. -694 bp Pstl/Pvul I fragment of vector p170-2 can be used. Eight positive results were obtained in two rounds of screening and double plaque purification. Ta. Next, λgtlO minibrenobu DNA was prepared and digested with Choka1. most One clone, 25B, with a long cDNA insert (~2 kb) was selected. . As shown in Figure IA, clone 25B was transformed into a cynomolgus monkey using Notl. Approximately 2 kb Not I/Not including the region encoding CD4 The I fragment was excised. This fragment was digested with Notl-digested larvae/intestinal alkaline phosphatide. Atase (rcIAPJ) (Boehringer Mannheim), Sequencing plasmid p processed according to the manufacturer's instructions Subcloned into NN12. The resulting construct is called psQ131. The plasmid pNN 12 for sequencing is a commercially available plasmid ptl. Restriction enzyme digestion from c8 (Pharmacia PL Biochemicals) By removing the synthetic IJ linker, a new product with an easy-to-use restriction enzyme site I replaced it with a new synthetic piece and constructed it. Provides a replication origin and confers ampinlin resistance The 25 kb backbone structure common to pUC plasmids was left unchanged. p The newly synthesized part of NNl2 is shown in FIG. The nucleotide sequence of the CD4 insert of 9SQ131 is from A, M, Maxam and and W, C11bert, “A New Method For Sequ encing DNA-, Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 74. pp. 560-64 (1977). human Comparison with the nucleotide sequence of the CD4 protein reveals that this ~2 kb insert was found to not include all of the region encoding cynomolgus monkey CD4. . Additionally, other clones isolated from this library encode CD4. There was nothing that could cover all of the areas. Therefore, primer extension cDNA The library was created using previously isolated cynomolgus monkey PBL polyA” mRNA. Built from A. Example ■ - Cynomolgus monkey primer cDNA library synthesis and screening leaning Based on the sequence of the psQ131 insert, all procedures were performed according to the manufacturer's instructions. A DNA synthesizer (Applied Biosystems, 380A) was used. The antisense oligonucleotide primer 74AID118 was synthesized and and purified by acrylamide electrophoresis. See also L. JMcBride (cited above). Light. The sequence of T4AI0118 is: 5' TGG GCCATG TGG GCA CAA CCT TCA TGT TGG 3°. 'T4 polynucleotide kinase (Ne w England Biolabs, Beverly, MA) , the oligonucleotide was phosphorylated using ATP. 20 μg of cynomolgus monkey PBL polyA”mtlNA was added to CH3Hg0H (2 , 5mM) for 10 minutes at room temperature. Next, 1710 volumes of 0. 7M β- Mercaptoethanol was added and incubated for 5 minutes at room temperature. Synthesis of the first cDNA strand was performed using 200 pmol of kinase-treated T4AID1. 18(7) addition. 0. 0625 M Tris-HCI (pH8,3)10. 75 M KCI/0. 0015 M 6 in EDTA Primers were incubated with mRNA for 5 min at 8°C, 7 min at 55°C, and 5 min at 42°C. A and the product was ethanol precipitated. cDNA synthesis and linker ligation were performed as described above. manufacturing Excess linker was transferred to a 6L spin column (5Prime) according to the method recommended by -3Prime, PA, Cat, No, 5301-04738> removed did. This cDNA was ligated with 1 μg of Shadan R1-digested λgt10, and the above-mentioned It was packaged like this. Phages packaged all as described above. Infect with 1 ml of E, colj BNN102 and plate the cells (21c m x 21 cm), and a phage stock was prepared. As above, 1. 000. Plaque hybridization by seeding 000 phages For application screening: Manufactured by A. This library with two probes Screened. The first probe T4AIDO8 has the following sequence: 5 °CTG AGT GGCTCT CAT CACCACCAG GTT 3’ . T4AIDO8 was synthesized as described above. Screening with T4AIDO8 Nine double positives were obtained. The largest of these The insert from clone 24 (~900 bp> It was subcloned into pNN12 for cloning. psQl this subclone I called it 34. Two other clones, clone 36 and clone 35, have been shown to grow in cynomolgus monkeys. Human CD4 clone DC2], 3-5 406 bp Nc It was discovered by screening with the upper MI fragment. D.C. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of 213-5 are shown in FIG. clone The insert from 6 was subcloned into pNN12 and the resulting construct was transformed into 1) SQ I called I3. See Figure IC. Similarly, the insert from clone 35 was subcloned into pNN12, resulting in The constructed construct was called l+5Q135. Vector psQ136(+)SQ135 and all others) are the largest 5' clones obtained and sequenced. It was. The resulting subclone contains a region encoding cynomolgus monkey CD4. None included the entire length of the area. The full-length DNA sequence of cynomolgus monkey CD4 shown in Figure 4 consists of three overlapping subclusters. Loans (in order from 5' to 3') pSQ 136, psQ134 and psQ1 This is a synthetic sequence assembled from 31. Subclone ps0136 is the null of Figure 4. Contains leotide 1-560 and nucleotides 1182-1342. sub claw 1) SQ134 contains nucleotides 467-1341 of FIG. sub claw The sample psQ131 contains nucleotides 998-3064 of FIG. Figure 4 shows crabs. The deduced full-length amino acid sequence (AA-2s-AAa33) of Quercus monkey CD4 is also shown. . Figure 5 shows that soluble cynomolgus monkey CD4 (AA-2s-AAavs) Soluble human CD4 from pGB391 (PCT patent application PCT/US8102 940) (In Vitro International Cutture Co11ection, Linthicum, MD, IVl 10151) Against, 94. 250% similarity and 91. have an identity of 250% It shows. In Figure 5, unmatched amino acids are marked with an asterisk ★. Example ■ - Cloning of Soluble Macaque D4 camulatLa) CD4 is +Enzy of P, J, Nevman et al. matic Amplification Of Platelet-Spec ific Messenger RNA Using Tha Polytne rase Chain Reaction-, clone in the same way as L did. The soluble region of rhesus monkey CD4 is a combination of human CD4 and cynomolgus monkey CD4. From the region showing 100% nucleotide homology with the region encoding the extracellular portion Cloning was performed using selected oligonucleotide primers. These oligonucleotide primers were synthesized as described above. cronin All of these oligonucleotide primers used in the 5' was phosphorylated using nucleotide kinase and ATP. These ori The oligonucleotides are shown in FIG. Cloning of the extracellular region was performed in three steps. First, rhesus macaque soluble The 5' region of CD4 is subjected to a specifically initiated reverse transcriptase reaction, followed by the first chain cD4. It was created from mRNA by PCR amplification of NA. Second, the overlapping 3′ region A region was generated using a similar reverse transcriptase/PCR amplification method. The third step of the cloning method The next step is to attach a stop codon linker to the 3'' fragment.Finally, this fragment is was cloned into a vector for encoding. Rhesus monkey blood supplemented with heharin (New England Region) Prepare PBL from I Primate Center) and Whole cells were extracted from these PBLs by the same method described for cynomolgus monkey CD4. RNA was isolated. Enough total RNA was not obtained to create polyA “mRNA.” Because there was no PBL, 5 μg of rhesus macaque total PBL RNA was added to 10 μl of CH38. Denatured in g0H (2,5mM) for 10 minutes at room temperature and then for 5 minutes at room temperature. , incubate with 1 μl of β-mercaptoethanol (0.7 M) to stop the reaction. did. To obtain the 5°-terminal portion of the region encoding the extracellular portion of rhesus CD4, Rhesus macaque PBL using oligonucleotide T4AID156 (Figure 6) RNA was subjected to reverse transcriptase reaction to initiate synthesis of second-strand cDNA. cDNA combination Or 0. 05M Tris (pH 8,3) 10. 003M MgCl270 ．． 075 M KCl10. 01. M's DTT70. 5mM dNTP mixture 150 pmol of T4AID156 bray? -15001J MMLV reverse Transcriptase (Bethesda Research Labs, Gaither Sburg, MD) in a final reaction volume of 50 μl for 1 hour at 37°C. The reaction was stopped by placing the tube above water. For polymerase chain reaction (PCR) amplification, 50 pmol of T4 AID156 primer and 100 pmol of T4AID148 primer (Figure 6) and dried in a 5 peed Vac (Savant); Next, 50 μl of PCR dilution buffer (0,025 M KCI and 0. 02% gelatin) was added to resuspend the dried oligonucleotide. this mixture was added to the stopped reverse transcriptase reaction (see f graph above) and 94 ℃ for 2 minutes. This mixture was mixed with Perkin Elmer/Cetus. Cool to 37°C in a DNA thermal cycler and place in a Thermus Taq DNA polymerase (Cetus) l μl (5 units) isolated from added. Amplification was performed for 11 minutes for 30 cycles in a DNA thermal cycler. , 94°C for 20 seconds; 3 minutes, 37°C for 20 seconds; and 72°C for 10 minutes. Cono PCR products were prepared using TAE Hano 7y (0.04M Tris-acetic acid 10. 0 1% GTG agarose gel ("Seakem-") (F MCMarine Co11oids, Rockland, ME). Ta. Cut out the appropriate fragment (approximately 540 bp) and insert To, ol, M Tris- CI (pH8>10. 001 M) 100 in dialysis tube containing EDTA TBE Hano 7y (0,089M Tris- Poronic acid 10. 089M poric acid 70. Electroeluted in 0.002M EDTA) . This appropriately sized fragment is attached to cynomolgus monkey CD4 adjacent to the primer. Confirmed by comparison with the DNA sequence (see Figures 4 and 6). 15 seconds pole The sex was reversed and the eluted DNA was incubated in the presence of 20 μg of carrier tRNA. The mixture was precipitated with ethanol. This PCR fragment was digested with Smal and CIAP according to the manufacturer's protocol. (Boehringer Mannheim) to dephosphorylate the linearized vector. It was oxidized and cloned into the encoding plasmid pNNO8. plJ NO8 is plasmid plJc8 (Pharmacia PL Biochem jcals) by restriction enzyme digestion to remove the synthetic polylinker from It was constructed by replacing it with a piece. Provides transcription start site and ampinoline resistance , the 25 kb backbone common to pUC plasmids remained unchanged. plJNO8 The newly synthesized part of is shown in Figure 7. Ligation of PCR fragment and pNNO8 is 0. 05 M-Tris (pH 7,8) 10. 01 M MgChlo, 0 3M NaC 110,001M (7) Shelmidine 10. 2mM EDTA lo, 002 M DTT lo, 25 to l mM ATP/1 mg/ml in BSA with T4 DNA ligase overnight at 16°C. This lige/yon mixture was used to transform E. coli DH5α cells, The transformants were then plated on LB agar containing Anbinrin (50 μg/ml). . The resulting 24 colonies were grown and subjected to Nagi1 digestion of alkaline miniprenobu DNA. The samples were analyzed by electrophoresis. Two of these colonies have inserts of the correct size. (i.e. approximately 540 bp). The proteins isolated from these colonies One of the lasmids, psqi46, was purified by density gradient centrifugation on CsC1 and M Sequencing was performed according to axam/Gi 1 bert. I) SQ146 rhododendron The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the CD4 insert of the gene are shown in FIG. To obtain the 3-terminal part of the region that covers the extracellular part of rhesus CD4. Synthesis of second-strand cDNA using oligonucleotide T4AID150 (Figure 6) started. PCR amplification was performed using primers T4AID150 and T4AID17. 8 (Figure 6). Gel purify the appropriate PCB fragment (~80obp) Ta. All steps were performed as previously described. The purified PCR fragment was treated with the Freneau fragment of E. coli DNA polymerase. Then, the following sequence: 5' TGA GAT CTT TGT　GC33°ACT　CTA　GAA　ACA　CGCCGG　5’re Connected to linker/adapter T4AID182/183. T4AID182/ 183 has a stop codon TGA at the 5' end, an internal I+1 site, and -keno/ It was connected to the plasmid pNNl1 for ligation. pNNll is pUC8(Ph armacia PL Biochemicals) to control the synthetic polylinker. It was constructed by removing the fragments with limited enzymatic digestion and replacing them with new synthetic fragments. pNI The newly synthesized portion of Jll is shown in FIG. This Lige/Yon mixture was added to E, col. i Used for transformation of JA221. The minibrenobu analysis was performed on the 24 columns obtained. I went to knee. Four of these, psQ159, psQ160, psQ 161 and psQ162 contain fragments of the correct size (i.e. approximately aoo bp). I was reading. Subclone I) Nucleo of the 7 rhesus CD4 insert of SQ162 The sequence and deduced amino acid sequence are shown in FIG. Example V - Soluble Rhododendron-Human Chimera D4 DNA Coordination 1 Mammal Construction of cell expression vectors As shown in Figure 11, the soluble rhesus-human chimeric CD4 DNA sequence was It was constructed in a cell-like expression vector. In this construct, 5° of the CD4 coding region The end is rhesus monkey CD4 DNA, and the third end is human) CD4 DNA. . More specifically, the mammalian expression vector pBG341 [R,M, Kramer , -5structure And Properties Of A Ht+ man Non-Pancreatic Phospholipase A2- , J. Biol, Chem, 264, pp. 5768-75'( 1989)] (Fig. 12) was digested with υyu11 and tail, and the promoter region and A 1 kb fragment containing the Notl and Notl cloning sites was isolated. Rhesus monkey CD4 plasmid psQ146 was digested with Nagi1 and Togami Ml, 44 nucleotides preceding the rhesus CD4 nucleotide tosole from l to 499 in Figure 8 A 543 bp fragment containing the vector nucleotides was isolated. Human CD4 expression vector pBG391 (PCT patent application PCTlUSSR102 940) (In Vitro International Culture Co11ection, Linthicum. MD, IVI 10151> was transformed into 7 cells with ByMI and Aatll. This (D The plasmid has two...Ms, one in the CD4 sequence and one in the vector. 