JPH05207892A - ダニ抗原に対するモノクローナル抗体とその利用 - Google Patents

ダニ抗原に対するモノクローナル抗体とその利用

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JPH05207892A
JPH05207892A JP3035018A JP3501891A JPH05207892A JP H05207892 A JPH05207892 A JP H05207892A JP 3035018 A JP3035018 A JP 3035018A JP 3501891 A JP3501891 A JP 3501891A JP H05207892 A JPH05207892 A JP H05207892A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides fari
nae)由来の抗原 Der fIIを哺乳類に免疫して得られる、
Der fIIを選択的に認識しＩｇＧまたはＩｇＭクラスに
属する抗 Der fIIモノクローナル抗体、これを用いたア
フィニティクロマトグラフィーによる Der fIIの精製
法、前記モノクローナル抗体とインキュベートする免疫
測定法、およびその利用である。 【効果】 Der fIIに対して特異的に結合し得るモノク
ローナル抗体を得ることができる。さらに本発明の方法
は、 Der fIIに特異的な測定方法であり、化学反応を用
いる従来の方法より極めて簡便で、極めて高感度に特異
的に Der fIIを検出測定することができ、また、本発明
のモノクローナル抗体を使用することにより、試料中よ
り Der fIIを簡便に高純度に精製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、コナヒョウヒダニ（De
rmatophagoides farinae) の主要アレルゲンである Der
fIIに特異的なモノクローナル抗体、その抗体の産生セ
ルライン、モノクローナル抗体を用いた免疫測定法およ
び Der fIIの精製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ハウスダスト（室内塵）は気管支喘息、
アレルギー性鼻炎などの重要なアレルゲンであるが、そ
のアレルゲンは主としてダニに由来しているといわれ
（坂本、化学と生物、Vol.26, No.2 1988)、ハウスダス
トの皮膚テスト陽性者の９割以上は、ダニでも陽性であ
るといわれている（早川、信田、日本臨床、45巻、８
号、1987）。アレルゲンの起源として重要なダニは、コ
ナヒョウヒダニ（Dermtopha-goides farinae) や、ヤケ
ヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronysinuss) であ
る (T. Miyamoto ら、J. Allergy 42, 14 (1968)) 。コ
ナヒョウヒダニには、アレルゲン活性を持つ Der fＩ
（分子量 24,000)、 Der fII（分子量 15,000 〜16,00
0) という２つの主要タンパク (Yasueda, Int. Arch. A
llergy ppl. Immunol.,81, 214 (1986)) のほか、さま
ざまな分子量の複数のアレルゲンが存在している。 Der
fＩは主にダニ糞中、Der fII はダニ虫体中（含死体、
破片）に含有されている。
【０００３】一般的にアレルギーの治療は起因アレルゲ
ンを確定することが治療上最も重要で、臨床上ではアレ
ルゲンの回避などの患者指導等が有効（坂本、化学と生
物、Vol.26, No.2 (1988))で、患者の生活環境中に存在
するダニアレルゲンの確定と量の測定が必要となる。こ
れについては、従来よりさまざまなハウスダスト中のダ
ニアレルゲン検出法が提案されてきている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、アルコール抽
出した塵中のダニ排泄物由来タンパク質と芳香族ジアゾ
化合物との呈色反応（特開昭60−135844、特開昭60−17
1459、特開昭61-59261）では検出方法が複雑である。ま
たダニアレルゲンの存在を確認するのみで、アレルゲン
