JPH05271288A - 新規な薬理学的特性を有する蛋白質 - Google Patents

新規な薬理学的特性を有する蛋白質

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JPH05271288A
JPH05271288A JP4035445A JP3544592A JPH05271288A JP H05271288 A JPH05271288 A JP H05271288A JP 4035445 A JP4035445 A JP 4035445A JP 3544592 A JP3544592 A JP 3544592A JP H05271288 A JPH05271288 A JP H05271288A
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Tsukasa Seya
谷 司 瀬
Toshiyuki Kanamori
森 利 至 金
Atsushi Arai
居 淳 新
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Mochida Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】天然型メンブレンコファクタープロテインと同
じアミノ酸配列構造を一部に有し、補体系が自己細胞に
対して障害的に作用する疾患に有効な、新規な薬理学的
特性を有する蛋白質の提供。 【構成】本発明の蛋白質は天然型メンブレンコファクタ
ープロテイン(Membrane Cofactor
Protein, MCP)の少なくとも膜貫通領域お
よび細胞質内領域が欠如していることを特徴とする新規
な薬理学的特性を有する蛋白質であり、液相中のC3b
に対するコファクター活性と同様に、固相中のC3bに
対してもI因子のコファクター活性を有することを特徴
とする新規な薬理学的特性を有する蛋白質である。ま
た、さらに本発明は、それらをコードする塩基配列を有
するDNA、および、該蛋白質を少なくとも1つの有効
成分として含有する医薬組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、天然型メンブレンコフ
ァクタープロテイン(Membrane Cofact
or Protein、以下MCPと記す)と同じアミ
ノ酸配列構造を一部に有し、活性化された補体系が自己
細胞や組織に対して障害的に作用することを特徴とする
疾患に有効な生理活性蛋白質に関する。詳しくは、補体
系活性化に重要な補体第3成分の活性化断片であるC3
bをI因子が不活化する際に必要なコファクター(co
factor、補因子)としての新規な薬理学的特性を
有する蛋白質に関する。また、その新規な薬理学的特性
を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するDNA、
この蛋白質を有効成分として含有する上記疾患に用いる
ための医薬組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】補体系は血中に存在する約20種類の蛋
白質成分から構成される生体防御系で、1880年代末
に、55℃に加熱すると失活する溶菌性の物質として血
漿中に発見された。その後の研究によってこの補体系を
構成する各種蛋白質成分の単離、同定が為され、この系
は二つの異なった活性化の出発点を有するカスケード反
応(古典経路と第二経路)を形成していることが明かと
なった。古典経路は、主として抗原抗体複合体によって
活性化され、第二経路は、主として生体内に侵入した異
物(微生物等)により活性化される。また、両経路とも
最終的に標的細胞を溶解するように各成分が順次カスケ
ードに沿って反応するが、この系での重要なカスケード
産物である補体第3成分(以下C3と記す)転換酵素複
合体と、補体第5成分(以下C5と記す)転換酵素複合
体の形成機転が二つの経路で異なっている。即ち、古典
経路のC3転換酵素複合体は、補体第4成分(以下C4
と記す)と補体第2成分(以下C2と記す)の反応複合
体として細胞膜等に結合したC4b2aであり、C5転
換酵素複合体は、C3転換酵素複合体とC3との反応複
合体であるC4b2a3bである。
【0003】一方、第二経路でのC3転換酵素複合体
は、C3とB因子の反応複合体として細胞膜等に結合し
たC3bBbであり、C5転換酵素複合体は、C3転換
酵素複合体であるC3bBbとC3との反応複合体であ
るC3bBb3bである。
【0004】両経路において、C5転換酵素複合体によ
って活性化されたC5(C5b)は、C5〜C9と順次
反応して最終的に膜侵襲複合体(Membrane A
ttack Complex,以下、MACと記す)を
形成して細胞溶解を引き起こす。また、補体系のカスケ
ード産物の中には、直接的な細胞障害作用以外に種々の
生理活性を有するものが知られている。特にC3の活性
化産物のひとつであるC3aおよびC5の活性化産物の
ひとつであるC5aは別名アナフィラトキシン(ana
phylatoxin)とも呼ばれ、肥満細胞からのヒ
スタミン(histamin)の遊離作用や白血球に対
する走化作用を示すことが知られている。これらは血管
の透過性を亢進させ、補体系が活性化されている箇所に
白血球を呼び寄せるように作用していると考えられ、免
疫複合体や溶解した細胞断片の貪食等による処理に対し
て合理的なものであろう。
【0005】このように細菌や異種細胞に対する補体系
の細胞溶解作用機序が明らかになる一方で、補体系は何
故自己細胞に対しては障害作用を示さないのかという疑
問が生じてきた。その疑問に対する解答の一つとして、
近年になって細胞膜上に自己の補体系の作用を抑制する
分子群が存在することが明かとなった。中でも補体系カ
スケード反応中で重要な位置にあるC3bに結合する三
種の細胞膜蛋白質の発見は、自己細胞に対する補体系の
作用を理解する上で画期的な出来事であった。即ち、補
体受容体1(Complement Receptor
1,以下、CR1と記す)、崩壊促進因子(Deca
y−Accelerating Factor,以下D
AFと記す)、およびメンブレンコファクタープロテイ
ン(Membrane Cofactor Prote
in、MCP)が次々と発見され、その遺伝子がクロー
ニングされ、それぞれの作用特性、補体系制御機序につ
いても種々の検討が為されるに至った。
【0006】CR1は、1)血漿中のI因子のコファク
ターとしてC3bをiC3bという不活性型に変換する
作用(不可逆的蛋白分解作用)と、2)C3転換酵素複
合体の解離を強力に促進する作用(可逆的複合体解離作
用)とを併せ持つ分子量約200kdの細胞膜蛋白質と
して1980年に同定された(Fearon,DT.
J.Exp.Med. 152 20−30,198
0)。その遺伝子は1987年にクローニングされ、そ
の塩基配列からの解析によると、CR1は約60アミノ
酸からなる繰り返し構造(Short Concens
us Repeat,以下SCRと記す)7つを1ユニ
ットとして、計4ユニットから構成されている膜貫通型
の糖蛋白質である(Klickstein,LB.
t al.J.Exp.Med. 165 1095−
1112,1987)。
【0007】DAFは、C3およびC5転換酵素複合体
の解離を強力に促進する作用(可逆的複合体解離作用)
を有する物質としてヒト赤血球より単離された分子量約
70kdの糖蛋白質である(Nicholson−We
ller,A. et al. J.Immunol.
129 184−189,1982)。その遺伝子も
1987年にクローニングされ、その解析によりDAF
も約60アミノ酸からなる繰り返し構造を4個持つこと
が明かとなった(Caras,IW. etal. N
ature 325 545−549,1987 およ
び Medof,ME. et al. Proc.N
atl.Acad.Sci.USA84 2007−2
011,1987)。
【0008】MCPはこれら三種の中で最も新たにクロ
ーニングされた分子量45〜70kdの膜糖蛋白である
(Lublin,DM. et al. J.Exp.
