JPH05271288A

JPH05271288A - 新規な薬理学的特性を有する蛋白質

Info

Publication number: JPH05271288A
Application number: JP4035445A
Authority: JP
Inventors: Tsukasa Seya; 谷司瀬; Toshiyuki Kanamori; 森利至金; Atsushi Arai; 居淳新
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-02-21
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 1993-10-19
Also published as: EP0581967A1; EP0581967A4; WO1993017122A1

Abstract

(57)【要約】【目的】天然型メンブレンコファクタープロテインと同
じアミノ酸配列構造を一部に有し、補体系が自己細胞に
対して障害的に作用する疾患に有効な、新規な薬理学的
特性を有する蛋白質の提供。【構成】本発明の蛋白質は天然型メンブレンコファクタ
ープロテイン（ＭｅｍｂｒａｎｅＣｏｆａｃｔｏｒ
Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＣＰ）の少なくとも膜貫通領域お
よび細胞質内領域が欠如していることを特徴とする新規
な薬理学的特性を有する蛋白質であり、液相中のＣ３ｂ
に対するコファクター活性と同様に、固相中のＣ３ｂに
対してもＩ因子のコファクター活性を有することを特徴
とする新規な薬理学的特性を有する蛋白質である。ま
た、さらに本発明は、それらをコードする塩基配列を有
するＤＮＡ、および、該蛋白質を少なくとも１つの有効
成分として含有する医薬組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、天然型メンブレンコフ
ァクタープロテイン（ＭｅｍｂｒａｎｅＣｏｆａｃｔ
ｏｒＰｒｏｔｅｉｎ、以下ＭＣＰと記す）と同じアミ
ノ酸配列構造を一部に有し、活性化された補体系が自己
細胞や組織に対して障害的に作用することを特徴とする
疾患に有効な生理活性蛋白質に関する。詳しくは、補体
系活性化に重要な補体第３成分の活性化断片であるＣ３
ｂをＩ因子が不活化する際に必要なコファクター（ｃｏ
ｆａｃｔｏｒ、補因子）としての新規な薬理学的特性を
有する蛋白質に関する。また、その新規な薬理学的特性
を有する蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
この蛋白質を有効成分として含有する上記疾患に用いる
ための医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】補体系は血中に存在する約２０種類の蛋
白質成分から構成される生体防御系で、１８８０年代末
に、５５℃に加熱すると失活する溶菌性の物質として血
漿中に発見された。その後の研究によってこの補体系を
構成する各種蛋白質成分の単離、同定が為され、この系
は二つの異なった活性化の出発点を有するカスケード反
応（古典経路と第二経路）を形成していることが明かと
なった。古典経路は、主として抗原抗体複合体によって
活性化され、第二経路は、主として生体内に侵入した異
物（微生物等）により活性化される。また、両経路とも
最終的に標的細胞を溶解するように各成分が順次カスケ
ードに沿って反応するが、この系での重要なカスケード
産物である補体第３成分（以下Ｃ３と記す）転換酵素複
合体と、補体第５成分（以下Ｃ５と記す）転換酵素複合
体の形成機転が二つの経路で異なっている。即ち、古典
経路のＣ３転換酵素複合体は、補体第４成分（以下Ｃ４
と記す）と補体第２成分（以下Ｃ２と記す）の反応複合
体として細胞膜等に結合したＣ４ｂ２ａであり、Ｃ５転
換酵素複合体は、Ｃ３転換酵素複合体とＣ３との反応複
合体であるＣ４ｂ２ａ３ｂである。

【０００３】一方、第二経路でのＣ３転換酵素複合体
は、Ｃ３とＢ因子の反応複合体として細胞膜等に結合し
たＣ３ｂＢｂであり、Ｃ５転換酵素複合体は、Ｃ３転換
酵素複合体であるＣ３ｂＢｂとＣ３との反応複合体であ
るＣ３ｂＢｂ３ｂである。

【０００４】両経路において、Ｃ５転換酵素複合体によ
って活性化されたＣ５（Ｃ５ｂ）は、Ｃ５〜Ｃ９と順次
反応して最終的に膜侵襲複合体（ＭｅｍｂｒａｎｅＡ
ｔｔａｃｋＣｏｍｐｌｅｘ，以下、ＭＡＣと記す）を
形成して細胞溶解を引き起こす。また、補体系のカスケ
ード産物の中には、直接的な細胞障害作用以外に種々の
生理活性を有するものが知られている。特にＣ３の活性
化産物のひとつであるＣ３ａおよびＣ５の活性化産物の
ひとつであるＣ５ａは別名アナフィラトキシン（ａｎａ
ｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ）とも呼ばれ、肥満細胞からのヒ
スタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎ）の遊離作用や白血球に対
する走化作用を示すことが知られている。これらは血管
の透過性を亢進させ、補体系が活性化されている箇所に
白血球を呼び寄せるように作用していると考えられ、免
疫複合体や溶解した細胞断片の貪食等による処理に対し
て合理的なものであろう。

【０００５】このように細菌や異種細胞に対する補体系
の細胞溶解作用機序が明らかになる一方で、補体系は何
故自己細胞に対しては障害作用を示さないのかという疑
問が生じてきた。その疑問に対する解答の一つとして、
近年になって細胞膜上に自己の補体系の作用を抑制する
分子群が存在することが明かとなった。中でも補体系カ
スケード反応中で重要な位置にあるＣ３ｂに結合する三
種の細胞膜蛋白質の発見は、自己細胞に対する補体系の
作用を理解する上で画期的な出来事であった。即ち、補
体受容体１（ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＲｅｃｅｐｔｏｒ
１，以下、ＣＲ１と記す）、崩壊促進因子（Ｄｅｃａ
ｙ−ＡｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ，以下Ｄ
ＡＦと記す）、およびメンブレンコファクタープロテイ
ン（ＭｅｍｂｒａｎｅＣｏｆａｃｔｏｒＰｒｏｔｅ
ｉｎ、ＭＣＰ）が次々と発見され、その遺伝子がクロー
ニングされ、それぞれの作用特性、補体系制御機序につ
いても種々の検討が為されるに至った。

【０００６】ＣＲ１は、１）血漿中のＩ因子のコファク
ターとしてＣ３ｂをｉＣ３ｂという不活性型に変換する
作用（不可逆的蛋白分解作用）と、２）Ｃ３転換酵素複
合体の解離を強力に促進する作用（可逆的複合体解離作
用）とを併せ持つ分子量約２００ｋｄの細胞膜蛋白質と
して１９８０年に同定された（Ｆｅａｒｏｎ，ＤＴ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２２０−３０，１９８
０）。その遺伝子は１９８７年にクローニングされ、そ
の塩基配列からの解析によると、ＣＲ１は約６０アミノ
酸からなる繰り返し構造（ＳｈｏｒｔＣｏｎｃｅｎｓ
ｕｓＲｅｐｅａｔ，以下ＳＣＲと記す）７つを１ユニ
ットとして、計４ユニットから構成されている膜貫通型
の糖蛋白質である（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ，ＬＢ．ｅ
ｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５１０９５−
１１１２，１９８７）。

【０００７】ＤＡＦは、Ｃ３およびＣ５転換酵素複合体
の解離を強力に促進する作用（可逆的複合体解離作用）
を有する物質としてヒト赤血球より単離された分子量約
７０ｋｄの糖蛋白質である（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗｅ
ｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１２９１８４−１８９，１９８２）。その遺伝子も
１９８７年にクローニングされ、その解析によりＤＡＦ
も約６０アミノ酸からなる繰り返し構造を４個持つこと
が明かとなった（Ｃａｒａｓ，ＩＷ．ｅｔａｌ．Ｎ
ａｔｕｒｅ３２５５４５−５４９，１９８７およ
びＭｅｄｏｆ，ＭＥ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４２００７−２
０１１，１９８７）。

