JPH0526470B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ ヒトＢ型血球の血液型抗原決定基に対する特
異性を有する単一クローン抗体（monoclonal
antibody）。 ２ Ｂ型血球の抗原決定基に対する特異性を有
し、該決定基を有するＢ型血球試料の凝集を生じ
させることができる請求の範囲第１項記載の単一
クローン抗体。 ３ 該抗体とＢ型血球との間の相互作用の平衡定
数が1.3×107M-1よりも大きい請求の範囲第１項
または第２項記載の単一クローン抗体。 ４ 該抗体とＢ型血球との間の相互作用の平衡定
数が1.2×108M-1よりも大きい請求の範囲第３項
記載の単一クローン抗体。 ５ 該抗体と血液型ＢのＢ型血球を含む免疫複合
体の解離反応の速度定数が2.2×10-2sec-1より小
さい請求の範囲第１項または第２項記載の単一ク
ローン抗体。 ６ 該抗体と血液型ＢのＢ型血球を含む免疫複合
体の解離反応の速度定数が7.6×10-4sec-1より小
さい請求の範囲第５項記載の単一クローン抗体。 ７ 該抗体と血液型A1BのＢ型血球を含む免疫複
合体の解離反応の速度定数が5.0×10-2sec-1より
小さい請求の範囲第１項または第２項記載の単一
クローン抗体。 ８ 該抗体と血液型A1BのＢ型血球を含む免疫複
合体の解離反応の速度定数が3.4×10-3sec-1より
小さい請求の範囲第７項記載の単一クローン抗
体。 発明の分野 本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、特
に単一クローン抗体の血液型分類試薬としての使
用に関する。 発明の背景 脊椎動物の体内に異物（抗原物質）が入ると免
疫反応が生じる。この免疫反応の目的は、抗原物
質が動物の体に障害を与えることを防ぎこのよう
な抗原物質を体から除去することである。免疫系
は、抗原物質を選択的に認識し抗原物質の特定の
複数の部位に結合する特性を有する免疫グロブリ
ン分子（以後抗体という）を生産することによつ
てこの目的を達成する。これらの部位は決定基と
して知られ、１つの抗原はこのような決定基を１
ないし複数有することができる。免疫系によつて
産生された抗体はそれぞれ単一の決定基に対して
のみ特異性を有しているが、抗体が産生される源
となる抗原物質が複数の決定基を有している場合
は複数の異る抗体が産生される。 抗体の主な機能は、有害な異物を凝集すること
によつてこの物質を除去する正常な体の機能を助
け、これによつて体の有害な異物から保護するこ
とである。 抗体による抗原物質の凝集は、血液型分類の分
野では、体外においても実用的に利用されてい
る。 赤血球はその表面に多くの異る、かつ特色のあ
る抗原決定基を有しており、これらの決定基の性
質にもとずき、血液をいくつかの型（たとえば
Ａ、Ｂ、Ｏ、A1B、A2B、Bcprd）に分類するこ
とができる。血液供与者から血液被供与者への輸
血に際しては輸血される血液が血液被供与者の血
液と同型であることが必要である。もし同型でな
いと、血液被供与者の免疫系は輸血された赤血球
の表面のなじみのない決定基に対して抗体を生成
する。外来の赤血球に対するこのような抗体の反
応は血液型分類技術の基礎をなすものである。 広い意味では、血液試料の分類は、その試料の
型の赤血球の表面にある複数の決定基に対する抗
血清を添加しときに生じる試料中の赤血球の凝集
等を検出することに依存する。凝集は肉眼で容易
に見られまたは機械で自動的に検出が可能な巨視
的な効果である。 従来血液型分離試薬の主要な供給源は被術者
（humansubject）の超免疫化
（hyperimmunisation）によるものであつた。こ
れは被術者の血液型と異る型の血清を致死量に至
らない相当量だけ被術者の体内に入れることによ
つ行われる。これは正常な免疫反応に生起し、そ
の結果被術者の血液中に抗体が産生される。次い
でこの血液の試料をとり、それから抗体試薬を作
る。このような試薬は、未知の血液試料が最初に
人体血清供与者の体内に入つたものと同型のもで
あれば赤血球の可視的な綿状沈殿
（floeealation）または凝集（aggin−tination）
を生じるので、未知の血液試料の分類に使用する
ことができる。 実際には、２つの型の血液型分類テストが行わ
れている（エフ、ダンスフオードおよびシー、バ
ウリー「血液型分類技術」第２版1967年）。第１
の型のテストでは、まず分類すべき血液の試料を
血液型分類タイル（blood grouping tile）上に
載せる（英国薬局方、「ABO供与者の決定」の項
参照）。次にこの血液試料をタイル上で抗血清試
料と混合する。その後凝集が起れば、それは分類
すべき血液の未知試料が抗血清が生成した血液型
と同型の血液型に属することを示すものである。
実際にこのようなタイル凝集分類テストは救急処
置の場合に日常的に行われている。 第２の型のテストにおいては、分類すべき血液
試料を抗血清とともに試験管内で生理食塩水中に
置き標準時間（２時間）静置する。凝集の存在は
標準時間内に生じた沈降によつて判別することが
できる。緊急な場合にはテストを促進するため遠
心分離が行われる。 特定の血液型分類試薬の効き目はそれが凝集体
（ag−glutinant）を生成する速度およびその凝集
素（agg−lutinin）としての能力と濃度との比例
の仕方とによつて判断される。 これらの基準中前者はこの分野において通常
「結合活性」と呼ばれている。特定の血液型分類
試薬の結合活性時間は血液試料を試薬と混合して
から試料の認識しうる凝集が起る時までに要する
時間として定義される。 血液型分類試薬の希釈特性を決定するため、生
理食塩水凝集力価を測定する。この測定には、試
薬すべき血液型分類試薬の生理食塩水２倍希釈溶
液を等量ずつ複数調整する。次いで各希釈溶液に
既知の量の適当な赤血球懸濁液を加える。この場
合すべての希釈溶液に同量の懸濁液を加える。各
希釈溶液試料を標準時間（通常２時間）静置し、
その時間経過後顕微鏡下で凝集カウント
（agglutination count）を行う。相当量の凝集が
生じる最大希釈の試料を決定し、この希釈を「生
理食塩水凝集力価」（saline agglutina−tion
titre）と名付ける。したがつて、高い生理食塩
水凝集力価を有する試薬は強力な凝集素である。 被術者の超免疫化の技術を用いることにより赤
血球決定基に対する抗体を産生する場合は２つの
問題が生じる。第一に、血清は供給に限界があ
り、現在多きな外科手術のひん度が増大するにつ
れて血液型分類の必要性が著るしく高まつてい
る。このため他の医療上の用途にも必要な人体血
清の供給がひつ追している。その上、目然に生成
した赤血球に対する抗体の凝集効果はある程度ば
らつきを生じる傾向がある。その理由の一つは、
免疫応答は、各構成抗体が上記のように各々が一
つの決定基に対して得意的作用を有する複数の抗
体の「カクテル」（混合物）を生じさせる、とい
うことである。このカクテルの中の各種抗体を分
離することはできないので、従来の抗血清は複数
の抗体の混合物を含み、この混合物は動物によつ
て異る（さらに同種の動物内においても、また日
によつても）。同一の血液型のすべての赤血球に
ついて同一の決定基のセツトが存在することがな
いので、免疫応答は多くの場合非常にまちまちで
ある。 要約すると、血液型分類に適当な試薬は次の条
件を備えていなければならない。 (1) 適当な抗原に対し特異性を有すること。 (2) 比較的に弱い血液型に対し、日常の血液型分
類法によつても緊急時の血液型分類法によつて
も、良好な巨視的反応を示すために充分に強力
であること。 (3) 使用諸条件下において安定であること。 (4) 比較的に安価で容易に入手可能であること。 最近の分子生物学の発達は、抗体を産生する脾
細胞とミエローマ細胞から雑種細胞（ハイブリド
ーマ）を産生することにより高度に特異性を有す
る抗体を生産する技術を提供した。コーラーとミ
ルステインの業績であるこの技術（Eur.J.
Immunol ６292−295（1976）、Nature 256
495−497（1975）、Eur.J.Immunol ６511−519
（1976）参照）は、抗体の無限の供給量を生産す
る方法を提供するものである。抗体を産生する雑
種細胞はただ１種の免疫グロブリン分子、即ち一
つの決定基に対し特異性を有する免疫グロブリン
のみを産生するので、産生された抗体は単一クロ
ーン抗体と命名されている。雑種細胞はミエロー
マ細胞とリンパ細胞の２つの望まいし特徴を結合
する。即ちミエローマ細胞は不死の性質を有し試
験管の中で自己複製することができる一方リンパ
細胞は抗体を表現する望ましい特性を有する。し
たがつて、このような雑種細胞は、純粋で明確な
免疫グロブリンの恒久的な供給源である。雑種細
胞を産生するために使用される方法は、通常マウ
スに適当な抗原で免疫を与え、免疫反応が起るの
に充分な時間をかけた後マウスを犠牲にしてその
脾臓を取り出すことである。次いで脾臓から細胞
懸濁液を作り、この懸濁液をマウスのミエローマ
細胞の懸濁液と混合する。これら２種類の細胞の
融合を促進するためにポリエチレングリコールを
用いることができる。その結果１つのリンパ細胞
から得られるハイブリドーマ培養個体は１種類の
抗体即ち１つの特定の決定基に対し特異的な抗体
を産生する。 この技術はポーク等によつてＡ型赤血球の決定
基に対する単一クローン抗体を産生するために使
用され（Vox Sanguinis 39 134−140（1980））、
このような単一クローン抗Ａ抗体（monoclonal
anti−A′）は有益な血液型分類試薬であることが
示されている。 しかしながら、今までは、マウスをヒトのＢ型
血球で免疫化してもミエローマ細胞と融合して抗
Ｂ免疫グロブリンを作るハイブリドーマ細胞を形
成しうるような脾細胞はできないものと一般に考
えられていた。 われわれは、驚くべきことに、実際にはそうで
はなく、融合は容易に得られ、その結果単一クロ
ーン抗Ｂ抗体を高能率で表現するハイプリドーマ
細胞を形成することにより、有益な生理食塩水凝
集力価特性を有する高結合活性の特異的血液分類
試薬を生産することができることを発見した。さ
らに、当該単一クローン抗Ｂ抗体とＢ型血球の間
に形成される免疫複合体に関する平衡定数と解離
速度定数とを定義できることが判つた。従来知ら
れていた血液型分類試薬は異る特異性を有する免
疫グロブリンの混合物を含むものであつたから従
来は血液型分類試薬と赤血球の間に形成された免
疫複合体の力のこのような定量分析は不可能であ
つた。したがつて従来達成できた最善の数字でも
精々平均値にすぎなかつた。 発明の説明 本発明によれば、Ｂ型血球の抗原決定基に対し
特異性を有する単一クローン抗体が提供される。 本明細書においては、Ｂ型血球はＢ型血球上に
のみ見出される１以上の抗原決定基を有するすべ
ての赤血球を含むものとする。このような決定基
を有する血液型の例はＢ、A1B、A2Bおよび
Bcprdである。 単一クローン抗体はマウス、IgM、単一クロー
ン抗Ｂ免疫グロブリンであることが望ましい。 単一クローン抗体は前記の決定基を有するＢ型
血液の試料を凝集させる能力を有するものである
ことが望ましい。単一クローン抗体とＢ型血球と
の間の相互作用の平衡定数が1.3×107M-1より大
きい単一クローン抗体、特にこの平衡定数が1.2
×108M-1より大きい単一クローン抗体の場合に
は特に有益な上記の特性が得られることが判つ