Med. 168 181−194,1988)。MC
Pも約60アミノ酸からなる繰り返し構造を4個有して
おり、これはDAFの構造に類似しているが、MCPは
I因子のコファクターとしての活性(不可逆的C3b不
活化作用)を示すのみで、崩壊促進作用は持たない(S
eya,T. et al. J.Exp.Med.
163 837−855,1986)。ヒトMCPはそ
のmRNAのスプライシング様式の相違によって、少な
くとも6種のイソ体が存在する(国際公開番号 WO9
1/02002 および Post,TW.et a
. J.Exp.Med. 174 93−102,
1991)。
【0009】さらに興味深いことにMCPは、そのMC
Pを有している細胞上に存在するC3bに対しては作用
するが、他細胞上のC3bには作用しないこと、および
細胞膜から抽出単離された天然型MCPは、液相中のC
3bあるいは可溶化された基質に結合したC3bには作
用するが、不溶性基質に結合したC3bにはほとんど作
用しないことが明かとなっている(瀬谷 司 日本臨床
46(9)別冊 1933−1937,1988.
Seya,T. et al. Biochem.J.
264 581−588,1989.および 国際公
開番号 WO91/02002)。
【0010】以上のように細胞膜上に存在する補体系制
御蛋白質の実態が明らかになるに伴って、それを疾患の
治療剤として応用する試みが為されるようになった。従
来より種々の疾患に於いて、補体系の活性化による血中
総補体価の低下や炎症組織への補体成分の沈着が認めら
れている(典型的な例としては、腎炎、血管炎、SLE
等が挙げられよう)。従って、このような疾患状態では
補体系が自己細胞に対して障害的に作用していることが
予想され、補体制御蛋白質はこのような病態を治療する
のに有効な薬物となると考えられる。
【0011】CR1に関しては、遺伝子工学的に産生さ
れた可溶型CR1を用いて、虚血後心筋壊死モデル(W
eisman,HF. et al. Science
249146−151,1990)、逆受身アルサス
反応モデル(Yeh,CG.et al. J.Imm
unol. 146 250−256,1991)、移
植組織片超急性拒絶反応モデル(Pruitt,SK.
et al. J.Surg.Res. 50 35
0−355,1991)に対する有効性が検討されてお
り、いずれの場合も可溶型CR1がモデル病態に対して
抑制的に作用したことが報告されている。
【0012】DAFについては、発作性夜間ヘモグロビ
ン尿症患者赤血球(当該患者の赤血球膜上にはDAFが
欠損しており、自己の補体系によって溶血を起こすこと
が知られている)を用いてその治療効果が検討された
(Medof,ME. etal. Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 82 2980−29
84,1985)。しかしながら、本検討ではこの病態
を完全には回復することができなかったことが報告され
ている。
【0013】以上のように補体系制御蛋白質の医療用治
療剤としての応用が有望視され始めてはいるが、実際に
それらを医療現場に提供するには、いくつかの克服すべ
き重要な問題が存在している。即ち、CR1は種々の病
態モデルでその有効性が確認されており、医療用治療剤
として最も有望であろうと思われるが、分子量が約20
0Kdと巨大であり、一般的にはその生産や精製工程で
の取り扱いが容易ではない。DAFは前記のようにその
治療剤としての効果が期待通りではない。
【0014】MCPについては、その有効性に関する具
体的な報告は現時点では無いが、MCPは固相基質(不
溶性基質)に吸着したC3bには作用しないことが明か
となっている。(瀬谷 司 日本臨床 46(9)別冊
1933−1937,1988; Seya,T.
et al. Biochem.J. 264 581
−588,1989;および 国際公開番号 WO91
/02002)。すなわち補体系が細胞に障害的に作用
する場が細胞膜上であることと、外因的に用いられた天
然型MCPの持つ作用特性である固相基質あるいは他の
細胞上に吸着したC3bには作用せず、液相においての
みI因子のコファクターとして作用するという事実とを
併せて考えると、MCPの有効性は従来技術において、
あまり期待できない。
【0015】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、補体系が自
己細胞や組織に対して障害的に作用してしまうような疾
患に用いるための医薬組成物を医療現場に提供するため
に、生産や精製工程での取り扱いが容易な比較的低分子
量であり、かつ、補体系が障害作用を示す実際の場、即
ち、固相基質(細胞膜)に吸着した補体系成分の作用を
抑制するような新規な薬理学的特性を有する蛋白質を創
造することを目的とする。
【0016】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
現在知られている天然型MCP分子中にはそれが外因的
に用いられた場合固相上のC3bに作用することを阻害
するような部位が存在していると推定し、その阻害部位
を欠如させることにより、固相でのC3bにも作用する
という重要な薬理学的特性を付加できるであろうと考え
た。そしてこのような新しい着想に基づき鋭意研究を重
ねた結果、本発明者らは新規な薬理学的特性を有する蛋
白質の創造に成功し、それを基に本発明を完成させた。
【0017】すなわち、本発明の第1態様は、天然型メ
ンブレンコファクタープロテイン(Membrane
Cofactor Protein, MCP)の少な
くとも膜貫通領域および細胞質内領域が欠如しているこ
とを特徴とする新規な薬理学的特性を有する蛋白質を提
供する。
【0018】さらに、本発明の第1態様は、下記式1に
示したアミノ酸配列の少なくとも一部を有するものであ
る場合好適である。
【0019】本発明の第2態様は、本発明の第1態様の
新規な薬理学的特性を有する蛋白質をコードする塩基配
列を有するDNAを提供する。
【0020】本発明の第3態様は、本発明の第1態様の
新規な薬理学的特性を有する蛋白質を、少なくとも1つ
の有効成分として含有することを特徴とする、補体系が
自己細胞に対して障害的に作用する疾患に用いるための
医薬組成物である。
【0021】以下、本発明を詳細に説明する。本発明第
1態様の蛋白質は、天然型メンブレンコファクタープロ
テイン(Membrane Cofactor Pro
tein, MCP)の少なくとも膜貫通領域および細
胞質内領域が欠如していることを特徴とする新規な薬理
学的特性を有する蛋白質である。
【0022】図1は国際公開番号WO91/02002
の図3を引用したものであり、cDNAより与えられた
6種のMCPのイソ体の構造を表わしている。図1中の
4SCRsは、4つのSCR領域、ST(STA 、ST
B およびSTC )は富セリン−スレオニン領域(Ser
ine−threonine rich reagio
n)、UKはその配列の機能が未知であるUK領域(u
nknown)、HYは疎水性領域(hydropho
bic reagion)、CYT(CYT1およびC
YT2 )は細胞質内領域(cytoplasmic t
ail reagion)を表わしている。前記天然型
MCPの膜貫通領域とは、通常、細胞膜上に膜を貫通し
た形で存在する天然型MCPが、膜を貫通している領域
をさし、それは図1にHYとして表記されている部分を
さす。また細胞質内領域とは図1中でCYT1 あるいは
CYT2 と表記されている部分をさす。アミノ酸配列上
において例示すると、国際公開番号WO91/0200
2の図1中のアミノ酸番号295〜317が膜貫通領域
で318〜350が細胞質内領域である。
【0023】本発明第1態様の少なくとも膜貫通領域お
よび細胞質内領域が欠如している蛋白質は、図1のMC
Pクローン中のST(STA 、STB 、STC )および
UKに相当する蛋白質上の領域部分、または、それら領
域部分の両端の境界の任意の点から、C末端側のアミノ
酸配列を欠如された蛋白質である。具体的には、[4S
CRs−STC −UK]構造の蛋白質、[4SCRs−
STA −STB −ST C ]構造の蛋白質、[4SCRs
−STC ]構造の蛋白質、[4SCRs]構造の蛋白質