【０００８】ＭＣＰはこれら三種の中で最も新たにクロ
ーニングされた分子量４５〜７０ｋｄの膜糖蛋白である
（Ｌｕｂｌｉｎ，ＤＭ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１６８１８１−１９４，１９８８）。ＭＣ
Ｐも約６０アミノ酸からなる繰り返し構造を４個有して
おり、これはＤＡＦの構造に類似しているが、ＭＣＰは
Ｉ因子のコファクターとしての活性（不可逆的Ｃ３ｂ不
活化作用）を示すのみで、崩壊促進作用は持たない（Ｓ
ｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１６３８３７−８５５，１９８６）。ヒトＭＣＰはそ
のｍＲＮＡのスプライシング様式の相違によって、少な
くとも６種のイソ体が存在する（国際公開番号ＷＯ９
１／０２００２およびＰｏｓｔ，ＴＷ．ｅｔａ
ｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４９３−１０２，
１９９１）。

【０００９】さらに興味深いことにＭＣＰは、そのＭＣ
Ｐを有している細胞上に存在するＣ３ｂに対しては作用
するが、他細胞上のＣ３ｂには作用しないこと、および
細胞膜から抽出単離された天然型ＭＣＰは、液相中のＣ
３ｂあるいは可溶化された基質に結合したＣ３ｂには作
用するが、不溶性基質に結合したＣ３ｂにはほとんど作
用しないことが明かとなっている（瀬谷司日本臨床
４６（９）別冊１９３３−１９３７，１９８８．
Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
２６４５８１−５８８，１９８９．および国際公
開番号ＷＯ９１／０２００２）。

【００１０】以上のように細胞膜上に存在する補体系制
御蛋白質の実態が明らかになるに伴って、それを疾患の
治療剤として応用する試みが為されるようになった。従
来より種々の疾患に於いて、補体系の活性化による血中
総補体価の低下や炎症組織への補体成分の沈着が認めら
れている（典型的な例としては、腎炎、血管炎、ＳＬＥ
等が挙げられよう）。従って、このような疾患状態では
補体系が自己細胞に対して障害的に作用していることが
予想され、補体制御蛋白質はこのような病態を治療する
のに有効な薬物となると考えられる。

【００１１】ＣＲ１に関しては、遺伝子工学的に産生さ
れた可溶型ＣＲ１を用いて、虚血後心筋壊死モデル（Ｗ
ｅｉｓｍａｎ，ＨＦ．ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９１４６−１５１，１９９０）、逆受身アルサス
反応モデル（Ｙｅｈ，ＣＧ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４６２５０−２５６，１９９１）、移
植組織片超急性拒絶反応モデル（Ｐｒｕｉｔｔ，ＳＫ．
ｅｔａｌ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５０３５
０−３５５，１９９１）に対する有効性が検討されてお
り、いずれの場合も可溶型ＣＲ１がモデル病態に対して
抑制的に作用したことが報告されている。

【００１２】ＤＡＦについては、発作性夜間ヘモグロビ
ン尿症患者赤血球（当該患者の赤血球膜上にはＤＡＦが
欠損しており、自己の補体系によって溶血を起こすこと
が知られている）を用いてその治療効果が検討された
（Ｍｅｄｏｆ，ＭＥ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２２９８０−２９
８４，１９８５）。しかしながら、本検討ではこの病態
を完全には回復することができなかったことが報告され
ている。

【００１３】以上のように補体系制御蛋白質の医療用治
療剤としての応用が有望視され始めてはいるが、実際に
それらを医療現場に提供するには、いくつかの克服すべ
き重要な問題が存在している。即ち、ＣＲ１は種々の病
態モデルでその有効性が確認されており、医療用治療剤
として最も有望であろうと思われるが、分子量が約２０
０Ｋｄと巨大であり、一般的にはその生産や精製工程で
の取り扱いが容易ではない。ＤＡＦは前記のようにその
治療剤としての効果が期待通りではない。

【００１４】ＭＣＰについては、その有効性に関する具
体的な報告は現時点では無いが、ＭＣＰは固相基質（不
溶性基質）に吸着したＣ３ｂには作用しないことが明か
となっている。（瀬谷司日本臨床４６（９）別冊
１９３３−１９３７，１９８８；Ｓｅｙａ，Ｔ．
ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６４５８１
−５８８，１９８９；および国際公開番号ＷＯ９１
／０２００２）。すなわち補体系が細胞に障害的に作用
する場が細胞膜上であることと、外因的に用いられた天
然型ＭＣＰの持つ作用特性である固相基質あるいは他の
細胞上に吸着したＣ３ｂには作用せず、液相においての
みＩ因子のコファクターとして作用するという事実とを
併せて考えると、ＭＣＰの有効性は従来技術において、
あまり期待できない。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、補体系が自
己細胞や組織に対して障害的に作用してしまうような疾
患に用いるための医薬組成物を医療現場に提供するため
に、生産や精製工程での取り扱いが容易な比較的低分子
量であり、かつ、補体系が障害作用を示す実際の場、即
ち、固相基質（細胞膜）に吸着した補体系成分の作用を
抑制するような新規な薬理学的特性を有する蛋白質を創
造することを目的とする。

【００１６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
現在知られている天然型ＭＣＰ分子中にはそれが外因的
に用いられた場合固相上のＣ３ｂに作用することを阻害
するような部位が存在していると推定し、その阻害部位
を欠如させることにより、固相でのＣ３ｂにも作用する
という重要な薬理学的特性を付加できるであろうと考え
た。そしてこのような新しい着想に基づき鋭意研究を重
ねた結果、本発明者らは新規な薬理学的特性を有する蛋
白質の創造に成功し、それを基に本発明を完成させた。

【００１７】すなわち、本発明の第１態様は、天然型メ
ンブレンコファクタープロテイン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ
ＣｏｆａｃｔｏｒＰｒｏｔｅｉｎ，ＭＣＰ）の少な
くとも膜貫通領域および細胞質内領域が欠如しているこ
とを特徴とする新規な薬理学的特性を有する蛋白質を提
供する。

【００１８】さらに、本発明の第１態様は、下記式１に
示したアミノ酸配列の少なくとも一部を有するものであ
る場合好適である。

【００１９】本発明の第２態様は、本発明の第１態様の
新規な薬理学的特性を有する蛋白質をコードする塩基配
列を有するＤＮＡを提供する。

【００２０】本発明の第３態様は、本発明の第１態様の
新規な薬理学的特性を有する蛋白質を、少なくとも１つ
の有効成分として含有することを特徴とする、補体系が
自己細胞に対して障害的に作用する疾患に用いるための
医薬組成物である。

【００２１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明第
１態様の蛋白質は、天然型メンブレンコファクタープロ
テイン（ＭｅｍｂｒａｎｅＣｏｆａｃｔｏｒＰｒｏ
ｔｅｉｎ，ＭＣＰ）の少なくとも膜貫通領域および細
胞質内領域が欠如していることを特徴とする新規な薬理
学的特性を有する蛋白質である。

【００２２】図１は国際公開番号ＷＯ９１／０２００２
の図３を引用したものであり、ｃＤＮＡより与えられた
６種のＭＣＰのイソ体の構造を表わしている。図１中の
４ＳＣＲｓは、４つのＳＣＲ領域、ＳＴ（ＳＴ^A 、ＳＴ
^B およびＳＴ^C ）は富セリン−スレオニン領域（Ｓｅｒ
ｉｎｅ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｒｉｃｈｒｅａｇｉｏ
ｎ）、ＵＫはその配列の機能が未知であるＵＫ領域（ｕ
ｎｋｎｏｗｎ）、ＨＹは疎水性領域（ｈｙｄｒｏｐｈｏ
ｂｉｃｒｅａｇｉｏｎ）、ＣＹＴ（ＣＹＴ¹およびＣ
ＹＴ² ）は細胞質内領域（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔ
ａｉｌｒｅａｇｉｏｎ）を表わしている。前記天然型
ＭＣＰの膜貫通領域とは、通常、細胞膜上に膜を貫通し
た形で存在する天然型ＭＣＰが、膜を貫通している領域
をさし、それは図１にＨＹとして表記されている部分を
さす。また細胞質内領域とは図１中でＣＹＴ¹ あるいは
ＣＹＴ² と表記されている部分をさす。アミノ酸配列上
において例示すると、国際公開番号ＷＯ９１／０２００
２の図１中のアミノ酸番号２９５〜３１７が膜貫通領域
で３１８〜３５０が細胞質内領域である。