た。本明細書において言及する平衡定数の価はフ
アンクシヨナルアフイニテイー（functional
affinities）即ち多価の抗体（IgM）と赤血球と
の間の相互作用について行われる測定値である。
この点で、この価は１価の抗体（IgG）と抗原と
の間の相互作用について得られるイントリンシツ
クアフイニテイー（intrinsic affinities）とは異
る。イントリンシツクアフイニテイーはフアンク
シヨナルアフイニテイーと直接比較することはで
きない。本発明の単一クローン抗体について計算
しうる諸価は使用される検定法に従うものであつ
て、単一クローン抗体の特徴ずけに関する以下の
記載において詳細に述べることにする。 本発明の他の特徴は、単一クローン抗体が、当
該抗体と血液型ＢのＢ型血球とを含む免疫複合体
の解離反応の速度定数が2.2×10-2sec-1より小さ
く、望ましくは7.6×10-4sec-1より小さいもので
あることである。 本発明の他の特徴は、単一クローン抗体が、当
該抗体と血液型A1BのＢ型血球を含む免疫複合体
の解離反応の速度定数が5.0×10-2sec-1より小さ
く、望ましくは3.4×10-3sec-1より小さいもので
あることである。 本明細書において言及する解離定数の値は上記
のとおりフアンクシヨナルアフイニテイーであ
る。 本発明は、さらに、マウスにＢ型物質を注射
し、このマウスを犠牲にし、その脾臓を取り出し
脾細胞の懸濁液を形成し、この脾細胞をマウスの
ミエローマ細胞と融合して雑種細胞を形成し、該
雑種細胞をクローン化し、該クローン化した雑種
細胞に単一クローン抗体を分泌させるようにした
単一クローン抗体の産生方法を提供する。 前記雑種細胞はクローン化の前に選択されるこ
とが望ましい。 前記ミエローマ細胞はNS1細胞であることが望
ましい。さらに、本発明は、上記の方法によつて
産生された単一クローン抗体、該単一クローン抗
体を分泌することができるハイブリドーマ細胞お
よび該単一クローン抗体を含む血液型分類試薬を
包含するものである。 【図面の簡単な説明】 第１図はＩ標識抗Ｂ抗体とＢ型赤血球の平衡結
合を示す図である。 第２図は125I標識抗Ｂ抗体とＢ型赤血球の平衡
結合を示す修正スカツチヤード図（Scatchard
plot）である。 第３図は４℃および室温におけるＢ型赤血球か
らのＩラベル抗Ｂ抗体の解離速度を示す図であ
る。 第４図は室温における２×106赤血球または
A1B赤血球からのＩ標識抗Ｂ抗体の解離速度を示
す図である。 ハイブリドーマ細胞の調整についての一般的説
明 抗種抗体（anti−species antibody）を取出す
ためＯ型血球で吸収した後血清試料を抗Ｂ活性に
ついて検定することにより適当なマウスを見出し
た。吸収後の抗Ｂ凝集力価１：８のマウスに対し
完全フロインドアジユバント（Difco Bacto）
0.1ml中のＢ型物質100μｇを腹膜内に注射した。
５週間後同じ操作を繰返し、さらに９週間後Ｂ型
物質の0.1ml生理食塩水水溶液200μｇを静脈注射
により追加投与した。３日後に脾臓を取り出し脾
細胞懸濁液を調整した。 脾細胞（108）をポリエチレングリコールを使
つてマウスのミエローマNS1細胞（107）と融合
した（コツトン他Eur.J.Immunol ３135−140
（1973）、ダンスフオードおよびバウリー（上掲）、
ガルフレ他Nature266 550−552（1977））。成長
する雑種細胞をその特定の抗Ｂ活性産生能力によ
つて選択した。これはヒトのＡ、Ｂ、Ｏ赤血球を
用いる凝集検定によつて培養上清中に懸出され
た。抗Ｂ分泌雑種細胞は軟寒天培地上で２回クロ
ーン化し、最終的に５％ｖ／ｖの分子牛胎児の血
清（FCS、Sera−Lab）を補充したジユルベツ
コ、モデイフアイド、イーグルス、ミデイアム
（Dulbecco′s Mobified Eagle′s Modium
（DMEM、Gibco Biocult））中のスピナ培養
（sp−inner−cultures）１リツトルに培養した。
クローン化した雑種細胞は液体窒素中に貯蔵し
た。 遠心分離により細胞と砕片を除去し、ミリポア
フイルターで過し、10ｍＭのHEPES緩衝液と
0.1％アジ化ナトリウムを添加することによつて
単一クローン抗体を含む組織培養上清を調整し
た。各バツチのアリコートを日常の使用のために
４℃で貯蔵し、かつ貯蔵用として−20℃で貯蔵し
た。 雑種細胞の調整に使用する材料と方法についての
詳細な説明 マウスとラツト B10、BR、C3H／He−mgその他のマウスを
最初オーエルイシー1976リミテツド
（OLAC.1976Ltd）（英国Bicester）から得、次い
でOLACマウスから育生したメデイカル、リサー
チ、カウンシル株（Medical Research Councii
stocks）から得た。AKRマウスはバンテイング
（Banting）およびキングマン（King−man）（英
国York）から得た。（C3H×BALB／Ｃ）F1マ
ウスおよびLou、DA、AOラツトはメデイカル、
リサーチ、カウンシル動物舎で育生した、ウイス
ター（wistar）、PVG、WAGおよびスプレイグ
ドーリー（Sprague−Dawley）ラツトはバンテ
イングおよびキングマンから得た。試験および免
疫用のマウスは生後６〜８週間のものであつた。 免疫化 免疫化に使用するヒトＢ型物質 ダブリユ、ワトキンス博士（クリニカル、リサ
ーチ、センター、英国ハロー）はフエノール（95
％）に不溶、硫酸アンモニウム（100％）に不溶、
エタノール（45〜55％）に不溶、かつ水に可溶
な、モーガン法（1965年）によつて得られる凍結
乾燥した卵巣嚢（ovarian cyst）液の抽出物であ
るヒトＢ型（およびＡ型）物質を提供した。これ
らは炭水化物80〜85％（Ｌ−グルコース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−フルコサミン、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース）、アミノ酸15
〜20％（主としてＬ−スレオニン、Ｌ−セリン、
Ｌ−プロリン）およびシアル酸１〜２％からなる
糖たん白である。これらの物質は凍結乾燥して受
領し、0.9％生理食塩水中で溶解して２mg／mlと
し、−20℃で貯蔵した。 完全フロインドアジユバント（CFA）中でのＢ
型物質エマルジヨンの調整 0.9％生理食塩水中の２mg／ml濃度のＢ型物質
１mlをCFA（Difco Baeto）、即ちBayol Ｆ、油
およびマンニツトオレイン酸洗剤の混合物で結核
菌（Myco−bacterium tuberculosis）を含有す
る混合物）１mlに添加した。混合物を２方向タツ
プで直角に連結した２個の５ml注射器中で強く撹
拌し（英国チヤンス、ワーリー）、白いクリーム
状物質が形成されるまで（10分〜20分間）間欠的
に氷で冷却した。このクリーム状物質は水上に適
下しても拡散しかつた。CFAはいまだに最良の
免疫応答補助剤の一つである（ボンフオード1980
年参照）。肉芽腫が形成されることがあるので異
なつた場所で繰返し注射を行つた。 免疫化スケジユール 適当なマウスを見出すため、免疫化していない
マウスの尾から採血し、抗種抗体を除去するため
Ｏ型赤血球で吸収を行つた後、血清をＢ型赤血球
で試験管凝集により検定した。 高い抗Ｂ力価を有する生後６〜８週間のメスノ
B10、BR マウスおよびC3H／He−mgマウスに
対し次の３つの調剤の１つを腹膜内に注射した。
即ちCFA0.1ml中のＢ型物質100μｇ、CFA0.1ml中
のＢ型物質10μｇ、またはパツクたＢ型赤血球
（４回洗浄）0.1mlのいずれか１つである。２週間
後マウスの尾から採血を行つた。 高い血清力価を有するB10、BRマウスに対し
５週間ごとにＢ型物質100μｇもしくは10μｇの腹
膜注射を繰返し行うか、または最初の注射の後３
週間後、４週間後および５週間後に赤血球0.1ml
を繰返し注射した。最後の注射後１週間後、３週
間後および６週間後にマウスの尾から採血した。 血清の収集 マウス尾部からの採血0.5mlを合成樹脂製チユ
ーブに収集し、37℃で１時間静置して凝塊とし、
この凝塊の収縮を助けるためチユーブから解放し
た。分離した血清を0.9％生理食塩水で希釈し、
56℃の水浴中で20分間保温し、必要に応じＯ血球
またはA1血球で吸収した。アリコートを−20℃
で貯蔵した。 血液型Ｂに対する単一クローン抗体の調整 この段階での処理の一般的アウトラインは所望
の反応性を有する単一クローン抗体を産生するた
めのコーラーとミルステインによつて書かれた基
本原理（上記参考文献参照）に従う。 脾細胞 ヒポキサンチン グアニン ホスホリボ
シル トランスフエラーゼ（HGPR−Tase）
＋ve 特異的Ig ＋ve 末端で分化（terminally different−iated） ミエローマ細胞 HGPRTase −ve 特異的Ig −ve 不 死 −ve 雑種細胞 HGPRTase ＋ve 特異的Ig ＋ve 不 死 融合されないミエローマ細胞はHGPRTaseを
欠損しており、したがつて選択された媒体中では
死んでしまう（リトルフイールド、Science
145、709−710、1964年）。また融合されない脾細
胞は組織培養中で生き残ることできない。脾細胞
とミエローマ細胞の雑種細胞のみがHGPRTase
と不死性をともに備えており、したがつて生き残
ることができる。そこで所要の特異性を有する抗
体を分泌する細胞を選択することができる。即
ち、雑種細胞は両方の親細胞のそれぞれの長所を
備えている。 ストツク溶液 50％ポリエチレングリコール（P.E.G.）溶液 10ｇのP.E.G.1500（BDH Lot G573370）を高
圧滅菌し、直ちに45℃の水浴に移した後37℃で
DMEMを10ml添加した。 アミノプエリンストツク1000X アミノプテリン（シグマ）をわずかに暖めた
0.008M NaOH中で0.176mg／mlに溶解し、−20℃
で暗所中に貯蔵した。 HTストツク100X ヒポキサンチン（シグマ）136.1mgとチミジン
（thymidino）38.75mgをDDW100ml中にふつとう
により溶解し−20℃で50mlアリコートとして貯蔵
した。 50ml DMEM 50ml HT100X 調整した溶液は過し（ミリポア、孔の大きさ
0.22μｍ）−20℃で13mlアリコートとして貯蔵し。
解凍後HTを60〜70℃で加熱して再溶解した。 HAT媒体50X DMEM 45ml HT100X 50ml アミノプテリン 1000X ５ml 溶液を上記と同様に13mlアリコートとして、
過し、貯蔵し解凍した。 20％FCS−DMEM中のHAT（HAT媒体） DMEM 400ml FCS（バツチ901112） 100ml Ｐ／Ｓ ８ml グルタミン ８ml ピリミジン（Pyr） ６ml HAT媒体50X 10.6ml （1.0×1.0-4M ヒポキサンチン、4.0×4.0-7Mア
ミノプテリン、1.6×10-5Mチミジン） 20％FCS−DMM中のHT（HT媒体） 上記の調整法中HAT50XをHT50X10.6mlで置
き換えた。したがつて次の用語を使う。 無血清DMEM（serum froo DMEM）＝DMEM
＋PS＋グルタミン＋ピリミジン 20％FCS−DMEM＝無血清DMEM＋20％FCS HAT媒体＝20％FCS−DMEM＋HAT HT媒体＝２％FCS−DMEM＋HT 抗Ｂミエローマ雑種細胞の産生と初期選択 コーラー等によつて記述された方法に従つて細