等が挙げられる。図1に示される様に、MCPにはその
mRNAのスプライシング様式の相違によって少なくと
も6種のイソ体が存在することが明かとなっている(国
際公開番号 WO91/02002 および Pos
t,TW.et al. J.Exp.Med. 17
93−102,1991)。本発明の、新しい着想
に基づき創造された新規な活性を有する蛋白質の中で、
下記式1(配列番号1)に示したものは国際公開番号W
O91/02002明細書、図1中のアミノ酸番号−3
4〜−1、252〜266および295以降を欠如させ
たものであり、式記式2(配列番号2)に示したものは
国際公開番号WO91/02002明細書、図1中のア
ミノ酸番号−34〜−1および252以降を欠如させた
ものである。
【0024】また、さらに、本発明の蛋白質は、下記式
1に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を有する場
合、下記式1または2に表されるアミノ酸配列を有する
場合、さらには、下記式1または2で示される場合が好
適である。
【0025】 (式1) Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly Pro Arg Pro Thr 245 250 255 Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu 260 265 270 Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp 275 279
【0026】 (式2) Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys 245 250 251
【0027】また、本発明の第1態様である新規な薬理
学的特性を有する蛋白質は、従来知られていたMCPと
は大きく異なり、液相中のC3bに対する場合と同様に
従来ならば作用を示さない固相上のC3bに対するI因
子のコファクターとしての作用を有することを特徴とす
る新規な薬理学的特性を有する蛋白質である場合が好ま
しい。I因子のコファクターとしての作用とは、補体系
においてC3bが不活化する、すなわち、C3bからi
C3bへの変換反応における、I因子の補因子としての
活性作用であり、より具体的には、外因的に補充された
本発明の蛋白質が補体系制御因子の1つであるI因子の
補因子として作用し、結果として補体系成分C3bを不
可逆的に分解しそのC3bとしての作用を抑制あるいは
消失せしめることをさす。
【0028】この現象は当該技術分野の一般的常識を覆
すものであり、未だかつて何人も推定し得なかったこと
である。事実、国際公開番号WO91/02002明細
書中で、その発明者は可溶型MCPを創造してはいる
が、このような新規な薬理学的特性を認識あるいは推定
するには至っておらず、逆に可溶型MCPは固相上のC
3bに対してはI因子のコファクターとしての作用が無
い旨の開示をしている。従って、本発明の明細書に開示
されるMCPは、国際公開番号WO91/02002に
開示されたものとは異なるのみならず、発明として一線
を画すものである。
【0029】固相上のC3bとは、活性化された補体系
成分C3bが生体組織や細胞あるいは生体を構成する有
形成分さらには生体内に人為的に設置された人工有形物
等に共有結合または非共有結合を介して結合している状
態を指し、例えば細胞膜などの固相または不溶性基質に
吸着または結合した状態で存在するC3b等がある。ま
た、液相中のC3bとは、例えば生体液や各種溶液中に
遊離した状態で存在するC3bまたは可溶化された基質
に結合したC3b等である。
【0030】本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白
質は、既知であるMCPから固相上のC3bへの作用に
対して障害となる、MCP中の一部を除くという新たな
着想に基づき創造されたもので、固相上のC3bに対し
て、液相中のC3bに対するコファクター活性と同様に
作用を示すものであれば如何なるものでもよい。本発明
の蛋白質の基本的な性質(物性、活性等)、特に、固相
上のC3bに対する作用の有無を変化させることなく、
そのアミノ酸配列に欠失、付加あるいは置換といった変
異を導入することができる。例えば、疎水性アミノ酸残
基の他の疎水性アミノ酸残基への置換、陽性電荷を持つ
アミノ酸の他の陽性電荷を持つアミノ酸への置換、Gl
uとAspあるいはLysとHisとArgでの相互置
換、またはIle,Val,Met,Leuの群間、G
ly,Ala,Ser,Cysの群間、およびTrp,
Tyr,Pheの群間での置換は推定できる。従って、
前記式1または2で示されたアミノ酸配列そのもので規
定される蛋白質、もしくは上記式1または2で示された
アミノ酸配列を少なくとも有する蛋白質の、N末端およ
び/またはC末端および/または内部において、一つ以
上のアミノ酸の置換、欠失、付加等が生じてなる変異体
も、本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質の上記
の基本的な性質が認められるかぎり、本発明の蛋白質に
包含される。加えて、該変異体に、糖付加アルキル化、
酸化、還元、水解等、種々の化学修飾を施してなる物
質、あるいは薬理学上許容されうる酸または塩基との塩
を形成させてなる物質等も、もちろん、本発明の新規な
薬理学的特性を有する蛋白質に包含される。
【0031】また、本発明第1態様の新規な薬理学的特
性を有する蛋白質は、メリフィールド法のような標準的
なポリペプチド合成法により、あるいは本発明の蛋白質
分子を含有する天然物MCPから得られたものであって
もよいが、好ましくは、後記する本発明の第2態様のD
NA等を用いて遺伝子工学的手法により、培養細胞によ
って産生されたものがよい。また、培養細胞が、大腸菌
および哺乳動物培養細胞である場合、より好ましい。若
しくは、国際公開番号WO91/02002明細書中で
開示されているMCPの塩基配列より固相上のC3bへ
の作用に阻害的な部位に相当する塩基配列を欠失させた
塩基配列すなわち、下記式3(配列番号3)の塩基配列
を有するDNAの少なくとも一部を用いることによっ
て、遺伝子工学的に得られたものであってもよい。
【0032】 (式3) TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840
【0033】本発明の蛋白質を遺伝子工学的に得るに
は、一般的に使用されている宿主−ベクター系を用いる
ことができる。例えば宿主として大腸菌を用いる場合
は、プロモーターとしてLacUV5、トリプトファン
プロモーターやλPL プロモーター等が使用可能であ
る。また、λファージ系のベクターであるλgt11を
用いて、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質として得
ることもできる。
【0034】さらに、哺乳動物培養細胞を宿主として使
用する場合は、サル由来COS細胞、チャイニーズハム
スター由来CHO細胞、マウス由来3T3細胞あるいは
ヒト由来線維芽細胞等が好適である。これらを宿主とす
る場合には、プロモーターとして、SV40初期プロモ
ーター、アデノウイルス主要後期プロモーターあるいは
β−アクチンプロモーターやポリペプチド鎖伸長因子プ
ロモーター等が使用できる。これらの宿主−ベクター系
を用いた場合、各々の宿主が好適に増殖し得る条件下で
培養し、かつ、各々のプロモーターが機能するような条
件を与えることによって、本発明の新規な薬理学的特性
を有する蛋白質を得ることができる。
【0035】本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白
質は、精製された蛋白質である場合がより好ましいが、
特にこれに限定されるものではない。得られた新規な活
性を有する蛋白質は、現在一般的に用いられている蛋白
性物質の精製法を用いて精製することができる。例え
ば、塩析、酸・アルカリ沈澱法、限外濾過法、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、HPLC、クロマト
フォーカシング、電気泳動法等を適宜組み合わせること