【００２３】本発明第１態様の少なくとも膜貫通領域お
よび細胞質内領域が欠如している蛋白質は、図１のＭＣ
Ｐクローン中のＳＴ（ＳＴ^A 、ＳＴ^B 、ＳＴ^C ）および
ＵＫに相当する蛋白質上の領域部分、または、それら領
域部分の両端の境界の任意の点から、Ｃ末端側のアミノ
酸配列を欠如された蛋白質である。具体的には、［４Ｓ
ＣＲｓ−ＳＴ^C −ＵＫ］構造の蛋白質、［４ＳＣＲｓ−
ＳＴ^A −ＳＴ^B −ＳＴ ^C ］構造の蛋白質、［４ＳＣＲｓ
−ＳＴ^C ］構造の蛋白質、［４ＳＣＲｓ］構造の蛋白質
等が挙げられる。図１に示される様に、ＭＣＰにはその
ｍＲＮＡのスプライシング様式の相違によって少なくと
も６種のイソ体が存在することが明かとなっている（国
際公開番号ＷＯ９１／０２００２およびＰｏｓ
ｔ，ＴＷ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７
４９３−１０２，１９９１）。本発明の、新しい着想
に基づき創造された新規な活性を有する蛋白質の中で、
下記式１（配列番号１）に示したものは国際公開番号Ｗ
Ｏ９１／０２００２明細書、図１中のアミノ酸番号−３
４〜−１、２５２〜２６６および２９５以降を欠如させ
たものであり、式記式２（配列番号２）に示したものは
国際公開番号ＷＯ９１／０２００２明細書、図１中のア
ミノ酸番号−３４〜−１および２５２以降を欠如させた
ものである。

【００２４】また、さらに、本発明の蛋白質は、下記式
１に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を有する場
合、下記式１または２に表されるアミノ酸配列を有する
場合、さらには、下記式１または２で示される場合が好
適である。

【００２５】（式１） Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly Pro Arg Pro Thr 245 250 255 Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu 260 265 270 Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp 275 279

【００２６】（式２） Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys 245 250 251

【００２７】また、本発明の第１態様である新規な薬理
学的特性を有する蛋白質は、従来知られていたＭＣＰと
は大きく異なり、液相中のＣ３ｂに対する場合と同様に
従来ならば作用を示さない固相上のＣ３ｂに対するＩ因
子のコファクターとしての作用を有することを特徴とす
る新規な薬理学的特性を有する蛋白質である場合が好ま
しい。Ｉ因子のコファクターとしての作用とは、補体系
においてＣ３ｂが不活化する、すなわち、Ｃ３ｂからｉ
Ｃ３ｂへの変換反応における、Ｉ因子の補因子としての
活性作用であり、より具体的には、外因的に補充された
本発明の蛋白質が補体系制御因子の１つであるＩ因子の
補因子として作用し、結果として補体系成分Ｃ３ｂを不
可逆的に分解しそのＣ３ｂとしての作用を抑制あるいは
消失せしめることをさす。

【００２８】この現象は当該技術分野の一般的常識を覆
すものであり、未だかつて何人も推定し得なかったこと
である。事実、国際公開番号ＷＯ９１／０２００２明細
書中で、その発明者は可溶型ＭＣＰを創造してはいる
が、このような新規な薬理学的特性を認識あるいは推定
するには至っておらず、逆に可溶型ＭＣＰは固相上のＣ
３ｂに対してはＩ因子のコファクターとしての作用が無
い旨の開示をしている。従って、本発明の明細書に開示
されるＭＣＰは、国際公開番号ＷＯ９１／０２００２に
開示されたものとは異なるのみならず、発明として一線
を画すものである。

【００２９】固相上のＣ３ｂとは、活性化された補体系
成分Ｃ３ｂが生体組織や細胞あるいは生体を構成する有
形成分さらには生体内に人為的に設置された人工有形物
等に共有結合または非共有結合を介して結合している状
態を指し、例えば細胞膜などの固相または不溶性基質に
吸着または結合した状態で存在するＣ３ｂ等がある。ま
た、液相中のＣ３ｂとは、例えば生体液や各種溶液中に
遊離した状態で存在するＣ３ｂまたは可溶化された基質
に結合したＣ３ｂ等である。

【００３０】本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白
質は、既知であるＭＣＰから固相上のＣ３ｂへの作用に
対して障害となる、ＭＣＰ中の一部を除くという新たな
着想に基づき創造されたもので、固相上のＣ３ｂに対し
て、液相中のＣ３ｂに対するコファクター活性と同様に
作用を示すものであれば如何なるものでもよい。本発明
の蛋白質の基本的な性質（物性、活性等）、特に、固相
上のＣ３ｂに対する作用の有無を変化させることなく、
そのアミノ酸配列に欠失、付加あるいは置換といった変
異を導入することができる。例えば、疎水性アミノ酸残
基の他の疎水性アミノ酸残基への置換、陽性電荷を持つ
アミノ酸の他の陽性電荷を持つアミノ酸への置換、Ｇｌ
ｕとＡｓｐあるいはＬｙｓとＨｉｓとＡｒｇでの相互置
換、またはＩｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｌｅｕの群間、Ｇ
ｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｃｙｓの群間、およびＴｒｐ，
Ｔｙｒ，Ｐｈｅの群間での置換は推定できる。従って、
前記式１または２で示されたアミノ酸配列そのもので規
定される蛋白質、もしくは上記式１または２で示された
アミノ酸配列を少なくとも有する蛋白質の、Ｎ末端およ
び／またはＣ末端および／または内部において、一つ以
上のアミノ酸の置換、欠失、付加等が生じてなる変異体
も、本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白質の上記
の基本的な性質が認められるかぎり、本発明の蛋白質に
包含される。加えて、該変異体に、糖付加アルキル化、
酸化、還元、水解等、種々の化学修飾を施してなる物
質、あるいは薬理学上許容されうる酸または塩基との塩
を形成させてなる物質等も、もちろん、本発明の新規な
薬理学的特性を有する蛋白質に包含される。

【００３１】また、本発明第１態様の新規な薬理学的特
性を有する蛋白質は、メリフィールド法のような標準的
なポリペプチド合成法により、あるいは本発明の蛋白質
分子を含有する天然物ＭＣＰから得られたものであって
もよいが、好ましくは、後記する本発明の第２態様のＤ
ＮＡ等を用いて遺伝子工学的手法により、培養細胞によ
って産生されたものがよい。また、培養細胞が、大腸菌
および哺乳動物培養細胞である場合、より好ましい。若
しくは、国際公開番号ＷＯ９１／０２００２明細書中で
開示されているＭＣＰの塩基配列より固相上のＣ３ｂへ
の作用に阻害的な部位に相当する塩基配列を欠失させた
塩基配列すなわち、下記式３（配列番号３）の塩基配列
を有するＤＮＡの少なくとも一部を用いることによっ
て、遺伝子工学的に得られたものであってもよい。

【００３２】（式３） TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840

【００３３】本発明の蛋白質を遺伝子工学的に得るに
は、一般的に使用されている宿主−ベクター系を用いる
ことができる。例えば宿主として大腸菌を用いる場合
は、プロモーターとしてＬａｃＵＶ５、トリプトファン
プロモーターやλＰ_L プロモーター等が使用可能であ
る。また、λファージ系のベクターであるλｇｔ１１を
用いて、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質として得
ることもできる。

【００３４】さらに、哺乳動物培養細胞を宿主として使
用する場合は、サル由来ＣＯＳ細胞、チャイニーズハム
スター由来ＣＨＯ細胞、マウス由来３Ｔ３細胞あるいは
ヒト由来線維芽細胞等が好適である。これらを宿主とす
る場合には、プロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモ
ーター、アデノウイルス主要後期プロモーターあるいは
β−アクチンプロモーターやポリペプチド鎖伸長因子プ
ロモーター等が使用できる。これらの宿主−ベクター系
を用いた場合、各々の宿主が好適に増殖し得る条件下で
培養し、かつ、各々のプロモーターが機能するような条
件を与えることによって、本発明の新規な薬理学的特性
を有する蛋白質を得ることができる。