1 site; however, the protrusions of these sites are different. 2147 bp Aatll/Nailman MI fragment (containing vector sequences), and 2324 b p MI/BsoM [fragment (3° end of soluble human CD4 and vector sequence ) were isolated. To construct an expression vector containing a soluble rhesus human bovine mela DNA sequence Then, the following fragments were ligated with T4 DNA ligase: Mouth 1” 1- pB0341 ~ l kb υyu II/Spoon" Ip, 5Q146 0. 543k b Cup Yu I/b! MlpBG391 2. 324 kb Bs upper Ml/also lower M+ pBG391 2. 147 kb Bs engineering Ml/Ai 11° chimerap obtained Lasmid pDG100 is shown in FIG. Figure 13 shows the CD4D of pDGloo. The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the NA insert are shown. In Figure 13 , nucleotides 1-489 correspond to the rhesus CD4 sequence, and nucleotide 4 90-1298 corresponds to the human CD4 sequence. G, Chu et al. - Electropora Lion For The Eff icient Transfection Of Mammalian Ce1 ls With DNA'', Nucle+c ACldS Re5search , 15. The protocol described in pp. 1311-25 (1987) CO37 cells were transformed with pDGloo according to the method. Polyclonal No’7 Ft, western plot using neat CD4ffn serum (935) Soluble chimeric rhesus macaques fed pDGloo as detected by test analysis. /human CD4, mouse anti-human CD4 monoclonal antibodies 0KT4a and 0K Immunoprecipitation was possible with T4 (Ortho Pharmaceutical), but L The data cannot be shown in eu3a (Becton Dickinson). Nikumu22! And A, Middle 1 expression vector BG341. , rhT4 Figure 14 shows soluble rhesus monkey Construction of a mammalian cell expression vector encoding cD4 (AA-2s-AA3vs) Indicates the construction. Rhesus-human chimeric plasmid pDG100 was transformed into Hindll and BHM. A 572 bp rhesus CD4 5” fragment was isolated. . Vector psQ1. 62 is sequentially digested with Paste M1 and Nagi 1, and 800 The 3° end of soluble rhesus CD4 of bp was isolated. Expression vector pBG341 was sequentially digested with Hindlfl and Reika1, and and 4. An 8 kb vector fragment was isolated. These three fragments were ligated with T4 ligase, and the expression vectors pBG341 and rh T4 was generated and cultured in CO5-7 cells (ATCC: 1651> was transfected. Figure 15 shows pBG341. Soluble rhesus CD4 nucleo from rhT4 The sequence and deduced amino acid sequence are shown. Figure 16 shows soluble 7 rhesus C D4 was 99.9% for soluble cynomolgus "j'le cD4 (Figure 4). 75Q% similar degrees and 99. This shows that the degree of identity is 500%. Figure 17 shows the soluble a rhesus CD4 is 94% relative to soluble human CD4 (from pBG391, supra). ．． It shows that the degree of similarity is 264% and the degree of identity is 91272%. Figure 1 Amino acid mismatches at 6 and 17 are marked with an asterisk. B, = vector BG341JOD, rhT4pBG341. rhT4 Rhesus CD4 inserts were transferred to DHPR-Chinese hamster ovary (CF). IO) Create other constructs for stable expression of soluble rhesus CD4 in cells. It was used to This construct was called pBG341JOD, rhT4. As shown in Figure 18A, pBG341. rhT4 (10tt g) No. 150mM NaCl/10mM Tris-HCI (pH 7,9>/10mM MgCl27100μg/ml gelatin 70. 01 % Triton X-100), and 1 encoding soluble rhesus CD4. , 357 kb fragment was isolated by electrophoresis on low melting point agarose. pBG3 41 (Fig. 12) was digested with AatlI and trillion'1, and a ~1 kb fragment was isolated. Ta. This fragment was added to pJOD-s in 6. 750 kb Notl/Aatll fragment (PCT patent application PCT/US8910141g) and the resulting product The lasmid was pBG341. It was called JOD. Plasmid pBG341. J.O. D (10Mg) was cleaved with Nagi 1, the 5′ end was dephosphorylated with CIAP, and then directly Stranded plasmid DNA was isolated by low melting point agarose electrophoresis. linearized pBG341, JOD 1,357 encoding soluble rhesus CD4 kl) N. tl/Notl fragment, and the resulting plasmid was pBG341JOD, r hT4 (called the Figure 18 poem). This plasmid was transfected with electroporane M/ into DHPR- CHO cells. cells grown in the presence of 500 nM methotrexate were selected. (European Patent Application East 343. 783). More specifically, pB34 1JOD, rhT4 (200A!, g), 50mM KCI/10mM T ris-)1cI (pH 7,5)/10mM MgCl□/lmM DTT The width was υ, and it disintegrated at 1+1. The cleaved DNA was precipitated with ethanol and then treated with 0.0% ethanol. 8ml LX HeBS (20mM HEPES (pH 7,05>/137m M NaCl 115mM KCl 10. 7mM Na2HPOa/6mM De resuspended in bovine straw). DI (FR-C) 10 cells [G, l1rla ub and ri, A, Chas:n, 1solation Of Chin ese Hamster 0vary Ce1l Mutants Defic ient In Dihydrofolate Reductase Acti vity-, Proc, Natl. Acad, Sci, IJSA, 77, pp, 4216-20 (1980) α” supplemented with 4 mM G/retamine and 10% dialyzed/fetal serum. The cells were grown to 50% funufluence in modified Eagle's medium (MEM). Cells were treated with trypsin and then freshly prepared to inactivate the trypsin. Culture medium was added. Cells were centrifuged (~2000 x gav) for 4 minutes. Thin pBG341 JOD, r 08m1 containing hT4 was resuspended in eBs. Transfer this sample to a BioRad electroporation cuvette and Using a Rad Gene Pulser cap, the capacitance was set to 960μFd and The voltage was set to 290V and the electrovapor pressure was set to 290V. 4mM G before transferring into α”MEMIOml supplemented with rutamine and 10% fetal bovine serum. , cells were placed on water for 10 min, and placed in three 100 AU11 tissue culture plates. I was on the road. Cells were cultured in an incubator (37°C and 5% 002) for 3 days and then α-MEM supplemented with 4 mM glutamine and 10% dialyzed fetal calf serum (α゜MEM lacking nucleotides). After 5 days, cells were given 4mM of glutamine, 10% dialyzed fetal bovine serum and 500 nM methotrex α-MEM supplemented with sate (A selective medium) was fed. Add selective medium every 3 to 4 days. Replaced and inspected plates for cell overgrowth. The grown cells can be For the production of soluble rhesus CD4, seven mice were tested as described below. . C) to rhesus 500. A cell line named 21 was developed into a soluble rhesus macaque. Selected for CD4 production. This cell line has approximately 5 pg/cell/hino soluble rhesus cD4 (Fig. 15 (7) AAI-AA375). Example ■ - Rhesus macaque CD4 and the above-mentioned transformed CI (O Soluble rhesus CD4 produced by cells was established as follows. 1 mmulon tl 96-well microtiter plate (Dynate ch, chantilly, Virginia), 0. 05M sodium bicarbonate 5 μg/ml anti-human CD4 monoclonal buffer in 7-mum buffer, pi (9,0). Null antibody 1. 1) Coat 7 (50 μm/well) and incubate the plate at 4°C. Inoculated overnight a ID7 (Patrick from Biogen, Inc.) ia Chish. 111) is a mouse monochrome that binds to the extracellular region of human C[)4. It is a local antibody. Other commercially available drugs that bind to the extracellular region of Hi-CD4 Monoclonal antibodies may also serve as functional substitutes for ID7 (e.g. OKD4A or Leu3A). Before use,)D? Monoclonal antibodies were purified as follows. 1D7 ascites was diluted with PBS (v/v) and the protein was diluted with 40% anhydrous sulfate. Precipitated with monium. This precipitate was dissolved in PBS and dialyzed against PBS. Manufacturer Affi-gel Protein A MAPS II Purify the antibody using a kit (Biorad, Cat, No. 153-6159) did. The purified antibody was dialyzed against a large volume of PBS, and the aliquots of the antibody were combined. Stored at 70°C. All steps below were performed at room temperature unless otherwise noted. Place the plate at 0. 05% Tveen-20/PBS. plate, Blocked for 2 hours with 2% skim milk powder in PBS (2% milk/PBS) (2 00 μl/well). It was then washed as described above. Next, sample ps of conditioned medium (50 μm/ Add wells, incubate plates for 3 to 4 hours, and as described above. Washed. Next, horseradish paste diluted 1/1000 with 2% milk/PBS Add oxidase-conjugated anti-CD4 monoclonal antibody (50 μm/well), After incubating for 15 hours, the plates were washed as above. HRP- The conjugate is a commercially available HRP (BoehrInger Mannheim) A mouse monoclonal antibody that binds to the extracellular region of CD4 (Bjogen, In c) By combining it with (a gift from Patricia Chisholm) Created. This monoclonal antibody was purified as described above. human CD4 cells Other commercially available monoclonal antibodies that bind to the outer region (e.g. 0KT4) may also be an R-capable alternative. Finally, 100 μl/well of 0-phenylethylenediamine (OPD)’ (C albiochem) (Oy4 mg/ml) and incubate the cow for 20 to 30 minutes. and then add 100 μl/well of IN H2S0A to develop color. It was stopped. The absorbance at 490 nm was measured using an ELISA plate reader (Ther momax, Mo1ecular Devices, Menlov Par k, CA) “This material is a potential tumor inducer and should be disposed of before disposal. :5og's 2 Cro7. 25ml of 10N H2S0a, 145ml Must be detoxified with a solution of H20. Example ■ - P′ of soluble rhesus CD4 Soluble rhesus CD4 (Fig. 15 AAI-AA37S) stably transformed as described above in the cell line C) 10 rhesus 5 (purified from 10,21). This transformant was grown in a growth medium (10% fetal orchid serum, 1 mM 1-glutamic acid). 500 nM methotrexate, 150 μg/ml streptomycin and α-modified Eagle “S” supplemented with 1 g/ml gentamicin at 50°C. The cells were grown in a medium until they reached a full fluence. Cells were incubated at 37°C in 1OL Nunc cell factory (American Bioanalysis cal, Natick, Massachusetts, Cat, No. 139446). The medium used when the co/fluence was reached. discard and add 8 L of production medium (1% fetal serum instead of 10%) to the cells. A growth medium containing Production medium was conditioned for an additional 3 to 4 days at 37°C. continued. Collect the conditioned medium and feed the cells with 8 L of fresh production medium and The cells were incubated at 37°C for an additional 3 to 4 days. This cycle in its entirety Repeated 40 times. The recovered conditioned medium was added to a final concentration of 0. Azification to 02% Added sodium. This conditioned medium was then incubated at 4°C until accumulated in SQL. Stored. All the following steps were carried out on a sex cartridge (Millipore) at 4°C. , Bedford, Massachusetts, Cat. No., MSL IO302), strain and add an equal volume of 30 mM sodium acetate. (pH 5.5>). Diluted conditioned medium (100 L) was added to 250 ml of S-5 epharose F. ast equipment resin (Pharmacia LKB Biotechnology , Inc., Piscataway, New Jersey, Cat, N o, 17-0511-01') and 15 rnM sodium acetate ( A 5upperflo-250 column (Seprag en Corp, San Leadro, Cal+fornia, Ca t, No. 10-0250-003 at about 5 to 1 OL/hr. this The column was coated with approximately 5 times as much 20 mM Tris/HCI (pH 8,5) as the column. Elution was performed at a flow rate of 5 to 10 L/hr. Remaining protein (rhesus rsC D4) in 5 to 6 column volumes of 20 mM Tris/HCI ( 2 with elution buffer containing pH 5.5> and 120 mM sodium chloride. It was eluted at a flow rate of SL/hr. During the elution, 20 ml of frac/=I was taken. The absorbance at 280 nm was measured. Has remarkable absorbance at 2110 nm border 2 150 ml each), freeze 4 of them and store at -80℃ until use. It existed. Aliquots that were not frozen were treated with monoclonal anti-CD as described below. Immediately subjected to affinity chromatography on a 4-affinity column. . Anti-CD4 monoclonal described in Example ■ used as affinity reagent Antibody ID7 was provided as ascites. Ascites (74 mt. ), saturated ammonium sulfate The antibody was precipitated by mixing with Monium (60 ml).This precipitate was mixed with 1. 0. '00 Centrifuge for 30 minutes at 0× gav to pellet and add 70 ml of 1. O mMh ethylamine (pH 7. 6). mouth resuspended sulfuric acid The ammonium fraction was treated with 10mM h-ethylamine (pH 7. 6) Dialyzed overnight with Ta. The dialyzed fraction was pretreated with 10mM) ethylamine (pH 7. 