JPH0530996A - セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法 - Google Patents
セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法Info
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- JPH0530996A JPH0530996A JP18796391A JP18796391A JPH0530996A JP H0530996 A JPH0530996 A JP H0530996A JP 18796391 A JP18796391 A JP 18796391A JP 18796391 A JP18796391 A JP 18796391A JP H0530996 A JPH0530996 A JP H0530996A
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- Japan
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- proteinase
- serine proteinase
- proteinase inhibitor
- serine
- inhibitor
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 セリンプロテイナーゼインヒビターについて
の情報を正確に得ることが出来る技術を提供することで
ある。 【構成】 セリンプロテイナーゼインヒビターと反応す
る物質と、プロテイナーゼに結合したセリンプロテイナ
ーゼインヒビターとを反応させ、セリンプロテイナーゼ
インヒビターと反応した物質を測定するセリンプロテイ
ナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法。
の情報を正確に得ることが出来る技術を提供することで
ある。 【構成】 セリンプロテイナーゼインヒビターと反応す
る物質と、プロテイナーゼに結合したセリンプロテイナ
ーゼインヒビターとを反応させ、セリンプロテイナーゼ
インヒビターと反応した物質を測定するセリンプロテイ
ナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、セリンプロテイナーゼ
インヒビターの阻害活性の測定方法に関するものであ
る。
インヒビターの阻害活性の測定方法に関するものであ
る。
【０００２】
【発明の背景】人の血液中のセリンプロテイナーゼイン
ヒビターは、肝、血管内皮細胞、白血球、胎盤などで合
成され、一部は血小板から放出され、血液凝固・線維素
溶解（線溶）系、キニン・カリクレイン系、免疫補体系
の制御調節に関与し、又、組織炎症の進展を制御するな
ど生体防御反応に係わっている。このようなセリンプロ
テイナーゼインヒビターとしては、例えばトロンビン、
Ｘａ因子やＩＸａ因子と結合するヒト・アンチトロンビ
ンＩＩＩ、トロンビンと結合するヒト・ヘパリンコファ
クターＩＩ、活性化プロテインＣやトロンビンと結合す
るヒト・プロテインＣインヒビター、エラスターゼ、Ｘ
Ｉａ因子や活性化プロテインＣと結合するヒト・α1 ア
ンチトリプシン、エラスターゼやカテプシンＧと結合す
るヒト・α 1 アンチキモトリプシン、プラスミンと結合
するヒト・α2 プラスミンインヒビター、組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターやウロキナーゼと結合するヒト
・プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、組
織プラスミノーゲンアクチベーターやウロキナーゼと結
合するヒト・プラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター２、ＸＩＩａ因子、Ｃ１エステラーゼやカリクレイ
ンと結合するヒト・Ｃ１インヒビター等が良く知られて
いる。
ヒビターは、肝、血管内皮細胞、白血球、胎盤などで合
成され、一部は血小板から放出され、血液凝固・線維素
溶解（線溶）系、キニン・カリクレイン系、免疫補体系
の制御調節に関与し、又、組織炎症の進展を制御するな
ど生体防御反応に係わっている。このようなセリンプロ
テイナーゼインヒビターとしては、例えばトロンビン、
Ｘａ因子やＩＸａ因子と結合するヒト・アンチトロンビ
ンＩＩＩ、トロンビンと結合するヒト・ヘパリンコファ
クターＩＩ、活性化プロテインＣやトロンビンと結合す
るヒト・プロテインＣインヒビター、エラスターゼ、Ｘ
Ｉａ因子や活性化プロテインＣと結合するヒト・α1 ア
ンチトリプシン、エラスターゼやカテプシンＧと結合す
るヒト・α 1 アンチキモトリプシン、プラスミンと結合
するヒト・α2 プラスミンインヒビター、組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターやウロキナーゼと結合するヒト
・プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、組
織プラスミノーゲンアクチベーターやウロキナーゼと結
合するヒト・プラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター２、ＸＩＩａ因子、Ｃ１エステラーゼやカリクレイ
ンと結合するヒト・Ｃ１インヒビター等が良く知られて
いる。
【０００３】ところで、これらのセリンプロテイナーゼ
インヒビター、特にα1 アンチトリプシン、α1 アンチ
キモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ及びＣ１イン
ヒビター等の総量は全血漿蛋白質の１０％にも達し、血
液凝固・線維素溶解（線溶）系、キニン・カリクレイン
系、免疫補体系などの制御調節に深く係わって機能して
おり、これらの制御調節因子の先天性あるいは後天性の
異常症は、血液凝固・線維素溶解（線溶）系やその他の
生体機能に異常を来して発見される場合が多く、このこ
とはこれらのセリンプロテイナーゼインヒビターが生理
的にも不可欠な因子であることを示唆している。従っ