胞融合を行つた（上記文献参照）。準備として、
次の諸媒体を空気中の５％CO2雰囲気で37℃で一
晩かけて平衡させた。 (1) 50％PEG溶液 (2) 無血清DMEM (3) 20％FCS−DMEM 上記媒体は48のリンブローウエル（Linbro
well）に分配された1.5mlアリコートを含む。 融合を行う日の朝、脾臓を無菌状態で取出し、
細胞を無血清DMEM10ml中に細分して入れ、次
いで10ml遠心管に移した。細胞塊を沈降させるた
め５〜10分時間をかけ、次いで懸濁細胞をピペツ
トで取出し無血清DMEM中で２度洗浄した。１
個の脾臓から1.4×108の懸濁細胞が得られた。こ
れらの細胞の中108は５〜10mlの無血清DMEM中
で採集された。同時に、スピナ培養中で2.6×
106／mlで培養した107ミエローマNSI細胞を２度
洗浄し無血清DMEM5ml中に再懸濁した。 脾細胞（108）とミエローマ細胞（107）を含む
媒体を50mlコーニング管に貯え、400ｇで５分間
室温で遠心分離することによつて細胞を沈澱さ
せ、次いでアスピレータポンプ付属パスツールピ
ペツトを使つて媒体をできるだけ完全にアスピレ
ートした。管を37℃の水の入つたビーカー中に支
持し、50％PEG溶液（37℃で平衡させたもの）
１mlを１分間にわたりゆつくりと添加した後さら
に１分間この添加に用いたピペツトの端で静かに
撹拌した。次いで懸濁液に対し無血清DMEM（37
℃で平衡させたもの）を最初２分間は毎分１ml、
次の４分間は毎分２mlの割合で、次に10mlを滴状
で、さらにその後は自由に50mlまでゆつくりと添
加するこそにより懸濁を希釈した。各添加ごとに
管を静かに撹拌した。遠心分離（400ｇで５分間）
後、細胞を前記添加に用いた24mlピペツトで静か
に20％FCS−DMEM（平行させたもの）25ml中に
注入することによりこの溶液中に懸濁させた。次
いで20％FCS−DMEM中の融合混合物を、平行
させた20％FCS−DMEM1.5mlを含む48のリンブ
ローウエルに0.5mlアリコートとして分配した。 供給細胞として、残りの脾細胞を希釈し、およ
そ４×105／ウエルの割合で滴下することにより
添加した。次いで培養トレイを空気中CO25％、
温度45％雰囲気中で37℃でインキユベートした。 翌日（第１日）および細胞融合後第２日、第３
日、第７日、第11日に各培養媒体の上半分を取り
除き（起りうるクロスコンタミネーシヨンを避け
るため各ウエルごとに別個のパスツールピペツト
を使つた）、空気中５％CO2で平衡させた等容量
のHAT選択媒体（リトルフイールド1964年）で
置換した。 雑種細胞の成長および起りうる酵母菌または微
生物による汚染を検査するため培養を毎日観察し
た。その際培養基をインキユベータの外に置く時
間は極力短かくするようにした。細胞単層の成長
が全面成長に近くなつた時（細胞融合後約14〜21
日、それは媒体が（フエノール）赤色から黄色に
変色する時とほぼ同時である）、培養上清をはじ
めて試験した（Ａ型、Ｂ型およびＯ型赤血球を用
いる凝集により）。その日１mlピペツトで細胞を
懸濁させ、１mlの細胞懸濁液を１mlのHAT媒体
（37℃で平衡させたもの）に移すことにより陽性
の培養を下部分類した。元の培養にはHAT媒体
を補充した。インキユベータの故障に対する安全
対策とさて分割した培養を別個のインキユベータ
で成長させ、凝集により定期的に検定し、できる
だけ早く10％DMSOを含むFCS中の液体N2中で
凍結した。陰性の培養は媒体が黄色を呈したとき
再検査した。酵母歯または微生物による汚染に対
して、45％EtOHを添加した後５分間培養をアス
ピレートし、空のウエルをEtOHで洗浄すること
によつて対処した。培養トレイ上の分割した媒体
を常に直ちにアスピレートした。 融合ウエルの最初の検査後４〜10日後に継代培
養を再検査し、陽性培養のアリコートを凍結する
かまたはクローン化用にまわした。 抗Ｂ分泌雑種細胞の単離 コツトン等によつて記述されたように（上記文
献参照）、選択した培養からの細胞のクローン化
を軟寒天上で行つた。0.9％生理食塩水中の１％
寒天（Difco Bacto）50ml（45℃）をHAT−
DMEM2X（2X DMEM100ml＋ｐ／S4ml＋グル
タミン４ml＋ピリジン４ml＋FCS75ml＋50X
HAT 7.8ml）（45℃）に添加することにより
HAT媒体中の0.5％寒天溶液を調整した。この寒
天混合物を９cmペトリ皿（ヌンク（Ｎ−unc））
に各皿15mlずつピペツトで注入し、層流組織培養
フード内にふたをとつた状態で５分間凝固させた
後ガスを入れたインキユベータ中で30分間平衡さ
せた。 リンブローウエルで作つたDMEMの３倍溶液
６杯中の１mlの細胞に0.5％寒天HAT−DMEM1
mlを添加した。２mlの混合物をsetした寒天上に
均一に重ね、前記と同様に空気乾燥し、空気中５
％CO2の雰囲気中で37℃でインキユベートした。 14〜20日後、複数の分離した肉眼で見える細胞
コロニーが形成された。その中の多くは単一の細
胞から成長していた。これらのコロニーは細いパ
スツールピペツトを使つて最小数のコロニー（通
常10〜20）を含む皿から採取し、ガスを入れたイ
ンキユベータ中で平衡させたHAT−DMEM1ml
を含むリンブローウエルに植えつけた。 培養成長の通常のサイクルに従つて凝集の有無
を検査し、培養を分割し、その中のあるものを液
体N2中で凍結した。次いで培養の半分を等量の
HT媒体に順次移して２、３回通し次いで20％
FCS−DMEMに通し、これらの操作に全体で５
〜６日かけることによつて選択クローンをHAT
から引離した。 細胞を前述の方法で、ただし0.5％寒天を含む
20％FCS−DMEM中で、再クローン化した。こ
うして２度クローン化した細胞を、(1)培養上清が
赤血球に対し強い凝集を示す能力および(2)急速な
高密度細胞成長を示すことを条件として選択し
た。２日置きに培養の半量を順次10％、５％、
2.5％FCSを含む媒体にそれぞれ移すことによつ
て選択したクローンを低FCS中で成長させるよう
にした。 希釈を制限し供給細胞を加えるクローン化 この方法は低密度で寒天上に移した場合にはう
まく成長しなかつた雑種細胞に対して用いられ
た。細胞懸濁液を倍加希釈系列としてリンブロー
ウエル中で１：32まで希釈し、これを数列準備し
た。各列に対して次のものの１つを供給細胞とし
てそれぞれ含む成長媒体100μを添加した。 (1) ４×105B10、BR胸腺細胞 (2) ４×105B10、BR脾細胞 (3) ４×105X線照射3T3マウス線維芽細胞
（1rad／secで20000rads） (4) ４×105マイトマイシン処理*を施したB10、
BR胸腺細胞 (5) ４×105マイトマイシン処理*を施したB10、
BR脾細胞 (6) なし 単離コロニーを採集するのに適当かどうかを調
べるため雑種細胞を低希釈で比較した。 ＊ EBSS中で0.5mg／mlのマイトマイシンＣ（シ
グマ）0.1mlを細胞107含む媒体１mlに添加し、
37℃で30分間インキユベーシヨンを行い、３回
洗浄した。 雑種細胞の液体Ｎ2中での貯蔵 凍結した株を２〜８×105細胞／mlの指数関数
的に増加する細胞から調整した。培養上清10mlか
ら沈澱した細胞を90％FCS−10％ DMSO2mlに
再懸濁し（すなわち約106／ml）、次いで２つの無
菌の凍結びんに分けた（１びんあたり106）。各び
んを２〜４時間氷の上で冷却した後リンデ
（Linde）液体N2タンクの蒸気相中で一晩冷却し、
最後に液体N2に浸漬した。この操作により細胞
は約１℃／minに冷却される。 凍結した株から細胞を成長させるため、凍結び
んを37℃水浴中で解凍し、内容物を成長媒体10ml
中でゆつくりと希釈した。沈殿した細胞（400ｇ、
５分）を５〜10％FCS−DMEM ５ml中で再懸濁
した。 50mlの直ちに開始するため、スピナ培養から細
胞107複数のびんを調整した。 抗体分泌雑種細胞の命名 例 抗Ｂ産生クローンNB1／19、112、28 各雑種細胞は細胞融合実験に関する呼称で命名
する。上記の場合NB1のＮは親ミエローマNS1
を示し、Ｂは抗Ｂ脾細胞を示す。 第１の数字（上記の例では19）はクローンが得
られた最初の未クローン化培養ウエル（eulture
well）を示す。 その後の数字（112および28）は、選択された
クローンが第１および第２の寒天クローニングに
したがつて成長したそれぞれの培養ウエルを示
す。１個のリンブロートレイの培養ウエルは１〜
24の数字を付け、またはA1〜1D6の文字を付け
る。したがつて、５個のトレイを使用した場合は
ウエルは１〜120または1A1〜5D6となる。 呼称全体は細胞クローン、産生された単一クロ
ーン抗体またはその抗原特異性を示す。 単一クローン抗Ｂの特徴づけ クローン化した抗Ｂ産生雑種細胞の３つの安定
な組織培養系列（NB1／19.112.28、NB1／
6.36.36およびNB1／48.30.40）をＢ型抗原を投与
したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ系列と
の間の融合によつて得た。分泌された単一クロー
ン抗体を含む組織培養上清を上記３つの系列につ
いて別々に検査した。 同一のバツチから取つたブラツド・グループ・
レフエレンス・ラボラトリー（Blood Group
Reference Laboratory）からのヒト抗Ｂ試料
（BGRLNo.7327）および市販のヒト抗Ｂ試料を用
いてハイブリドーマ細胞によつて産生された単一
クローン抗Ｂ抗体の能率を査定した。 ダスフオードおよびバウリー（前掲）の方法に
より赤血球凝集テストを行つた。赤血球はACD
または７日以内の血餅試料（リージヨナル・ブラ
ツド・トランスフユージヨン・センター
（Regienal Blood Trans−fusion Cenfer）、ケ
ンブリツジからのもの）で使用前に４回洗浄し
た。生理食塩水中の20％赤血球懸濁液をタイルテ
スト用に使用し、２％懸濁液を標準２時間試験管
重力沈降テスト用に使用した。エンハーンスメン
トテスト（enhancement test）には２％パパイ
ン処理細胞懸濁液または20％ウシアルブミンを使
用した。抗体希釈液は生理食塩水中で作つた。 標準２時間試験管沈降テストにおいて、完全に
成長した培養上清は表１に示す抗Ｂ凝集力価を示
した。 【表】 上記３つの単一クローン抗体間の相違は上記沈
降テストおよび上記他のテストにおいて半復可能
なものであり、抗体NB1／19.112.28は一貫して
すぐれた結果を示した。 予想しうるとおり、A1B成人血球とBcord血球
は成人A2B血球および成人Ｂ血球よりも幾分低い
力価を示した。これはA1B成人血球とBcord血球
が弱いＢ型であるためである。 テストしたすべての試薬はパネル上のすべての
血液型について充分な凝集を示したが、NB1／
19.112.28の活性は表に示す６種類の弱いBeord血
液型に対して顕著なものであつた。５種類の異る
A1B血液（表には示していない）に対する
NB1／19.112.28の活性範囲は、BGRL抗Ｂの
16.32（平均32）に対し256−1024（平均力価512）
であつた。さらに行つた実験で、NB1／48と
NB1／19の精製生成物の生理食塩水凝集力価を
２％Ｂ型血球および２％A1B型血球について測定
した。精製したNB1／48およびNB1／19の各分
画をマイクロフユージ（mi−erofuge）し、Ａ１％ １cm、280＝10としてA280＝1.00（すなわち100μｇ／ml