によって実施できる。例えば、本発明の蛋白質を含有す
る溶液を0.02M NaCl/10mM 燐酸緩衝液
(pH7.5)に対して透析した後、イオン交換クロマ
トグラフィーに付し、NaClの直線濃度勾配によって
溶出する。活性画分を集め、更にモノクローナル抗体を
用いたアフィニティークロマトグラフィーに付す。これ
をグリシン(Glycine)−HCl緩衝液(pH
2.5)で溶出し、活性画分を得ればよい。あるいは、
MCPを精製する公知の方法(Seya,T. et
al. J.Exp.Med. 163 837−85
5,1986)に従って実施してもよい。MCPの活性
は、I因子存在下でのC3bの不活化、即ち、C3bか
らiC3bへの変換を確認すればよい。例えば、瀬谷ら
の方法(Seya,T. et al. Clin.C
him.Acta119 189−196,1982)
に従って蛍光標識したC3bを作製し、これを基質とし
てI因子存在下でMCP分子を添加する。反応終了後、
β−メルカプトエタノール(mercaptoetha
nol)等で還元し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミド電気泳動(以下、SDS−PAGEと記
す)に付す。そのゲルをフルオロメーターで走査するこ
とにより、C3bからiC3bへの変換の状態をその分
子量の相違から確認すればよい。
【0036】本発明の第2態様は、本発明の第1態様の
新規な薬理学的特性を有する蛋白質をコードする塩基配
列を有するDNAを提供する。本発明第2態様のDNA
は下記式3(配列番号3)に示した塩基配列の少なくと
も一部を有する場合、下記式3または下記式4(配列番
号4)で示した塩基配列を有する場合好適であり、さら
には下記式3または4で示した塩基配列で規定される場
合より好適である。
【0037】 (式3) TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840
【0038】 (式4) TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756
【0039】式3に示したものは国際公開番号WO91
/02002明細書図3、すなわち本願図1のクローン
H2−15のシグナルペプチド領域(SP)、疎水性領
域(HY)および細胞質内領域CYT2 を欠如させたも
のに相当する。式4に示したものは、天然型MCPの4
つのSCR部分(4SCRs)に相当する。
【0040】本発明のDNAは、天然MCP由来のシグ
ナルペプチド等に相当する塩基配列をさらに、有してい
てもよい。本発明第2態様のDNAは、その全てを一般
的なDNA合成法によって得られたものでもよく、ま
た、部位特異的塩基配列変異法によって公知のMCP遺
伝子の適当な部位に翻訳停止コドンを導入することによ
っても得られたものであってもよい。好ましくはMCP
をコードするmRNAをクローニングするための公知の
方法(Lublin,DM. et al. J.Ex
p.Med. 168181−194,1988)に従
ってそのcDNAを得た後、そのcDNAを用いて遺伝
子工学的手法により不用な部分を削除および再構成する
ことによって得られたものがよい。
【0041】例えば、図1のクローンH2−14あるい
はH2−15をテンプレートとして、その疎水性領域直
前に翻訳停止コドンを有するような部分ミスマッチプラ
イマーを用いて遺伝子連鎖増幅法(Polymeras
e Chain Reaction,以下PCRと記
す)により人工的に翻訳停止コドンを付加したC末端遺
伝子部分を得る。これを適当な制限酵素で切断し、同様
に制限酵素処理したN末端領域遺伝子と結合させればよ
い。
【0042】また、本発明の第2態様のDNAは第1態
様のMCPをコードし適当な条件下で、発現し得るよう
なDNAであれば如何なる塩基配列を有するDNAでも
良く、さらには、前記式3または前記式4で示された塩
基配列に規定されるDNAであっても、該塩基配列に加
え、その5´末端および/または3´末端および/また
はその中間部に任意の1つ以上の塩基が付加または置換
されたものであってもよい。当該技術分野では、遺伝暗
号の縮重に伴い、それがコードする蛋白質のアミノ酸配
列を変化させることなく遺伝子の塩基配列を置換するこ
とができる。即ち、ほとんどのアミノ酸は複数個の遺伝
暗号でコードされており、例えば、ValはGTT,G
TA,GTC,GTGの何れかでコードされ、Alaは
GCA,GCT,GCC,GCGの何れかでコードされ
る。従って、本発明の第2態様のDNAはそのコードす
るアミノ酸配列に変化を与えない限り、その塩基配列の
1つ以上の塩基が他の塩基に置換された変異体をも包含
する。なお、配列番号3および4に示した塩基配列を有
するDNAを含有するプラスミド(pM852、pM8
53)により形質転換された大腸菌株[HB101(p
M851)、HB101(pM852)]は通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている[寄
託番号微工研菌寄第12715号(FERM P−12
715)および微工研菌寄第12716号(FERM
P−12716)]。
【0043】さらに本発明の第3態様は、第1態様の新
規な薬理学的特性を有する蛋白質を少なくとも1つの有
効成分として含有することを特徴とする、補体系が自己
細胞に対して障害的に作用する疾患に用いるための医薬
組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、第1態様の
みで構成されていてもよいが、本発明の新規な薬理学的
特性すなわち、固相上のC3bに作用する活性を損なわ
ない限り、一般的に使用される製剤学的混合物である賦
型剤、安定化剤あるいは溶解補助剤等を含有していても
よい。具体例として、リンガー液、燐酸緩衝液、ヒト血
清アルブミン、水解ゼラチン、蔗糖、デキストラン、ポ
リエチレングリコール等があり、薬剤形態により、適宜
選択使用される。
【0044】本発明の医薬組成物の投与量は患者の年
齢、体重、性別およびその疾患の種類や程度により適宜
調節されるが、通常は1ng/kg〜10mg/kg、
好ましくは1μg/kg〜10mg/kg、さらに好ま
しくは10μg/kg〜5mg/kgがよい。このよう
な治療の対象となる疾患は、補体系が自己細胞や組織に
対して障害的に作用する疾患であればよいが、なかでも
腎炎、肝炎、血管炎、喘息、自己免疫疾患、虚血性臓器
障害、再潅流障害、関節リウマチ、移植組織片拒絶、シ
ョック、多臓器不全および播種性血管内凝固症である場
合が好ましい。
【0045】本発明第3態様の医薬組成物を用いた治療
方法は、新規な薬理学的特性を有する本発明の蛋白質
を、その有効量が患部に到達するような方法で投与され
れば如何なるものでもよい。例えば、静脈内、動脈内、
皮下、筋肉内、経口のような全身的投与や、関節腔内、
髄腔内のような局所投与、あるいは鼻腔内、気管内、口
腔内投与のような経粘膜投与、さらには座剤等による腸
管内投与による治療方法が含まれる。
【0046】
【実施例】以下に本発明を実施例をもってより具体的に
示すが、これは本発明の実施様態の一つの例示であり、
本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例
中の学術用語、略号等は特に断らない限り当該技術分野
で一般的に使用されているものに従った。また、遺伝子
組換えに関わる基本的操作は、マニアチス等(Mani
atis,T. et al.)、”モレキュラー ク
ローニング、ア ラボラトリー マニュアル(Mole
cular Cloning,A Laborator
y Manual)” コールド スプリング ハーバ
ー ラボラトリー(Cold Spring Harb
or Laboratory)、1989、蛋白質精製
に関わる基本的操作は、日本生化学会編 ”新生化学実
験講座第1巻 蛋白質I 分離・精製・性質” 東京化
学同人 1990 をそれぞれ参考として実施した。各
種機器、試薬の使用法は各々附属の使用説明書に従っ
た。
【0047】(実施例1) MCP遺伝子のC末端相当
領域の改変1 新規な薬理学的特性を有する本発明の新規な薬理学的特
性を有する蛋白質を遺伝子工学的に産生させるために、