て、これらセリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活
性の情報を得ることは極めて重要なことである。
インヒビター、特にα1 アンチトリプシン、α1 アンチ
キモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ及びＣ１イン
ヒビター等の総量は全血漿蛋白質の１０％にも達し、血
液凝固・線維素溶解（線溶）系、キニン・カリクレイン
系、免疫補体系などの制御調節に深く係わって機能して
おり、これらの制御調節因子の先天性あるいは後天性の
異常症は、血液凝固・線維素溶解（線溶）系やその他の
生体機能に異常を来して発見される場合が多く、このこ
とはこれらのセリンプロテイナーゼインヒビターが生理
的にも不可欠な因子であることを示唆している。従っ
て、これらセリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活
性の情報を得ることは極めて重要なことである。
【０００４】又、α1 アンチトリプシン、α1 アンチキ
モトリプシン、α2 マクログロブリンは環境からの刺激
によって顕著な濃度変化が認められる、所謂急性期反応
蛋白質であり、癌マーカー、炎症マーカーとして臨床的
に大きな意味を持つ。しかしながら、これまでにおける
セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の情報
は、セリンプロテイナーゼインヒビターを添加しない系
においての酵素活性を測定したものと、セリンプロテイ
ナーゼインヒビターを添加した系においての酵素活性を
測定したものとを比較することにより得ていたにすぎ
ず、これではセリンプロテイナーゼインヒビターを間接
的に調べているにすぎないことから起きる不確定性があ
ったり、セリンプロテイナーゼインヒビターの量が少な
い場合には測定自体も困難といった問題点が有る。
モトリプシン、α2 マクログロブリンは環境からの刺激
によって顕著な濃度変化が認められる、所謂急性期反応
蛋白質であり、癌マーカー、炎症マーカーとして臨床的
に大きな意味を持つ。しかしながら、これまでにおける
セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の情報
は、セリンプロテイナーゼインヒビターを添加しない系
においての酵素活性を測定したものと、セリンプロテイ
ナーゼインヒビターを添加した系においての酵素活性を
測定したものとを比較することにより得ていたにすぎ
ず、これではセリンプロテイナーゼインヒビターを間接
的に調べているにすぎないことから起きる不確定性があ
ったり、セリンプロテイナーゼインヒビターの量が少な
い場合には測定自体も困難といった問題点が有る。
【０００５】
【発明の開示】本発明の目的は、セリンプロテイナーゼ
インヒビターについての情報を正確に得ることが出来る
技術を提供することである。この本発明の目的は、セリ
ンプロテイナーゼインヒビターと反応する物質と、プロ
テイナーゼに結合したセリンプロテイナーゼインヒビタ
ーとを反応させ、セリンプロテイナーゼインヒビターと
反応した物質を測定することを特徴とするセリンプロテ
イナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法によって達
成される。
インヒビターについての情報を正確に得ることが出来る
技術を提供することである。この本発明の目的は、セリ
ンプロテイナーゼインヒビターと反応する物質と、プロ
テイナーゼに結合したセリンプロテイナーゼインヒビタ
ーとを反応させ、セリンプロテイナーゼインヒビターと
反応した物質を測定することを特徴とするセリンプロテ
イナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法によって達
成される。
【０００６】又、測定しようとするセリンプロテイナー
ゼインヒビターが結合するプロテイナーゼを固相に固定
化する工程と、該固定化プロテイナーゼに該セリンプロ
テイナーゼインヒビターを結合させる工程と、該固定化
プロテイナーゼに結合した該セリンプロテイナーゼイン
ヒビターとセリンプロテイナーゼインヒビターと反応す
る物質とを反応させる工程と、セリンプロテイナーゼイ
ンヒビターと反応した物質を測定する工程とを具備する
ことを特徴とするセリンプロテイナーゼインヒビターの
阻害活性の測定方法によって達成される。
ゼインヒビターが結合するプロテイナーゼを固相に固定
化する工程と、該固定化プロテイナーゼに該セリンプロ
テイナーゼインヒビターを結合させる工程と、該固定化
プロテイナーゼに結合した該セリンプロテイナーゼイン
ヒビターとセリンプロテイナーゼインヒビターと反応す
る物質とを反応させる工程と、セリンプロテイナーゼイ
ンヒビターと反応した物質を測定する工程とを具備する
ことを特徴とするセリンプロテイナーゼインヒビターの
阻害活性の測定方法によって達成される。
【０００７】測定しようとするセリンプロテイナーゼイ
ンヒビターが結合されるプロテイナーゼの固定化固相
（担体）としては、例えば多孔質なものであることが好
ましく、このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸
化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セ
ルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキスト
リン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガ
ロース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられ
る。そして、このような素材の多孔質担体であれば、一
次的な形状は粒子（ビーズ）状、棒状あるいはプレート
状のものであっても差し支えない。
ンヒビターが結合されるプロテイナーゼの固定化固相
（担体）としては、例えば多孔質なものであることが好
ましく、このような担体の材料としてはケイ藻土、二酸
化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セ
ルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキスト
リン、架橋ポリアクリルアミド、アガロース、架橋アガ
ロース、ポリスチレン等の各種の合成樹脂が挙げられ
る。そして、このような素材の多孔質担体であれば、一
次的な形状は粒子（ビーズ）状、棒状あるいはプレート
状のものであっても差し支えない。
【０００８】プロテイナーゼは上記多孔質の固定化担体
に、化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的に
結合させることができる。例えば、所定のプロテイナー
ゼの溶液が入れられた容器内に固定化担体を入れ、プロ
テイナーゼ溶液に浸し、この溶液に流動力を作用させて
流動させることにより、固定化担体に均一にプロテイナ
ーゼを結合させることが出来る。尚、その他の点に関す
る結合技術については、１９７６年、講談社発行、千畑
一郎ほか２名編「実験と応用 アフィニティクロマトグ
ラフィー」（第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎
誠ほか２名編「アフィニティクロマトグラフィー」
（第１版）を参考にできる。
に、化学的及び／又は物理的に直接、あるいは間接的に
結合させることができる。例えば、所定のプロテイナー
ゼの溶液が入れられた容器内に固定化担体を入れ、プロ
テイナーゼ溶液に浸し、この溶液に流動力を作用させて
流動させることにより、固定化担体に均一にプロテイナ
ーゼを結合させることが出来る。尚、その他の点に関す
る結合技術については、１９７６年、講談社発行、千畑
一郎ほか２名編「実験と応用 アフィニティクロマトグ
ラフィー」（第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎
誠ほか２名編「アフィニティクロマトグラフィー」
（第１版）を参考にできる。
【０００９】そして、上記のようにして得られた固定化
プロテイナーゼに対して該プロテイナーゼを標的とする
セリンプロテイナーゼインヒビターを結合させるのであ
るが、この結合に際してはｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ
６．５〜８．０で行い、又、４〜４５℃、好ましくは２
５〜３７℃で行うのが良い。反応時間は、一定量の安定
な複合体が生成できさえすれば任意であり、一般的には
３０分から２時間の間で行われる。
プロテイナーゼに対して該プロテイナーゼを標的とする
セリンプロテイナーゼインヒビターを結合させるのであ
るが、この結合に際してはｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ
６．５〜８．０で行い、又、４〜４５℃、好ましくは２
５〜３７℃で行うのが良い。反応時間は、一定量の安定
な複合体が生成できさえすれば任意であり、一般的には
３０分から２時間の間で行われる。
【００１０】セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害
活性の測定に用いられるセリンプロテイナーゼインヒビ
ターと反応し、プロテイナーゼと反応しない物質として
は該セリンプロテイナーゼインヒビターに対する抗体が
挙げられる。このような抗体は、その由来を特に限定さ
れるものではなく、哺乳動物等にセリンプロテイナーゼ
インヒビターを投与、免疫して得られる抗血清、腹水液
をそのままか、あるいは従来公知の方法である硫酸ナト
リウム沈澱法、硫酸アンモニウム沈澱法、セファデック
スゲルによるゲル濾過法、イオン交換セルロースクロマ
トグラフィ法、電気泳動法等（右田俊介偏「免疫化学」
中山書店ｐｐ７４〜８８参照）で精製して用いることが
できる。あるいは、セリンプロテイナーゼインヒビター
で感作した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓細胞や
骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブリドー
マ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを使用す
ると特異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩ
ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いる
ことができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理してＦａ
ｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）2 といった活性抗体フラ
グメントにして使用しても良い。さらに、これらの抗体
は単一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用し
ても良い。尚、上記のようにして得られた抗体が本発明
に用いられるものであるか否かは、これらを反応させ、
該プロテイナーゼと反応しないものを選択すれば良い。
活性の測定に用いられるセリンプロテイナーゼインヒビ
ターと反応し、プロテイナーゼと反応しない物質として
は該セリンプロテイナーゼインヒビターに対する抗体が
挙げられる。このような抗体は、その由来を特に限定さ
れるものではなく、哺乳動物等にセリンプロテイナーゼ
インヒビターを投与、免疫して得られる抗血清、腹水液
をそのままか、あるいは従来公知の方法である硫酸ナト
リウム沈澱法、硫酸アンモニウム沈澱法、セファデック
スゲルによるゲル濾過法、イオン交換セルロースクロマ
トグラフィ法、電気泳動法等（右田俊介偏「免疫化学」
中山書店ｐｐ７４〜８８参照）で精製して用いることが
できる。あるいは、セリンプロテイナーゼインヒビター
で感作した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓細胞や
骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブリドー
マ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを使用す
ると特異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩ
ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いる
ことができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理してＦａ
ｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）2 といった活性抗体フラ
グメントにして使用しても良い。さらに、これらの抗体
は単一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用し
ても良い。尚、上記のようにして得られた抗体が本発明
に用いられるものであるか否かは、これらを反応させ、
該プロテイナーゼと反応しないものを選択すれば良い。
【００１１】このような抗体に付けられる標識物質とし
ては、例えば酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活
性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵
素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質、放射性同位元
素などが挙げられる。具体的な物質としては、特開昭６
２−９０５３９号公報などに記載のものが挙げられる
が、好ましくは酵素、又は螢光物質であり、さらに好ま
しくはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルタメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素で
ある。これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応
系、発色系は公知のものを使用できる。具体的には、特
開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３
９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６
３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明
細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。そして、これら標識物質の抗
体への結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方
法で行うことができ、例えば石川 栄治、河合 忠、宮
井潔 編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９
７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特
集第５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応
用−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された
方法を参考にすることができる。
ては、例えば酵素、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の活
性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補酵
素）、酵素前駆体、アポ酵素、螢光物質、放射性同位元
素などが挙げられる。具体的な物質としては、特開昭６
２−９０５３９号公報などに記載のものが挙げられる
が、好ましくは酵素、又は螢光物質であり、さらに好ま
しくはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルタメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素で
ある。これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応
系、発色系は公知のものを使用できる。具体的には、特
開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３
９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６
３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明
細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。そして、これら標識物質の抗
体への結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方
法で行うことができ、例えば石川 栄治、河合 忠、宮
井潔 編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院、１９
７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時増刊特
集第５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技術と応
用−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載された
方法を参考にすることができる。
【００１２】そして、上記のようにして得られた固定化
プロテイナーゼに結合したセリンプロテイナーゼインヒ
ビターと標識物質を付けた抗体とを免疫反応させ、標識
物質を測定することで、セリンプロテイナーゼインヒビ
ターの阻害活性が簡便な操作で、感度、正確度、精度及
び再現性良く、直接に測定できる。標識物質に起因した
信号は、吸光度法（比色法) 、螢光法、発光法または放
射活性測定法で検出することができ、測定法としては信
号の経時的変化を測定するレート測定法または一定時間
後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定するこ
とができる。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比
色法) では紫外線、可視光、近赤外光を利用することが