【００３５】本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋白
質は、精製された蛋白質である場合がより好ましいが、
特にこれに限定されるものではない。得られた新規な活
性を有する蛋白質は、現在一般的に用いられている蛋白
性物質の精製法を用いて精製することができる。例え
ば、塩析、酸・アルカリ沈澱法、限外濾過法、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、クロマト
フォーカシング、電気泳動法等を適宜組み合わせること
によって実施できる。例えば、本発明の蛋白質を含有す
る溶液を０．０２ＭＮａＣｌ／１０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に対して透析した後、イオン交換クロマ
トグラフィーに付し、ＮａＣｌの直線濃度勾配によって
溶出する。活性画分を集め、更にモノクローナル抗体を
用いたアフィニティークロマトグラフィーに付す。これ
をグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
２．５）で溶出し、活性画分を得ればよい。あるいは、
ＭＣＰを精製する公知の方法（Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３８３７−８５
５，１９８６）に従って実施してもよい。ＭＣＰの活性
は、Ｉ因子存在下でのＣ３ｂの不活化、即ち、Ｃ３ｂか
らｉＣ３ｂへの変換を確認すればよい。例えば、瀬谷ら
の方法（Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ１１９１８９−１９６，１９８２）
に従って蛍光標識したＣ３ｂを作製し、これを基質とし
てＩ因子存在下でＭＣＰ分子を添加する。反応終了後、
β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ
ｎｏｌ）等で還元し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと記
す）に付す。そのゲルをフルオロメーターで走査するこ
とにより、Ｃ３ｂからｉＣ３ｂへの変換の状態をその分
子量の相違から確認すればよい。

【００３６】本発明の第２態様は、本発明の第１態様の
新規な薬理学的特性を有する蛋白質をコードする塩基配
列を有するＤＮＡを提供する。本発明第２態様のＤＮＡ
は下記式３（配列番号３）に示した塩基配列の少なくと
も一部を有する場合、下記式３または下記式４（配列番
号４）で示した塩基配列を有する場合好適であり、さら
には下記式３または４で示した塩基配列で規定される場
合より好適である。

【００３７】（式３） TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840

【００３８】（式４） TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756

【００３９】式３に示したものは国際公開番号ＷＯ９１
／０２００２明細書図３、すなわち本願図１のクローン
Ｈ２−１５のシグナルペプチド領域（ＳＰ）、疎水性領
域（ＨＹ）および細胞質内領域ＣＹＴ² を欠如させたも
のに相当する。式４に示したものは、天然型ＭＣＰの４
つのＳＣＲ部分（４ＳＣＲｓ）に相当する。

【００４０】本発明のＤＮＡは、天然ＭＣＰ由来のシグ
ナルペプチド等に相当する塩基配列をさらに、有してい
てもよい。本発明第２態様のＤＮＡは、その全てを一般
的なＤＮＡ合成法によって得られたものでもよく、ま
た、部位特異的塩基配列変異法によって公知のＭＣＰ遺
伝子の適当な部位に翻訳停止コドンを導入することによ
っても得られたものであってもよい。好ましくはＭＣＰ
をコードするｍＲＮＡをクローニングするための公知の
方法（Ｌｕｂｌｉｎ，ＤＭ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６８１８１−１９４，１９８８）に従
ってそのｃＤＮＡを得た後、そのｃＤＮＡを用いて遺伝
子工学的手法により不用な部分を削除および再構成する
ことによって得られたものがよい。

【００４１】例えば、図１のクローンＨ２−１４あるい
はＨ２−１５をテンプレートとして、その疎水性領域直
前に翻訳停止コドンを有するような部分ミスマッチプラ
イマーを用いて遺伝子連鎖増幅法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，以下ＰＣＲと記
す）により人工的に翻訳停止コドンを付加したＣ末端遺
伝子部分を得る。これを適当な制限酵素で切断し、同様
に制限酵素処理したＮ末端領域遺伝子と結合させればよ
い。

【００４２】また、本発明の第２態様のＤＮＡは第１態
様のＭＣＰをコードし適当な条件下で、発現し得るよう
なＤＮＡであれば如何なる塩基配列を有するＤＮＡでも
良く、さらには、前記式３または前記式４で示された塩
基配列に規定されるＤＮＡであっても、該塩基配列に加
え、その５´末端および／または３´末端および／また
はその中間部に任意の１つ以上の塩基が付加または置換
されたものであってもよい。当該技術分野では、遺伝暗
号の縮重に伴い、それがコードする蛋白質のアミノ酸配
列を変化させることなく遺伝子の塩基配列を置換するこ
とができる。即ち、ほとんどのアミノ酸は複数個の遺伝
暗号でコードされており、例えば、ＶａｌはＧＴＴ，Ｇ
ＴＡ，ＧＴＣ，ＧＴＧの何れかでコードされ、Ａｌａは
ＧＣＡ，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＧの何れかでコードされ
る。従って、本発明の第２態様のＤＮＡはそのコードす
るアミノ酸配列に変化を与えない限り、その塩基配列の
１つ以上の塩基が他の塩基に置換された変異体をも包含
する。なお、配列番号３および４に示した塩基配列を有
するＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＭ８５２、ｐＭ８
５３）により形質転換された大腸菌株［ＨＢ１０１（ｐ
Ｍ８５１）、ＨＢ１０１（ｐＭ８５２）］は通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている［寄
託番号微工研菌寄第１２７１５号（ＦＥＲＭＰ−１２
７１５）および微工研菌寄第１２７１６号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２７１６）］。

【００４３】さらに本発明の第３態様は、第１態様の新
規な薬理学的特性を有する蛋白質を少なくとも１つの有
効成分として含有することを特徴とする、補体系が自己
細胞に対して障害的に作用する疾患に用いるための医薬
組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、第１態様の
みで構成されていてもよいが、本発明の新規な薬理学的
特性すなわち、固相上のＣ３ｂに作用する活性を損なわ
ない限り、一般的に使用される製剤学的混合物である賦
型剤、安定化剤あるいは溶解補助剤等を含有していても
よい。具体例として、リンガー液、燐酸緩衝液、ヒト血
清アルブミン、水解ゼラチン、蔗糖、デキストラン、ポ
リエチレングリコール等があり、薬剤形態により、適宜
選択使用される。

【００４４】本発明の医薬組成物の投与量は患者の年
齢、体重、性別およびその疾患の種類や程度により適宜
調節されるが、通常は１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、
好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ま
しくは１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇがよい。このよう
な治療の対象となる疾患は、補体系が自己細胞や組織に
対して障害的に作用する疾患であればよいが、なかでも
腎炎、肝炎、血管炎、喘息、自己免疫疾患、虚血性臓器
障害、再潅流障害、関節リウマチ、移植組織片拒絶、シ
ョック、多臓器不全および播種性血管内凝固症である場
合が好ましい。

【００４５】本発明第３態様の医薬組成物を用いた治療
方法は、新規な薬理学的特性を有する本発明の蛋白質
を、その有効量が患部に到達するような方法で投与され
れば如何なるものでもよい。例えば、静脈内、動脈内、
皮下、筋肉内、経口のような全身的投与や、関節腔内、
髄腔内のような局所投与、あるいは鼻腔内、気管内、口
腔内投与のような経粘膜投与、さらには座剤等による腸
管内投与による治療方法が含まれる。

【００４６】

【実施例】以下に本発明を実施例をもってより具体的に
示すが、これは本発明の実施様態の一つの例示であり、
本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例
中の学術用語、略号等は特に断らない限り当該技術分野
で一般的に使用されているものに従った。また、遺伝子
組換えに関わる基本的操作は、マニアチス等（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．）、”モレキュラーク
ローニング、アラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ）” コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９、蛋白質精製
に関わる基本的操作は、日本生化学会編 ”新生化学実
験講座第１巻蛋白質Ｉ分離・精製・性質” 東京化
学同人１９９０をそれぞれ参考として実施した。各
種機器、試薬の使用法は各々附属の使用説明書に従っ
た。