の同定や定量は実施できない。小動物の体液と化学薬品
との呈色反応（特開昭62−296828、特開昭62−296829）
では操作は簡単ではあるがダニ以外の小動物も検出され
てしまい、ダニアレルゲンの同定、定量ができない。ま
たダニ虫体抽出物を動物に免疫して得られた抗血清によ
る検出方法（特開昭63−191961) では、塵中のダニの生
体の検出、定量はできるが死体や破片や糞の検出や定量
については不明であり、またアレルゲンの確定、定量は
できない。
【０００５】ダニアレルギーの治療においてはダニアレ
ルゲンエキスを用いた減感作療法が行われるのが一般的
である。減感作療法については投与アレルゲンの確定、
精製が望まれている（江田、日本臨床44巻、臨時増刊号
1986) 。この点に関して、従来の虫体、または糞その
ものを免疫した哺乳類から作成されたモノクローナル抗
体の系では、抗体の特異性についてははっきりしていな
い。
【０００６】本発明は Der fIIに特異的なモノクローナ
ル抗体を使用することにより上記のようなアレルゲン同
定、定量系の問題点を解決し、免疫学的に塵中の Der f
IIを高感度かつ簡便に同定、定量することを目的とし、
塵中のコナヒョウヒダニの数をも推察可能であることを
示唆するとともに、試料中の Der fIIを簡便にかつ高純
度に精製することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、 Der fII
に特異的なモノクローナル抗体を複数作製し、これを用
いて免疫学的測定法の検討を行った。その結果、本発明
に係わるモノクローナル抗体は Der fII測定試薬として
極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。即
ち、本発明は Der fIIに対して特異的に結合しうるモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とする試料中の Der
fIIの同定、定量、測定方法である。
【０００８】本発明のモノクロナール抗体は、公知の細
胞融合法により製造できる。さらに詳細には、本発明の
モノクローナル抗体は次の(1) 〜(4) の工程、即ち、 (1) 抗体産生細胞調製工程 (2) 融合、スクリーニング、クローニング工程 (3) ハイブリドーマ培養工程 (4) 必要に応じて行われる精製工程 を実施することによって得られる。
【０００９】以下、各工程について詳細に説明する。 (1) 抗体産生細胞調製工程 抗 Der fII抗体産生細胞は Der fIIを抗原とし、この抗
原をBalb/cマウスまたは A/Jマウスに十分免疫した脾臓
より採取できる。 Der fIIをマウス１頭あたり10〜30μ
g となるようにフロイントの完全アジュバントまたは不
完全アジュバントを等量混ぜて腹腔内に投与すること
を、２〜４週間の間隔で繰り返す。血液中の抗体価が十
分に上がっていることを確認し、アジュバントなしで同
量の Der fIIを尾静脈または腹腔内に投与し最終免疫と
する。最終免疫から２〜５日後、マウスの脾臓から抗体
産生細胞を採取する。 (2) 融合、スクリーニング、クローニング工程 融合は融合促進剤の存在下、上記マウス抗体産生細胞な
らびに公知のマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）を公
知の方法にて混合することにより行うことができる。
【００１０】一般にマウスミエローマ細胞はハイブリド
ーマ選択培地で生育できず、かつ、それ自身が抗体を産
生しないものが好ましい。このようなマウスミエローマ
細胞としてはマウスミエローマ細胞P3-NS1-1-Ag4-1（以
下、ＮＳ−１と略記する）、Sp-2/O-Ag14(以下、ＳＰ−
２と略記する）あるいはこれと同様のものがあげられ
る。
【００１１】両細胞の比は、通常ミエローマ細胞１に対
して抗体産生細胞１〜20の比率で行う。細胞融合促進剤
としては、例えばポリエチレングリコールが用いられ、
好ましくは分子量1000〜7500のものがよく用いられる。
ハイブリドーマの培養は、例えば融合促進剤を洗浄除去
しハイブリドーマ選択用培地に懸濁したハイブリドーマ
の 100〜200 μl ずつを96ウェルプレートに播き、約37