6) Pre-equilibrate with 30 ml of Q-Sepharose Fast Flow column ( Pharmacia LKB Biotechnology. Inc. , Pi scatavay. New Jersey. Cat. No. 17-05 10-Of). column with approximately 5 times the column volume of equilibration buffer. Wash and add 10mM) ethylamine (pH 7. 6) including O. 0 from OM. 3 Dissolve at 40 ml/hr with 500-ml of sodium chloride in a linear concentration gradient of M. I put it out. Take fractions (>4 to 5 ml each) and add sodium dodecyl sulfate. analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and cooled. Stained with Mano Blue. Fractions containing antibodies were pooled. Elution pool ( 108 ll 1 liter contains about 77 B protein as measured by absorbance at 280 nm ) was concentrated to 21 ml using an Am1con ultrala cell (absorbance measurement at 280n111). (contains about 53 mg of protein). The ultrafiltrate was 0. 1M sodium borate (pH 8. 0)70. 5 M's Dialyzed overnight against sodium chloride and then in an Am1conti extrafiltration cell. Q ml (contains about 51 mg of protein as measured by absorbance at 280 nm) Concentrated into Purified ID7 monoclonal antibody (10 ml containing 51 mg of antibody) was 4 g of CNBr-SephaCNBr-5 epharo according to manufacturer's instructions se(SiCo,,St,Louis,Missouri,Cat, No. C9142) to obtain 12 ml of derivatized resin. this The resin (12 ml) was applied to the column and equilibrated with phosphate buffered saline (PBS). Pass 150 ml of the saved S-5 epharose eluate through this column. did. The column was then washed with approximately 5 times the column volume of PBS and approximately 5 times the column volume with 0. 5 M of sodium chloride in PBS, and then approximately 5 column volumes of PBS. Washed. Rhesus monkey rsCD4 was added to approximately 5 times the column volume of 50 mM glycol. /) IcI(p)l 3. 0)/250mM sodium chloride affinity eluted from the column. Add 1 ml of each fraction to the eluted protein. For immediate neutralization, a 75 μm 0. Contains 5M HEPES (pH 7.2>) The sample was collected in a tube. Fractions with significant absorption at 280 nm were pooled and incubated at -80 °C. saved. This aphrase was also applied to another 150 S-3epha:ose eluate. A purity purification process was performed. A typical affinity column elution pool is 4 It had a volume of 5 ml and contained 1 to 2 mg of Kumbak substance. Analysis by Coomano-Blue staining of KEL (SDS-PAGE) revealed that the above-mentioned purified The protocol yielded substantially pure rhesus rsCD4. Shown in Figure 19 As shown, this purified rhesus monkey r5CD4 was chromatographically analyzed on 5OS-PAGE. It was developed as a doublet with mobilities of 48 and 52 kDa. In Figure 19, #1 is a polymer JliF color marker made by BI'IL, No. 604. ’1LA), and 7:LA7 #2 and #3 are non-reduced and reduced, respectively. containing 5 g of 7 rhesus CD4. This doublet is artificially produced by purification. It cannot be considered a product. This is because pulse-chase experiments of transformed CHO cells In experiments, rhesus monkey rsCD4 was secreted extracellularly as a doublet with the same mobility. This is because it was found that (data not shown). Other anti-CD4 monoclonal antibodies were placed in place of EDT in the purification protocol described above. Can be exchanged. Such antibodies include 0rtho Phar. Commercially available from Aceuticals, Raritan, New Jersey Includes 0KT4 and 0KT4a. This protocol allows affinity column binding of the CD4 variant to be purified. The anti-CD4 antibody selected for this purpose can easily be used to purify other CD4 variants. It is known to those skilled in the art that soluble chimpanzee CD4 can be applied to rhesus monkey CD4. In substantially the same manner as in the case of P. J. Newman et al. Amplified using reverse transcriptase/PCR amplification method and cloned/glucated. For second-strand synthesis The reverse transcriptase reaction was performed using two different primers and two soluble cynomolgus CD4 molecules. Specific and non-specific oligonucleotides prepared from the 3” end of the column This was done using 4 guns. Cultured human hemagglutinin 7 (rPHAJ) stimulated chimpanzee PBL (New England Regional Primate Center Total RNA was obtained as described above. was prepared. T4AID150 (Figure 6) is used to initiate the synthesis of CD4. A reverse transcriptase reaction for the synthesis of NA was performed. non-specific to initiate second-strand synthesis A standard oligo dT (12 to 18 nucleotides) was also used. and used T4AID148 (Figure 6) and T4AID150 as primers. PCR amplification was performed. 1 minute, 20 seconds at 94℃: 3 minutes, 20 seconds at 55℃ ; and 30 cycles of PCR at 72° C. for 4 minutes. The obtained PCR fragment was transformed into E. coli Pol 1 Flenow fragment (New Er + grand Biolabs) and dXTPs. These were made into blunt ends. Next, this fragment was made into gel PI, digested with SmaI, and C The blunt end was ligated to the IAP-treated sequencing plasmid pNNO8. . This hector was then used to transform E. coli JA221. The resulting colonies were incubated with Notl-whitened alkaline minibleb DNA. It was analyzed by electrophoresis. D4A From PCB cDNA’A starting at ID150 One clone obtained (psQ205) and oligo-dT initiated cD One clone of NA (psQ200) was sequenced. Solubility of pSQ205 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the chimpanzee CD4 insert (AA- 2s-4 to A37S) is shown in FIG. Soluble chimpanzee CD of psQ200 4 insert nucleotide sequence and deduced amino acid sequence (AA-25-AA37J ) is shown in FIG. Figure 22 shows the nucleotide sequences of the CD4 inserts of psQ200 and psQ205. This is a comparison. Soluble, encoded by pSQ200 and pSQ205 The amino acid sequences of the male and female chimpanzee CD4 proteins were compared in FIG. In Figures 22 and 23, unmatched nucleotides and amino acids are marked with an asterisk, respectively. Marked. As shown in Figure 23, these amino acid sequences are 99. 749% Similarity and 99. It showed an identity of 749%. Figure 24 shows that the soluble Chinopant-CD4 sequence from pSQ200 is 99. for D4 (from pB0391, supra). 248% similarity and 9 8. It shows that the degree of identity is 99%. Amino acids that do not match are marked with an asterisk. Marked. (Margin below) Expression of human CD4 protein by X-human CD4 transgenic mice , and therefore in animals such as humans that are tolerant to the human CD4 protein. To evaluate the immunogenicity of soluble rhesus CD4 (rrhesus CD4J) Next, we conducted experiments using human CD4 transgenic mice. this In terms of human CD4) transgenic mice, human CD4 It is possible to predict the immune response to amino acid variants of Gezall rsCD4. human CD The 4 transgenic, 7+7 model shows that the immune response to variants of the CD4 molecule is provides a system for determining whether therapeutic benefit can be obtained from 11-Direct microinjection of CD4 transgene cDNA into fertilized mouse embryos transgenic cells that express human CD4 on the surface of both thymocytes and lung cells. Genetic mice were created. Human CD4 transgenic mouse of the present invention The method used for the production of the Maniu atin Th of B. Hogan et al. e Mouse Embryo (ColdSpring Harbor La (1986) Ikog8. To achieve T cell-specific human CD4 expression, the regulation of the human CD2 gene was Construct a transgene consisting of human CD4 cDNA under the control of node elements. The structure of [G, Lang et al. man CD2 Gene And Its Expression In T rangenicMice-1EMBO, J, 7. pp, 1675-8 2 (1988); D., R. Greaves et al. -Human CD2 3 '-Flanking 5equences Conference I(igh-Le velT Ce1l-Specific, Po5ition-Indepen dent Gene Expression In Transgene Mic e-, Ce1l, 56. See pp. 979-86 (1989) 1゜I Each starting material consists of: (1) 5° flanking arrangement and cord; A fragment of the human CD2 gene consisting of the sequence (National In5titudinal For Medical Research S The Ridgevay. Dimitris Ki of Mill Hill, London Nl21AA Bluescript KS vector (gift from Dr. oussis) Stratagene) (Figure 25): (2) From the 3' side flanking sequence poly containing the human CD2 gene fragment (a gift from Dr. Kioussis) lll-1 vector (Figure 26); and (3) full-length human CD4 protein subclone PATY, 6 (Figure 27). these materials will be explained in more detail as follows. As shown in Figure 25, the Bluescript KS vector contains the CD2 code From ~5 kb of genomic DNA, which is the 5' flanking DNA directly upstream of the region. 5all/Bam old human CD2 fragment; the first exo of the human CD2 gene ~0. 2 kb genomic DNA fragment; and human - ~1°8 kb cDNA fragment (indolone) containing the remaining part of the CD2 gene 2-4 had (absent). The 5ail/BamHI fragment shown in Figure 27 is essentially Generally, Lang's diagram IA (with 5 exons and 4 introns) described above illustrating the organization of the human CD2 gene); 0 and Figure 3 (CD2-A) (except the first intron (all introns )It is described in. The Bucotcol described in Figure 25 differs from the above-mentioned literature in the following points. different. Figure IA of Lang mentioned above and Figure 3 of GreaVes mentioned above (CD2 - The 5all part shown in A) is destroyed by site-specific mutagenesis, and the 5all part is changed to Furthermore, the Sac site was destroyed and replaced with the Eco old site shown in FIG. 25. This EcoR1 site is located in the 5° untranslated region of the CD2 gene. Finally, CD2 Disrupt the EcoRV site in the second exon of the gene [see Lang's Figure IB above]. and changed it to a stop codon. This stop codon, shown in Figure 25, This prevents the expression of CD2 protein in the cells. As shown in Figure 26, the polyllll-1 vector 5. Side flanking DNA. Contains 5Kb old/Xbal DNA fragment [See Figure 3 (CD2-B) of Greaves, supra]. Figure 2 shows subclone PATY 6, which has DNA encoding full-length human CD4. As shown in 7, plasmid pBGL78A [PCT patent application PCT/US8 81029401 and pB0378 [PCT Patent Application PCT/US88102 940]. Figure 28 shows the sequence of the human CD4 gene of PATY', 6. Shown below. As shown in Figure 29, PATY, 6 is Digest with LLL[I, which cuts in the region and the 3' untranslated region, and make the ends blunt. It was treated with Flenow fragment in order to Added EcoRI'J linker, Hill-CD A 2.8 kb fragment containing the cDNA of 4 was isolated. This fragment is Bluesc The only EcoR1 part located in the 5° untranslated region of the CD2 gene sequence of ript KS inserted in the position. At this site, the CD4 cDNA is linked to the 5′ flank of the CD2 gene. It was under the control of an element located immediately upstream of the DNA. Then build this Xbal things? Partially digested tjl, sol, rBamHl, 1ok The Bluescrfpt KS fragment of b. from poly II+-1 ~5. 10kb Bluescript KS cut of 5kb stone old/criminal 1 fragment On the other hand, the control element of the 3° flanking DNA of the CD2 gene is human CD4. cD) Insert so that it is downstream of JA. Finally, the resulting construct was 5al The human CD4 transgene was isolated by digestion with 1 and 1. Human CD4 transgenic mice were generated substantially as described above by Flogan. It was prepared as described above. In particular, 4 mouse fertilized embryos (C57BL15XCBA/J ) strain of female mice (Natio+al In5 posture for Med ical Re5earch, Mill Hill, London was isolated at the single-cell stage from a. A solution containing the leech-CD4 transgene was added to a given egg. microinjected into the pronuclei. The eggs that survived the operation were returned to their adoptive mothers' fallopian tubes. child at birth The genome was subjected to Southern bronotometric analysis [e.g., 5 Southern, J., Mo1. 　 Biol,,98. pp. 503-517 (1975)] , identified offspring carrying the transgene. Next, we breed individuals with the introduced gene. We established a transgenic mouse strain. The transaction established in this way The Sujieni and Ri strains were maintained by sequential backcrossing with the C57BL/6 strain of mice. ()ackson Laboratories, Bar Harbor, M E) o Two independent lines of transgenic mice, the 310 line and the 3 Series 13 was selected for further study. The 310 line carries a relatively low copy number of human C D4 transgene (approximately 2 copies/cell), and the 313 line has a higher copy number with a transgene (more than 10 copies/cell). 310 and 313 cell surfaces using immunofluorescence staining and FACS analysis. Expression of the human l-CD4 transgene was detected at . 