【００４７】（実施例１）ＭＣＰ遺伝子のＣ末端相当
領域の改変１新規な薬理学的特性を有する本発明の新規な薬理学的特
性を有する蛋白質を遺伝子工学的に産生させるために、
プラスミドベクターであるｐＵＣ１９にクローン化され
たＭＣＰ遺伝子（以下クローン名をｐＵＣ１９−ＭＣＰ
（Ｄ）と記す）を改変した。用いたＭＣＰ構造遺伝子は
図１のクローンＨ２−１５に相当し、これはポスト等
（Ｐｏｓｔ，ＴＷ．ｅｔａｌ．）、ジャーナルオ
ブエクスペリメンタルメディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．）、１７４９３−１０２，１９９１の図４に記
載のものと同一である。まずＰＣＲ用のプライマーとし
て以下の２種の一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ合成機（３８１Ａ
型，アプライドバイオシステムズ社）を用いて合成し
た。センスプライマー：５’−ＧＴＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＣＧＡＴＡＡＧＧ−３’ アンチセンスプライマー：５’−ＣＣＧＧＴＡＣＣＣＴ
ＡＴＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣ
−３’ １０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）
／５０ｍＭＫＣｌ／１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ ／０．０
１％ゼラチン溶液１００μｌに、上記２種のプライマー
各々０．８μｇと、テンプレートとしてｐＵＣ１９−Ｍ
ＣＰ（Ｄ）５０ｎｇおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（パーキンエルマーシータス社）２．５単位さらに基質
として２００μＭとなるようにｄＮＴＰ（ＮはＡ，Ｔ，
Ｃ，Ｇの４種を表す）を溶解し、ＰＣＲ用恒温槽（サー
マルサイクラー，パーキンエルマーシータス社）を用い
てＰＣＲ（遺伝子連鎖増幅法）を実施した。操作は、ミ
カエル等（Ｍｉｃｈａｅｌ，ＡＩ．ｅｔａｌ．）”
ＰＣＲプロトコール（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），アガ
イドトゥメソッズアンドアプリケーション（Ａ
ＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ）” アカデミックプレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ），１９９０を参考として実
施した。反応終了後、フェノール／クロロホルム抽出、
エタノール沈澱法により増幅された約１９０ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを得た。これを制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒
造社）およびＢｓｍＩ（ニューイングランドバイオラブ
社）とで二重消化し、同様の制限酵素により消化された
ｐＵＣ１９−ＭＣＰ（Ｄ）由来ラージフラグメントとＤ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社）を用いて結合した。得られた
プラスミドをｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ（Ｃ）と命名した。
実施例１の工程を図２に略記した。

【００４８】（実施例２）ＭＣＰ遺伝子のＮ末端近傍
相当領域の改変遺伝子組換え時の操作性の向上を目的として、ＭＣＰ遺
伝子のＮ末端近傍相当領域の改変を実施した。まず、人
工リンカーを得るために以下の２種の一本鎖ＤＮＡを実
施例１と同様の方法で合成した。合成リンカー（１）アッパーストランド：５’−ＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡ
ＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣ−３’ 合成リンカー（２）ロアーストランド：３’−ＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＴ
ＣＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧ−５’ これをアニールした後、これと、実施例１で得られたｐ
ＵＣ１９−ｓＭＣＰ（Ｃ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒
造社）およびＥｃｏ５２Ｉ（宝酒造社）で二重消化して
得られるラージフラグメントとを実施例１と同様の方法
で結合した。得られたプラスミドをｐＵＣ１９−ｓＭＣ
Ｐ（Ｄ）と命名した。なお、実施例２の工程を図３に略
記した。

【００４９】（実施例３）ＭＣＰ遺伝子のＣ末端相当
領域の改変２実施例２で得られたプラスミドｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ
（Ｄ）を用いて、さらにＣ末端相当領域に改変を有する
ＭＣＰ遺伝子を作製した。まず、以下の２種のプライマ
ーを実施例１と同様の方法で合成した。センスプライマー：５’−ＧＴＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＴ
ＧＣＧＡＴＡＡＧＧ−３’ アンチセンスプライマー：５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴ
ＡＴＣＡＴＴＴＡＡＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧ
−３’ これらを用いて、ｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ（Ｄ）をテンプ
レートとして実施例１と同様の方法でＰＣＲを実施し
た。得られた約１００ｂｐのフラグメントを制限酵素Ｋ
ｐｎＩ（既出）およびＢｓｍＩ（既出）で二重消化し、
これと、同様の制限酵素により消化されたｐＵＣ１９−
ｓＭＣＰ（Ｄ）由来ラージフラグメントとを実施例１と
同様の方法で結合した。得られたプラスミドをｐＵＣ１
９−ｓＭＣＰ１２３４と命名した。なお、実施例３の工
程を図４に略記した。

【００５０】（実施例４）ＣＯＳＩ細胞発現用プラス
ミドの構築哺乳動物培養細胞での強力な発現ベクターとして知られ
ているｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ｅ
ｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１８５３２２，１９９０）の改良型ベクターであるｐ
ＥＦＮ−Ｉを基にＣＯＳＩ細胞発現用プラスミドを構築
した。ｐＥＦＮ−Ｉは、ＳＶ４０の複製開始点（ｏｒ
ｉ）、ヒトポリペプチド鎖伸長因子１αのプロモーター
領域およびＳＶ４０のポリＡ付加シグナル配列を有す
る。実施例２で得られたｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ（Ｄ）あ
るいは実施例３で得られたｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ１２３
４を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、
各々のプラスミドの有するＭＣＰ構造遺伝子断片（スモ
ールフラグメント）を単離した。これらの断片を各々、
同様の制限酵素で二重消化したｐＥＦＮ−Ｉと実施例１
と同様の方法で結合した。得られたプラスミドを各々ｐ
Ｍ８５１およびｐＭ８５２と命名した。なお、実施例４
の工程を図５に略記した。

【００５１】ｐＭ８５１は配列番号３に示される塩基配
列をｐＭ８５２は配列番号４に示される塩基配列を各々
有するプラスミドである。各プラスミドにより形質転換
された大腸菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている［寄託番号微工研菌寄第１２７
１５号（ＦＥＲＭＰ−１２７１５）および微工研菌寄
第１２７１６号（ＦＥＲＭＰ−１２７１６）］。

【００５２】（実施例５）ＣＯＳＩ細胞での発現実施例４で作製したｐＭ８５１およびｐＭ８５２を各々
ＣＯＳＩ細胞へ導入し、本発明の蛋白質を発現させた。
即ち、０．５μｇのｐＭ８５１あるいはｐＭ８５２を５
μｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌと記す）（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸（以下ＥＤＴＡと記す）溶液に溶解し、０．２
ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストランおよび５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含有するダルベッコ
変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥ培地，日水製薬社）７００
μｌを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を
作製した。直径３．５ｃｍの培養プレート内でセミコン
フルエントまで単層培養されたＣＯＳＩ細胞にそのＤＮ
Ａ−ＤＥＡＥデキストラン混合液を滴下し、５％ＣＯ₂
／９５％空気下３７℃にて培養した。４時間後、ＤＮＡ
−ＤＥＡＥデキストラン混合液を除去し、１％ウシ胎児
血清（アーバインサイエンティフィック社）を含有する
Ｄ−ＭＥ培地を添加した。２４時間培養後、培地を血清
不含のＤ−ＭＥ培地に交換し、さらに４８〜９６時間培
養した。この培養上清を回収し、本発明の新規な薬理学
的特性を有する蛋白質の精製に供した。