）
になるまで各分画をP.B.S.（phosphate buffered
saline）中で注意深く希釈した。培養上清（それ
から分画が精製されたもの）の硫酸アンモニウム
カツトをマイクロフユージし、P.B.S.中で1/16に
希釈した。段階２倍希釈溶液は、ハミルトン注射
器でピペツトを行い、各ピペツト動作の間にそれ
ぞれ４回注射器を洗浄することにより、PH7.4の
P.B.S.中で作つた。各希釈溶液の25μアリコー
トを、２％赤血球25μ（５×106）がP.B.S.に懸
濁した状態で、ガラス管中でPH7.4、室温で２時
間インキユベートした。細胞沈殿物を注意深くガ
ラススライドに移し凝集の数を数えた。本実験に
おいて使用した培養上清は上掲の表１のものであ
る。結果を表２に示す。 【表】 表２における記号の意味 Ｃ：完全凝集 Ｖ：非常に強い凝集 ＋＋） ＋） （＋）：中程度の凝集 GW：やや弱い Ｗ：弱い 抗体結合活性を反映するタイル凝集テストで
は、成人Bcerd血球と成人A1B血球の比較的弱い
反応は、成人Ｂ血球と成人A2B血球に比べて種々
の異る試薬の抗Ｂ活性の差をより明確に示した。
その結果を第３に示す。 【表】 A1B血球およびBcprd血球に対して単一クロー
ン抗ＢのNB1／19.112.18を濃縮せずかつ添加剤
を使用せずに使用した場合は数秒内に市販の試薬
に見られるものと類似の強い凝集反応を生じた。
BGRL試薬は肉視的に充分な結果を生じたが、凝
集の速度と範囲は劣つていた。 さらに行われた実験において、20％Ｂ型赤血球
および20％A1B型赤血球のNB1／48および
NB1／19によるタイル凝集時間を測定した。使
用された試薬は赤血球が20％で使用された以外は
表２に関連して記載したものと同一である。各希
釈物の2μアリコートを不透明のガラスタイル
上で赤血球20μと混合し、規則的に振り動かし
た。混合の瞬間にペダル操作式ストツプウオツチ
をスタートした。表４は凝集が生じる時間（秒）
と５分後の凝集の程度を示す。凝集の程度は表３
に関連して定義したものと同じである。たとえ
ば、13Vは十凝集が13秒後に起り、５分後に非常
に強い凝集があつたことを示す。 【表】 【表】 異る試薬の２倍希釈溶液について得た結果およ
びNB1／19.112.28の相対効力を表５に示す。た
とえば、４倍希釈の場合、テストした培養上情の
調整物は市販の抗Ｂ血情と比べてA1B血球に対す
る満足しうる反応を示した。 【表】 すべてのABO特異性を有する単一クローン抗
体が等しく血液型分類に適しているわけではな
い。ここで挙げた例では３つの単一クローン抗Ｂ
の中２つはBGRL標準に比肩しうる特性を有して
はいるが、他の１つに比べると不充分な血液型分
類試薬であつた。 単一クローン抗Ｂの特異性は定義的なフアンク
シヨンナルアフイニテイ−の測定を可能にするも
のである。フアンクシヨンナルアフイニテイーは
２つの方法によつて表わすことができる。 第一に、フアンクシヨナルアフイニテイーは、
単一クローン抗BIgＭ分子と赤血球上の（対応す
る免疫化学上の型の）Ｂ決定基との間の会合反応
の平衡定数として表わすことができる。この平衡
定数（以後Ｋで示す）はまず溶液中に存在する結
合可能な抗体の異なるレベルにおける125I標識抗
Ｂ抗体とＢ型赤血球の平衡結合量を測定すること
によつて得られる。実験は次のとおり行われた。 測定はすべて２回ずつ行つた。125I標識NB1／
19およびNB1／48の直線希釈系列（linear
dilution series）をハミルトン注射器を使つて正
確にピペツトすることによつて（注射器は各試験
管ごとに５回洗浄する）緩衝液（0.8％BSA−
EBSS＋10mMHepes＋0.1％NaN3 PH7.4）中で
調整した。125I 標識抗体の25μ部分を1.5mlべツ
クマン、マイクロフユージチユーブ（Beckman
microfuge tubes）に加え、次いで新鮮なＢ型血
球２×106を含む緩衝液15μを加えた。測定用混
合物をローラ上で４℃でインキユベートした。６
時間後に氷で冷やした緩衝液1.5mlを急速に添加
し、直ちに15秒間マイクロフユージ回転を行い上
清を取り出した。緩衝液添加からマイクロフユー
ジのスイツチ投入までの時間は２〜４秒であつ
た。コントロールインキユベーシヨンにおいて、
A1型血球２×106でＢ型血球を置換し、添加結合
可能カウントのそれぞれ1.2〜2.0％、0.9〜1.2％
を占める125I標識NB1／19およびNB1／48の結合
を実験値から減算した。その結果を第１図に示
す。第１図はNB1.19およびNB1／48について添
加結合可能抗体量に対する125I抗体の結合量
（epm×10-3）をプロツトしたものである。これ
らのグラフから125I標識抗ＢのＢ型赤血球に対す
る平衡結合特性の修正スカツチヤードプロツトを
作ることができる。このような図を第２図として
示す。第２図はNB1／19とNB1／48双方につい
ての値を示す。またNB1／48は内側のグラフ中
に拡大して示す。どちらの場合もＸ軸に対する外
挿法は飽和状態での結合抗体量を示している。 平衡定数はスカツチヤードプロツトから容易に
計算できる。 またフアンクシヨナルアフイニテイーは単一ク
ローン抗BIgＭ分子と赤血球上のＢ決定基（相当
する免疫化学型の）との間に形成される免疫複合
体の解離反応の解離速度定数として表わすことも
できる。解離速度定数（以後Ｋ−１で示す）は０
時間をとつて作られる解離曲線の接線のこう配を
測定することにより125I標識単一クローン抗Ｂの
赤血球からの解離時間変化のグラフから計算する
ことができる。 ある実験では４℃および室温における125I標識
抗Ｂ抗体のＢ型赤血球からの解離速度を冷却した
抗体が過剰の状態で測定した。125I標識NB1／19
（結合可能抗体：6.0×105cpm、50ng）また
NB1／48（9.0×105epm：124ng）を25μずつ1.5
mlマイクロフユージ管に加え次いでＢ型赤血球２
×106含む緩衝液（0.8％BSA−EBSS＋10mM
Hepes＋0.1％NaN3PH7.4）25μを加えた。混合
物をローラ上で４℃でインキユベートした。１時
間後これらの管の中の４本に氷で冷やした緩衝液
1.5mlを急速に加えた後直ちに血球をエツペンド
ルフマイクロフユージ（Eppendorf mierofuge）
中で15秒間回転して沈澱させた。上清を素早く取
り除き、結合した放射能（epm）を測定するため
血球を移した。 ２時間インキユベートした残りの測定管に
NB1／19培養上清の125倍硫酸アンモニウム濃縮
液を緩衝液で1/10に希釈したものを25μ加え
た。次いで混合物75μをローラ上で４℃または
室温でインキユベートした。異なる時間（15分〜
24時間）に冷緩衝液を加え血球を直ちに沈澱させ
上記の方法で係数した。コントロールインキユベ
ーシヨンにおいてA1型血球２×106をＢ型血球に
置換し、１時間４℃のインキユベーシヨン後の
NB1／19およびNB1／48の結合（追加計数の1.1
％および1.9％）を実験値から減算した。したが
つて結合は２時間のインキユベーシヨン前の時間
（pr−eincubation peried）終了時における結合
数の百分率として表わされた。125I標識NB1／19
およびNB1／48におる100％結合はそれぞれ9.1×
104epmおよび715×104であつた。 最後の反応混合物では、培養上清中の単一クロ
ーン抗体の濃度を少くとも10μ／mlと見なす
と、標識抗体の少くとも40倍過剰の冷却BN1／
19が存在していた。 上記諸結果を第３図に示す。第３図ａは24時間
の期間における解離を示し、第３図ｂは時間軸を
拡大して最初の45分間を再プロツトしたものであ
る。 さらに他の実験において、125I標識抗Ｂ抗体の
Ｂ型血球またはA1B型赤血球２×106からの室温
における解離速度を過剰の冷却抗体の状態で測定
した。実験の操作は前記と同様であるが、冷却抗
体を抗原で標識した抗体複合体に加えた後血球を
２分置きに沈澱させこれを10分間続けた点で異
る。その結果の処理は前記と同一である。その結
果以下の諸値が使用されまたは得られた。 【表】 結果を第４図に示す。第４図はＢ型赤血球に
関するものであり第４図はA1B型赤血球に関す
るものである。 上記各実験によつて測定したフアンクシヨナル
アフイニテイーおよび上記他の実験で測定した特
性をNB1／19.112.18およびNB1／48.30.40につい
て下表６および７に要約する。 【表】 【表】 【表】 最後に、NB1／19.112.28を自動血液型分類機
に使用した場合の血液型分類試薬としての効力、
パパイン処理赤血球を使用し場合のNB1／
19.112.28の選択性およびその熱安定性を試薬す
るため若干の実験を行つた。 光学的密度読取りおよびマイクロプロセツサに
よるプリントアウト機能を備えた最近の自動血液
型分類機16Cにより自動血液型分類テストを行つ
た。その際１％メチルセルローズおよび0.25％プ
リメリンを使用して試薬を増強した。 単一クローン抗体NB1／19.112.28培養上清の
１／１５希釈液を844のクエン酸処理した供血者血液
試科について自動血液型分類機16Cで試験した。
表８に示す結果はすぐれたもので、BGRL抗
B1／10希釈液を同一の試料について使用して得
た結果と同一であつた。どちらの試薬も誤つた陽
性または陰性結果を示すことはなかつた。 【表】 上記の試験管内およびタイル生理食塩水テスト
ならびに１％メチルセルローズおよび0.25％プロ
メリンで増強した血球を使用した自動テストにお
いて、単一クローン抗ＢはA1型血球または０型
血球とはまつたく反応しなかつた。N1B／
19.112.28の抗Ｂ特異性は、表９に示すように、
パパイン処理した場合および20％アルブミンを使
用した場合においても維持された。NB1／
19.112.28の凝集活性の限界増強効果（marginal
enhancement）がこれらのテストにおいて観測
され、これは特にパパイン処理をしたA1B型血球
について顕著であつた。 【表】 安定性試験において、無希釈NB1／19.112.28
培養上清の２mlのアリコートを異る諸条件下にさ
らした後室温で力価および結合性を再び測定し
た。 反復凍結触解（表10参照）によつて抗Ｂ活性レ
ベルが減少することはなかつた。 【表】 ＊ 無希釈上清の処理後の希釈
短時間の熱安定性試験（表11参照）は、単一ク
ローン抗Ｂが−20℃および４℃での貯蔵に対して
も、また56℃でのインキユベーシヨンに対して
も、安定であることを示している。 【表】 ＊ 無希釈上清の処理後の希釈
無希釈の上清は添加剤を使用しなくても少くと
も超免疫商業試薬と同等の効力を有する。それは
日常の分類作業で出くわす弱いＢ型（A1B型およ
びBcprd型血球）を検出するのに好適な迅速です
きまなく凝集したタイル反応を呈する。それはま
た自動血液型分類にも安心して使用することがで
きる。２回クローン化した抗体産生雑種細胞系列
は大型の組織培養器中で成長するように適合さ
れ、くり返し継代培養をすることにより均一な特
性の抗体を分泌し続ける。連続成長によつて作ら
れた大量の活性培養上清はスクリーニングテスト
の回数が個々にスクリーンされる多数の供与血清
から同量のヒト試薬を生産するために現在必要と
されている回数よりもはるかに少くてすみ、テス
トに要する手間をかなり省けるという利点を有す
る。また強力な培養上清１を作るための材料費
は５ポンドという低コストであるが、この費用は
活性上清の許容しうる希釈調整物（表５参照）を