310 series mice and 313 series mice Chests from mice, and non-transgenic, RiC57BL/6 control mice. Glandular cells and lung cells were prepared. The thymus was removed from the mouse and treated with 2XIO-52-mercaptoethanol, 2mM. L-glutamine, 100 units/ml Peninggin G, 100 Atg/+a1 RPMI supplemented with treptomycin G and 10% (V/V) fetal bovine serum. After placing in 1640 medium (hereafter referred to as “Complete RPM+J”), the thymus was Ido (Fisher 5 scientific Co., Pittsburgh) , PA, Cat, No. 12-544-2) between the frosted sides. A single cell suspension was made by pressing with a hat. Wash thymocytes with complete RPMI, Remove large debris by passing a cotton plug into the neck of the inch bassoon rubibenoto. Ta. Cell numbers were then counted. After taking out the lungs, cut them into criss-cross shapes and mince them, then place the lungs on a matte slide. Is it a single cell crushed on the affected side? l! A suspension was made to prepare lung cells. Complete RP After washing once in MI, the red blood cells were transferred to B, B, Mfshell & S, M, Sh: 1g1m, 5alacted Methods In Ce1l ular tmmunolo (Freeman & Co, San Fr Gaze solution for hemolysis (H emolytic Geys 5 solution). A bag filled with a cotton plug Viable cells free of debris were collected through a stool pipette. Then the lungs Visceral cells were counted. Mouse monoclonal antibody FIT (J, *Identification) specific for the extracellular region of human CD4 Leu3a (Becton Dickinson, Cat, No, 72 36), or FITC-labeled normal mouse I as a negative conotrol antibody. gG (Becton Dickinson-Simultest-reag Immunofluorescence staining was performed using the following immunofluorescence staining. 5 XIO5 thymocytes or lung cells were treated with FITC at the concentration specified by the manufacturer. Combined with Leu3a or device TC-conjugated mouse IgG, 2% fetal serum and Incubate in PBS (total volume 100 μl) supplemented with 0.002% NaN3. The staining was carried out. Incubate the cells on water for approximately 30 minutes and then incubate with the same buffer three times. Washed and then analyzed on a FAC3tar fluorescence excitation cell sorter. [m30 is FITC-Leu3a (dotted line) and negative control node FITc-human CD4 stained with mouse IgG (solid line) transgenic mice (310 and 313 lines) and non-transgenic mice (C57 Relative cell number to logarithm of fluorescence intensity of lung cells and thymocytes of BL/6 strain (linear scale). The logarithm of the fluorescence intensity is the number of stained molecules per cell. Reflect density. Non-transgenic control cells express human CD4 I showed that I didn't. In contrast, both the 310 and 313 series The 313 system expresses the human CD4 molecule in cells, and the 313 system has high levels of protein in most cells. Expressed texture. Peripheral lymphocytes, e.g. lung cells, were significant only in 313 line mice. produced high levels of human CD4. Immunity is often caused by the development of T cells in the thymus. Since tolerance has been established [5prent et al.'s 1mmuno1. Rev. 1. 01. p, 1. 73 (1988)], we found that both systems were It was considered to be tolerant to immunization with D4 protein. Therefore, using both systems, The immunogenicity of human rsCD4 and rhesus monkey rsCD4 was determined as described below. Beta. XI - 0 trials with human rsCD4 Human CD4 “self protein” in transgenic mice due to expression of human CD4 To find out whether the ability to respond to transgenic mice (310 line) and non-transgenic mice with human rsCD. 4 to examine the production of antibodies against human CD4. All investments herein The human rsCD4 used in the preparation and assay was provided by Dr. ToIII Hageman, A gift from Bjogen, Inc. The sequence of human rsCD4 is PCT/US ! 18102940. The transgenic mouse is 0. 2ml complete Freundspat GuC FA) (Colorado Serum Co, Denver Co, 50 μg of human rsCD4 emulsified in Cat, No, cs14so) was added to the abdomen. Administered intracavitally (i, p, ) or CFA (0,2 ml. )In 5071 g of human rsCD4 was divided into two parts, each of which was divided into hind limbs (0.05 m1/foot). It was administered to Funtrol non-transgenic mice, unrelated The antigen, 50 μg porcine insulin in CFA (Sigma Chemical Co, St, Louis, MO, Cat, No, 13505) ( 0.2 ml, i, p,). Immunity 7. 14. after 24 and 40 days Blood was collected from mice and plated on plates coated with human rsCD4 by EL[SA. , serum samples were analyzed for the presence of IgG-specific anti-human rsCD4 antibodies as described above. . RIB + adjuvant (RI BI Iamunoch+v Re5earch, Inc-, Hamilton 50 μg human CD4 (0, R-730) in lMT, Cat, No, R-730) 2m1. Q)/Troll mice boosted with f, p,) were given RIBI ( 0,2s1. Booster immunization was performed with only i, p, ). Post-immunization 54. 63 and 76 days The blood was drawn again and the serum sample was retaken to check for the presence of anti-human rsCD4 antibodies. and assayed by ELISA on human rsCD4-coated plates as described above. Said. The εLISA assay described above was performed as follows. First, 95 well poly Vinyl plate (Dynatech Laboratories, Inc6, C hantilly, VA, Cat, No. 001-010-2101), P sag/ml human) rsCD4 (50 μl/well) in BS (mouse immunization Coat at 37°C for 2 hours or at 4°C overnight with the same rsCD4 used for I did it. What is the difference between coating at 37°C for 2 hours and coating at 4°C overnight? There was no difference. , 5katron A/S microplate weight y7w -T nib L/-T was washed 4-5 times, then PBS/1%B5A10°01%T ween-2010, 05% NaN5 (~250 μl/well) for 1 hour at room temperature. I blocked it. After removing the buffer, add PBS/1% BSA70. 02% Twee n-2010, diluted serum in 5% NaNa (50 μl/well) or Standard mouse monoclonal anti-human specific for the extracellular region of CD4 as described above. CD4 antibody (50 μl/well in the same buffer) was added to each well. 3 plates Incubate for 2 hours at 7°C, then PBSlo. O1%Tveen-201 Washed 4-5 times with 0.05% NaN3 (Skatron A/S microplate). Washer). Next, goat anti-mouse I conjugated with alkaline phosphatase gG (Fc-specific) antibody (Jackson Immunoresearch, '/1est Grove, PA, Cat, No, 11 S-055 -071) (50μl/well, PBS/L%B5A10. 02% Twee Add n-2010, 05% (final dilution ratio 1/1000 in NaN3) and plate The cells were incubated at 37°C for 1 hour. Wash the plate again for 5 katr. 4-5 times in an A/S microplate washer) and the substrate 4-nitrate. Lophenyl phosphate (PNPP) (Boehringer Mannhe im, West Germany, Cat, No, 738-352) (0. 1M glycine/1mM MgCl2/1mM ZnCl2 - 6H20, I) HIo, 150 μl of long/zl solution in 6). star Measure the absorbance at 405 nm after maximal binding to the highest dilution of antibody did. Mouse monoclonal anti-human CD4 antibody 2-5-2E6 used in the above assay was produced using the following procedure. However, any mouse monochrome produced using this method -Nal anti-human CD4 antibodies are also useful for the above-mentioned problems. First, two Ba1 b C Mouse (Jackson lmll1unoresearch, Wes 10'Oμg of human rs emulsified with CFA (Grove, PA) in a 1=1 ratio. Immunized with CD4 (1p). Two weeks later, one mouse was treated with 75 μg human in PBS. One mouse was boosted with rsCD4 i,p,) and the other mouse was boosted with IFA 1.1. Boosting was performed with 75 μg of emulsified human rsCD4 (i, p,). Additional exemption One month after infection, both mice were incubated with 50 μg of rsCD4 in PBS. A booster shot was given intravenously. Three days after this booster, due to fusion with myeloma cells, In addition, lung cells from both mice were pooled. Fusion is edited by W. Godjng. , Monoc) anal Antibodies: Pr1nci les a nd Practice (Academic Press, New Year K., 1983). Two parallel assays were performed with supernatants from fused cells and both assays were positive. Antibodies that showed this reaction were selected. One such assay is substantially as described above. ELISA on human rsCD4-coated plates, such as In detail The supernatant was added to a plate coated with human rsCD4 and then treated with peroxidase. Labeled goat anti-mouse IgG antibody was added. Other assays can be performed substantially as described above. ELISA on plates coated with standard goat anti-mouse Ig. nothing. Specifically, after adding the supernatant to these plates, 12J-rsCD4 (human ) was added. Figure 31 shows that the expression of human CD4 in transgenic mice is similar to that of human rsCD4. The EL+SA assay used to determine whether to establish tolerance for The results of b. Figure 31 shows transgenic mice (310 series) and non-transgenic mice. Anti-human rsCD4 antibody at various times after immunization of transgenic mice Represents serum antibody titer. Antibody titers are standard monoclonal anti-human rsCD4 anti- Expressed on logarithmic coordinates as the reciprocal of the dilution factor of serum that shows binding of 50% of the body's binding amount. . Filled symbols indicate individual cells initially immunized with human rscD4 in CFA. Transgenic mice, black squares, administered in footprints; black circles, 1p, administered represents something). Open symbols indicate individuals initially immunized with human rsCD4 in CFA. Represents non-transgenic mice (muzzle squares, pedicle administration; open circles, i, p administration) . Negative control mice (i.e., non-tiger mice that received an unrelated antigen) genetic mice) are represented by black triangles. In an independent assay, gative control, transgenic immunized with the same unrelated antigen Identical results were obtained in mice (data not shown). This assay uses human CD41-transgenic mice and non-transgenic mice. Both nicked mice showed that they raised primary antibody responses against human rsCD4. However, the response of human CD4 transgenic mice is different from that of non-transgenic mice. It was significantly lower than that of U.S. Secondary immunization (40-day booster) Strong immune response with high antibody formation against human rsCD4 in transgenic mice I got it. In contrast, human CD4 transgenic mice did not show any increased response upon secondary immunization. Instead, they The anti-human rsCD4 antibody titer decreased after the secondary immunization. Therefore, transgenic Expression of human CD4 as a self-constituent in mice allows them to H) Significantly impairs the ability to mount an immune response against rsCD4 and induce human CD4 production. This reflects the difference in the repertoire of reactive lymphocytes between animals that express the disease and those that do not. . In yet another assay, two human CD4 transgenic mice (31 3 lines) and two non-transgenic mice were treated with 50μ emulsified in CFA. g of human rsCD4 (0.2ml. 35 days after immunization with i, l), ) Raw incomplete Freund's adjuvant (IFA) (Colorado Seru 50μg human in mCo, Denver, Co, C3#1451) rscD4 (0,2m1. i, p,). negative control Two non-transgenic mice were treated with 50 μg of porcine insulin (unrelated). Immunization (0.2 ml. i, p,) L, after 35 days, IFA single Germany (0.2m1. i, p, ) immunized. Take serum from all 6 mice Blood was collected and placed in a Corning 96-well plate (Corning Gla ss Works, Corning, NY, Cat, No, 2580 Anti-human r sCD4 antibodies were assayed. Dynatach and Corning used There were no significant differences in microtiter plates. Results from this assay is consistent with the experimental data shown in Figure 31, thus indicating that the human CD4 transgenic This supports the observation that mice are tolerant to human CD4 protein. Furthermore, antibody antibodies against human rsCD4 in human CD4 transgenic mice were tested. The reaction was analyzed by immunostaining of human CD4-producing cells, and the natural transmembrane human CD was detected. It was determined whether human CD4-producing cells produce antibodies that recognize 4 molecules. 5XIO5 human Jurkat cells (American Type Cu1tu) re Co11ectfon, Rockville, MD, Cat, N o, TIB 152) in 100 μl of PBS/2 containing one-tenth of serum. % fetal calf serum (FCS) 10. 02% NaN5. child serum from human CD4 transgenic mice (310 line) or non-transgenic mice. Serum taken from a genetic mouse (CS7BL/6) 24 days after immunization. Or, as a negative control, use non-immunized human CDI transgenic cells. This is serum taken from a bear mouse (310 series). Immunization was carried out exactly as described above. (i.e., 50 μg human rsCD4/CFA; 0.0 μg human rsCD4/CFA; 2ml t,p,). After incubating for 30 minutes on ice, cells were incubated in PBS/2% FCS 10. 