【００５３】（実施例６）培養上清からの本発明の蛋
白質の精製実施例５で得られた培養上清を０．０５％ノニデットＰ
−４０（以下ＮＰ−４０と記す）含有２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）に対して４℃で一晩透析した。沈澱物
を遠心分離操作により除去し、上清をクロマトフォーカ
シングカラムクロマトグラフィーに供した。即ち、クロ
マトフォーカシングゲル（ファルマシア社）を充填し、
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）／０．０５
％ＮＰ−４０で平衡化したカラム（直径２ｃｍＸ長さ
７０ｃｍ）に試料を付し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．７５）／０．０５％ＮＰ−４０／１０％ポリバ
ッファー７４（ファルマシア社）でカラムを洗浄した
後、１０％ポリバッファー７４にて作製された２０〜
２５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）の直線濃度勾配に
て溶出した。参考例４に示したＭＣＰの酵素免疫測定法
による陽性画分をプールし、１０ｍＭ燐酸緩衝生理食
塩液（以下ＰＢＳと記す，ｐＨ７．４）／０．０５％
ＮＰ−４０に対して透析した。これを参考例２に作製法
を示したＭＣＰに対する単クローン性抗体をリガンドと
したアフィニティカラムクロマトグラフィーに供した。
アフィニティカラム（直径２ｃｍＸ長さ１０ｃｍ）に試
料を付し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％ＮＰ−
４０、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．５ＭＮａＣ
ｌ／０．０５％ＮＰ−４０でカラムを洗浄した。０．
１７Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ２．５）／０．０５％ＮＰ−４０を用いて蛋白質
を溶出し、ただちに溶出画分１０ｍｌに対し１ｍｌの１
ＭＴｒｉｓを添加し、中和した。これを２０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ６．０）／０．０５％ＮＰ−４０に対
して一晩透析した後、濃縮装置（Ｍｓ．ＢＴＡＵＲＹ−
ＫＮ，アトー社）を用いて濃縮した。実施例６の工程に
よって本発明の蛋白質を、回収率７０％以上で、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ後の銀染色にて単一バンドとなるまで精製で
きた。

【００５４】（実施例７）固相上のＣ３ｂに対する作
用細胞膜から抽出された天然型ＭＣＰは、液相中のＣ３ｂ
にはＩ因子のコファクター活性を示すが固相上のＣ３ｂ
に対しては作用を示さないことが瀬谷等によって明らか
にされている（Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．２６４５８１−５８８，１９８９）。
そこで本発明者等は、実施例６で得られた蛋白質につい
て固相上のＣ３ｂに対する作用について検討した。方法
は、この瀬谷等の文献に記載の方法に準じて実施した。
まず、以下に記載の公知の方法に従って補体系の各成分
を精製した。Ｃ１：マツモト等（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ
ａｌ．）、ジャーナルオブイムノロジー（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．）、１４２２７４３−２７５０，１９
８９Ｃ２：ナガサワ等（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ．）、プロシーディングスオブザナショナル
アカデミーオブサイエンスオブザユナイテ
ッドステイトオブアメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７４２９９８−３
００１，１９７７Ｃ３：セヤ等（Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．）、ジャ
ーナルオブバイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）８９，６５９−６６４，１９８１Ｃ４：ナガサワ等（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ．）、モレキュラーイムノロジー（Ｍｏｌｅｃ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１７１３６５−１３７２，１９
８０Ｂ：セヤ等（Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．）、コ
ンプレメント（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、２１６５−
１７４，１９８５Ｄ：ボラナキス等（Ｖｏｌａｎａｋｉｓ，ＪＥ．
ｅｔａｌ．）、ジャーナルオブイムノロジー
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１１９３３７−３４２，１
９７７Ｉ：ナガサワ等（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ
ａｌ．）、ジャーナルオブイムノロジー（Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．）、１２５５７８−５８２，１９８０さらに精製されたＣ３の一部は過沃素酸標識試薬（ピア
ースケミカル社）を用いて¹²⁵ Ｉで標識した。赤血球膜
上に固着したＣ３ｂを得るために、ヒツジ洗浄赤血球
（Ｅ，日研生物社）と抗ヒツジ赤血球ウサギ抗体（Ａ，
コーディス社）を反応させた後、順次Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２
を添加し、ＥＡＣ４ｂ２を形成させた。これに少量の未
標識Ｃ３を加えＥＡＣ４ｂ２ａ３ｂを形成させた後、
¹²⁵ Ｉ標識Ｃ３、Ｂ因子およびＤ因子を各々添加してＥ
Ａ¹²⁵ ＩＣ３ｂ（赤血球膜上に固着化した¹²⁵ Ｉ標識Ｃ
３ｂ）を得た。この赤血球１Ｘ１０⁷ 〜３Ｘ１０⁷ 細胞
を基質として、これに１μｇのＩ因子および実施例６で
得た蛋白質４０ｎｇを加え、総量１６０μｌとして３７
℃にて１時間放置した。３％ＮＰ−４０および１０％ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を各々１０μｌ、β−
メルカプトエタノールを５μｌおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
用色素混合液を４５μｌ加えることで反応を停止させ、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後オートラジオグラフィーを用
いて固相上のＣ３ｂの分解状態を解析した。なお、ＨＳ
Ｂ−２細胞株の細胞膜画分より実施例６に記載の方法に
準じて精製した天然型ＭＣＰをＣ３ｂ分解能の対照とし
て用いたが、これは固相上のＣ３ｂには作用しない為、
反応開始時に０．４％となるようにＮＰ−４０を加え予
め赤血球膜を溶解し、Ｃ３ｂが液相中に存在するように
処理した後に反応を実施した。

【００５５】その結果を図６に示す。図６は各種処理を
行った¹²⁵ Ｉで標識されたＣ３ｂの各種反応処理後の試
料のＳＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラムである。各
レーンの試料の処理条件を以下に示す。レーン１：固相化Ｃ３ｂ＋Ｉ因子レーン２：固相化Ｃ３ｂ＋Ｉ因子＋天然型ＭＣＰレーン３：固相化Ｃ３ｂ＋Ｉ因子＋天然型ＭＣＰ＋ＮＰ
−４０（ＮＰ−４０は固相上のＣ３ｂを可溶化するため
に添加）レーン４：固相化Ｃ３ｂ＋Ｉ因子＋本発明の蛋白質レーン１とレーン２を比較するとＣ３ｂのバンドパター
ンには変化が見られない。これは天然型ＭＣＰは固相上
のＣ３ｂに対してはＩ因子のコファクターとしての活性
を持たないことを示している。これにＮＰ−４０を加え
たレーン３では、レーン２に比較して１１６Ｋｄ〜１２
０Ｋｄのバンドの消失がみられる。これは、ＮＰ−４０
によって可溶化されたＣ３ｂが、天然型ＭＣＰをコファ
クターとするＩ因子によって分解されたことを示す。

【００５６】レーン４は、固相上のＣ３ｂにＩ因子と本
発明の蛋白質をＮＰ−４０非存在下で反応させたもので
あるが、レーン３と同様に１１６Ｋｄ〜１２０Ｋｄのバ
ンドの消失がみられる。これは本発明の蛋白質が、天然
型ＭＣＰとは異なり、固相上のＣ３ｂに対してもＩ因子
のコファクターとしての作用を有することを示してい
る。これにより、本発明の蛋白質は固相上のＣ３ｂに対
しても、天然型ＭＣＰが液相中のＣ３ｂに対する場合と
同様にコファクター活性を示すことが明かとなった。

【００５７】（実施例８）補体依存性細胞障害作用へ
の影響ヒト補体系による細胞障害作用に感受性を示すＣＨＯ細
胞を用いて、本発明の蛋白質の細胞障害保護効果につい
て検討した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６
１）を１０％ウシ血清（セルカルチャーラボラトリーズ
社）含有ハムＦ−１２培地（日水製薬社）を用いて、常
法に従って培養した。１検体約１ｘ１０⁶細胞として、
参考例５に示した抗ＣＨＯ細胞家兎抗血清を加え、０℃
にて１５分間処理した。次いで１００ｍＭＥＧＴＡを
含有するゼラチンベロナール緩衝液（０．１４５ＭＮ
ａＣｌ／０．０５Ｍバルビタールナトリウム（ｐＨ
７．４）／０．１％ゼラチン／１００ｍＭＥＧＴＡ）
にて２０％に調製された正常ヒト血清及び本発明の新規
な薬理学的特性を有する蛋白質約４００ｎｇを加え、３
７℃にて１時間放置した。その検体にさらに抗ヒトｉＣ
３ｂマウスモノクローナル抗体を加え、０℃で４５分間
処理し、さらにＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体
（カッペル社）及びヨウ化プロピジウムを加え、０℃で
３０分間処理した。なお、抗ヒトｉＣ３ｂマウスモノク
ローナル抗体はニューヨーク大学の飯田恭子博士より供
与されたもの（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６２４１３−
４１７，１９８７）を用いた。このような処理を施した
検体中の生細胞数、死細胞数及び蛍光強度（ＣＨＯ細胞
へのＣ３ｂ沈着量に比例）を蛍光活性セルソーター（Ｅ
ＰＩＣＳＰｒｏｆｉｌｅII，コールター社）を用いて
解析した。