使用することによつてさらに低減することができ
る。
異性を有する単一クローン抗体（monoclonal
antibody）。 ２ Ｂ型血球の抗原決定基に対する特異性を有
し、該決定基を有するＢ型血球試料の凝集を生じ
させることができる請求の範囲第１項記載の単一
クローン抗体。 ３ 該抗体とＢ型血球との間の相互作用の平衡定
数が1.3×107M-1よりも大きい請求の範囲第１項
または第２項記載の単一クローン抗体。 ４ 該抗体とＢ型血球との間の相互作用の平衡定
数が1.2×108M-1よりも大きい請求の範囲第３項
記載の単一クローン抗体。 ５ 該抗体と血液型ＢのＢ型血球を含む免疫複合
体の解離反応の速度定数が2.2×10-2sec-1より小
さい請求の範囲第１項または第２項記載の単一ク
ローン抗体。 ６ 該抗体と血液型ＢのＢ型血球を含む免疫複合
体の解離反応の速度定数が7.6×10-4sec-1より小
さい請求の範囲第５項記載の単一クローン抗体。 ７ 該抗体と血液型A1BのＢ型血球を含む免疫複
合体の解離反応の速度定数が5.0×10-2sec-1より
小さい請求の範囲第１項または第２項記載の単一
クローン抗体。 ８ 該抗体と血液型A1BのＢ型血球を含む免疫複
合体の解離反応の速度定数が3.4×10-3sec-1より
小さい請求の範囲第７項記載の単一クローン抗
体。 発明の分野 本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、特
に単一クローン抗体の血液型分類試薬としての使
用に関する。 発明の背景 脊椎動物の体内に異物（抗原物質）が入ると免
疫反応が生じる。この免疫反応の目的は、抗原物
質が動物の体に障害を与えることを防ぎこのよう
な抗原物質を体から除去することである。免疫系
は、抗原物質を選択的に認識し抗原物質の特定の
複数の部位に結合する特性を有する免疫グロブリ
ン分子（以後抗体という）を生産することによつ
てこの目的を達成する。これらの部位は決定基と
して知られ、１つの抗原はこのような決定基を１
ないし複数有することができる。免疫系によつて
産生された抗体はそれぞれ単一の決定基に対して
のみ特異性を有しているが、抗体が産生される源
となる抗原物質が複数の決定基を有している場合
は複数の異る抗体が産生される。 抗体の主な機能は、有害な異物を凝集すること
によつてこの物質を除去する正常な体の機能を助
け、これによつて体の有害な異物から保護するこ
とである。 抗体による抗原物質の凝集は、血液型分類の分
野では、体外においても実用的に利用されてい
る。 赤血球はその表面に多くの異る、かつ特色のあ
る抗原決定基を有しており、これらの決定基の性
質にもとずき、血液をいくつかの型（たとえば
Ａ、Ｂ、Ｏ、A1B、A2B、Bcprd）に分類するこ
とができる。血液供与者から血液被供与者への輸
血に際しては輸血される血液が血液被供与者の血
液と同型であることが必要である。もし同型でな
いと、血液被供与者の免疫系は輸血された赤血球
の表面のなじみのない決定基に対して抗体を生成
する。外来の赤血球に対するこのような抗体の反
応は血液型分類技術の基礎をなすものである。 広い意味では、血液試料の分類は、その試料の
型の赤血球の表面にある複数の決定基に対する抗
血清を添加しときに生じる試料中の赤血球の凝集
等を検出することに依存する。凝集は肉眼で容易
に見られまたは機械で自動的に検出が可能な巨視
的な効果である。 従来血液型分離試薬の主要な供給源は被術者
（humansubject）の超免疫化
（hyperimmunisation）によるものであつた。こ
れは被術者の血液型と異る型の血清を致死量に至
らない相当量だけ被術者の体内に入れることによ
つ行われる。これは正常な免疫反応に生起し、そ
の結果被術者の血液中に抗体が産生される。次い
でこの血液の試料をとり、それから抗体試薬を作
る。このような試薬は、未知の血液試料が最初に
人体血清供与者の体内に入つたものと同型のもで
あれば赤血球の可視的な綿状沈殿
（floeealation）または凝集（aggin−tination）
を生じるので、未知の血液試料の分類に使用する
ことができる。 実際には、２つの型の血液型分類テストが行わ
れている（エフ、ダンスフオードおよびシー、バ
ウリー「血液型分類技術」第２版1967年）。第１
の型のテストでは、まず分類すべき血液の試料を
血液型分類タイル（blood grouping tile）上に
載せる（英国薬局方、「ABO供与者の決定」の項
参照）。次にこの血液試料をタイル上で抗血清試
料と混合する。その後凝集が起れば、それは分類
すべき血液の未知試料が抗血清が生成した血液型
と同型の血液型に属することを示すものである。
実際にこのようなタイル凝集分類テストは救急処
置の場合に日常的に行われている。 第２の型のテストにおいては、分類すべき血液
試料を抗血清とともに試験管内で生理食塩水中に
置き標準時間（２時間）静置する。凝集の存在は
標準時間内に生じた沈降によつて判別することが
できる。緊急な場合にはテストを促進するため遠
心分離が行われる。 特定の血液型分類試薬の効き目はそれが凝集体
（ag−glutinant）を生成する速度およびその凝集
素（agg−lutinin）としての能力と濃度との比例
の仕方とによつて判断される。 これらの基準中前者はこの分野において通常
「結合活性」と呼ばれている。特定の血液型分類
試薬の結合活性時間は血液試料を試薬と混合して
から試料の認識しうる凝集が起る時までに要する
時間として定義される。 血液型分類試薬の希釈特性を決定するため、生
理食塩水凝集力価を測定する。この測定には、試
薬すべき血液型分類試薬の生理食塩水２倍希釈溶
液を等量ずつ複数調整する。次いで各希釈溶液に
既知の量の適当な赤血球懸濁液を加える。この場
合すべての希釈溶液に同量の懸濁液を加える。各
希釈溶液試料を標準時間（通常２時間）静置し、
その時間経過後顕微鏡下で凝集カウント
（agglutination count）を行う。相当量の凝集が
生じる最大希釈の試料を決定し、この希釈を「生
理食塩水凝集力価」（saline agglutina−tion
titre）と名付ける。したがつて、高い生理食塩
水凝集力価を有する試薬は強力な凝集素である。 被術者の超免疫化の技術を用いることにより赤
血球決定基に対する抗体を産生する場合は２つの
問題が生じる。第一に、血清は供給に限界があ
り、現在多きな外科手術のひん度が増大するにつ
れて血液型分類の必要性が著るしく高まつてい
る。このため他の医療上の用途にも必要な人体血
清の供給がひつ追している。その上、目然に生成
した赤血球に対する抗体の凝集効果はある程度ば
らつきを生じる傾向がある。その理由の一つは、
免疫応答は、各構成抗体が上記のように各々が一
つの決定基に対して得意的作用を有する複数の抗
体の「カクテル」（混合物）を生じさせる、とい
うことである。このカクテルの中の各種抗体を分
離することはできないので、従来の抗血清は複数
の抗体の混合物を含み、この混合物は動物によつ
て異る（さらに同種の動物内においても、また日
によつても）。同一の血液型のすべての赤血球に
ついて同一の決定基のセツトが存在することがな
いので、免疫応答は多くの場合非常にまちまちで
ある。 要約すると、血液型分類に適当な試薬は次の条
件を備えていなければならない。 (1) 適当な抗原に対し特異性を有すること。 (2) 比較的に弱い血液型に対し、日常の血液型分
類法によつても緊急時の血液型分類法によつて
も、良好な巨視的反応を示すために充分に強力
であること。 (3) 使用諸条件下において安定であること。 (4) 比較的に安価で容易に入手可能であること。 最近の分子生物学の発達は、抗体を産生する脾
細胞とミエローマ細胞から雑種細胞（ハイブリド
ーマ）を産生することにより高度に特異性を有す
る抗体を生産する技術を提供した。コーラーとミ
ルステインの業績であるこの技術（Eur.J.
Immunol ６292−295（1976）、Nature 256
495−497（1975）、Eur.J.Immunol ６511−519
（1976）参照）は、抗体の無限の供給量を生産す
る方法を提供するものである。抗体を産生する雑
種細胞はただ１種の免疫グロブリン分子、即ち一
つの決定基に対し特異性を有する免疫グロブリン
のみを産生するので、産生された抗体は単一クロ
ーン抗体と命名されている。雑種細胞はミエロー
マ細胞とリンパ細胞の２つの望まいし特徴を結合
する。即ちミエローマ細胞は不死の性質を有し試
験管の中で自己複製することができる一方リンパ
細胞は抗体を表現する望ましい特性を有する。し
たがつて、このような雑種細胞は、純粋で明確な
免疫グロブリンの恒久的な供給源である。雑種細
胞を産生するために使用される方法は、通常マウ
スに適当な抗原で免疫を与え、免疫反応が起るの
に充分な時間をかけた後マウスを犠牲にしてその
脾臓を取り出すことである。次いで脾臓から細胞
懸濁液を作り、この懸濁液をマウスのミエローマ
細胞の懸濁液と混合する。これら２種類の細胞の
融合を促進するためにポリエチレングリコールを
用いることができる。その結果１つのリンパ細胞
から得られるハイブリドーマ培養個体は１種類の
抗体即ち１つの特定の決定基に対し特異的な抗体
を産生する。 この技術はポーク等によつてＡ型赤血球の決定
基に対する単一クローン抗体を産生するために使
用され（Vox Sanguinis 39 134−140（1980））、
このような単一クローン抗Ａ抗体（monoclonal
anti−A′）は有益な血液型分類試薬であることが
示されている。 しかしながら、今までは、マウスをヒトのＢ型
血球で免疫化してもミエローマ細胞と融合して抗
Ｂ免疫グロブリンを作るハイブリドーマ細胞を形
成しうるような脾細胞はできないものと一般に考
えられていた。 われわれは、驚くべきことに、実際にはそうで
はなく、融合は容易に得られ、その結果単一クロ
ーン抗Ｂ抗体を高能率で表現するハイプリドーマ
細胞を形成することにより、有益な生理食塩水凝
集力価特性を有する高結合活性の特異的血液分類
試薬を生産することができることを発見した。さ
らに、当該単一クローン抗Ｂ抗体とＢ型血球の間
に形成される免疫複合体に関する平衡定数と解離
速度定数とを定義できることが判つた。従来知ら
れていた血液型分類試薬は異る特異性を有する免
疫グロブリンの混合物を含むものであつたから従
来は血液型分類試薬と赤血球の間に形成された免
疫複合体の力のこのような定量分析は不可能であ
つた。したがつて従来達成できた最善の数字でも
精々平均値にすぎなかつた。 発明の説明 本発明によれば、Ｂ型血球の抗原決定基に対し
特異性を有する単一クローン抗体が提供される。 本明細書においては、Ｂ型血球はＢ型血球上に
のみ見出される１以上の抗原決定基を有するすべ
ての赤血球を含むものとする。このような決定基
を有する血液型の例はＢ、A1B、A2Bおよび
Bcprdである。 単一クローン抗体はマウス、IgM、単一クロー
ン抗Ｂ免疫グロブリンであることが望ましい。 単一クローン抗体は前記の決定基を有するＢ型
血液の試料を凝集させる能力を有するものである
ことが望ましい。単一クローン抗体とＢ型血球と
の間の相互作用の平衡定数が1.3×107M-1より大
きい単一クローン抗体、特にこの平衡定数が1.2
×108M-1より大きい単一クローン抗体の場合に
は特に有益な上記の特性が得られることが判つ
た。本明細書において言及する平衡定数の価はフ
アンクシヨナルアフイニテイー（functional
affinities）即ち多価の抗体（IgM）と赤血球と