02% Washed with NaN3. Next, FITC-labeled sheep anti-mouse Ig (FI+t,) assay was performed. Medicine (Cappell, Cooper Bioa+edical, WestC hester, PA, Cat, No, 1311-1744) (manufactured by PBS/2% FCSlo, 02% Naps) as specified by the manufacturer, and The cells were incubated on water for an additional 20 aliquots. Cells were washed twice, then FA The cells were analyzed using a CStar fluorescence excitation cell sorter. Figure 32 shows how this FACS analysis is compared to the logarithm of fluorescence intensity versus relative cell number (linear The histogram is shown below. The solid line is the reagent for the second step - Cells stained only with FITC-labeled sheep anti-mouse Ig (control) are shown. vinegar. The line with the 7 symbols indicates the human CD4 transfectants immunized with human rsCD4. Ennick mice (Tg) and non-transgenic mice immunized with human rsCD4. Figure 2 shows cells stained with serum from bear mice (NTg). The dotted line is from non-immunized non-transgenic mice (control). Cells stained with serum are shown. FACS analysis shows that human CD4 transgenic cells were isolated by immunization with human rsCD4. Primary antibodies raised in bear mice recognize natural, transmembrane human CD4 molecules. I have shown that I do not. The antibodies target epitopes unique to the soluble form of human CD4. It seems that they are aware of the situation. Therefore, human CD4 trans to human rsCD4 Sujeni. There are clear differences between the responses of bear mice and non-transgenic mice. There is. In clear contrast to non-transgenic mice, transgenic genetic mice have a unique ability to detect the “self-J” epitope possessed by natural, transmembrane CD4. The aim is to avoid causing an immune response. xn-no'・ke Rhesus monkey rsCD4, which is an amino acid variant, is a transgenic human CD4. transgenic cells to see if they elicit an immune response in bear mice. mouse (310 line) and non-transgenic mouse were emulsified in CFA. 50 μg of rhesus monkey rsCD4 (produced and purified as described above) ) (0.2 ml, i, p,). These mice were incubated for 43 days after immunization. 50 μg of rhesus rsCD4 emulsified in IFA (0.2 ml. i,p ,) was boosted. In a separate independent assay, human CD4 transgenics mouse (line 313) and non-transgenic mice were cultured as described above. immunized with Gezaru rsCD4. These mice were incubated 35 days post-immunization as described above. Booster immunization was given to sea urchin. In both assays, blood was collected on various days post-immunization. Serum samples in numbers were tested with antibodies that recognize rhesus monkey rsCD4 and human r5 Cross-reactive antibodies recognizing CD4 were analyzed by ELISA. The ELISA assay was performed using rhesus monkey rsCD4 as described in Example XI. Or plate coated with human rsCD4 (5 μg/ml, diluted in PBS). I went there. The results of the ELISA assay are shown in Figure 33. The antibody titers shown are as follows: It was decided. For serum that reacts with human rsCD4, the antibody titer is Serum dilution ratio showing 50% binding of monoclonal anti-human rsCD4 antibody (See Example X■). However, this monoclonal antibody rscD4-coated plates. Therefore, human rsC D4-coated plates and rhesus rsCD4-coated plates. Non-transgenic mouse anti-rhesus CD4 polyclonal binding Serum with high antibody titer was selected as the standard for anti-rhesus CD4 antibody assay. It was used for In detail, the standard used was 50 μg in CFA. Immunized with rhesus monkey rsCD4 and immunized with rhesus monkey rSCD4 in IFA on day 43. The serum was from a boosted non-transgenic mouse. Secondary immunization with serum The experimental sera were collected on day 7 post-response (i.e., 50 days post-immunization). Monkey rsCD4 antibody titers were determined on plates coated with 7 rhesus monkeys rsCD4. , standard non-transgenic mouse polyclonal anti-rhesus rs It was expressed as the reciprocal of the serum dilution ratio indicating binding of 50% of the binding amount of CD4 serum. The antibody titer obtained as a gamma rhesus monkey rsCD4-specific antibody was compared with a human rsCD4-specific antibody. A conversion constant was established to convert the antibody titer into a value that can be directly compared with the antibody titer in the body. this is , standard polyclonal anti-rhesus rsCD4 serum, human) rsCD 4-coated plates and rhesus rsCD4-coated plates. assay to directly determine the relative binding capacity of each form to rsCD4. By doing so, it was done. Anti-rhesus rsCD4 serum is effective against human rsCD4. was determined to bind to rhesus monkey rsCD4 twice as well as to bind to rhesus monkey rsCD4. That is, human r of standard anti-rhesus rsCD4 serum onto sCD4-coated plates. Binding was determined by adding 2-fold diluted serum to rhesus rsCD4-coated plates. This means that it is equivalent to a combination. Therefore, the standard serum anti-rhesus The monkey rsCD4 antibody titer was twice that of its anti-human rsCD4 antibody titer. All of The antibody titer of the experimental anti-rhesus rscD4 serum was the standard polyclonal anti-rscD4 serum. Adjustments were made by comparison with rhesus monkey rsCD4 serum. In Figure 33, 0 rho was immunized with rhesus rsCD4 in CFA and 43 day rho I Human CD4 transgenic cells boosted with rhesus rsCD4 in FA. Black mouse (310 series) (Tg) is indicated by black mark, non-transgenic mouse (NTg) is represented by a white mark. Individual mice are represented by squares or circles. white triangle The unrelated antigen was supplemented with O-low insulin (50 μl) emulsified in CFA. g) (0.2m1. i, p, ) and immunized with low IFA alone (0.2 ml) for 43 days. ．． 　Represents the response of non-transgenic mice administered with i, p,). left panel Table 1 shows serum anti-rhesus rsCD4 antibody titers at various days after immunization. . The right panel shows anti-human rsCD4 antibody titers at various days post-immunization. Results from an independent assay in 313 transgenic mice are shown in Figure 3. This was consistent with the experimental data shown in 3. As shown in Figure 33, human CD4) transgenic mice and non-transgenic mice When a genetic mouse is immunized with rhesus rsCD4, the immunogen (rhesus rsCD4) rsCD4) and antibodies that recognize human rsCD4 were induced. . These results demonstrate that human CD4 transgenic mice We show that the anti-7 rhesus macaque CD4 immune response can be generated comparable to the response of mouse mice. vinegar. Furthermore, this result shows that immunization with rhesus monkey rsCD4 is more effective than human CD4 (human CD4). Demonstrates success in "breaking tolerance" in transgenic mice. why If so, human CD4 transgenic, bear mouse and non-transgenic mouse This is because both of them produced antibodies that bind to human rsCD4 with high antibody titers. . Furthermore, human CD4) transgenic mice immunized with rhesus monkey rsCD4 and and non-transgenic mouse serum containing natural, transmembrane human l-CD4. The antibodies that recognize it were analyzed. Immunofluorescence staining was performed on normal rhesus monkey peripheral blood lymphocytes as a source of normal CD4 lymphocytes. Paball (PBL) (New England Primate Center. 5outhboro, MA) and normal human PBL (obtained from a healthy donor) ). Rhesus monkey PBL and human PBL were isolated as follows. Blood (10 m1) was diluted 2 times with RPMI-1640 medium (not supplemented), and 50 m1 3 ml of lymphocyte isolation medium (Organon Teknika) in a tube of , Durham, NC, Cat, No. 36427) at room temperature. . Tubes were centrifuged at 400xgav for 30 minutes at room temperature. Interfacing PBL before harvesting and staining from PBS/2% FCS 10. 02%Na Washed three times with N3. Additionally, by exposure to the mitogen phytohemagglutinin (PI(A)) Human PBL maintained with recombinant interleukin 2 (IL-2) after stimulation (prepared as described above) was also stained. Because these cells may represent a slightly different form of the human CD4 molecule. activation PBL was prepared as follows. Normal human PBL (complete RPM of tool) 2XIO6 cells/ml in Co5tar T-25 flask (Co5tar r, Cambridge, MA, Cat. No. 3025), lAtg Ha 1 PHA (Difco Laboratories, Detroit, Ml, Cat, No. 3110-57-3). add cells Cultured for 3 days at 37°C in a humidified, 5% CO2 incubator. After 3 days, fine Cells were adjusted to a density of 1xlO6 cells/ml in complete RPMI medium and recombinant IL- 2 (rlL-2) (r-T cell growth factor, human, rhTCGF, Lot N o, NP 6003SO9, 2. in 50mM acetic acid. 1x106 units/mg, Bi Manufactured by Ogen, Inc., Cambridge, MA, at -70°C. (preservation) was added at a concentration of 20 units/ml. Add fresh rlL-2 every 3 days , cell density as needed to maintain cells at a density of 1xlO' cells/ml. adjusted. Cells were cultured for a total of 3-4 weeks. Cells used within this period There was no obvious difference between them. Fluorescent staining was performed using 3X105 PBL (rhesus monkey, human or activated human PBL) and transgenic mice immunized with rhesus monkey rsCD4. and non-transgenic mouse serum (1:10 dilution). Proceed as described in Example X. CD4 on both human and rhesus T cells Monoclonal antibody Leu3a (Becton, Dickins on, MountainView, CA, Cat, No, 6320) was used as a positive staining tool (according to the manufacturer's instructions). F ITC-labeled goat anti-mouse IgG Fc-specific antibody (Jackson Immun oresearch, West Grove, PA, Cat, No. 1 15-015-071) was used as the reagent for the second step. stained cells was analyzed by FACS as described in Example X. Figure 34 shows the following fluorescent staining of rhesus monkey, human and human PHA-activated PBLs. show. (1) Positive control Leu3a monoclonal antibody (above figure, (dotted line), (2) second step reagent alone, i.e. negative control staining ( (upper figure, solid line), (3) anti-rhesus rsCD4 serum of transgenic mice (NTg) (middle mouth, dotted line), (4) Anti-Rhesus rhesus in non-transgenic mice Le rsCD4 serum (NTg) (lower figure, dotted line) and (5) butaine in CFA Serum of non-transgenic mice immunized with surin and boosted with IFA alone , that is, negative control staining (lower figure and center opening, solid line). all The serum was from 19 days after the secondary reaction (i.e., 62 days after immunization). This experiment consisted of human CD4 transgenic mouse serum and non-transgenic mouse serum. Both mouse sera contain antibodies that recognize natural, transmembrane rhesus monkey CD4. Indicates that it is included. However, only non-transgenic mouse serum can be isolated Naturally produced either fresh human PBL or activated human PBL. , contained an antibody that recognizes membranous human l-CD4. The possibility of xm-H+vQ infection as a method or method is to prevent HIV infection and Antibodies useful for the treatment of rhesus macaque rsCD4, such as antibodies that recognize Hlv, We investigated whether this is caused by immunization with triggering such antibodies. - Rubbing is possible based on observations supporting the existence of an immune network (i.e., induction of anti-idiotype antibodies by antibodies) [e.g. 1. 1 mmun of M, Roitt et al. Dish, pp, 10. 1-10. 11 (Gower Medical Public (1985)). Generally, the antigen is then an anti-idiotype. Antibodies that have specific variable region structures (idiotypes) that can be raised wake up Some of those anti-idiotypic antibodies are structurally related to the antigen of origin. and therefore compete in binding to the original antigen and idiotype antibody. moreover In detail, antibodies raised by the CD4 immunogen (anti-CD4 antibodies) have specific specificity. (idiotypic structure), and in the internal image of an idiotypic antibody. Causes certain anti-idiotype antibodies. Those anti-idiotype antibodies It is structurally similar to the immunogen CD4 and binds to HIV like CD4. In order to test this possibility, we have virtually Purified old V gp120 (5 μg/ml in PBS) as described in Example XI ) on plates coated with alkaline phosphatase In goat anti-mouse IgG. Perform ELISA assay using specific detection reagents followed by substrate PIIIPP. It was. The results of this assay are shown in Figure 35. This is a transgenic mouse (310 line) (Tg) and non-transgenic mice (NTg) Rhesus monkey rsCD was also emulsified in Freund's adjuvant as in Example X. 4 shows the binding activity to old V gp120 of the serum obtained by immunization and booster immunization with No. 4. The graph shows absorbance at 405 nm versus serum dilution ratio. The black circle is the primary resistor. 