【００５８】その結果を図７に示す。実験方法は実施例
８に記載した通りである。ａ）は対照群（ＭＣＰ非存
在）での生細胞、ｂ）は死細胞である。ｃ）は本発明の
蛋白質存在下での生細胞、ｄ）は死細胞である。各グラ
フの縦軸は細胞数を表す指数、横軸は蛍光強度を示して
いる。これにより、本発明の蛋白質非存在下では死細胞
画分中に多量のｉＣ３ｂ沈着細胞（蛍光強度の強い側の
ピーク）が検出され［図７（ｂ）］、一方、本発明のＭ
ＣＰ分子存在下ではｉＣ３ｂ沈着細胞が激減するととも
に死細胞自体も減少する事［図７（ｄ）］が明かとなっ
た。この結果と実施例７の結果とを併せて考えると、本
発明の蛋白質は、天然型ＭＣＰとは異なり、固相上のＣ
３ｂも分解することにより細胞に沈着するＣ３ｂ絶対量
を減少せしめ、その結果として補体系の細胞障害性を抑
制するものと思われた。

【００５９】（実施例９）毒性試験実施例６で得られた本発明の蛋白質を用いてマウスおよ
びラットにおける毒性試験を実施した。即ち、６〜８週
齢のＢａｌｂ／ｃ系マウス雌雄各々１０匹および同週齢
のＷｉｓｔａｒ系ラット雌雄各々１０匹に対して実施例
６で得られた蛋白質を１日１回１週間連日静脈内投与し
た。投与期間中を通して各動物個体の一般性状を観察し
た。本試験では最高投与量群である１０ｍｇ／Ｋｇ群で
も何れの動物においても死亡例は観察されず、一般性状
においても変化はみられなかった。

【００６０】（実施例１０）注射用溶液剤の調製実施例６で得られた本発明の蛋白質１００ｍｇを１０ｍ
ｇ／ｍｌの水解ゼラチンを含有する生理食塩液１００ｍ
ｌに溶解し、ポアサイズ０．２２μｍのフィルター（マ
イレックスＧＶ，ミリポア社）を用いて濾過滅菌した。
これを無菌的に１０ｍｌずつガラスバイアルに分注後密
栓し、注射用溶液剤とした。

【００６１】（実施例１１）注射用凍結乾燥製剤の調
製実施例６で得られた本発明の蛋白質１００ｍｇを１００
ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有する１０ｍＭ
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００ｍｌに溶解し、ポアサイズ
０．２２μｍのフィルター（マイレックスＧＶ，ミリポ
ア社）を用いて濾過滅菌した。これを無菌的に３ｍｌず
つガラスバイアルに分注、凍結乾燥後密栓し、注射用凍
結乾燥剤とした。

【００６２】参考例１ＭＣＰに対する単クローン性抗
体の調製基本的にコーラー等（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔａｌ．
Ｎａｔｕｒｅ２５６４９５−４９７，１９７５）
の方法に従ってＭＣＰに対する単クローン性抗体を作製
した。具体的な方法は、Ｓｅｙａ，Ｔ．ｅｔａｌ．
ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＩｎｆｌａｍｍ．７７８−
８９，１９９０に報告した。即ち、精製された細胞膜画
分由来天然型ＭＣＰ（０．５μｇ／０．５ｍｌＰＢＳ
／０．００２％ＮＰ−４０）を０．８ｍｌのフロイン
ド完全アージュバントと充分に混合し、Ｂａｌｂ／ｃ系
マウスに皮下投与した。投与は１０日間隔で計３回実施
した。最終投与から４日後にマウスの脾臓を摘出し、脾
細胞を単離後、マウス骨髄腫由来細胞株であるＮＳ−１
細胞と常法に従って融合させた。これら融合細胞クロー
ンの培養上清をヒツジ赤血球を用いたプロテインＡロゼ
ット形成法にてスクリーニングし、ＭＣＰに対する抗体
を産生しているクローンを得た。これらのハイブリドー
マをＢａｌｂ／ｃ系マウスの腹腔内に移植し、４００ｒ
ａｄの放射線を照射した。約１０日後にマウスから腹水
を採取した。この腹水に５０％飽和となるように硫酸ア
ンモニウムを加え、塩析を実施した。４時間後遠心分離
法により沈澱を回収し、水に溶解した後０．５ＭＮａ
Ｃｌ／０．０２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）に
対して透析し、抗体粗精製画分とした。予め２ＭＮａＣ
ｌ／０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ／０．０２ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．９）で平衡化したプロテインＡセフ
ァロース（ファルマシア社）カラムに抗体粗精製画分を
付し、平衡化緩衝液にてそのカラムを洗浄後、０．１Ｍ
クエン酸（ｐＨ６．０）および０．１Ｍクエン酸
（ｐＨ３．０）を用いて順次抗体を溶出させた。抗体の
溶出は２８０ｎｍにおける紫外線（ＵＶ₂₈₀ ）の吸収で
モニターした。溶出ピークをプールした後ＰＢＳに対し
て透析し、これをＭＣＰに対する単クローン性抗体精製
標品とした。

【００６３】（参考例２）単クローン性抗体をリガン
ドとしたアフィニティー担体の調製参考例１で得た単クローン性抗体精製標品１００ｍｇと
ＢｒＣＮで活性化されたセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社）５０ｍｌとを混合し、４℃で緩やかに撹拌しなが
ら一晩放置した。その後１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．５）で洗浄し、０．５ＭＮａＣｌ／２０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した。

【００６４】（参考例３）酵素標識単クローン性抗体
の調製ＭＣＰの酵素免疫測定系を作製するために参考例１で得
た単クローン性抗体を用いて酵素標識抗体を調製した。
まず４ｍｇ／ｍｌに調製した西洋わさびパーオキシダー
セ（東洋紡社）水溶液１ｍｌに０．１ＭＮａＩＯ₄
０．２ｍｌを加え、混合後２５℃で１５分間放置した。
これに１．５％エチレングリコール水溶液０．２ｍｌを
加え、混合後２５℃でさらに２０分間放置した。その後
１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）に対して
３回透析した。これに０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
（２０ｘＳＣＢ，ｐＨ９．５）７０μｌを加え、直ちに
抗体溶液（予め２ｘＳＣＢに対して３回透析した後、約
５ｍｇ／ｍｌに調製したもの）を添加し、撹拌後２５℃
で２時間放置した。次いで１ｘＳＣＢにて４ｍｇ／ｍｌ
に調製したＮａＢＨ₄ 溶液０．１ｍｌを加え、４℃にて
さらに２時間放置した。その後７６ｍＭＰＢＳ（ｐＨ
６．４）に対して３回透析し、酵素標識抗体標品とし
た。

【００６５】（参考例４）ＭＣＰの酵素免疫測定法９６穴マルチタイターイムノプレート（ヌンク社）の各
ウェルに一次抗体として５μｇ／ｍｌの参考例１で得た
モノクローナル抗体のうちの一種を０．１ｍｌずつ分注
し、４℃にて一晩放置した。各ウェルをイオン交換水
０．３ｍｌにて５回洗浄した後、１０％ウシ血清アルブ
ミン含有ＰＢＳと等量混合した検体或いは標準物質を
０．１ｍｌずつ加え、室温にて２時間放置した。０．０
０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩液（洗浄液）０．３
ｍｌを用いて各ウェルを５回洗浄した後、さらにイオン
交換水０．３ｍｌで１回洗浄した。二次抗体として参考
例３で得た西洋わさびパーオキシダーゼ標識モノクロー
ナル抗体（０．５μｇ／ｍｌ）と１０％ウシ血清アルブ
ミン含有ＰＢＳとの等量混合液を０．１ｍｌずつ各ウェ
ルに加え、室温にて２時間放置した。洗浄液０．３ｍｌ
で５回、イオン交換水０．３ｍｌで１回各ウェルを洗浄
した後、発色液（オルトフェニレンジアミン４５ｍｇお
よび１％Ｈ₂ Ｏ₂ ４００μｌを燐酸ナトリウム−クエン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１５ｍｌに溶解したもの）
０．１ｍｌを加え、室温にて１５分間放置した。その後
反応停止液（１ＮＨ₂ ＳＯ₄ ）０．１ｍｌを加え撹拌
後、反応液の４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ₄₉₀ ）を
マイクロプレートリーダー（ＥＴＹ−９６Ａ型，東洋測
器社）で測定した。標準物質のＯＤ₄₉₀ から得た検量線
より検体中のＭＣＰ量を算出した。