プラスミドベクターであるpUC19にクローン化され
たMCP遺伝子(以下クローン名をpUC19−MCP
(D)と記す)を改変した。用いたMCP構造遺伝子は
図1のクローンH2−15に相当し、これはポスト等
(Post,TW. et al.)、ジャーナル オ
ブ エクスペリメンタル メディスン(J.Exp.M
ed.)、174 93−102,1991の図4に記
載のものと同一である。まずPCR用のプライマーとし
て以下の2種の一本鎖DNAをDNA合成機(381A
型,アプライドバイオシステムズ社)を用いて合成し
た。 センスプライマー:5’−GTTATGTTTGAAT
GCGATAAGG−3’ アンチセンスプライマー:5’−CCGGTACCCT
ATCAATCCAAACTGTCAAGTATTCC
−3’ 10mM トリス(Tris)−HCl(pH8.3)
/50mM KCl/1.5mM MgCl2 /0.0
1%ゼラチン溶液100μlに、上記2種のプライマー
各々0.8μgと、テンプレートとしてpUC19−M
CP(D)50ngおよび耐熱性DNAポリメラーゼ
(パーキンエルマーシータス社)2.5単位さらに基質
として200μMとなるようにdNTP(NはA,T,
C,Gの4種を表す)を溶解し、PCR用恒温槽(サー
マルサイクラー,パーキンエルマーシータス社)を用い
てPCR(遺伝子連鎖増幅法)を実施した。操作は、ミ
カエル等(Michael,AI. et al.)”
PCR プロトコール(Protocols),ア ガ
イド トゥ メソッズ アンド アプリケーション(A
Guide to Methods and App
lications)” アカデミック プレス(Ac
ademic Press),1990を参考として実
施した。反応終了後、フェノール/クロロホルム抽出、
エタノール沈澱法により増幅された約190bpのDN
Aフラグメントを得た。これを制限酵素KpnI(宝酒
造社)およびBsmI(ニューイングランドバイオラブ
社)とで二重消化し、同様の制限酵素により消化された
pUC19−MCP(D)由来ラージフラグメントとD
NAリガーゼ(宝酒造社)を用いて結合した。得られた
プラスミドをpUC19−sMCP(C)と命名した。
実施例1の工程を図2に略記した。
【0048】(実施例2) MCP遺伝子のN末端近傍
相当領域の改変 遺伝子組換え時の操作性の向上を目的として、MCP遺
伝子のN末端近傍相当領域の改変を実施した。まず、人
工リンカーを得るために以下の2種の一本鎖DNAを実
施例1と同様の方法で合成した。 合成リンカー(1) アッパーストランド:5’−AATTCGTCGACA
TGGAGCCTCCC−3’ 合成リンカー(2) ロアーストランド :3’−GCAGCTGTACCT
CGGAGGGCCGG−5’ これをアニールした後、これと、実施例1で得られたp
UC19−sMCP(C)を制限酵素EcoRI(宝酒
造社)およびEco52I(宝酒造社)で二重消化して
得られるラージフラグメントとを実施例1と同様の方法
で結合した。得られたプラスミドをpUC19−sMC
P(D)と命名した。なお、実施例2の工程を図3に略
記した。
【0049】(実施例3) MCP遺伝子のC末端相当
領域の改変2 実施例2で得られたプラスミドpUC19−sMCP
(D)を用いて、さらにC末端相当領域に改変を有する
MCP遺伝子を作製した。まず、以下の2種のプライマ
ーを実施例1と同様の方法で合成した。 センスプライマー:5’−GTTATGTTTGAAT
GCGATAAGG−3’ アンチセンスプライマー:5’−AAGGTACCCT
ATCATTTAAGACACTTTGGAACTGG
−3’ これらを用いて、pUC19−sMCP(D)をテンプ
レートとして実施例1と同様の方法でPCRを実施し
た。得られた約100bpのフラグメントを制限酵素K
pnI(既出)およびBsmI(既出)で二重消化し、
これと、同様の制限酵素により消化されたpUC19−
sMCP(D)由来ラージフラグメントとを実施例1と
同様の方法で結合した。得られたプラスミドをpUC1
9−sMCP1234と命名した。なお、実施例3の工
程を図4に略記した。
【0050】(実施例4) COSI細胞発現用プラス
ミドの構築 哺乳動物培養細胞での強力な発現ベクターとして知られ
ているpEF−BOS(Mizushima,S.
t al. Nucleic Acids Res.
18 5322,1990)の改良型ベクターであるp
EFN−Iを基にCOSI細胞発現用プラスミドを構築
した。pEFN−Iは、SV40の複製開始点(or
i)、ヒトポリペプチド鎖伸長因子1αのプロモーター
領域およびSV40のポリA付加シグナル配列を有す
る。実施例2で得られたpUC19−sMCP(D)あ
るいは実施例3で得られたpUC19−sMCP123
4を制限酵素EcoRIおよびKpnIで二重消化し、
各々のプラスミドの有するMCP構造遺伝子断片(スモ
ールフラグメント)を単離した。これらの断片を各々、
同様の制限酵素で二重消化したpEFN−Iと実施例1
と同様の方法で結合した。得られたプラスミドを各々p
M851およびpM852と命名した。なお、実施例4
の工程を図5に略記した。
【0051】pM851は配列番号3に示される塩基配
列をpM852は配列番号4に示される塩基配列を各々
有するプラスミドである。各プラスミドにより形質転換
された大腸菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている[寄託番号微工研菌寄第127
15号(FERM P−12715)および微工研菌寄
第12716号(FERM P−12716)]。
【0052】(実施例5) COSI細胞での発現 実施例4で作製したpM851およびpM852を各々
COSI細胞へ導入し、本発明の蛋白質を発現させた。
即ち、0.5μgのpM851あるいはpM852を5
μlの10mM トリス塩酸緩衝液(以下Tris−H
Clと記す)(pH7.4)/1mM エチレンジアミ
ン四酢酸(以下EDTAと記す)溶液に溶解し、0.2
mg/ml DEAE−デキストランおよび50mM
Tris−HCl(pH7.4)を含有するダルベッコ
変法イーグル培地(D−ME培地,日水製薬社)700
μlを添加し、DNA−DEAEデキストラン混合液を
作製した。直径3.5cmの培養プレート内でセミコン
フルエントまで単層培養されたCOSI細胞にそのDN
A−DEAEデキストラン混合液を滴下し、5%CO2
/95%空気下37℃にて培養した。4時間後、DNA
−DEAEデキストラン混合液を除去し、1%ウシ胎児
血清(アーバインサイエンティフィック社)を含有する
D−ME培地を添加した。24時間培養後、培地を血清
不含のD−ME培地に交換し、さらに48〜96時間培
養した。この培養上清を回収し、本発明の新規な薬理学
的特性を有する蛋白質の精製に供した。
【0053】(実施例6) 培養上清からの本発明の蛋
白質の精製 実施例5で得られた培養上清を0.05%ノニデットP
−40(以下NP−40と記す)含有20mM酢酸緩衝
液(pH5.0)に対して4℃で一晩透析した。沈澱物
を遠心分離操作により除去し、上清をクロマトフォーカ
シングカラムクロマトグラフィーに供した。即ち、クロ
マトフォーカシングゲル(ファルマシア社)を充填し、
10mM Tris−HCl(pH9.0)/0.05
% NP−40で平衡化したカラム(直径2cmX長さ
70cm)に試料を付し、20mM 酢酸緩衝液(pH
4.75)/0.05% NP−40/10% ポリバ
ッファー74(ファルマシア社)でカラムを洗浄した
後、10% ポリバッファー74にて作製された20〜
250mM酢酸緩衝液(pH4.3)の直線濃度勾配に
て溶出した。参考例4に示したMCPの酵素免疫測定法
による陽性画分をプールし、10mM 燐酸緩衝生理食
塩液(以下PBSと記す,pH7.4)/0.05%
NP−40に対して透析した。これを参考例2に作製法
を示したMCPに対する単クローン性抗体をリガンドと
したアフィニティカラムクロマトグラフィーに供した。
アフィニティカラム(直径2cmX長さ10cm)に試
料を付し、PBS(pH7.4)/0.05% NP−
40、次いでPBS(pH7.4)/0.5M NaC
l/0.05% NP−40でカラムを洗浄した。0.