の間の相互作用について行われる測定値である。
この点で、この価は１価の抗体（IgG）と抗原と
の間の相互作用について得られるイントリンシツ
クアフイニテイー（intrinsic affinities）とは異
る。イントリンシツクアフイニテイーはフアンク
シヨナルアフイニテイーと直接比較することはで
きない。本発明の単一クローン抗体について計算
しうる諸価は使用される検定法に従うものであつ
て、単一クローン抗体の特徴ずけに関する以下の
記載において詳細に述べることにする。 本発明の他の特徴は、単一クローン抗体が、当
該抗体と血液型ＢのＢ型血球とを含む免疫複合体
の解離反応の速度定数が2.2×10-2sec-1より小さ
く、望ましくは7.6×10-4sec-1より小さいもので
あることである。 本発明の他の特徴は、単一クローン抗体が、当
該抗体と血液型A1BのＢ型血球を含む免疫複合体
の解離反応の速度定数が5.0×10-2sec-1より小さ
く、望ましくは3.4×10-3sec-1より小さいもので
あることである。 本明細書において言及する解離定数の値は上記
のとおりフアンクシヨナルアフイニテイーであ
る。 本発明は、さらに、マウスにＢ型物質を注射
し、このマウスを犠牲にし、その脾臓を取り出し
脾細胞の懸濁液を形成し、この脾細胞をマウスの
ミエローマ細胞と融合して雑種細胞を形成し、該
雑種細胞をクローン化し、該クローン化した雑種
細胞に単一クローン抗体を分泌させるようにした
単一クローン抗体の産生方法を提供する。 前記雑種細胞はクローン化の前に選択されるこ
とが望ましい。 前記ミエローマ細胞はNS1細胞であることが望
ましい。さらに、本発明は、上記の方法によつて
産生された単一クローン抗体、該単一クローン抗
体を分泌することができるハイブリドーマ細胞お
よび該単一クローン抗体を含む血液型分類試薬を
包含するものである。 【図面の簡単な説明】 第１図はＩ標識抗Ｂ抗体とＢ型赤血球の平衡結
合を示す図である。 第２図は125I標識抗Ｂ抗体とＢ型赤血球の平衡
結合を示す修正スカツチヤード図（Scatchard
plot）である。 第３図は４℃および室温におけるＢ型赤血球か
らのＩラベル抗Ｂ抗体の解離速度を示す図であ
る。 第４図は室温における２×106赤血球または
A1B赤血球からのＩ標識抗Ｂ抗体の解離速度を示
す図である。 ハイブリドーマ細胞の調整についての一般的説
明 抗種抗体（anti−species antibody）を取出す
ためＯ型血球で吸収した後血清試料を抗Ｂ活性に
ついて検定することにより適当なマウスを見出し
た。吸収後の抗Ｂ凝集力価１：８のマウスに対し
完全フロインドアジユバント（Difco Bacto）
0.1ml中のＢ型物質100μｇを腹膜内に注射した。
５週間後同じ操作を繰返し、さらに９週間後Ｂ型
物質の0.1ml生理食塩水水溶液200μｇを静脈注射
により追加投与した。３日後に脾臓を取り出し脾
細胞懸濁液を調整した。 脾細胞（108）をポリエチレングリコールを使
つてマウスのミエローマNS1細胞（107）と融合
した（コツトン他Eur.J.Immunol ３135−140
（1973）、ダンスフオードおよびバウリー（上掲）、
ガルフレ他Nature266 550−552（1977））。成長
する雑種細胞をその特定の抗Ｂ活性産生能力によ
つて選択した。これはヒトのＡ、Ｂ、Ｏ赤血球を
用いる凝集検定によつて培養上清中に懸出され
た。抗Ｂ分泌雑種細胞は軟寒天培地上で２回クロ
ーン化し、最終的に５％ｖ／ｖの分子牛胎児の血
清（FCS、Sera−Lab）を補充したジユルベツ
コ、モデイフアイド、イーグルス、ミデイアム
（Dulbecco′s Mobified Eagle′s Modium
（DMEM、Gibco Biocult））中のスピナ培養
（sp−inner−cultures）１リツトルに培養した。
クローン化した雑種細胞は液体窒素中に貯蔵し
た。 遠心分離により細胞と砕片を除去し、ミリポア
フイルターで過し、10ｍＭのHEPES緩衝液と
0.1％アジ化ナトリウムを添加することによつて
単一クローン抗体を含む組織培養上清を調整し
た。各バツチのアリコートを日常の使用のために
４℃で貯蔵し、かつ貯蔵用として−20℃で貯蔵し
た。 雑種細胞の調整に使用する材料と方法についての
詳細な説明 マウスとラツト B10、BR、C3H／He−mgその他のマウスを
最初オーエルイシー1976リミテツド
（OLAC.1976Ltd）（英国Bicester）から得、次い
でOLACマウスから育生したメデイカル、リサー
チ、カウンシル株（Medical Research Councii
stocks）から得た。AKRマウスはバンテイング
（Banting）およびキングマン（King−man）（英
国York）から得た。（C3H×BALB／Ｃ）F1マ
ウスおよびLou、DA、AOラツトはメデイカル、
リサーチ、カウンシル動物舎で育生した、ウイス
ター（wistar）、PVG、WAGおよびスプレイグ
ドーリー（Sprague−Dawley）ラツトはバンテ
イングおよびキングマンから得た。試験および免
疫用のマウスは生後６〜８週間のものであつた。 免疫化 免疫化に使用するヒトＢ型物質 ダブリユ、ワトキンス博士（クリニカル、リサ
ーチ、センター、英国ハロー）はフエノール（95
％）に不溶、硫酸アンモニウム（100％）に不溶、
エタノール（45〜55％）に不溶、かつ水に可溶
な、モーガン法（1965年）によつて得られる凍結
乾燥した卵巣嚢（ovarian cyst）液の抽出物であ
るヒトＢ型（およびＡ型）物質を提供した。これ
らは炭水化物80〜85％（Ｌ−グルコース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−フルコサミン、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース）、アミノ酸15
〜20％（主としてＬ−スレオニン、Ｌ−セリン、
Ｌ−プロリン）およびシアル酸１〜２％からなる
糖たん白である。これらの物質は凍結乾燥して受
領し、0.9％生理食塩水中で溶解して２mg／mlと
し、−20℃で貯蔵した。 完全フロインドアジユバント（CFA）中でのＢ
型物質エマルジヨンの調整 0.9％生理食塩水中の２mg／ml濃度のＢ型物質
１mlをCFA（Difco Baeto）、即ちBayol Ｆ、油
およびマンニツトオレイン酸洗剤の混合物で結核
菌（Myco−bacterium tuberculosis）を含有す
る混合物）１mlに添加した。混合物を２方向タツ
プで直角に連結した２個の５ml注射器中で強く撹
拌し（英国チヤンス、ワーリー）、白いクリーム
状物質が形成されるまで（10分〜20分間）間欠的
に氷で冷却した。このクリーム状物質は水上に適
下しても拡散しかつた。CFAはいまだに最良の
免疫応答補助剤の一つである（ボンフオード1980
年参照）。肉芽腫が形成されることがあるので異
なつた場所で繰返し注射を行つた。 免疫化スケジユール 適当なマウスを見出すため、免疫化していない
マウスの尾から採血し、抗種抗体を除去するため
Ｏ型赤血球で吸収を行つた後、血清をＢ型赤血球
で試験管凝集により検定した。 高い抗Ｂ力価を有する生後６〜８週間のメスノ
B10、BR マウスおよびC3H／He−mgマウスに
対し次の３つの調剤の１つを腹膜内に注射した。
即ちCFA0.1ml中のＢ型物質100μｇ、CFA0.1ml中
のＢ型物質10μｇ、またはパツクたＢ型赤血球
（４回洗浄）0.1mlのいずれか１つである。２週間
後マウスの尾から採血を行つた。 高い血清力価を有するB10、BRマウスに対し
５週間ごとにＢ型物質100μｇもしくは10μｇの腹
膜注射を繰返し行うか、または最初の注射の後３
週間後、４週間後および５週間後に赤血球0.1ml
を繰返し注射した。最後の注射後１週間後、３週
間後および６週間後にマウスの尾から採血した。 血清の収集 マウス尾部からの採血0.5mlを合成樹脂製チユ
ーブに収集し、37℃で１時間静置して凝塊とし、
この凝塊の収縮を助けるためチユーブから解放し
た。分離した血清を0.9％生理食塩水で希釈し、
56℃の水浴中で20分間保温し、必要に応じＯ血球
またはA1血球で吸収した。アリコートを−20℃
で貯蔵した。 血液型Ｂに対する単一クローン抗体の調整 この段階での処理の一般的アウトラインは所望
の反応性を有する単一クローン抗体を産生するた
めのコーラーとミルステインによつて書かれた基
本原理（上記参考文献参照）に従う。 脾細胞 ヒポキサンチン グアニン ホスホリボ
シル トランスフエラーゼ（HGPR−Tase）
＋ve 特異的Ig ＋ve 末端で分化（terminally different−iated） ミエローマ細胞 HGPRTase −ve 特異的Ig −ve 不 死 −ve 雑種細胞 HGPRTase ＋ve 特異的Ig ＋ve 不 死 融合されないミエローマ細胞はHGPRTaseを
欠損しており、したがつて選択された媒体中では
死んでしまう（リトルフイールド、Science
145、709−710、1964年）。また融合されない脾細
胞は組織培養中で生き残ることできない。脾細胞
とミエローマ細胞の雑種細胞のみがHGPRTase
と不死性をともに備えており、したがつて生き残
ることができる。そこで所要の特異性を有する抗
体を分泌する細胞を選択することができる。即
ち、雑種細胞は両方の親細胞のそれぞれの長所を
備えている。 ストツク溶液 50％ポリエチレングリコール（P.E.G.）溶液 10ｇのP.E.G.1500（BDH Lot G573370）を高
圧滅菌し、直ちに45℃の水浴に移した後37℃で
DMEMを10ml添加した。 アミノプエリンストツク1000X アミノプテリン（シグマ）をわずかに暖めた
0.008M NaOH中で0.176mg／mlに溶解し、−20℃
で暗所中に貯蔵した。 HTストツク100X ヒポキサンチン（シグマ）136.1mgとチミジン
（thymidino）38.75mgをDDW100ml中にふつとう
により溶解し−20℃で50mlアリコートとして貯蔵
した。 50ml DMEM 50ml HT100X 調整した溶液は過し（ミリポア、孔の大きさ
0.22μｍ）−20℃で13mlアリコートとして貯蔵し。
解凍後HTを60〜70℃で加熱して再溶解した。 HAT媒体50X DMEM 45ml HT100X 50ml アミノプテリン 1000X ５ml 溶液を上記と同様に13mlアリコートとして、
過し、貯蔵し解凍した。 20％FCS−DMEM中のHAT（HAT媒体） DMEM 400ml FCS（バツチ901112） 100ml Ｐ／Ｓ ８ml グルタミン ８ml ピリミジン（Pyr） ６ml HAT媒体50X 10.6ml （1.0×1.0-4M ヒポキサンチン、4.0×4.0-7Mア
ミノプテリン、1.6×10-5Mチミジン） 20％FCS−DMM中のHT（HT媒体） 上記の調整法中HAT50XをHT50X10.6mlで置
き換えた。したがつて次の用語を使う。 無血清DMEM（serum froo DMEM）＝DMEM
＋PS＋グルタミン＋ピリミジン 20％FCS−DMEM＝無血清DMEM＋20％FCS HAT媒体＝20％FCS−DMEM＋HAT HT媒体＝２％FCS−DMEM＋HT 抗Ｂミエローマ雑種細胞の産生と初期選択 コーラー等によつて記述された方法に従つて細
胞融合を行つた（上記文献参照）。準備として、
次の諸媒体を空気中の５％CO2雰囲気で37℃で一