【００６６】（参考例５）抗ＣＨＯ細胞家兎抗血清の
調製常法通りに培養されたＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳにて充
分に洗浄した後、約１ｘ１０⁷ 細胞／ｍｌとなるように
細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液約２ｍｌを日本
在来白色種家兎に動脈内投与した。週１度のこの投与を
５回繰り返し、最終投与から１週間後に家兎血液を耳動
脈より採取した。血清を分離後、参考例１と同様に塩析
を実施した。沈澱を回収し、適当量の水に溶解した後、
ＰＢＳに対して透析した。これを抗ＣＨＯ細胞家兎抗血
清標品とした。

【００６７】

【発明の効果】本発明の新規な薬理学的特性を有する蛋
白質は、固相上のＣ３ｂに対しても液相中のＣ３ｂに対
する場合と同様にＩ因子のコファクターとしての作用を
有する、新規な薬理特性を有する蛋白質を提供するもの
である。

【００６８】これは、補体系が障害作用を示す実際の場
合、すなわち、固相基質（細胞膜）に吸着した補体系成
分の作用を抑制しうる新規な蛋白質である。また、本発
明は同時に該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を含
有する医薬組成物をも提供する。

【００６９】従って、本発明は、補体系が自己細胞に対
して障害的に作用する疾患、腎炎、肝炎、血管炎、喘
息、自己免疫疾患、虚血性臓器障害、再灌流障害、関節
リウマチ、移植組織片拒絶、ショック、多臓器不全およ
び播種性血管内凝固症等の治療に新しい道を開くもので
ある。

【００７０】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：279 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly Pro Arg Pro Thr 245 250 255 Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu 260 265 270 Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp 275 279

【００７１】配列番号：2 配列の長さ：251 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys 245 250 251

【００７２】配列番号：3 配列の長さ：840 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..840 特徴を決定した方法：S 配列 TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840

【００７３】配列番号：4 配列の長さ：756 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..756 特徴を決定した方法：S 配列 TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＭＣＰの６種のイソ体の構造を示す図で
ある。

【図２】ｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ（Ｃ）の構築方法を示
す略図である。

【図３】ｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ（Ｄ）の構築方法を示
す略図である。

【図４】ｐＵＣ１９−ｓＭＣＰ１２３４の構築方法を
示す略図である。

【図５】ＣＯＳＩ発現用プラスミドの構築方法を示す
略図である。

【図６】コファクター活性を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
のバンドパターンを示した図である。

【図７】補体依存性細胞障害作用への影響を表す、細
胞数を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢＡＣＤＡＣＳＡＣＶＣ１２Ｎ 15/12 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型メンブレンコファクタープロテイン
（ＭｅｍｂｒａｎｅＣｏｆａｃｔｏｒＰｒｏｔｅｉ
ｎ，ＭＣＰ）の少なくとも膜貫通領域および細胞質内
領域が欠如していることを特徴とする新規な薬理学的特
性を有する蛋白質。
【請求項２】下記式１に示したアミノ酸配列の少なくと
も一部を有することを特徴とする請求項１に記載の新規
な薬理学的特性を有する蛋白質。（式１） Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Gly Pro Arg Pro Thr 245 250 255 Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu 260 265 270 Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp 275 279
【請求項３】前記式１または下記式２に示したアミノ酸
配列を有することを特徴とする請求項１に記載の新規な
薬理学的特性を有する蛋白質。（式２） Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys 20 25 30 Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg 35 40 45 Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr 50 55 60 Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly 85 90 95 Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val 130 135 140 Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala 145 150 155 160 Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys 165 170 175 Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val 180 185 190 Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe 195 200 205 Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys 210 215 220 Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser 225 230 235 240 Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys 245 250 251
【請求項４】前記式１または２に示したアミノ酸配列で
示される請求項１に記載の新規な薬理学的特性を有する
蛋白質。
【請求項５】固相上のＣ３ｂに対するＩ因子のコファク
ターとしての作用を有することを特徴とする請求項１な
いし４いずれかに記載の新規な薬理学的特性を有する蛋
白質。
【請求項６】ヒト以外の細胞によって産生された請求項
１ないし５いずれかに記載の新規な薬理学的特性を有す
る蛋白質。
【請求項７】前記ヒト以外の細胞が大腸菌である請求項
６に記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
【請求項８】前記培養細胞が哺乳動物培養細胞である請
求項６に記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。
【請求項９】下記式３に示した塩基配列を有するＤＮＡ
の少なくとも一部を用いて産生された請求項６ないし８
いずれかに記載の新規な薬理学的特性を有する蛋白質。（式３） TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAAGGTCCTA GGCCTACTTA CAAGCCTCCA 780 GTCTCAAATT ATCCAGGATA TCCTAAACCT GAGGAAGGAA TACTTGACAG TTTGGATTGA 840
【請求項１０】請求項１ないし８いずれかに記載の新規
な薬理学的特性を有する蛋白質をコードする塩基配列を
有するＤＮＡ。
【請求項１１】前記式３に示した塩基配列の少なくとも
一部を有する請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】前記式３に示した塩基配列を有するＤＮ
Ａ。
【請求項１３】下記式４に示した塩基配列を有するＤＮ
Ａ。（式４） TGTGAGGAGC CACCAACATT TGAAGCTATG GAGCTCATTG GTAAACCAAA ACCCTACTAT 60 GAGATTGGTG AACGAGTAGA TTATAAGTGT AAAAAAGGAT ACTTCTATAT ACCTCCTCTT 120 GCCACCCATA CTATTTGTGA TCGGAATCAT ACATGGCTAC CTGTCTCAGA TGACGCCTGT 180 TATAGAGAAA CATGTCCATA TATACGGGAT CCTTTAAATG GCCAAGCAGT CCCTGCAAAT 240 GGGACTTACG AGTTTGGTTA TCAGATGCAC TTTATTTGTA ATGAGGGTTA TTACTTAATT 300 GGTGAAGAAA TTCTATATTG TGAACTTAAA GGATCAGTAG CAATTTGGAG CGGTAAGCCC 360 CCAATATGTG AAAAGGTTTT GTGTACACCA CCTCCAAAAA TAAAAAATGG AAAACACACC 420 TTTAGTGAAG TAGAAGTATT TGAGTATCTT GATGCAGTAA CTTATAGTTG TGATCCTGCA 480 CCTGGACCAG ATCCATTTTC ACTTATTGGA GAGAGCACGA TTTATTGTGG TGACAATTCA 540 GTGTGGAGTC GTGCTGCTCC AGAGTGTAAA GTGGTCAAAT GTCGATTTCC AGTAGTCGAA 600 AATGGAAAAC AGATATCAGG ATTTGGAAAA AAATTTTACT ACAAAGCAAC AGTTATGTTT 660 GAATGCGATA AGGGTTTTTA CCTCGATGGC AGCGACACAA TTGTCTGTGA CAGTAACAGT 720 ACTTGGGATC CCCCAGTTCC AAAGTGTCTT AAATGA 756
【請求項１４】請求項１ないし９いずれかに記載の新規
な薬理学的特性を有する蛋白質を少なくとも１つの有効
成分として含有することを特徴とする、補体系が自己細
胞に対して障害的に作用する疾患に用いるための医薬組
成物。
【請求項１５】前記疾患が、腎炎、肝炎、血管炎、喘
息、自己免疫疾患、虚血性臓器障害、再灌流障害、関節
リウマチ、移植組織片拒絶、ショック、多臓器不全およ
び播種性血管内凝固症からなる群より選ばれる少なくと
も１つの疾患である請求項１４に記載の医薬組成物。