℃において５％炭酸ガス−空気中で行うことができる。
【００１２】目的とするハイブリドーマのスクリーニン
グは培養液中の抗体価を測定することにより行う。即
ち、 Der fIIを結合させ、さらにウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略記する) にてブロッキングしたアッ
セイプレートの各ウェルにハイブリドーマの十分生育し
た培地の上清を加え、充分インキュベートし、プレート
内で抗原抗体反応させた後、上清を除去洗浄する。さら
に、これにアビジン化抗マウスＩｇＧ抗体を作用させて
洗浄後、ビオチン化アルカリフォスファターゼを作用さ
せ、洗浄後、基質となるｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ートを加えて呈色させる。
【００１３】抗体産生陽性のハイブリドーマについて限
界希釈法にてクローニングし、目的の単一のハイブリド
ーマを調製できる。 (3) ハイブリドーマ培養工程 前記工程で得たクローン化ハイブリドーマを、イン・ヴ
ィトロ(in vitro)またはイン・ヴィヴォ(in vivo) で培
養すれば、目的のモノクローナル抗体が産生できる。イ
ン・ヴィトロでの培養は、例えば、96ウェルプレート中
で数個のハイブリドーマの培養から始め、徐々にスケー
ルアップすることにより行うことができる。また、イン
・ヴィヴォでの培養は、例えば、融合細胞の増殖を容易
にさせるためのプリスタン（２，６，10, 14−テトラメ
チルペンタデカン：アルドリッチ社製）処理をしたマウ
スにハイブリドーマを腹腔内に接種することによって実
施できる。７〜15日後にはモノクローナル抗体を含む腹
水が蓄積される。 (4) 精製工程 必要によって行われる精製工程は、前工程で得られたモ
ノクローナル抗体を通常の物理化学的手法、例えば塩
析、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー等
の手段を組み合わせることにより行うことができるが、
モノクローナル抗体の抗体サブクラスがＩｇＧ１である
場合は、他のサブクラスのようにプロテインＡカラムに
よる吸着、溶出では回収率が悪いので、プロテインＧカ
ラムによる吸着、溶出の方が回収率が高く、かつ、簡便
である。
【００１４】本発明においては、以上の方法により、 D
er fIIを認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。
以上のようにして得られた Der fIIに対して特異的に結
合し得るモノクローナル抗体を用いて、公知の免疫測定
法、例えば、競合法、サンドイッチ法などが可能となっ
た。
【００１５】例えば、サンドイッチ法による免疫測定法
では、抗体を固相に固定化する場合は、その方法は公知
の方法を採用でき、固相としては、例えば、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ラテックス、アガ
ロース、セルロース、メタアクリレート、ガラスなどを
用いたマイクロタイタープレートや粒子が好ましく用い
られる。
【００１６】また、標識で結合された抗体における標識
化の方法、その検出方法は何等限定されるものではな
く、公知の方法により標識化及び測定することができ
る。例えば、酵素、蛍光色素、化学発光物質またはラジ
オアイソトープのいずれか、もしくはこれらを組み合わ
せることができる。標識剤としては、酵素を用いる方法
では、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼま
たはアルカリフォスファターゼ等の酵素が、放射性物質
を用いる方法では、125I、3H等が、蛍光物質を用いる方
法では、フルオレスカミン、フルオレッセイン・イソチ
オシアネート等が通常使用されるが、そのほかのもので
あっても良い。
【００１７】標識剤が酵素である場合には、その活性を
測定するために基質が用いられる。例えばパーオキシダ
ーゼの基質としては、２，２−アジノジ−（３−エチル
ベゼンズチアゾリンスルホン酸）−２アンモニウム塩−
H2O2、５−アミノサリチル酸−H2O2、ｏ−フェニレンジ
アミン−H2O2等が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質と