17M グリシン(Glycine)−HCl緩衝液
(pH2.5)/0.05%NP−40を用いて蛋白質
を溶出し、ただちに溶出画分10mlに対し1mlの1
M Trisを添加し、中和した。これを20mM 燐
酸緩衝液(pH6.0)/0.05% NP−40に対
して一晩透析した後、濃縮装置(Ms.BTAURY−
KN,アトー社)を用いて濃縮した。実施例6の工程に
よって本発明の蛋白質を、回収率70%以上で、SDS
−PAGE後の銀染色にて単一バンドとなるまで精製で
きた。
【0054】(実施例7) 固相上のC3bに対する作
用 細胞膜から抽出された天然型MCPは、液相中のC3b
にはI因子のコファクター活性を示すが固相上のC3b
に対しては作用を示さないことが瀬谷等によって明らか
にされている(Seya,T. et al. Bio
chem.J.264 581−588,1989)。
そこで本発明者等は、実施例6で得られた蛋白質につい
て固相上のC3bに対する作用について検討した。方法
は、この瀬谷等の文献に記載の方法に準じて実施した。
まず、以下に記載の公知の方法に従って補体系の各成分
を精製した。 C1: マツモト等(Matsumoto,M. et
al.)、ジャーナル オブ イムノロジー(J.I
mmunol.)、142 2743−2750,19
89 C2: ナガサワ等(Nagasawa,S. et
al.)、プロシーディングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテ
ッド ステイト オブ アメリカ(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA)、74 2998−3
001,1977 C3: セヤ等(Seya,T.et al.)、ジャ
ーナル オブ バイオケミストリー(J.Bioche
m.)89,659−664,1981 C4: ナガサワ等(Nagasawa,S. et
al.)、モレキュラー イムノロジー(Molec.
Immunol.)、17 1365−1372,19
80 B : セヤ等(Seya,T. et al.)、コ
ンプレメント(Complement)、 165−
174,1985 D : ボラナキス等(Volanakis,JE.
et al.)、ジャーナル オブ イムノロジー
(J.Immunol.)、119337−342,1
977 I : ナガサワ等(Nagasawa,S. et
al.)、ジャーナル オブ イムノロジー(J.Im
munol.)、125578−582,1980 さらに精製されたC3の一部は過沃素酸標識試薬(ピア
ースケミカル社)を用いて125 Iで標識した。赤血球膜
上に固着したC3bを得るために、ヒツジ洗浄赤血球
(E,日研生物社)と抗ヒツジ赤血球ウサギ抗体(A,
コーディス社)を反応させた後、順次C1、C4、C2
を添加し、EAC4b2を形成させた。これに少量の未
標識C3を加えEAC4b2a3bを形成させた後、
125 I標識C3、B因子およびD因子を各々添加してE
125 IC3b(赤血球膜上に固着化した125 I標識C
3b)を得た。この赤血球1X107 〜3X107 細胞
を基質として、これに1μgのI因子および実施例6で
得た蛋白質40ngを加え、総量160μlとして37
℃にて1時間放置した。3%NP−40および10%ド
デシル硫酸ナトリウム(SDS)を各々10μl、β−
メルカプトエタノールを5μlおよびSDS−PAGE
用色素混合液を45μl加えることで反応を停止させ、
SDS−PAGEで分離後オートラジオグラフィーを用
いて固相上のC3bの分解状態を解析した。なお、HS
B−2細胞株の細胞膜画分より実施例6に記載の方法に
準じて精製した天然型MCPをC3b分解能の対照とし
て用いたが、これは固相上のC3bには作用しない為、
反応開始時に0.4%となるようにNP−40を加え予
め赤血球膜を溶解し、C3bが液相中に存在するように
処理した後に反応を実施した。
【0055】その結果を図6に示す。図6は各種処理を
行った125 Iで標識されたC3bの各種反応処理後の試
料のSDS−PAGEのオートラジオグラムである。各
レーンの試料の処理条件を以下に示す。 レーン1:固相化C3b+I因子 レーン2:固相化C3b+I因子+天然型MCP レーン3:固相化C3b+I因子+天然型MCP+NP
−40(NP−40は固相上のC3bを可溶化するため
に添加) レーン4:固相化C3b+I因子+本発明の蛋白質 レーン1とレーン2を比較するとC3bのバンドパター
ンには変化が見られない。これは天然型MCPは固相上
のC3bに対してはI因子のコファクターとしての活性
を持たないことを示している。これにNP−40を加え
たレーン3では、レーン2に比較して116Kd〜12
0Kdのバンドの消失がみられる。これは、NP−40
によって可溶化されたC3bが、天然型MCPをコファ
クターとするI因子によって分解されたことを示す。
【0056】レーン4は、固相上のC3bにI因子と本
発明の蛋白質をNP−40非存在下で反応させたもので
あるが、レーン3と同様に116Kd〜120Kdのバ
ンドの消失がみられる。これは本発明の蛋白質が、天然
型MCPとは異なり、固相上のC3bに対してもI因子
のコファクターとしての作用を有することを示してい
る。これにより、本発明の蛋白質は固相上のC3bに対
しても、天然型MCPが液相中のC3bに対する場合と
同様にコファクター活性を示すことが明かとなった。
【0057】(実施例8) 補体依存性細胞障害作用へ
の影響 ヒト補体系による細胞障害作用に感受性を示すCHO細
胞を用いて、本発明の蛋白質の細胞障害保護効果につい
て検討した。CHO−K1細胞(ATCC CCL6
1)を10%ウシ血清(セルカルチャーラボラトリーズ
社)含有ハムF−12培地(日水製薬社)を用いて、常
法に従って培養した。1検体約1x106細胞として、
参考例5に示した抗CHO細胞家兎抗血清を加え、0℃
にて15分間処理した。次いで100mM EGTAを
含有するゼラチンベロナール緩衝液(0.145M N
aCl/0.05M バルビタールナトリウム(pH
7.4)/0.1%ゼラチン/100mM EGTA)
にて20%に調製された正常ヒト血清及び本発明の新規
な薬理学的特性を有する蛋白質約400ngを加え、3
7℃にて1時間放置した。その検体にさらに抗ヒトiC
3bマウスモノクローナル抗体を加え、0℃で45分間
処理し、さらにFITC標識抗マウスIgGヤギ抗体
(カッペル社)及びヨウ化プロピジウムを加え、0℃で
30分間処理した。なお、抗ヒトiC3bマウスモノク
ローナル抗体はニューヨーク大学の飯田恭子博士より供
与されたもの(Immunology 62 413−
417,1987)を用いた。このような処理を施した
検体中の生細胞数、死細胞数及び蛍光強度(CHO細胞
へのC3b沈着量に比例)を蛍光活性セルソーター(E
PICS ProfileII,コールター社)を用いて
解析した。
【0058】その結果を図7に示す。実験方法は実施例
8に記載した通りである。a)は対照群(MCP非存
在)での生細胞、b)は死細胞である。c)は本発明の
蛋白質存在下での生細胞、d)は死細胞である。各グラ
フの縦軸は細胞数を表す指数、横軸は蛍光強度を示して
いる。これにより、本発明の蛋白質非存在下では死細胞
画分中に多量のiC3b沈着細胞(蛍光強度の強い側の
ピーク)が検出され[図7(b)]、一方、本発明のM
CP分子存在下ではiC3b沈着細胞が激減するととも
に死細胞自体も減少する事[図7(d)]が明かとなっ
た。この結果と実施例7の結果とを併せて考えると、本