できる。
プロテイナーゼに結合したセリンプロテイナーゼインヒ
ビターと標識物質を付けた抗体とを免疫反応させ、標識
物質を測定することで、セリンプロテイナーゼインヒビ
ターの阻害活性が簡便な操作で、感度、正確度、精度及
び再現性良く、直接に測定できる。標識物質に起因した
信号は、吸光度法（比色法) 、螢光法、発光法または放
射活性測定法で検出することができ、測定法としては信
号の経時的変化を測定するレート測定法または一定時間
後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定するこ
とができる。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比
色法) では紫外線、可視光、近赤外光を利用することが
できる。
【００１３】又、上記本発明の目的は、ヒト以外の動物
のプロテイナーゼとセリンプロテイナーゼインヒビター
とを反応させ、この反応により生成した複合体をサンド
イッチアッセイにより測定することを特徴とするセリン
プロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法によ
って達成される。尚、複合体をサンドイッチアッセイに
より測定する場合に用いる抗体は、ヒトプロテイナーゼ
とは反応せず、ヒト以外の動物のプロテイナーゼと反応
する抗体を用いることが好ましい。
のプロテイナーゼとセリンプロテイナーゼインヒビター
とを反応させ、この反応により生成した複合体をサンド
イッチアッセイにより測定することを特徴とするセリン
プロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法によ
って達成される。尚、複合体をサンドイッチアッセイに
より測定する場合に用いる抗体は、ヒトプロテイナーゼ
とは反応せず、ヒト以外の動物のプロテイナーゼと反応
する抗体を用いることが好ましい。
【００１４】すなわち、ヒト以外の動物のプロテイナー
ゼとセリンプロテイナーゼインヒビターとの反応複合体
を、ヒト以外の動物のプロテイナーゼと反応する抗体を
用いたサンドイッチアッセイで測定することにより、セ
リンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性を正確に測
定できる。つまり、セリンプロテイナーゼインヒビター
がヒト以外のプロテイナーゼと反応し、複合体を生成す
ることを利用し、元々存在していたヒトプロテイナーゼ
との複合体と区別し、ヒト以外のプロテイナーゼとの複
合体をサンドイッチアッセイで測定すれば、これはセリ
ンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性を正確に測定
できることに基づいたものである。
ゼとセリンプロテイナーゼインヒビターとの反応複合体
を、ヒト以外の動物のプロテイナーゼと反応する抗体を
用いたサンドイッチアッセイで測定することにより、セ
リンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性を正確に測
定できる。つまり、セリンプロテイナーゼインヒビター
がヒト以外のプロテイナーゼと反応し、複合体を生成す
ることを利用し、元々存在していたヒトプロテイナーゼ
との複合体と区別し、ヒト以外のプロテイナーゼとの複
合体をサンドイッチアッセイで測定すれば、これはセリ
ンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性を正確に測定
できることに基づいたものである。
【００１５】セリンプロテイナーゼインヒビターと反応
するヒト以外の動物のプロテイナーゼとしては、例えば
α1 アンチトリプシンと反応するヒト以外の動物のプロ
テイナーゼとしては牛エラスターゼ、豚エラスターゼ等
が挙げられ、又、α1 アンチキモトリプシンと反応する
ヒト以外の動物のプロテイナーゼとしては牛キモトリプ
シン等が挙げられる。
するヒト以外の動物のプロテイナーゼとしては、例えば
α1 アンチトリプシンと反応するヒト以外の動物のプロ
テイナーゼとしては牛エラスターゼ、豚エラスターゼ等
が挙げられ、又、α1 アンチキモトリプシンと反応する
ヒト以外の動物のプロテイナーゼとしては牛キモトリプ
シン等が挙げられる。
【００１６】これらの複合体をサンドイッチアッセイに
より測定する場合に用いる抗体は、ヒトプロテイナーゼ
とは反応せず、ヒト以外の動物のプロテイナーゼと反応
する抗体を用いることが好ましい訳であるが、このよう
な抗体は哺乳動物等にプロテイナーゼを投与、免疫して
得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公
知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸アンモニウ
ム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過法、イオ
ン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳動法等
（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４〜８８参
照）で精製して用いることができる。ヒトプロテイナー
ゼ結合カラムを通すことにより、これと反応しない画分
を得て用いることも可能である。あるいは、プロテイナ
ーゼで感作した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓細
胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブリ
ドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを使
用すると特異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体
はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用
いることができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理して
Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）2 といった活性抗体
フラグメントにして使用しても良い。さらに、これらの
抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使
用しても良い。尚、上記のようにして得られた抗体が本
発明に用いられるものであるか否かは、これらを反応さ
せ、ヒトプロテイナーゼと反応しないものを選択すれば
良い。
より測定する場合に用いる抗体は、ヒトプロテイナーゼ
とは反応せず、ヒト以外の動物のプロテイナーゼと反応
する抗体を用いることが好ましい訳であるが、このよう
な抗体は哺乳動物等にプロテイナーゼを投与、免疫して
得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるいは従来公
知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸アンモニウ
ム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過法、イオ
ン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳動法等
（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４〜８８参
照）で精製して用いることができる。ヒトプロテイナー
ゼ結合カラムを通すことにより、これと反応しない画分
を得て用いることも可能である。あるいは、プロテイナ
ーゼで感作した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓細
胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブリ
ドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを使
用すると特異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体
はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用
いることができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理して
Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）2 といった活性抗体
フラグメントにして使用しても良い。さらに、これらの
抗体は単一で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使
用しても良い。尚、上記のようにして得られた抗体が本
発明に用いられるものであるか否かは、これらを反応さ
せ、ヒトプロテイナーゼと反応しないものを選択すれば
良い。
【００１７】以下、実施例により具体的に説明するが、
本発明は実施例によって限定されるものではない。
本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００１８】
〔実施例１〕９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌ
ンク社製イムノプレート２）に市販のエラスターゼ（エ
ラスチンプロダクト社）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）に６μｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを５０μｌず
つ各ウェルに添加した。３７℃で１時間固定化した後プ
レートをＰＢＳで３回洗浄し、続いて１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶液を１００μｌずつ各ウェ
ルに添加し、３７℃で１時間ブロッキングした。
ンク社製イムノプレート２）に市販のエラスターゼ（エ
ラスチンプロダクト社）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）に６μｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを５０μｌず
つ各ウェルに添加した。３７℃で１時間固定化した後プ
レートをＰＢＳで３回洗浄し、続いて１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶液を１００μｌずつ各ウェ
ルに添加し、３７℃で１時間ブロッキングした。
【００１９】プレートをＰＢＳで３回洗浄し、２０００
０ｎｇ／ｍｌから３２ｎｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳで調整
した市販のα1 −アンチトリプシン（α1 ＡＴ）を各々
５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応さ
せた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液で７μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗α1 ＡＴ抗体
（ウサギ、ケミコン社）を１００μｌずつ各ウェルに添
加し、３７℃で１時間反応させた。
０ｎｇ／ｍｌから３２ｎｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳで調整
した市販のα1 −アンチトリプシン（α1 ＡＴ）を各々
５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間反応さ
せた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液で７μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗α1 ＡＴ抗体
（ウサギ、ケミコン社）を１００μｌずつ各ウェルに添
加し、３７℃で１時間反応させた。
【００２０】ＰＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ウサギＩｇ抗体を１００μｌずつ各ウェルに添