しては、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドが、アルカリフォスファターゼの基質としては、ｐ−
ニトロフェニルスルフォニルフォスフェート等が用いら
れる。測定のためには、これらの試薬以外にも溶解剤、
洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が使用される。これ
らの試薬を用いた免疫測定のキットも本発明の範囲であ
る。
【００１８】通常サンドイッチ法による免疫測定法は、
測定されるべき物質（抗原）を認識する第１のモノクロ
ーナル抗体と第１のモノクローナル抗体とは異なる抗原
決定部位を認識する第２のモノクローナル抗体を用い、
第１のモノクローナル抗体が固相に固定化されており、
第２のモノクローナル抗体が標識化されていることを特
徴とする。
【００１９】
【発明の効果】本発明により Der fIIに対して特異的に
結合し得るモノクローナル抗体が得られた。さらに、本
発明の方法で試料中の Der fIIは10〜300ng/mlという低
濃度の範囲でも高感度に測定可能である。本方法は、 D
er fIIに特異的な測定方法であり、化学反応を用いる従
来の方法より極めて簡便であり、またコナヒョウヒダニ
を免疫して得られたモノクローナル抗体を用いた従来の
方法よりも極めて高感度に特異的に Der fIIを検出測定
することが可能となった。また、本発明により得られた
モノクローナル抗体を使用することにより、試料中より
Der fIIを簡便に高純度に精製することが可能となっ
た。
【００２０】
【実施例】以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に
説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものでは
ない。 実施例１ (1) 抗 Der fIIモノクローナル抗体の調製 抗 Der fIIモノクローナル抗体の調製は、以下に示すよ
うな方法で行った。
【００２１】イ）免疫 コナヒョウヒダニを飽和食塩水浮遊法で採取し、リン酸
緩衝液食塩水（以下、ＰＢＳと略記する）で抽出、60％
飽和硫安沈澱の上清をDEAE−セファセル(0.05MTris Cl,
pH8.0)にかけ、非吸着画分をＳ−セファロース(0.02M
アセテートバッファ、pH5.5 〜0.2M NaCl(リニアーグラ
ジエント))にかけ80mM NaCl 溶出画分をセファデックス
G-75 にかけて得られるピークを回収し、粗精製 Der f
IIとし免疫抗原とした。 Der fIIが30μg /100μl (A/J
マウスでは10μg /100μl)となるように等量のフロイン
ト完全アジュバント(FCA Difco社製）と混合乳化し、Ba
lb/cマウス（雄) （または A/Jマウス（雄））の腹腔に
１頭あたり30μg (A/Jマウスでは10μg)となるように混
合乳化物を投与した。約２〜４週間のインターバルで同
量の Der fIIをフロイント不完全アジュバント(FIA Dif
co社製) に混合乳化したものを腹腔に５回追加免疫し
た。最終免疫は細胞融合の３日前に予め血中抗体価が陽
性になることを確認したマウス（血清を1,000 倍以上に
希釈しても DerfIIを固相とする酵素免疫測定で陽性)
について Der fII30μg (A/Jマウスでは５μg)を含むＰ
ＢＳを尾静脈(A/Jマウスでは腹腔）に投与した。
【００２２】ロ）細胞の調製 最終免疫の３日後にマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を10
％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地 (FLOW Lab. C
o., LTD. 以下、RPMIと略記する）中に分散させ200m/s
ステンレスメッシュで濾過した後、ウシ胎児血清を含ま
ないRPMI培地（以下、−RPMIと略記する）で３回洗浄し
た。融合パートナーであるマウスの骨髄腫細胞（ミエロ
ーマ）としてはBalb/cマウスに対してはＮＳ−１、 A/J
マウスに対してはＳＰ−２を用いた。これを予め８−ア
ザグアニン30μg/mlを添加したRPMIで細胞融合の約１週