晩かけて平衡させた。 (1) 50％PEG溶液 (2) 無血清DMEM (3) 20％FCS−DMEM 上記媒体は48のリンブローウエル（Linbro
well）に分配された1.5mlアリコートを含む。 融合を行う日の朝、脾臓を無菌状態で取出し、
細胞を無血清DMEM10ml中に細分して入れ、次
いで10ml遠心管に移した。細胞塊を沈降させるた
め５〜10分時間をかけ、次いで懸濁細胞をピペツ
トで取出し無血清DMEM中で２度洗浄した。１
個の脾臓から1.4×108の懸濁細胞が得られた。こ
れらの細胞の中108は５〜10mlの無血清DMEM中
で採集された。同時に、スピナ培養中で2.6×
106／mlで培養した107ミエローマNSI細胞を２度
洗浄し無血清DMEM5ml中に再懸濁した。 脾細胞（108）とミエローマ細胞（107）を含む
媒体を50mlコーニング管に貯え、400ｇで５分間
室温で遠心分離することによつて細胞を沈澱さ
せ、次いでアスピレータポンプ付属パスツールピ
ペツトを使つて媒体をできるだけ完全にアスピレ
ートした。管を37℃の水の入つたビーカー中に支
持し、50％PEG溶液（37℃で平衡させたもの）
１mlを１分間にわたりゆつくりと添加した後さら
に１分間この添加に用いたピペツトの端で静かに
撹拌した。次いで懸濁液に対し無血清DMEM（37
℃で平衡させたもの）を最初２分間は毎分１ml、
次の４分間は毎分２mlの割合で、次に10mlを滴状
で、さらにその後は自由に50mlまでゆつくりと添
加するこそにより懸濁を希釈した。各添加ごとに
管を静かに撹拌した。遠心分離（400ｇで５分間）
後、細胞を前記添加に用いた24mlピペツトで静か
に20％FCS−DMEM（平行させたもの）25ml中に
注入することによりこの溶液中に懸濁させた。次
いで20％FCS−DMEM中の融合混合物を、平行
させた20％FCS−DMEM1.5mlを含む48のリンブ
ローウエルに0.5mlアリコートとして分配した。 供給細胞として、残りの脾細胞を希釈し、およ
そ４×105／ウエルの割合で滴下することにより
添加した。次いで培養トレイを空気中CO25％、
温度45％雰囲気中で37℃でインキユベートした。 翌日（第１日）および細胞融合後第２日、第３
日、第７日、第11日に各培養媒体の上半分を取り
除き（起りうるクロスコンタミネーシヨンを避け
るため各ウエルごとに別個のパスツールピペツト
を使つた）、空気中５％CO2で平衡させた等容量
のHAT選択媒体（リトルフイールド1964年）で
置換した。 雑種細胞の成長および起りうる酵母菌または微
生物による汚染を検査するため培養を毎日観察し
た。その際培養基をインキユベータの外に置く時
間は極力短かくするようにした。細胞単層の成長
が全面成長に近くなつた時（細胞融合後約14〜21
日、それは媒体が（フエノール）赤色から黄色に
変色する時とほぼ同時である）、培養上清をはじ
めて試験した（Ａ型、Ｂ型およびＯ型赤血球を用
いる凝集により）。その日１mlピペツトで細胞を
懸濁させ、１mlの細胞懸濁液を１mlのHAT媒体
（37℃で平衡させたもの）に移すことにより陽性
の培養を下部分類した。元の培養にはHAT媒体
を補充した。インキユベータの故障に対する安全
対策とさて分割した培養を別個のインキユベータ
で成長させ、凝集により定期的に検定し、できる
だけ早く10％DMSOを含むFCS中の液体N2中で
凍結した。陰性の培養は媒体が黄色を呈したとき
再検査した。酵母歯または微生物による汚染に対
して、45％EtOHを添加した後５分間培養をアス
ピレートし、空のウエルをEtOHで洗浄すること
によつて対処した。培養トレイ上の分割した媒体
を常に直ちにアスピレートした。 融合ウエルの最初の検査後４〜10日後に継代培
養を再検査し、陽性培養のアリコートを凍結する
かまたはクローン化用にまわした。 抗Ｂ分泌雑種細胞の単離 コツトン等によつて記述されたように（上記文
献参照）、選択した培養からの細胞のクローン化
を軟寒天上で行つた。0.9％生理食塩水中の１％
寒天（Difco Bacto）50ml（45℃）をHAT−
DMEM2X（2X DMEM100ml＋ｐ／S4ml＋グル
タミン４ml＋ピリジン４ml＋FCS75ml＋50X
HAT 7.8ml）（45℃）に添加することにより
HAT媒体中の0.5％寒天溶液を調整した。この寒
天混合物を９cmペトリ皿（ヌンク（Ｎ−unc））
に各皿15mlずつピペツトで注入し、層流組織培養
フード内にふたをとつた状態で５分間凝固させた
後ガスを入れたインキユベータ中で30分間平衡さ
せた。 リンブローウエルで作つたDMEMの３倍溶液
６杯中の１mlの細胞に0.5％寒天HAT−DMEM1
mlを添加した。２mlの混合物をsetした寒天上に
均一に重ね、前記と同様に空気乾燥し、空気中５
％CO2の雰囲気中で37℃でインキユベートした。 14〜20日後、複数の分離した肉眼で見える細胞
コロニーが形成された。その中の多くは単一の細
胞から成長していた。これらのコロニーは細いパ
スツールピペツトを使つて最小数のコロニー（通
常10〜20）を含む皿から採取し、ガスを入れたイ
ンキユベータ中で平衡させたHAT−DMEM1ml
を含むリンブローウエルに植えつけた。 培養成長の通常のサイクルに従つて凝集の有無
を検査し、培養を分割し、その中のあるものを液
体N2中で凍結した。次いで培養の半分を等量の
HT媒体に順次移して２、３回通し次いで20％
FCS−DMEMに通し、これらの操作に全体で５
〜６日かけることによつて選択クローンをHAT
から引離した。 細胞を前述の方法で、ただし0.5％寒天を含む
20％FCS−DMEM中で、再クローン化した。こ
うして２度クローン化した細胞を、(1)培養上清が
赤血球に対し強い凝集を示す能力および(2)急速な
高密度細胞成長を示すことを条件として選択し
た。２日置きに培養の半量を順次10％、５％、
2.5％FCSを含む媒体にそれぞれ移すことによつ
て選択したクローンを低FCS中で成長させるよう
にした。 希釈を制限し供給細胞を加えるクローン化 この方法は低密度で寒天上に移した場合にはう
まく成長しなかつた雑種細胞に対して用いられ
た。細胞懸濁液を倍加希釈系列としてリンブロー
ウエル中で１：32まで希釈し、これを数列準備し
た。各列に対して次のものの１つを供給細胞とし
てそれぞれ含む成長媒体100μを添加した。 (1) ４×105B10、BR胸腺細胞 (2) ４×105B10、BR脾細胞 (3) ４×105X線照射3T3マウス線維芽細胞
（1rad／secで20000rads） (4) ４×105マイトマイシン処理*を施したB10、
BR胸腺細胞 (5) ４×105マイトマイシン処理*を施したB10、
BR脾細胞 (6) なし 単離コロニーを採集するのに適当かどうかを調
べるため雑種細胞を低希釈で比較した。 ＊ EBSS中で0.5mg／mlのマイトマイシンＣ（シ
グマ）0.1mlを細胞107含む媒体１mlに添加し、
37℃で30分間インキユベーシヨンを行い、３回
洗浄した。 雑種細胞の液体Ｎ2中での貯蔵 凍結した株を２〜８×105細胞／mlの指数関数
的に増加する細胞から調整した。培養上清10mlか
ら沈澱した細胞を90％FCS−10％ DMSO2mlに
再懸濁し（すなわち約106／ml）、次いで２つの無
菌の凍結びんに分けた（１びんあたり106）。各び
んを２〜４時間氷の上で冷却した後リンデ
（Linde）液体N2タンクの蒸気相中で一晩冷却し、
最後に液体N2に浸漬した。この操作により細胞
は約１℃／minに冷却される。 凍結した株から細胞を成長させるため、凍結び
んを37℃水浴中で解凍し、内容物を成長媒体10ml
中でゆつくりと希釈した。沈殿した細胞（400ｇ、
５分）を５〜10％FCS−DMEM ５ml中で再懸濁
した。 50mlの直ちに開始するため、スピナ培養から細
胞107複数のびんを調整した。 抗体分泌雑種細胞の命名 例 抗Ｂ産生クローンNB1／19、112、28 各雑種細胞は細胞融合実験に関する呼称で命名
する。上記の場合NB1のＮは親ミエローマNS1
を示し、Ｂは抗Ｂ脾細胞を示す。 第１の数字（上記の例では19）はクローンが得
られた最初の未クローン化培養ウエル（eulture
well）を示す。 その後の数字（112および28）は、選択された
クローンが第１および第２の寒天クローニングに
したがつて成長したそれぞれの培養ウエルを示
す。１個のリンブロートレイの培養ウエルは１〜
24の数字を付け、またはA1〜1D6の文字を付け
る。したがつて、５個のトレイを使用した場合は
ウエルは１〜120または1A1〜5D6となる。 呼称全体は細胞クローン、産生された単一クロ
ーン抗体またはその抗原特異性を示す。 単一クローン抗Ｂの特徴づけ クローン化した抗Ｂ産生雑種細胞の３つの安定
な組織培養系列（NB1／19.112.28、NB1／
6.36.36およびNB1／48.30.40）をＢ型抗原を投与
したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ系列と
の間の融合によつて得た。分泌された単一クロー
ン抗体を含む組織培養上清を上記３つの系列につ
いて別々に検査した。 同一のバツチから取つたブラツド・グループ・
レフエレンス・ラボラトリー（Blood Group
Reference Laboratory）からのヒト抗Ｂ試料
（BGRLNo.7327）および市販のヒト抗Ｂ試料を用
いてハイブリドーマ細胞によつて産生された単一
クローン抗Ｂ抗体の能率を査定した。 ダスフオードおよびバウリー（前掲）の方法に
より赤血球凝集テストを行つた。赤血球はACD
または７日以内の血餅試料（リージヨナル・ブラ
ツド・トランスフユージヨン・センター
（Regienal Blood Trans−fusion Cenfer）、ケ
ンブリツジからのもの）で使用前に４回洗浄し
た。生理食塩水中の20％赤血球懸濁液をタイルテ
スト用に使用し、２％懸濁液を標準２時間試験管
重力沈降テスト用に使用した。エンハーンスメン
トテスト（enhancement test）には２％パパイ
ン処理細胞懸濁液または20％ウシアルブミンを使
用した。抗体希釈液は生理食塩水中で作つた。 標準２時間試験管沈降テストにおいて、完全に
成長した培養上清は表１に示す抗Ｂ凝集力価を示
した。 【表】 上記３つの単一クローン抗体間の相違は上記沈
降テストおよび上記他のテストにおいて半復可能
なものであり、抗体NB1／19.112.28は一貫して
すぐれた結果を示した。 予想しうるとおり、A1B成人血球とBcord血球
は成人A2B血球および成人Ｂ血球よりも幾分低い
力価を示した。これはA1B成人血球とBcord血球
が弱いＢ型であるためである。 テストしたすべての試薬はパネル上のすべての
血液型について充分な凝集を示したが、NB1／
19.112.28の活性は表に示す６種類の弱いBeord血
液型に対して顕著なものであつた。５種類の異る
A1B血液（表には示していない）に対する
NB1／19.112.28の活性範囲は、BGRL抗Ｂの
16.32（平均32）に対し256−1024（平均力価512）
であつた。さらに行つた実験で、NB1／48と
NB1／19の精製生成物の生理食塩水凝集力価を
２％Ｂ型血球および２％A1B型血球について測定
した。精製したNB1／48およびNB1／19の各分
画をマイクロフユージ（mi−erofuge）し、Ａ１％ １cm、280＝10としてA280＝1.00（すなわち100μｇ／ml
）
になるまで各分画をP.B.S.（phosphate buffered
saline）中で注意深く希釈した。培養上清（それ