10 day low of rhesus monkey rsCD4 response, or 10 day low serum after immunization. . Black triangles indicate blood samples from day 75 of the secondary anti-rhesus CD4 response (day 50 post-immunization). Represents Qing. Black squares represent serum on day 62 after immunization on day 19 of the secondary response. White Circles represent serum from 28 days after secondary response (71 days after immunization). This assay shows that immunization with rhesus monkey rsCD4 results in human CD4 transfectants. We demonstrate that binding activity to gpl20 is induced in mice. a Non-transgenic mice immunized with rhesus monkey rsCD4 show no such activity. Little or no sex was evoked. The data shown in Figure 35 is Two other human CD4 transgenic mice immunized with rhesus rsCD4. (310 line) and four other non-transgenic mice. It's like that. In addition, porcine insulin in CFA, followed by IFA-immunized Tg and and control serum from N7g mice had no detectable gp120 binding activity. Not found (data not shown). Figure 36 shows two 313 transgenic mice (black circles and squares) and and human rsCD4 in two non-transgenic mice (open circles and open squares). (left panel) and old V gptzo (right panel) ) shows the dynamics of appearance. These mice received 50 μg rhesus r in CFA. sCD4 (0,2m1. Aka in low IFA 35 days after immunization with i, p, Gesar rsCD450μg (0.2ml. It was boosted with ip, ) . Figure 36 also shows two negative control mice (one transgenic). Nick, the other non-transgenic, 2) (black and white triangles), human The binding activity to rsCD4 and old vgptzo is shown. These mice are C 50 μg of porcine insulin in FA (0.2 mf, i, p,) After 35 days oral weight 1FA (0,211Il, i. p,). Data are anti-human hrsCD4 antibody titer and anti-gl)1 20 antibody titers <plates coated with human rsCD4 as described in Example XI> and gptzo-coated plates as described above. (measured by ELISA) is plotted against the number of days after immunization. Anti-gp120 binding activity titers were determined using standard gp120-specific monoclonal antibody (anti-old V-1gp12ON, sequence-specific, neutralizing antibody) (DuPont Company, NEN Re5search Products, Wilmi ngton. DE, Cat, No, NEA-9305) expressed as ng equivalents/ml It is. Both transgenic and non-transgenic mice are human r produced antibodies that cross-reacted with sCD4 and reacted with rhesus monkey rsCD4, but rhesus monkeys Only transgenic mice immunized with rhesus monkey rsCD4 showed significant anti-old V The gp120 binding titer is shown. The binding activity to gptzo was determined by rhesus monkey rsC. It appeared late in the primary response or early in the secondary response to D4. Secondary response progression During the period, anti-gp120 titers leveled off or increased slightly. The appearance of specific binding activity to gptzo and its immunogenicity in rhesus monkey rsCD4. The uniqueness of the serum from infected transgenic mice is striking. I The specific binding activity for gptzo is 120 molecules. by antibodies that target the site and bind to the immunogen or its fragments. by an antibody specific for rhesus rsCD4, which subsequently binds to gptzo I wanted to prove that it wasn't something. Such a possibility is unlikely. why If so, both transgenic and non-transgenic mice have anti-rsCD4 make antibodies, but only in transgenic mice or with significant gptzo-specific This is because it has binding activity. Nevertheless, it is true that human CD4 transgenic To demonstrate that it elicits gp120-specific antibodies in mice, we Two independent approaches were taken. These methods are shown below. These are: Prove; (1) The gp120-specific antibody is a transgenic mouse anti- It can be isolated from rsCD4-specific antibodies contained in rhesus monkey rsCD4 serum; and (2) Immunization with gp120-specific 1 cell-producing B cells Geza rsCD4 was activated in transgenic mice. B, 1 (IV 12 (1,”) of human C immunized with rhesus rsCD4 D4 Collected from transgenic mice and non-transgenic mice The collected serum was fractionated using a gl)120 affinity column, and gp120-specific antibodies were extracted. It was purified and separated from other active components in total serum. A gpl 20 affinity column was manufactured by R as follows. Manufacturer's recommendation Follow the procedure to prepare O,IM Sodium Borate 103M NaCl(p)I 8. 4) Purified gPI20 (ioll) at a concentration of 5A2$8/4l was added to 0, 3 g Brominated/Unactivated Sepharose 4B (Sigma, Cab No. C-9142). Binding efficiency was examined by 5DS-PAGE analysis and 95% - found to be larger than cents. Add 5 volumes of 50mM glycine to the resin. 5 After washing with M NaCl (pH 3,0), 5 volumes of 20mM Tris-HCL lo, 5M NaCl, washed with 10,02% sodium azide, and the latter It was stored at 4°C in a buffer solution. Serum used in a “large amount” fractionation experiment aimed at recovering gll1120-specific antibodies is a human CD4 transgenic mouse (line 313) and a non-transgenic mouse. Whole blood 1 (100 μm) taken from a mouse with a Rhesus monkey rsCD45Qug in CFA on day O (0,)! m1. i,p ), and on day 35, rhesus monkey rsCD450 μg (0,2 ml, i, p,). The specific serum used was from 49 days after immunization. PBS (pH 7,5 ) (900 μm) was added to each 100 μl serum sample. Each diluted serum test 1120 μl was set aside as representative of starting material. The remainder of each sample (980 µ■) was transferred to a cephalogram coupled with 250 µI gptzo. (prepared as above), 1. 7ml shrimp tube (＾merican) BioanaLytical, Cat, No. 702800) . Put the lid on this shrimp tube and place it in the TEK-PRO tube for 3 hours at room temperature. ker (CAt, No, R4185-10). Then the resin is precipitated. 10. Centrifugation was performed at 000xgA for 5 seconds. unbound substances The supernatant containing the supernatant was removed. gl) 120-Sepharose (contains bound substances) into a column made with a 2 ml plastic pipette filled with glass wool. , 3x0. Wash with 5 mI PBS by gravity. 50 per wash Wash twice with 0 μm PBSlo, 5 M NaCl, and 5 M NaCl per wash. 00 μl 17) A final wash was performed twice with PBS. Next, color the combined substances. 100 μl of 50 mM glycine (pH 3,0)/250 l1M N Elution was performed with aC1/1 mg/ml BSA. 6 elution fractions (~100 μl/frac/−J) were collected from each column. Collect each fraction Immediately after 7. 5μm 0. 5M HEPES (pH 7.2) was added to neutralize. The starting material that was set aside, the “unbound fraction” (i.e., the initial serum supernatant after incubation), PBS washes, and eluted fractions. , gpl20, coated with human rsCD4 and rhesus monkey rsCD4, respectively. Example XjlL and Vl+, respectively, were assayed as described. Perform antibody titer or relative concentration Calculated as described in Example Or, the degree of rsCD4-specific antibody was determined. Total amount of antibody units in each fraction can be calculated. Because the antibody concentration is measured and the total amount of each This is because the amount is known. The results of each experiment are shown in FIG. The left panel is r　5CD4　transgenic mice (black bars) and non-transgenic mice Anti-g+)120 binding of various fractions from genetic mice (white bars) Shows percent activity. Right panel shows various fractions of anti-human rsCD 4 Percentage of activity is shown. The binding activity of the starting material is defined as 100%. gp120-specific binding of anti-rhesus rsCD4 serum from transgenic mice. Approximately 60% of the synthetic activity was removed upon exposure to gl)120-Sepharose. Ta. Other data show that by simply increasing the amount of gl) 120-Sepharose, It is proposed that more of the specific binding activity to gl) 120 could be removed. Ru. This is because when a small amount of the same serum sample is developed on this column, 100% g This is because binding activity to p120 was removed (data not shown). There was negligible gp120-specific binding activity in the PBS wash. However, a significant amount of gp120-specific binding activity eluted from the column. Contrast (2) The rsCD4-specific antibody did not bind to the gp120 column (1n g/ml), the elution fraction contained human anti-rsCD4 activity. was essentially undetected. The results of rhesus monkey rsCD4-specific binding activity are as follows. (data not shown). These data are based on human CD4 gl)120-specific in anti-rhesus rsCD4 serum of transgenic mice binding activity is due to gp120 specific antibody and anti-rsCD4 antibody indicates that it is not mediated by C, HIV-120 salt gl) 120-specific antibody was used in human CD4 transfectants immunized with rhesus monkey rsCD4. The second used to determine whether it is actually induced in Suzienick mice. The method is based on the following hypothesis. If the response to rhesus r　5CD4 is due to the gl)120-specific 1g receptor If we stimulate B cells with Mammals that were first immunized with rsCD4 and then administered the gl)120 antigen itself. Mice responded not only to the primary response to anti-gp120 but also to the boosted gl)1 20 responses. To test this hypothesis, we tested rhesus macaque rsC Rhesus rsCD450 μg (0 ,2m1. i,p,), rhesus monkey rsCD450μ in IFA on day 35 g(0.2m1. i, p,)) Human CD4 transgenic mouse (31 3 series), 750 days after immunization, gp12050 μg (0.2 ml, i, p,) were administered. The rationale for administering gl) 120 in physiological saline is Administration of antigen in saline elicits a strong primary immune response against protein antigens ′ is not sufficient to boost the response if the animal has been previously primed. This is because that. This experiment included two Huntroll mice. One transgenic control mouse (line 313) was given CFA on day 0. 50μg of porcine insulin (0.2ml. 35 days after administering i, p,) IFA alone in the eyes (0.2 ml. i, p, ), then on the 75th day gp12050μg in saline (0,2a+1. i, l1l) is administered . Transgenic control mice (313 line) were immunized 24 times first. On day 75, gp12050μg (0,21111,i,I ),) were administered. The results of this experiment are shown in FIG. This is suitable for solid-phase ELISA. The figure shows the anti-gp1201gG antibody titer measured by the method. We found that both control mice responded to gpi20 administered in saline. It was found that no substantial first-order response occurred. However, Freund Rhesus monkey rsCD4-primed transgenics in Ajini, zH Mice showed significantly increased levels of gp120/saline in response to saline administration. gp120-specific antibody titers were produced. Furthermore, if it is simply the primary anti-gp12 This antibody titer is much higher than expected if it were due to a zero response. This result is Exposure to rhesus rsCD4 is triggered by subsequent exposure to gp120 itself. This indicates that the cells primed the response to gp120. This result also Enhances the binding response to gp120 elicited by immunization with gezall rsCD4. We will show you how to add it. Next, we examined the human CD4 transgene. Anti-gl) induced by immunization of Ninoku mice with rhesus rsCD4 We investigated whether the 120 antibody could recognize cells expressing gp120. Immunostaining was performed on transformed CHO cells expressing recombinant gp160 on their surface. Cell (In I/jtro International Culture C o11ection. Linthicum, MD, IVI-10236), and the control population As a method, transformed CHO cells expressing recombinant LFA-3 were used. [PCT Patent Application PCT/US88101924]. To stain adherent CHO cells, use 5mM EDTA/PBS (pH 7° 5) for 5 minutes at 37°C to remove the cells from the culture flask. Tap the culture flask (Costar T-75 or T-150) to suspend Cells were collected into 50011 conical tubes. Cells were washed twice with cold staining buffer (PBS/2% FCSlo, 02% NaN5). ). Staining was carried out on 5xlO' cells (in staining buffer) as described above. P&so μm) were incubated with various sera at a final dilution of 1/10. Ta. As a positive control, DuPant anti-old'/-1gp12ON Urine monoclonal antibody was used at a concentration of 10 Fg/+1. Negative skit As a role, MOPC-21 (IgG+, k) is produced by unrelated mouse myeloma antibody (Litton Bionetics , Charleston, SC) at a concentration of IO μg/ml. 4° After incubation for 30 min at C, cells were washed three times with staining buffer. next , cells were incubated at 4°C for 30 min with FITC standard at a final dilution of 1720 in staining buffer. Goat anti-mouse Ig (Jackson 1mmunoresearch, C at, No. 115-016-062), and the cell surface Mouse antibodies bound to the surface were detected. Cells were then analyzed by FACS. The result Shown in FIG. Figure 39A shows the negative co-population of CI (O cells) expressing recombinant gp-αo. control reagent FITC-goat anti-mouse Ig (FITC-Gα Mlg) only (solid line) or MOPC-211g (γ+k) and FITC - Shows the results of staining with goat anti-mouse Ig (dotted line). Staining with these two negative controls was identical. Figure 39B (left) shows gp120-specific monoclonal antibody (αgpi20mAb ) (solid line) staining of recombinant gp160c)10 cells with unrelated MOPC Stronger fluorescence intensity compared to staining with -21 negative co-notrol antibody (dotted line) Indicates movement. In contrast, recombinant LFA-3C) to cells (Figure 39B, right) staining with gpl20-specific antibody and control MOPC-21 anti- Body staining is indistinguishable. Recombinant gp160 using gp120-specific monoclonal antibody of CHO cells Compared to FIG. 39B, the staining shows that the antibody titer is 1 μg/ml (FIG. 390) and 0. It decreased as the concentration decreased to 1 Fg/ml (Figure 39D). Staining with mouse serum is shown in Figures 39E and 39F. Pig infusion in CFA Sou g (0.2m1. i, p,) were administered on O days and months, and IFA only ( 0.2m1. i, p, ) on day 35 and gp120/saline (0, 2m1. i, p,) from transgenic mice administered on day 75. Control mouse sera A and B were obtained. Serum A was collected from this mouse on day 75. Hip serum B was collected before boosting with gp120/saline, 10101 days after immunization. Eye p120/Physiological saline 26 days after the physiological saline booster. Group I in Figure 38 As shown in I, this mouse showed only a weak primary anti-g120 response. Figure 3 9E, two control sera (A and B) were tested for recombinant gp160-CH. ○Prove that cells are indistinguishable in staining. The third serum (blood ff1c) was added to rsCD450Fg (0 ,2m1. Rhesus monkey rsCD45 in IFA at 355th immune locus in i, p,) 0μg (0.2m1. i, p,) and saline on day 75. gp120 in water (0.2m1. i, I),) were administered to the transgenic Obtained from a mouse (313 series). Serum C was collected from this mouse and gp120/physiology Separation occurred 26 days after administration of saline. This group (as shown in Figure 38) Transgenic mice developed high titer anti-gl)120 responses. interesting Particularly, serum C was tested with a DuPont gp120-specific monoclonal antibody. It showed a shift comparable to the fluorescence intensity observed with the staining, and was more intense than control serum B. The cells were stained with high fluorescence intensity (see Figure 39F). blood/! IC staining was performed using gpl, 60 (see Fig. 39F, right). The above experiment was conducted using a g+)120-specific antibody that recognizes gp150 molecules on the cell surface. , by immunizing with rhesus macaque rsCD4, human rsCD4 transgenic , prove that it is caused by bear mice. E. Infection assay Human CD41-transgenic mice produce in response to rhesus rsCD4. To investigate the potential therapeutic effects of Zur antibodies, serum from transgenic mice was Each was subjected to two in vitro assays. In the first assay, the infectivity of the old ■ The inhibition of was measured. In order Nianosei, fusion cell form between cells infected with HIV The inhibition of formation was measured. For infectivity measurements, Robert-Guroff et al.'s -t(TL'/-11l -net+tralizing Antibodies In Patient s With AIDS And AIDS-related Complex -9Nature, 316. Based on the method described in p. 72 (1985) I went to microa and said. In detail, supplemented RPMl (10mM Contains HEPES (pH 6,8) and 2IIIM glutamine, 20% F (20 μl) of RPMI 1640 medium supplemented with BS. 111B strain 1007CIDsa was diluted to 20 μ+t) without 1 mouse serum. Alternatively, it was added to human rsCD4 (positive conotrol). Serum samples and Both human rsCD4 and human rsCD4 were titrated. Incubate for 1 hour at 4°C, then incubate at room temperature for 1 hour. Incubate for 5 min and add (7) 4XlO' cells in supplemented RPMI (10 μl). No.08166 cells were added to 40 samples each of HTLV/serum and HTLV/rsCD4. Added to μl. C8166 is a CD4” transformed human cord blood lymph cell line [J, 5odroski et al., Nature, 322. pp, 470-74 (1 986)]. After 1 hour incubation at 37°C, three aliquots of each mixture were prepared. wells (15 μl/well) and the total volume of each well was added to the supplemented RP. The diameter was made to 200 μm with MI medium. Presence of fused cells (+) after at least 5 days Wells were visually assessed for infection or non-infection (-). Four transfectants were tested in three independent microassays performed as described above. Nick mouse anti-rhesus CD4 serum samples and one non-transgenic Mouse anti-rhesus CD4ffll supernatant samples were measured. Each assay has an independent A control serum sample was included. These control samples were Immunized with an unrelated antigen (moth cytochrome C) and boosted with the same antigen in IFA [R, H, Schwartz, -Key Lymphocyte Recognition of Antig en In As5ocia mouth on With Gene Products Of The Major Histocompatibility Col1 lplex-, Ann, Revs, Immun, 3. pp. 237-61 (1985)]. For each assay, control mouse serum inhibited infectivity at dilutions of 1/16 or higher. Transgenic and non-transgenic mice anti-rhesus For both CD4 sera, no protective effect was observed at dilutions of 1/16 or higher. It wasn't noticed. We consider these observations to be inconclusive for the following reasons. normal mouse serum Due to the non-specific inhibitory effect, which is a characteristic of Analysis of monkey serum was limited to dilutions higher than 1/16. i.e. in vitro dilution conditions that may contain antibody titers too low to demonstrate protective efficacy. . In addition, as indicated, the assay demonstrated that the inhibitory activity by anti-gl)120 antibodies and/or anti-tumor-penetrating CD4 antibodies could be detected. Nevertheless, antitumor A non-toxin containing a penetrating CD4 antibody that previously showed strong inhibitory activity in a fusion cell assay. Anti-human rscD4 serum from transgenic mice is partially Even the virus was unable to inhibit its infectivity. Therefore, human rsCD4 is F! A-harm positive Although it does provide a functional control (at a concentration of approximately 1 μg/ml), Antibody titers in mouse serum may be too low to inhibit infection under these assay conditions. Ru. (For 1/16 dilution, anti-g p120 antibody titer is considered to be lower than 1 μg/ml). In the assay we performed is simply ``+'' (fused cells present) or ``-'' (not infected). did. At present, there is no way to quantify differences in the level of infection or delay the reaction rate. There is no way to detect it. Finally, our analysis is limited to the laboratory strain HTLV-111B. It was done. Assays using isolates from u+v5 individuals may yield more comprehensive results. Ru. Furthermore, B, D, Walker et al.'s Proc, Natl, Acad, S ci, LISA, 84, pp. 8120-24 (1984) Similarly, anti-rhesus CD4 serum from transgenic mice was infected with HIV. Inhibits fusion cell formation between infected H9 cells and uninfected C8166 cells tested for the ability to In detail, 10mM HEPES (pHa, a> and RPMI 1640 medium containing 2mM glutamine and supplemented with 20% FBS. In 100 μl of ground, 5×10 H 9 cells together with anti-rhesus CD4 serum samples from transgenic mice. It was incubated for 30 minutes at 7°C and 5% CO2. (H9 cells are AIDS Re5search and Reference Reagent Prog ram, NIH Bethesda, MD. ) then looμ 15 x 1O3 uninfected C8166 cells in 1 volume of medium were added to each well. Add to a volume of 200 μl and incubate at 37°C under 5% CO2. , total fused cells per well at 2 and 24 hours after addition of C8166 cells. The number of cells was counted. Parallel co-culture (co-cuHivation) in CFA Unrelated antigen (porcine insulin) immunized in CFA and boosted (negated) in IFA non-transgenic mouse serum (gative control) or to- 0.62 μg/ml anti-human CD4 monoclonal antibody (positive control) ) was used. A 50% reduction in fused cells compared to the control was considered a positive result. Two independent assays were performed as described above. In one assay, one Anti-rhesus CD4 serum samples from transgenic mice showed inhibitory activity and 2 Anti-rhesus CD4 serum samples from two non-transgenic mice were similar. . In a second experiment, the same transgenic mouse antiserum and the same non-transgenic anti-blood transgenic mouse/ll (containing anti-human transmembrane CD4 antibody) inhibits It showed no effect. Microorganisms and recombinant DNA molecules according to the invention were introduced on April 26, 1990. Vitrointerna/Yonal Infuboretenodo Culture Collection, Li tiicum, Maryland, U.S.A. and certified as follows; 1) SQ131/E, coli JA22 1psQ134 / E, coli JA221psQI36 / E, c oli JA221psQ146 / E, coli JA221psQ16 2 / E, coli JA221psQ205 / E, coli JA 221psQ200/E, coli; A221pDGI00/E, coli JA2211) BG341JOD, rhT4/E, coli JA221 These cultures each have accession number IVI 10243-10251. was assigned. Although a number of embodiments of the present invention have been described so far, we have described various embodiments of the present invention. Additionally, other embodiments of using the methods and compositions of the present invention may be provided by: It's obvious. Accordingly, the scope of the invention includes alternative embodiments and the foregoing specification. including all modifications defined by this document and the claims appended hereto. , and that the invention is limited to the specific embodiments presented herein by way of example. It is understood that it will not be done. co4FIG, /A FIG, /El 5 Jin) mouth 401 GCTTCA 406 uLeu FI6. 3 F/G, 4A F/G4B Ministry ,! l'Q146's 7f) Game 11 and CD4 main humiliation rube middle WuAs p S e r As pTh rTy r 工１ecysG　1uValG　1uAsnLys　 LysG luG 1uValGluLeuLeuVa 1PheG 1yLe uThrAlaAsnSerAspTh rE i s LeuLeuGluG lyGlnSerLeuThrLeuProTrpArgAlaProLeuV alFIG　θ FIo, 12 poG+ao CD4 j! to eight etAs FIG, /3A G lyG l uLeuT r pTrpG 1nAlaG luArgAl ase rse rse rLys Se rTrp 1spProLysLe uG1nMetGlyLysLysLeuProLeuDay1sLeuThrLe uPr. G　lnA　1aLeu　ProG　1nTy　rA　laG　1yre　r G　1yAsn　LeuTh　r　LeuAlaLeuG　■ uA 1aLysTh rG 1yLys LeuHi sG 1nG lu Va　AsnLeuVa　ValMe　ArgAr　LysArgG　1 uLysA 1aValT rpValLeuAsn ProG 1 uA laG lyMe tT r pGIn Cys LeuLeuSe rAs pserGlyG　1nVal　LeuLeuG　l　u　Se　As　n 工 1eLysFIG, /3B p 13G341. Le Ding 4 Zer issue τ $ 1 θ A gAlase r 5erSerLys Se rT rpl l eTh r PheAs pLeu LysAsnLysG 1uV1 uValAs nL euVa lValMet ArgA 1aTh rG 1nPheGlnG 1uAsnLeuTh rCysGluVa ITrpG lyP roTh rSer　P　roLy　s　LeuTh　rLauser　LeuLysLe euAsn P roG 1uAlaG 1yre tTrpG 1nCysL euLeuSe rAsp 5erG 1yGlnFIG, 15B 1701 GAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAAGGACTrT CCTTCAGAATTGCTAAGTr 1750F/G15C 4051σmτAAATCAAT(πAAAGTATATATGAGTAMCT rGGTCTGACAGTrAC4100FIG, 15E FIG, 15F FIG, /6 A4) 2' colander 〆 7° Tet °t Suya Nitizer! Rebazu Issho pFIG, /7 Ninohe Befuma I: 18B 1nCys LeuLeu Se rAs p Se rG lyG 1nVa l　LeuLeuG　l　u　Se　As　nI　1eL凵@s Val　Leu　ProThrTrpSerThrP　roValGlnPr oMe tAlaLeuIleFIG, 20B Presenting two kings and indulgent Σ animals -- FIG. 2/A FIG2/B F/622B FI6. 220 F/G, 23 Psq200・Pegte F Oh Psq205. Bear 7)”F/θ24 Psq200. r: Spot) #e-F A Dete FF/θ25 1 CD 2 Tanha' 2 blows, Isegi is also Tadasugimangu. 3' phosphorus offering) 4 IG27 FI6. 29B ↓DaragCξ仝Cincludeπ, tyz To I4 entry H Tosu flood 99~ijiruju fly'π' 102 1t)3 Eisaki is a cliff (Osa) Climb the cliff EσjO’　702ft)3 Rising cliff = l village πθ　/l)f　/l)2　pi ・Sumaru Hiasa's sword FIG. 3/ θ 7 74, ;'4 40 54 63 Tee Shukatsusa attack FIG, 32A Sugabon Bumodo no Hibi-kun ( 7 → Mata to Kuri 扼AKAGUP) Sito body D 小体 I Joko 5 Shiba Rime #Cane Shikankyu to Glory Bu 9 human hlS The match between the prosperous friends Pyf,, 5 hiro 8 vs. A dumb and dumb opponent F/to 35A 4 ji form A 7a? tl-s 124 thousand views in tatami no otcho master 9P/2θ fee order woka rL Transfle7toKoniT; FIG39G anus Acquired immunodeficiency syndrome, A IDS-related complex (AI?C) and human immunodeficiency Caused by infectious agents that primarily target T4” lymphocytes, including viral infections. immunotherapeutic, prophylactic, and diagnostic products useful in the treatment or prevention of human diseases. Composition of. Human C that causes antibodies that bind to HIV gpl 20 in humans DNA encoding amino acid variants and derivatives of D4, or fragments thereof array. Such NA sequences may be used in the immunotherapeutic, prophylactic and diagnostic compositions of the present invention. Useful for compositions. Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS-related complexes and human immunity Due to infectious agents that primarily target T4"J lymphocytes, including infection with failure viruses. Useful for treatment, prevention or diagnosis of human diseases that occur, H1/ In humans, antibodies that bind to gp120, human CD4, or both are elicited. A novel screen for selecting amino acid variants and derivatives of human CD4 that cause Leaning method. 1--A, llc, Tsuku N-PcT/Us9110346゜