間前まで培養し、その後RPMIで培養した対数増殖期の細
胞を−RPMIで３回洗浄した。
【００２３】ハ）細胞融合及び抗体産生ハイブリドーマ
の選択 脾細胞１〜２×108cellsとミエローマを約５：１の割合
で混合し、遠心後ペレットとした。これにポリエチレン
グリコール（PEG4000 関東化学) 50％を含む−RPMI 1ml
を加えて１分間攪拌し、さらに１分間攪拌後、−RPMI８
mlを８分間かけて添加攪拌し、RPMI10mlを加えて遠心
し、ペレットを脾細胞が５×106/mlとなるように懸濁
し、 100μl ずつ96ウェルプレート（住友ベークライト
製）に播種した。翌日からヒポキサンチン 0.1mM、アミ
ノプテリン0.4 μM 、チミジン16μMを含むRPMI（以
下、ＨＡＴ培地と略記する）を、各ウェルに 100μl 添
加し、その後約１〜２週間、ＨＡＴ培地をハイブリドー
マのコロニーが出現するまで100μl ずつ交換した。ハ
イブリドーマのコロニーがウェルに出現した時点で抗 D
erfII抗体の検出を行い、陽性であったウェルの細胞に
ついて限界希釈を実施し、ヒポキサンチン 0.1mM、チミ
ジン16μM を含むRPMIでの培養期間を経た後、コロニー
の出現しているウェルについて抗 Der fII抗体の検出を
確認後、２回目の限界希釈を実施し、クローニングを行
った。こうして抗 Der fIIモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを得た。
【００２４】ニ）モノクローナル抗体の産生 クローニングされたモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマはRPMIで増殖させた後、予め２週間前に0.5ml のプ
リスタンを腹腔に投与したBalb/cマウス (A/Jマウス由
来のハイブリドーマではCAF-1 マウス) の腹腔に、１頭
あたり、106 〜107 cells で移植した。約２週間後に溜
った腹水を回収し、これよりモノクローナル抗体を精製
した。
【００２５】ホ）モノクローナル抗体の精製 腹水を 10,000rpm、20分間遠心して沈澱物を除き、0.3
μm の滅菌フィルター（マイレクス 0.3μm ミリポア
社) で濾過した濾液について、ローリー法によりタンパ
ク濃度を測定した。タンパク量として100 〜150mg 分の
濾液を市販のプロテインＧカラムキット(Mab Trap G フ
ァルマシア社製) で処理し、吸着画分をＰＢＳに透析
し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（以下、SDS-PAGEと略記する）、ウェスターン
ブロット法(Westernblot) でシングルバンドであること
を確認後、精製モノクローナル抗体とした。
【００２６】得られた精製モノクローナル抗体のうち６
種類について通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託した。受託番号は次の通りである。 寄託者が付した識別のための表示 受託番号 1B2 微工研条寄第 3247 号 (BP-3247) 7C10 微工研条寄第 3248 号 (BP-3248) 15E11 微工研条寄第 3249 号 (BP-3249) 18G8 微工研条寄第 3250 号 (BP-3250) 13A4 微工研条寄第 3251 号 (BP-3251) 24B7 微工研条寄第 3252 号 (BP-3252)。
【００２７】(2) 不溶化抗体の調製 未処理の96ウェルマイクロタイタープレート (Immulon
1 、ダイナテクラボラトリー社製、以下、マイクロタイ
タープレートと称する) の各ウェルにＰＢＳに溶解した
５μg/mlのマウス抗 Der fIIモノクローナル抗体の１
つ、15E11 の溶液を50μg/ml加えて室温で２時間インキ
ュベートした。次に各ウェルの溶液を除去し、0.05％の
トゥイーン20を含むＰＢＳ又は１％トゥイーン20を含む
ＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Tween と称する) で３回洗浄
し、１％BSA を含むＰＢＳで室温で１時間（または４℃
で１晩) ブロッキングした。ＰＢＳ−Tween で３回洗浄