発明の蛋白質は、天然型MCPとは異なり、固相上のC
3bも分解することにより細胞に沈着するC3b絶対量
を減少せしめ、その結果として補体系の細胞障害性を抑
制するものと思われた。
【0059】(実施例9) 毒性試験 実施例6で得られた本発明の蛋白質を用いてマウスおよ
びラットにおける毒性試験を実施した。即ち、6〜8週
齢のBalb/c系マウス雌雄各々10匹および同週齢
のWistar系ラット雌雄各々10匹に対して実施例
6で得られた蛋白質を1日1回1週間連日静脈内投与し
た。投与期間中を通して各動物個体の一般性状を観察し
た。本試験では最高投与量群である10mg/Kg群で
も何れの動物においても死亡例は観察されず、一般性状
においても変化はみられなかった。
【0060】(実施例10) 注射用溶液剤の調製 実施例6で得られた本発明の蛋白質100mgを10m
g/mlの水解ゼラチンを含有する生理食塩液100m
lに溶解し、ポアサイズ0.22μmのフィルター(マ
イレックスGV,ミリポア社)を用いて濾過滅菌した。
これを無菌的に10mlずつガラスバイアルに分注後密
栓し、注射用溶液剤とした。
【0061】(実施例11) 注射用凍結乾燥製剤の調
製 実施例6で得られた本発明の蛋白質100mgを100
mg/mlのヒト血清アルブミンを含有する10mM
PBS(pH7.4)100mlに溶解し、ポアサイズ
0.22μmのフィルター(マイレックスGV,ミリポ
ア社)を用いて濾過滅菌した。これを無菌的に3mlず
つガラスバイアルに分注、凍結乾燥後密栓し、注射用凍
結乾燥剤とした。
【0062】参考例1 MCPに対する単クローン性抗
体の調製 基本的にコーラー等(Kohler,G.et al
Nature 256 495−497,1975)
の方法に従ってMCPに対する単クローン性抗体を作製
した。具体的な方法は、Seya,T.et al
Complement Inflamm. 78−
89,1990に報告した。即ち、精製された細胞膜画
分由来天然型MCP(0.5μg/0.5ml PBS
/0.002% NP−40)を0.8mlのフロイン
ド完全アージュバントと充分に混合し、Balb/c系
マウスに皮下投与した。投与は10日間隔で計3回実施
した。最終投与から4日後にマウスの脾臓を摘出し、脾
細胞を単離後、マウス骨髄腫由来細胞株であるNS−1
細胞と常法に従って融合させた。これら融合細胞クロー
ンの培養上清をヒツジ赤血球を用いたプロテインAロゼ
ット形成法にてスクリーニングし、MCPに対する抗体
を産生しているクローンを得た。これらのハイブリドー
マをBalb/c系マウスの腹腔内に移植し、400r
adの放射線を照射した。約10日後にマウスから腹水
を採取した。この腹水に50%飽和となるように硫酸ア
ンモニウムを加え、塩析を実施した。4時間後遠心分離
法により沈澱を回収し、水に溶解した後0.5M Na
Cl/0.02M Tris−HCl(pH8.9)に
対して透析し、抗体粗精製画分とした。予め2MNaC
l/0.1M Glycine/0.02M Tris
−HCl(pH8.9)で平衡化したプロテインAセフ
ァロース(ファルマシア社)カラムに抗体粗精製画分を
付し、平衡化緩衝液にてそのカラムを洗浄後、0.1M
クエン酸(pH6.0)および0.1M クエン酸
(pH3.0)を用いて順次抗体を溶出させた。抗体の
溶出は280nmにおける紫外線(UV280 )の吸収で
モニターした。溶出ピークをプールした後PBSに対し
て透析し、これをMCPに対する単クローン性抗体精製
標品とした。
【0063】(参考例2) 単クローン性抗体をリガン
ドとしたアフィニティー担体の調製 参考例1で得た単クローン性抗体精製標品100mgと
BrCNで活性化されたセファロース4B(ファルマシ
ア社)50mlとを混合し、4℃で緩やかに撹拌しなが
ら一晩放置した。その後1M Tris−HCl(pH
8.5)で洗浄し、0.5M NaCl/20mM 燐
酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した。
【0064】(参考例3) 酵素標識単クローン性抗体
の調製 MCPの酵素免疫測定系を作製するために参考例1で得
た単クローン性抗体を用いて酵素標識抗体を調製した。
まず4mg/mlに調製した西洋わさびパーオキシダー
セ(東洋紡社)水溶液1mlに0.1M NaIO4
0.2mlを加え、混合後25℃で15分間放置した。
これに1.5%エチレングリコール水溶液0.2mlを
加え、混合後25℃でさらに20分間放置した。その後
1mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.4)に対して
3回透析した。これに0.2M炭酸ナトリウム緩衝液
(20xSCB,pH9.5)70μlを加え、直ちに
抗体溶液(予め2xSCBに対して3回透析した後、約
5mg/mlに調製したもの)を添加し、撹拌後25℃
で2時間放置した。次いで1xSCBにて4mg/ml
に調製したNaBH4 溶液0.1mlを加え、4℃にて
さらに2時間放置した。その後76mM PBS(pH
6.4)に対して3回透析し、酵素標識抗体標品とし
た。
【0065】(参考例4) MCPの酵素免疫測定法 96穴マルチタイターイムノプレート(ヌンク社)の各
ウェルに一次抗体として5μg/mlの参考例1で得た
モノクローナル抗体のうちの一種を0.1mlずつ分注
し、4℃にて一晩放置した。各ウェルをイオン交換水
0.3mlにて5回洗浄した後、10%ウシ血清アルブ
ミン含有PBSと等量混合した検体或いは標準物質を
0.1mlずつ加え、室温にて2時間放置した。0.0
05%Tween20含有生理食塩液(洗浄液)0.3
mlを用いて各ウェルを5回洗浄した後、さらにイオン
交換水0.3mlで1回洗浄した。二次抗体として参考
例3で得た西洋わさびパーオキシダーゼ標識モノクロー
ナル抗体(0.5μg/ml)と10%ウシ血清アルブ
ミン含有PBSとの等量混合液を0.1mlずつ各ウェ
ルに加え、室温にて2時間放置した。洗浄液0.3ml
で5回、イオン交換水0.3mlで1回各ウェルを洗浄
した後、発色液(オルトフェニレンジアミン45mgお
よび1%H22 400μlを燐酸ナトリウム−クエン
酸緩衝液(pH5.0)で15mlに溶解したもの)
0.1mlを加え、室温にて15分間放置した。その後
反応停止液(1N H2 SO4 )0.1mlを加え撹拌
後、反応液の490nmにおける吸光度(OD490 )を
マイクロプレートリーダー(ETY−96A型,東洋測
器社)で測定した。標準物質のOD490 から得た検量線
より検体中のMCP量を算出した。
【0066】(参考例5) 抗CHO細胞家兎抗血清の
調製 常法通りに培養されたCHO−K1細胞をPBSにて充
分に洗浄した後、約1x107 細胞/mlとなるように
細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液約2mlを日本
在来白色種家兎に動脈内投与した。週1度のこの投与を
5回繰り返し、最終投与から1週間後に家兎血液を耳動
脈より採取した。血清を分離後、参考例1と同様に塩析
を実施した。沈澱を回収し、適当量の水に溶解した後、
PBSに対して透析した。これを抗CHO細胞家兎抗血
清標品とした。
【0067】
【発明の効果】本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋
白質は、固相上のC3bに対しても液相中のC3bに対
する場合と同様にI因子のコファクターとしての作用を
有する、新規な薬理特性を有する蛋白質を提供するもの
である。