加し、室温下で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄し
た後、３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンを溶解し
た５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．
０２％過酸化水素含有）を２００μｌずつ各ウェルに添
加し、１５分間発色させた。そして、９Ｎの硫酸５０μ
ｌを加えて発色反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測
定したので、その結果を表１に示す。尚、α1 ＡＴを８
０℃で５分間加熱処理したものを用いた場合の結果も併
せて示す。
ゼ標識抗ウサギＩｇ抗体を１００μｌずつ各ウェルに添
加し、室温下で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄し
た後、３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンを溶解し
た５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．
０２％過酸化水素含有）を２００μｌずつ各ウェルに添
加し、１５分間発色させた。そして、９Ｎの硫酸５０μ
ｌを加えて発色反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測
定したので、その結果を表１に示す。尚、α1 ＡＴを８
０℃で５分間加熱処理したものを用いた場合の結果も併
せて示す。
【００２１】
表 １
α1 ＡＴ濃度（ｎｇ／ｍｌ） 吸光度 加熱処理α1 ＡＴの場合の吸光度
２００００ ０．８６５ ０．０１１
４０００ ０．６３８ ０．００８
８００ ０．２８１ ０．００５
１６０ ０．１４２ ０．００４
３２ ０．０９６ ０．００６
０ ０．００１ ０．００２
この表１から、α1 ＡＴの量が微量であっても測定でき
ていることが判る。
ていることが判る。
【００２２】〔実施例２〕
〔抗体の調製〕ウシ・キモトリプシンのＰＢＳ溶液１ｍ
ｇ／ｍｌをフロイント・アジュバントと乳化混合した
後、ウサギに免疫感作を行った。３週間後に得られた血
清をＰＢＳ溶液で希釈し、ヒト・キモトリプシンを結合
したセファデックスカラムを通し、ヒト・キモトリプシ
ンに結合せず、ウシ・キモトリプシンに結合する抗体を
得た。
ｇ／ｍｌをフロイント・アジュバントと乳化混合した
後、ウサギに免疫感作を行った。３週間後に得られた血
清をＰＢＳ溶液で希釈し、ヒト・キモトリプシンを結合
したセファデックスカラムを通し、ヒト・キモトリプシ
ンに結合せず、ウシ・キモトリプシンに結合する抗体を
得た。
【００２３】〔ヒト・α1 −アンチキモトリプシン（α
1 ＡＣＴ）の測定〕１０μｇ／ｍｌの濃度から段階希釈
したα1 ＡＣＴのＰＢＳ溶液２０μｌと５μｇ／ｍｌの
濃度のウシ・キモトリプシンのＰＢＳ溶液２０μｌを３
７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、ヤギ抗
ヒト・α1 −アンチキモトリプシン抗体を１０μｇ／ｍ
ｌの濃度で固定化した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて
一晩ブロッキングした９６穴マイクロタイタープレート
に、上記反応物と同量の１％ＢＳＡ−ＰＢＳとを混和し
たもの５０μｌずつを添加し、３７℃にて１時間反応さ
せた。
1 ＡＣＴ）の測定〕１０μｇ／ｍｌの濃度から段階希釈
したα1 ＡＣＴのＰＢＳ溶液２０μｌと５μｇ／ｍｌの
濃度のウシ・キモトリプシンのＰＢＳ溶液２０μｌを３
７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、ヤギ抗
ヒト・α1 −アンチキモトリプシン抗体を１０μｇ／ｍ
ｌの濃度で固定化した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて
一晩ブロッキングした９６穴マイクロタイタープレート
に、上記反応物と同量の１％ＢＳＡ−ＰＢＳとを混和し
たもの５０μｌずつを添加し、３７℃にて１時間反応さ
せた。
【００２４】ＰＢＳにて洗浄後、上記ウサギ抗ウシ・キ
モトリプシン抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２０００倍
希釈）と室温にて１時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄
後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（カッペル社製：
１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２０００倍希釈）と室温にて１
時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄後、ｏ−フェニレンジ
アミンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む５０ｍＭのクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．０２％過酸化水素含
有）２００μｌを加え、１５分後に９Ｎ硫酸５０μｌを
加え、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表２
に示す。
モトリプシン抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２０００倍
希釈）と室温にて１時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄
後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（カッペル社製：
１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２０００倍希釈）と室温にて１
時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄後、ｏ−フェニレンジ
アミンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む５０ｍＭのクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．０２％過酸化水素含
有）２００μｌを加え、１５分後に９Ｎ硫酸５０μｌを
加え、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表２
に示す。
【００２５】
この表２から、α1 ＡＣＴの量が微量であっても測定で
きていることが判る。
きていることが判る。
【００２６】〔実施例３〕正常人２例及び肝癌患者１例
の血清２μｌを２．５μｇ／ｍｌの濃度のウシ・キモト
リプシンＰＢＳ溶液１ｍｌに添加し、３７℃にて３０分
間インキュベートした。その３０μｌと１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ溶液３０μｌを混和し、その５０μｌを実施例２と
同様に９６穴マイクロタイタープレート上で測定した。
の血清２μｌを２．５μｇ／ｍｌの濃度のウシ・キモト
リプシンＰＢＳ溶液１ｍｌに添加し、３７℃にて３０分
間インキュベートした。その３０μｌと１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ溶液３０μｌを混和し、その５０μｌを実施例２と
同様に９６穴マイクロタイタープレート上で測定した。
【００２７】その結果、正常人２例では各々２１０μｇ
／ｍｌ、２６５μｇ／ｍｌ、肝癌患者１例では６３２μ
ｇ／ｍｌのα1 ＡＣＴが検出できた。
／ｍｌ、２６５μｇ／ｍｌ、肝癌患者１例では６３２μ
ｇ／ｍｌのα1 ＡＣＴが検出できた。
【００２８】
【効果】本発明によれば、セリンプロテイナーゼインヒ
ビターの阻害活性が感度、正確度、精度及び再現性良
く、簡単に測定できる。
ビターの阻害活性が感度、正確度、精度及び再現性良
く、簡単に測定できる。
Claims (4)
- 【請求項１】 セリンプロテイナーゼインヒビターと反
応する物質と、プロテイナーゼに結合したセリンプロテ
イナーゼインヒビターとを反応させ、セリンプロテイナ
ーゼインヒビターと反応した物質を測定することを特徴
とするセリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の
測定方法。 - 【請求項２】 測定しようとするセリンプロテイナーゼ
インヒビターが結合するプロテイナーゼを固相に固定化
する工程と、該固定化プロテイナーゼに該セリンプロテ
イナーゼインヒビターを結合させる工程と、該固定化プ
ロテイナーゼに結合した該セリンプロテイナーゼインヒ
ビターとセリンプロテイナーゼインヒビターと反応する
物質とを反応させる工程と、セリンプロテイナーゼイン
ヒビターと反応した物質を測定する工程とを具備するこ
とを特徴とするセリンプロテイナーゼインヒビターの阻
害活性の測定方法。 - 【請求項３】 ヒト以外の動物のプロテイナーゼとセリ
ンプロテイナーゼインヒビターとを反応させ、この反応
により生成した複合体をサンドイッチアッセイにより測
定することを特徴とするセリンプロテイナーゼインヒビ
ターの阻害活性の測定方法。 - 【請求項４】 ヒトプロテイナーゼとは反応せず、ヒト
以外の動物のプロテイナーゼと反応する抗体を用いての
サンドイッチアッセイにより測定することを特徴とする
請求項３のセリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活
性の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18796391A JPH0530996A (ja) | 1991-07-29 | 1991-07-29 | セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18796391A JPH0530996A (ja) | 1991-07-29 | 1991-07-29 | セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0530996A true JPH0530996A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=16215225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18796391A Pending JPH0530996A (ja) | 1991-07-29 | 1991-07-29 | セリンプロテイナーゼインヒビターの阻害活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0530996A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9400794A (nl) * | 1993-05-17 | 1994-12-16 | Sharp Kk | Vloeibaar-kristalafbeeldingsinrichting en werkwijze voor het vervaardigen van dezezelfde. |
| KR100387230B1 (ko) * | 1996-06-29 | 2003-08-27 | 삼성전자주식회사 | 액정표시소자패널및그제조방법 |
-
1991
- 1991-07-29 JP JP18796391A patent/JPH0530996A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9400794A (nl) * | 1993-05-17 | 1994-12-16 | Sharp Kk | Vloeibaar-kristalafbeeldingsinrichting en werkwijze voor het vervaardigen van dezezelfde. |
| KR100387230B1 (ko) * | 1996-06-29 | 2003-08-27 | 삼성전자주식회사 | 액정표시소자패널및그제조방법 |
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