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＨＩＶｇＰ１２０に結合する抗体をヒトにおいて引き起こす、ヒトＣＤ４の アミノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片をコードする、ＤＮＡ配列 。 ２．マウスＣＤ４、ラットＣＤ４、ウサギＣＤ４およびヒツジＣＤ４をコードす るＤＭ配列を除く、請求項１に記載のＤＭ配列。 ３．霊長類ＣＤ４をコードするＤＮＡ配列をさらに除く、請求項２に記載のＤＮ Ａ配列。 ４．請求項１に記載のＤＮＡ配列であって、前記アミノ酸変異体が、ヒトＣＤ４ と霊長類ＣＤ４とのアミノ酸相違部位に相当する１つ以上の部位でヒトＣＤ４の アミノ酸配列と異なったポリペプチド、あるいはその断片である、ＤＮＡ配列。 ５．前記ヒトＣＤ４とのアミノ酸の相違部位の１つ以上が、図５、１７、２３お よび２４に示す部位からなる群から選択される、請求項４に記載のＤＮＡ配列。 ６．前記アミノ酸変異体が、哺乳類ＣＤ４およびそれらの断片からなる群から選 択される、請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ７．前記アミノ酸変異体が、カニクイザルＣＤ４、アカゲザルＣＤ４、チンパン ジーＣＤ４、およびそれらの断片からなる群から選択される、請求項６に記載の ＤＮＡ配列。 ８．請求項７に記載のＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列が、カニクイザル可 溶性ＣＤ４タンパク質、アカゲザル可溶性ＣＤ４タンパク質およびチンパンジー 可溶性ＣＤ４タンパク質からなる群から選択される可溶性ＣＤ４タンパク質をコ ードする、ＤＮＡ配列。 ９．請求項１あるいは２に記載のＤＮＡ配列であって、前記アミノ酸変異体が； （ａ）ｐＳＱ１３６、ｐＳＱ１３４、ｐＳＱ１３１、ｐＳＱ１４６、ｐＳＱ１６ ２、ｐＢＧ３４１ＪＯＤ．ｒｈＴ４、ｐＳＱ２００、ｐＳＱ２０５およびｐＤＧ １００のＤＮＡ挿入物；（ｂ）１つ以上の前述のＤＮＡ挿入物に、Ｔｍより約２ ０℃から２７℃低い温度および１Ｍの塩化ナトリウムと同等の条件下で、ハイプ リダイズするＤＮＡ配列；および （ｃ）前述のＤＮＡ配列のいずれかに変化するＤＮＡ配列；からなる群から選択 される、ＤＮＡ配列。 １０．請求項９に記載のＤＮＡ配列であって、前記アミノ酸変異体が； （ａ）前記ｐＢＧ３４１ＪＯＤ．ｒｈＴ４のＤＮＡ挿入物；（ｂ）前述のＤＮＡ 挿入物に、Ｔｍより約２０℃から２７℃低い温度および１Ｍの塩化ナトリウムと 同等の条件下で、ハイプリダイズするＤＮＡ配列；および （ｃ）前述のＤＮＡ配列のいずれかに変化するＤＮＡ配列；からなる群から選択 される、ＤＮＡ配列。 １１．請求項１、４および９からなる群から選択されるＤＮＡ配列、および該Ｄ ＮＡ配列に作動可能に結合された１つ以上の発現制御配列を含有する、組み換え ＤＮＡ分子。 １２．請求項１１に記載の組み換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。 １３．前記宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ 、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの株、酵母、真菌類、動物細胞、植物細胞、昆虫細 胞および組織培養のヒトの細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の 単細胞宿主。 １４．請求項１から１０に記載のＤＮＡ配列のいずれかにコードされるポリペプ チド。 １５．請求項１４に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、図４（ カニクイザル）の式ＡＡ１−ＡＡ４３３のポリペプチド、図４（カニクイザル） の式ＡＡ１−ＡＡ３７５のポリペプチド、図１５（アカゲザル）の式ＡＡ１−Ａ Ａ３７５のポリペプチド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡ１−ＡＡ３７４（ｐ ＳＱ２００）のポリペプチド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡ１−ＡＡ３７５ （ｐＳＱ２０５）のポリペプチド、図４（カニクイザル）の式ＡＡ１−ＡＡ１８ ０のポリペプチド、図１５（アカゲザル）の式ＡＡ１−ＡＡ１８０のポリペプチ ド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡ１−ＡＡ１８０（ｐＳＱ２００）のポリペ プチド、図２３（チンパンジー）の式ＡＡ−ＡＡ１８０のポリペプチド、および 前述のポリペプチドのいずれかの部分、からなる群から選択される、ポリペプチ ド。 １６．ＨＩＶｇｐ１２０に結合する抗体をヒトにおいて誘起する、ヒトＣＤ４の アミノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片。 １７．可溶性ヒトＣＤ４の変異体である、請求項１６に記載のアミノ酸変異体。 １８．マウスＣＤ４タンパク質、ラットＣＤ４タンパク質、ウサギＣＤ４タンパ ク質およびヒツジＣＤ４タンパク質を除く、請求項１６に記載のアミノ酸変異体 。 １９．霊長類ＣＤ４をさらに除く、請求項１８に記載のアミノ酸変異体。 ２０．霊長類ＣＤ４とヒトＣＤ４とのアミノ酸相違部位に相当する１つ以上の部 位で、ヒトＣＤ４のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドで ある、請求項１６に記載のアミノ酸変異体。 ２１．前記ヒトＣＤ４とのアミノ酸相違部位の１つ以上が、図５、１７、２３お よび２４に示す部位からなる群から選択される、請求項２０に記載のアミノ酸変 異体。 ２２．哺乳類ＣＤ４およびその断片からなる群から選択される、請求項１６に記 載のアミノ酸変異体。 ２３．カニクイザルＣＤ４、アカゲザルＣＤ４、テンパンジーＣＤ４およびそれ らの断片からなる群から選択される、請求項２２に記載のアミノ酸変異体。 ２４．カニクイザル可溶性ＣＤ４タンパク質、アカゲザル可溶性ＣＤ４タンパク 質およびチンパンジー可溶性ＣＤ４タンパク質からなる群から選択される、請求 項２３に記載のアミノ酸変異体。 ２５．請求項１４および１５に記載のポリペプチドからなる群から選択されるポ リペプチドを製造する方法であって、請求項１２に記載の単細胞宿主を培養する 工程を包含する方法。 ２６．ＨＩＶｇｐ１２０に結合する抗体をヒトにおいて引き起こす、ヒトＣＤ４ のアミノ酸変異体あるいは誘導体を選択する方法であって； （ａ）ヒトＣＤ４あるいはその断片を発現する遺伝子導入哺乳類動物を、ヒトＣ Ｄ４のアミノ酸変異体および誘導体、およびそれらの断片からなる群から選択さ れたもので免疫する工程；（ｂ）該免疫した遺伝子導入哺乳類動物の血清抗体が ＨＩＶｇｐ１２０に結合する能力を試験する工程；および（ｃ）該免疫した遺伝 子導入哺乳類動物の血清抗体がＨＩＶｇｐ１２０に結合する場合に、該アミノ酸 変異体あるいは誘導体を選択する工程； を包含する、方法。 ２７．ヒトＣＤ４に結合する抗体をヒトにおいて引き起こす、ヒトＣＤ４のアミ ノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片を選択する方法であって； （ａ）ヒトＣＤ４あるいはその断片を発現する遺伝子導入哺乳類動物を、ヒトＣ Ｄ４のアミノ酸変異体および誘導体、およびそれらの断片からなる群から選択さ れたもので免疫する工程；（ｂ）該免疫した遺伝子導入哺乳類動物の血清抗体が ヒトＣＤ４に結合する能力を試験する工程；および（ｃ）該免疫した遺伝子導入 哺乳類動物の血清抗体がヒトＣＤ４に結合する場合に、該アミノ酸変異体あるい は誘導体を選択する工程； を包含する、方法。 ２８．前記遺伝子導入哺乳類動物がヒトＣＤ４を発現する、請求項２６あるいは ２７に記載の方法。 ２９．前記ヒトＣＤ４の発現がリンパ球に特異的である、請求項２８に記載の方 法。 ３０．前記遺伝子導入哺乳類動物がマウスである、請求項２６あるいは２７に記 載の方法。 ３１．前記遺伝子導入マウスがヒト可溶性ＣＤ４タンパク質のアミノ酸変異体で 免疫されている、請求項３０に記載の方法。 ３２．免疫治療的に有効な量の、請求項１６−２４のいずれかに記載の１つ以上 のヒトＣＤ４のアミノ酸変異体あるいは誘導体、またはそれらの断片を含有する 薬学的組成物。 ３３，薬学的に許容し得るアジュバントをさらに含有する、請求項３２に記載の 薬学的組成物。 ３４．前記アミノ酸変異体あるいは誘導体が多価である、請求項３２に記載の薬 学的組成物。 ３５．前記アミノ酸変異体が、図１５（アカゲザル）の式ＡＡ１−ＡＡ３７５の ポリペプチドである、請求項３２あるいは３３に記載の薬学的組成物。 ３６．請求項１６−２４のいずれかに記載のヒトＣＤ４のアミノ酸変異体あるい は誘導体、またはそれらの断片でヒトを免疫することにより産生される、ＨＩＶ ｇｐ１２０に結合する抗体。[Claims] 1. of human CD4 that causes antibodies in humans that bind to HIVgP120. DNA sequences encoding amino acid variants or derivatives, or fragments thereof . 2. Encodes mouse CD4, rat CD4, rabbit CD4 and sheep CD4. A DM arrangement according to claim 1, excluding a DM arrangement comprising: 3. 3. The DNA of claim 2, further excluding a DNA sequence encoding primate CD4. A array. 4. 2. The DNA sequence of claim 1, wherein the amino acid variant is human CD4. human CD4 at one or more sites corresponding to amino acid difference sites between human CD4 and primate CD4. A DNA sequence that is a polypeptide or a fragment thereof that differs from the amino acid sequence. 5. One or more of the amino acid differences with human CD4 are shown in Figures 5, 17, 23 and 5. The DNA sequence according to claim 4, wherein the DNA sequence is selected from the group consisting of the sites shown in and 24. 6. The amino acid variant is selected from the group consisting of mammalian CD4 and fragments thereof. The DNA sequence according to claim 1, which is selected. 7. The amino acid variant may be cynomolgus monkey CD4, rhesus monkey CD4, or chimpangus monkey CD4. of claim 6, selected from the group consisting of G-CD4, and fragments thereof. DNA sequence. 8. 8. The DNA sequence according to claim 7, wherein the DNA sequence is a cynomolgus monkey. Soluble CD4 protein, rhesus monkey soluble CD4 protein and chimpanzee A soluble CD4 protein selected from the group consisting of soluble CD4 protein. code, DNA sequence. 9. The DNA sequence according to claim 1 or 2, wherein the amino acid variant is; (a) pSQ136, pSQ134, pSQ131, pSQ146, pSQ16 2, pBG341JOD. rhT4, pSQ200, pSQ205 and pDG 100 DNA inserts; (b) one or more of the aforementioned DNA inserts at about 2 Hype at 0°C to 27°C lower and under conditions equivalent to 1M sodium chloride. a DNA sequence that redizes; and (c) a DNA sequence that changes to any of the aforementioned DNA sequences; DNA sequence. 10. 10. The DNA sequence of claim 9, wherein the amino acid variant is; (a) The pBG341JOD. rhT4 DNA insert; (b) the aforementioned DNA The insert is treated with a temperature of about 20°C to 27°C below Tm and 1M sodium chloride. a DNA sequence that hybridizes under comparable conditions; and (c) a DNA sequence that changes to any of the aforementioned DNA sequences; DNA sequence. 11. A DNA sequence selected from the group consisting of claims 1, 4 and 9, and said D recombinant, containing one or more expression control sequences operably linked to the NA sequence. DNA molecule. 12. A unicellular host transformed with a recombinant DNA molecule according to claim 11. 13. The host is E. coli, Pseudomonas, Bacillus , Streptomyces strains, yeast, fungi, animal cells, plant cells, insect cells. 13. The human cells of claim 12 selected from the group consisting of cells and human cells in tissue culture. Unicellular host. 14. A polypeptide encoded by any of the DNA sequences according to claims 1 to 10. Chido. 15. 15. The polypeptide according to claim 14, wherein the polypeptide is Polypeptide of formula AA1-AA433 of Cynomolgus macaque, Figure 4 (Cynomolgus macaque) Polypeptide of formula AA1-AA375, formula AA1-A of Figure 15 (rhesus monkey) A375 polypeptide, formula AA1-AA374 (p SQ200), formula AA1-AA375 in Figure 23 (chimpanzee) (pSQ205) polypeptide, formula AA1-AA18 in Figure 4 (cynomolgus monkey) Polypeptide of formula AA1-AA180 of Figure 15 (rhesus monkey) polype of formula AA1-AA180 (pSQ200) in Figure 23 (chimpanzee). peptide, a polypeptide of formula AA-AA180 of Figure 23 (chimpanzee), and a polypeptide selected from the group consisting of any portion of the aforementioned polypeptides; Do. 16. of human CD4 that induces antibodies that bind to HIV gp120 in humans. Amino acid variants or derivatives, or fragments thereof. 17. 17. The amino acid variant according to claim 16, which is a variant of soluble human CD4. 18. Mouse CD4 protein, rat CD4 protein, rabbit CD4 protein Amino acid variant according to claim 16, excluding protein and ovine CD4 protein. . 19. 19. The amino acid variant of claim 18, further excluding primate CD4. 20. One or more regions corresponding to amino acid difference sites between primate CD4 and human CD4 A polypeptide having an amino acid sequence different from that of human CD4 at 17. The amino acid variant according to claim 16, which is. 21. One or more of the amino acid difference sites with human CD4 are shown in FIGS. and 24. A different body. 22. 17. selected from the group consisting of mammalian CD4 and fragments thereof. amino acid variants. 23. Cynomolgus monkey CD4, rhesus monkey CD4, tempanzee CD4 and 23. The amino acid variant according to claim 22, selected from the group consisting of fragments of. 24. Cynomolgus monkey soluble CD4 protein, rhesus monkey soluble CD4 protein and chimpanzee soluble CD4 protein. Amino acid variant according to item 23. 25. A polypeptide selected from the group consisting of the polypeptides according to claims 14 and 15. 13. A method for producing a repeptide, comprising culturing the unicellular host according to claim 12. A method involving steps. 26. Human CD4 that causes antibodies in humans that bind to HIV gp120 A method for selecting an amino acid variant or derivative of (a) A transgenic mammal expressing human CD4 or a fragment thereof is selected from the group consisting of amino acid variants and derivatives of D4, and fragments thereof; (b) step of immunizing the immunized transgenic mammal with serum antibodies; and (c) testing the immunized gene for its ability to bind to HIV gp120. When the serum antibody of the offspring-introduced mammal binds to HIV gp120, the amino acid selecting variants or derivatives; A method that encompasses. 27. An amino acid of human CD4 that causes antibodies that bind to human CD4 in humans. A method for selecting amino acid variants or derivatives, or fragments thereof, comprising; (a) A transgenic mammal expressing human CD4 or a fragment thereof is selected from the group consisting of amino acid variants and derivatives of D4, and fragments thereof; (b) step of immunizing the immunized transgenic mammal with serum antibodies; and (c) testing the ability to bind human CD4; and (c) the immunized gene transfer. When a mammalian serum antibody binds to human CD4, the amino acid variant or is the step of selecting derivatives; A method that encompasses. 28. or claim 26, wherein said transgenic mammal expresses human CD4. 27. The method described in 27. 29. 29. The method of claim 28, wherein the expression of human CD4 is lymphocyte specific. Law. 30. 28. The transgenic mammal according to claim 26 or 27, wherein the transgenic mammal is a mouse. How to put it on. 31. The transgenic mouse contains an amino acid variant of human soluble CD4 protein. 31. The method of claim 30, wherein the subject is immunized. 32. an immunotherapeutically effective amount of one or more of any of claims 16-24. containing amino acid variants or derivatives of human CD4, or fragments thereof. Pharmaceutical composition. 33. According to claim 32, further comprising a pharmaceutically acceptable adjuvant. Pharmaceutical composition. 34. 33. The drug according to claim 32, wherein the amino acid variant or derivative is multivalent. chemical composition. 35. The amino acid variants have formulas AA1-AA375 in Figure 15 (rhesus monkey). 34. The pharmaceutical composition according to claim 32 or 33, which is a polypeptide. 36. The amino acid variant or amino acid variant of human CD4 according to any one of claims 16-24. is produced by immunizing humans with derivatives or fragments thereof, HIV Antibody that binds to gp120.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2692435A1 (en) * 1992-06-19 1993-12-24 Transgene Sa Transgenic rabbit susceptible to HIV, its use as an animal model and its production process.
FR2696188A1 (en) * 1992-09-25 1994-04-01 Curie Paris Vi Univ Pierre Mar Feline CD4 protein and corresp. DNA - for study of feline immunodeficiency virus and for therapy
US20040040061A1 (en) * 2002-02-27 2004-02-26 Michael Horn Expression in plants of HIV-related proteins
US10150970B2 (en) 2011-07-27 2018-12-11 Applied Biotechnology Institute, Inc. Methods to increase antigenicity of membrane-bound polypeptides produced in plants

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5110906A (en) * 1986-08-21 1992-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Derivatives of soluble T-4
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