から分画が精製されたもの）の硫酸アンモニウム
カツトをマイクロフユージし、P.B.S.中で1/16に
希釈した。段階２倍希釈溶液は、ハミルトン注射
器でピペツトを行い、各ピペツト動作の間にそれ
ぞれ４回注射器を洗浄することにより、PH7.4の
P.B.S.中で作つた。各希釈溶液の25μアリコー
トを、２％赤血球25μ（５×106）がP.B.S.に懸
濁した状態で、ガラス管中でPH7.4、室温で２時
間インキユベートした。細胞沈殿物を注意深くガ
ラススライドに移し凝集の数を数えた。本実験に
おいて使用した培養上清は上掲の表１のものであ
る。結果を表２に示す。 【表】 表２における記号の意味 Ｃ：完全凝集 Ｖ：非常に強い凝集 ＋＋） ＋） （＋）：中程度の凝集 GW：やや弱い Ｗ：弱い 抗体結合活性を反映するタイル凝集テストで
は、成人Bcerd血球と成人A1B血球の比較的弱い
反応は、成人Ｂ血球と成人A2B血球に比べて種々
の異る試薬の抗Ｂ活性の差をより明確に示した。
その結果を第３に示す。 【表】 A1B血球およびBcprd血球に対して単一クロー
ン抗ＢのNB1／19.112.18を濃縮せずかつ添加剤
を使用せずに使用した場合は数秒内に市販の試薬
に見られるものと類似の強い凝集反応を生じた。
BGRL試薬は肉視的に充分な結果を生じたが、凝
集の速度と範囲は劣つていた。 さらに行われた実験において、20％Ｂ型赤血球
および20％A1B型赤血球のNB1／48および
NB1／19によるタイル凝集時間を測定した。使
用された試薬は赤血球が20％で使用された以外は
表２に関連して記載したものと同一である。各希
釈物の2μアリコートを不透明のガラスタイル
上で赤血球20μと混合し、規則的に振り動かし
た。混合の瞬間にペダル操作式ストツプウオツチ
をスタートした。表４は凝集が生じる時間（秒）
と５分後の凝集の程度を示す。凝集の程度は表３
に関連して定義したものと同じである。たとえ
ば、13Vは十凝集が13秒後に起り、５分後に非常
に強い凝集があつたことを示す。 【表】 【表】 異る試薬の２倍希釈溶液について得た結果およ
びNB1／19.112.28の相対効力を表５に示す。た
とえば、４倍希釈の場合、テストした培養上情の
調整物は市販の抗Ｂ血情と比べてA1B血球に対す
る満足しうる反応を示した。 【表】 すべてのABO特異性を有する単一クローン抗
体が等しく血液型分類に適しているわけではな
い。ここで挙げた例では３つの単一クローン抗Ｂ
の中２つはBGRL標準に比肩しうる特性を有して
はいるが、他の１つに比べると不充分な血液型分
類試薬であつた。 単一クローン抗Ｂの特異性は定義的なフアンク
シヨンナルアフイニテイ−の測定を可能にするも
のである。フアンクシヨンナルアフイニテイーは
２つの方法によつて表わすことができる。 第一に、フアンクシヨナルアフイニテイーは、
単一クローン抗BIgＭ分子と赤血球上の（対応す
る免疫化学上の型の）Ｂ決定基との間の会合反応
の平衡定数として表わすことができる。この平衡
定数（以後Ｋで示す）はまず溶液中に存在する結
合可能な抗体の異なるレベルにおける125I標識抗
Ｂ抗体とＢ型赤血球の平衡結合量を測定すること
によつて得られる。実験は次のとおり行われた。 測定はすべて２回ずつ行つた。125I標識NB1／
19およびNB1／48の直線希釈系列（linear
dilution series）をハミルトン注射器を使つて正
確にピペツトすることによつて（注射器は各試験
管ごとに５回洗浄する）緩衝液（0.8％BSA−
EBSS＋10mMHepes＋0.1％NaN3 PH7.4）中で
調整した。125I 標識抗体の25μ部分を1.5mlべツ
クマン、マイクロフユージチユーブ（Beckman
microfuge tubes）に加え、次いで新鮮なＢ型血
球２×106を含む緩衝液15μを加えた。測定用混
合物をローラ上で４℃でインキユベートした。６
時間後に氷で冷やした緩衝液1.5mlを急速に添加
し、直ちに15秒間マイクロフユージ回転を行い上
清を取り出した。緩衝液添加からマイクロフユー
ジのスイツチ投入までの時間は２〜４秒であつ
た。コントロールインキユベーシヨンにおいて、
A1型血球２×106でＢ型血球を置換し、添加結合
可能カウントのそれぞれ1.2〜2.0％、0.9〜1.2％
を占める125I標識NB1／19およびNB1／48の結合
を実験値から減算した。その結果を第１図に示
す。第１図はNB1.19およびNB1／48について添
加結合可能抗体量に対する125I抗体の結合量
（epm×10-3）をプロツトしたものである。これ
らのグラフから125I標識抗ＢのＢ型赤血球に対す
る平衡結合特性の修正スカツチヤードプロツトを
作ることができる。このような図を第２図として
示す。第２図はNB1／19とNB1／48双方につい
ての値を示す。またNB1／48は内側のグラフ中
に拡大して示す。どちらの場合もＸ軸に対する外
挿法は飽和状態での結合抗体量を示している。 平衡定数はスカツチヤードプロツトから容易に
計算できる。 またフアンクシヨナルアフイニテイーは単一ク
ローン抗BIgＭ分子と赤血球上のＢ決定基（相当
する免疫化学型の）との間に形成される免疫複合
体の解離反応の解離速度定数として表わすことも
できる。解離速度定数（以後Ｋ−１で示す）は０
時間をとつて作られる解離曲線の接線のこう配を
測定することにより125I標識単一クローン抗Ｂの
赤血球からの解離時間変化のグラフから計算する
ことができる。 ある実験では４℃および室温における125I標識
抗Ｂ抗体のＢ型赤血球からの解離速度を冷却した
抗体が過剰の状態で測定した。125I標識NB1／19
（結合可能抗体：6.0×105cpm、50ng）また
NB1／48（9.0×105epm：124ng）を25μずつ1.5
mlマイクロフユージ管に加え次いでＢ型赤血球２
×106含む緩衝液（0.8％BSA−EBSS＋10mM
Hepes＋0.1％NaN3PH7.4）25μを加えた。混合
物をローラ上で４℃でインキユベートした。１時
間後これらの管の中の４本に氷で冷やした緩衝液
1.5mlを急速に加えた後直ちに血球をエツペンド
ルフマイクロフユージ（Eppendorf mierofuge）
中で15秒間回転して沈澱させた。上清を素早く取
り除き、結合した放射能（epm）を測定するため
血球を移した。 ２時間インキユベートした残りの測定管に
NB1／19培養上清の125倍硫酸アンモニウム濃縮
液を緩衝液で1/10に希釈したものを25μ加え
た。次いで混合物75μをローラ上で４℃または
室温でインキユベートした。異なる時間（15分〜
24時間）に冷緩衝液を加え血球を直ちに沈澱させ
上記の方法で係数した。コントロールインキユベ
ーシヨンにおいてA1型血球２×106をＢ型血球に
置換し、１時間４℃のインキユベーシヨン後の
NB1／19およびNB1／48の結合（追加計数の1.1
％および1.9％）を実験値から減算した。したが
つて結合は２時間のインキユベーシヨン前の時間
（pr−eincubation peried）終了時における結合
数の百分率として表わされた。125I標識NB1／19
およびNB1／48におる100％結合はそれぞれ9.1×
104epmおよび715×104であつた。 最後の反応混合物では、培養上清中の単一クロ
ーン抗体の濃度を少くとも10μ／mlと見なす
と、標識抗体の少くとも40倍過剰の冷却BN1／
19が存在していた。 上記諸結果を第３図に示す。第３図ａは24時間
の期間における解離を示し、第３図ｂは時間軸を
拡大して最初の45分間を再プロツトしたものであ
る。 さらに他の実験において、125I標識抗Ｂ抗体の
Ｂ型血球またはA1B型赤血球２×106からの室温
における解離速度を過剰の冷却抗体の状態で測定
した。実験の操作は前記と同様であるが、冷却抗
体を抗原で標識した抗体複合体に加えた後血球を
２分置きに沈澱させこれを10分間続けた点で異
る。その結果の処理は前記と同一である。その結
果以下の諸値が使用されまたは得られた。 【表】 結果を第４図に示す。第４図はＢ型赤血球に
関するものであり第４図はA1B型赤血球に関す
るものである。 上記各実験によつて測定したフアンクシヨナル
アフイニテイーおよび上記他の実験で測定した特
性をNB1／19.112.18およびNB1／48.30.40につい
て下表６および７に要約する。 【表】 【表】 【表】 最後に、NB1／19.112.28を自動血液型分類機
に使用した場合の血液型分類試薬としての効力、
パパイン処理赤血球を使用し場合のNB1／
19.112.28の選択性およびその熱安定性を試薬す
るため若干の実験を行つた。 光学的密度読取りおよびマイクロプロセツサに
よるプリントアウト機能を備えた最近の自動血液
型分類機16Cにより自動血液型分類テストを行つ
た。その際１％メチルセルローズおよび0.25％プ
リメリンを使用して試薬を増強した。 単一クローン抗体NB1／19.112.28培養上清の
１／１５希釈液を844のクエン酸処理した供血者血液
試科について自動血液型分類機16Cで試験した。
表８に示す結果はすぐれたもので、BGRL抗
B1／10希釈液を同一の試料について使用して得
た結果と同一であつた。どちらの試薬も誤つた陽
性または陰性結果を示すことはなかつた。 【表】 上記の試験管内およびタイル生理食塩水テスト
ならびに１％メチルセルローズおよび0.25％プロ
メリンで増強した血球を使用した自動テストにお
いて、単一クローン抗ＢはA1型血球または０型
血球とはまつたく反応しなかつた。N1B／
19.112.28の抗Ｂ特異性は、表９に示すように、
パパイン処理した場合および20％アルブミンを使
用した場合においても維持された。NB1／
19.112.28の凝集活性の限界増強効果（marginal
enhancement）がこれらのテストにおいて観測
され、これは特にパパイン処理をしたA1B型血球
について顕著であつた。 【表】 安定性試験において、無希釈NB1／19.112.28
培養上清の２mlのアリコートを異る諸条件下にさ
らした後室温で力価および結合性を再び測定し
た。 反復凍結触解（表10参照）によつて抗Ｂ活性レ
ベルが減少することはなかつた。 【表】 ＊ 無希釈上清の処理後の希釈
短時間の熱安定性試験（表11参照）は、単一ク
ローン抗Ｂが−20℃および４℃での貯蔵に対して
も、また56℃でのインキユベーシヨンに対して
も、安定であることを示している。 【表】 ＊ 無希釈上清の処理後の希釈
無希釈の上清は添加剤を使用しなくても少くと
も超免疫商業試薬と同等の効力を有する。それは
日常の分類作業で出くわす弱いＢ型（A1B型およ
びBcprd型血球）を検出するのに好適な迅速です
きまなく凝集したタイル反応を呈する。それはま
た自動血液型分類にも安心して使用することがで
きる。２回クローン化した抗体産生雑種細胞系列
は大型の組織培養器中で成長するように適合さ
れ、くり返し継代培養をすることにより均一な特
性の抗体を分泌し続ける。連続成長によつて作ら
れた大量の活性培養上清はスクリーニングテスト
の回数が個々にスクリーンされる多数の供与血清
から同量のヒト試薬を生産するために現在必要と
されている回数よりもはるかに少くてすみ、テス
トに要する手間をかなり省けるという利点を有す
る。また強力な培養上清１を作るための材料費
は５ポンドという低コストであるが、この費用は
活性上清の許容しうる希釈調整物（表５参照）を
使用することによつてさらに低減することができ
る。
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