【0068】これは、補体系が障害作用を示す実際の場
合、すなわち、固相基質(細胞膜)に吸着した補体系成
分の作用を抑制しうる新規な蛋白質である。また、本発
明は同時に該蛋白質をコードするDNA、該蛋白質を含
有する医薬組成物をも提供する。
【0069】従って、本発明は、補体系が自己細胞に対
して障害的に作用する疾患、腎炎、肝炎、血管炎、喘
息、自己免疫疾患、虚血性臓器障害、再灌流障害、関節
リウマチ、移植組織片拒絶、ショック、多臓器不全およ
び播種性血管内凝固症等の治療に新しい道を開くもので
ある。
【0070】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:279 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列 Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly Pro Arg Pro Thr 245 250 255 Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu 260 265 270 Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp 275 279
【0071】配列番号:2 配列の長さ:251 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列 Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys 245 250 251
【0072】配列番号:3 配列の長さ:840 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号:mat peptide 存在位置:1..840 特徴を決定した方法:S 配列 TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840
【0073】配列番号:4 配列の長さ:756 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号:mat peptide 存在位置:1..756 特徴を決定した方法:S 配列 TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756
【図面の簡単な説明】
【図1】 ヒトMCPの6種のイソ体の構造を示す図で
ある。
【図2】 pUC19−sMCP(C)の構築方法を示
す略図である。
【図3】 pUC19−sMCP(D)の構築方法を示
す略図である。
【図4】 pUC19−sMCP1234の構築方法を
示す略図である。
【図5】 COSI発現用プラスミドの構築方法を示す
略図である。
【図6】 コファクター活性を表す、SDS−PAGE
のバンドパターンを示した図である。
【図7】 補体依存性細胞障害作用への影響を表す、細
胞数を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 37/02 ACB ACD ACS ACV C12N 15/12 ZNA // C12P 21/02 C 8214−4B (C12P 21/02 C12R 1:91)

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】天然型メンブレンコファクタープロテイン
    (Membrane Cofactor Protei
    n, MCP)の少なくとも膜貫通領域および細胞質内
    領域が欠如していることを特徴とする新規な薬理学的特
    性を有する蛋白質。
  2. 【請求項2】下記式1に示したアミノ酸配列の少なくと
    も一部を有することを特徴とする請求項1に記載の新規
    な薬理学的特性を有する蛋白質。 (式1) Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly Pro Arg Pro Thr 245 250 255 Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu 260 265 270 Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp 275 279
  3. 【請求項3】前記式1または下記式2に示したアミノ酸
    配列を有することを特徴とする請求項1に記載の新規な
    薬理学的特性を有する蛋白質。 (式2) Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys 245 250 251
  4. 【請求項4】前記式1または2に示したアミノ酸配列で
    示される請求項1に記載の新規な薬理学的特性を有する
    蛋白質。
  5. 【請求項5】固相上のC3bに対するI因子のコファク
    ターとしての作用を有することを特徴とする請求項1な
    いし4いずれかに記載の新規な薬理学的特性を有する蛋
    白質。
  6. 【請求項6】ヒト以外の細胞によって産生された請求項
    1ないし5いずれかに記載の新規な薬理学的特性を有す
    る蛋白質。
  7. 【請求項7】前記ヒト以外の細胞が大腸菌である請求項
    6に記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
  8. 【請求項8】前記培養細胞が哺乳動物培養細胞である請
    求項6に記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
  9. 【請求項9】下記式3に示した塩基配列を有するDNA
    の少なくとも一部を用いて産生された請求項6ないし8
    いずれかに記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。 (式3) TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840
  10. 【請求項10】請求項1ないし8いずれかに記載の新規
    な薬理学的特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を
    有するDNA。
  11. 【請求項11】前記式3に示した塩基配列の少なくとも
    一部を有する請求項10に記載のDNA。
  12. 【請求項12】前記式3に示した塩基配列を有するDN
    A。
  13. 【請求項13】下記式4に示した塩基配列を有するDN
    A。 (式4) TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756
  14. 【請求項14】請求項1ないし9いずれかに記載の新規
    な薬理学的特性を有する蛋白質を少なくとも1つの有効
    成分として含有することを特徴とする、補体系が自己細
    胞に対して障害的に作用する疾患に用いるための医薬組
    成物。
  15. 【請求項15】前記疾患が、腎炎、肝炎、血管炎、喘
    息、自己免疫疾患、虚血性臓器障害、再灌流障害、関節
    リウマチ、移植組織片拒絶、ショック、多臓器不全およ
    び播種性血管内凝固症からなる群より選ばれる少なくと
    も1つの疾患である請求項14に記載の医薬組成物。
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