後、このプレートを使用した。このプレートは−30℃の
低温で充分に保存することができた。
【００２８】(3) ウシ膵臓アルカリフォスファターゼ
標識抗体の調製 精製済みのモノクローナル抗体1.7mg 当りウシ膵臓アル
カリフォスファターゼ（ＥＩＡグレード：ベーリンガー
社製）５mgを添加し、ＰＢＳに１晩透析した。透析後の
体積を測定し、1/10容積の20％グルタルアルデヒド（和
光純薬）を添加して室温にて２時間攪拌した。溶液を全
て回収してＰＢＳで１晩透析後、0.25MTris-HCl pH8.0
に１晩透析したものを標識抗体液とし、アジ化ナトリウ
ムを0.02％になるように加えて４℃で保存した。
【００２９】(4) 精製 Der fIIと精製 Der fＩを用い
た検量線の作成 本実施例中の(2) で述べた方法で作成したモノクロナー
ル抗体の１つ、15E11を固定したマイクロタイタープレ
ートに、精製 Der fII 0〜0.3 μg/mlを含有するＰＢＳ
（またはＰＢＳ−Tween)を50μl 加えた。特異的結合の
対照物として、同じコナヒョウヒダニのアレルゲンDer
fI（分子量24Ｋ）またはヤケヒョウヒダニのアレルゲン
Der pI（分子量24Ｋ）または DerpII( 分子量15Ｋ）を
０〜0.3 μg/ml含有するＰＢＳ（またはＰＢＳ−Tween)
を各々別なウェルに50μl 加えた。室温で２時間インキ
ュベート後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄し、次いで(3)
で作成したアルカリフォスファターゼ標識抗 Der fIIモ
ノクローナル抗体の１つ（名称を13A4* とする) を９μ
g/mlとなるようにＰＢＳ（またはＰＢＳ−Tween)で希釈
し、50μl ずつ添加した。室温で２時間インキュベート
後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄し、ジエタノールアミン
バッファーpH8.0 、５mlに基質タブレット（アルカリフ
ォスファターゼ基質、タブレット、シグマ社製）１個の
割合で溶解した基質溶液（以下基質溶液と略記する）を
100 μl 加えて発色させた。室温で10分間反応後、5N N
aOH 50μl を添加し反応を停止させた。各ウェルについ
てマイクロオートリーダー（コロナ社製、以下、オート
リーダーと称する）で波長405nm の吸光度を測定し、図
１のような結果を得た。
【００３０】実施例２ 実施例１の(1) で得られた抗 Der fIIモノクローナル抗
体を用いて、試料中のDer fII の定量と虫体数の関連性
について実験した。実施例１の(1) 、(2) で述べた方法
で作成したモノクローナル抗体15E11 を固定化したマイ
クロタイタープレートに、精製した Der fIIを０〜300n
g/mlを含有するＰＢＳ−Tween を標識物質として各ウェ
ルに50μl ずつ加えた。別のウェルには検出試料とし
て、人髪（５mg）、室外飼育のイヌの毛(5mg）、室内飼
育のイヌの毛（４mg）、室内飼育のネコの毛（１mg）、
青梅綿（５mg）のそれぞれに、コナヒョウヒダニを加え
ないものと、50匹加えたものに、ＰＢＳ−Tween500μl
を加えて、10秒間攪拌し10分間放置後、10,000rpm で２
分間遠心したものの上清を50μl 加えた。室温で２時間
インキュベートした後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄、次
いで(3) で作成したアルカリフォスファターゼ標識モノ
クロナール抗体13A4* を９μg/mlとなるようにＰＢＳ−
Tween で希釈し、50μl ずつ添加した。
【００３１】室温で２時間インキュベートした後、ＰＢ
Ｓ−Tween で３回洗浄し、基質溶液を 100μl 加えて発
色させた。室温で10分間反応させ、5N NaOH 50μl を加
えて反応を停止させた。各ウェルについてオートリーダ
ーで波長 405nmの吸光度を測定し、表１のような結果を
得た。 表１は、実施例２で得られた他物質共存時の Der fIIの
定量と虫体数の関連性を示す表である。ダニ無添加の時
は各サンプルとも405nm におけるO.D.値は０であった
が、ダニを50匹添加した時のO.D.値はコントロールであ
るPBS にダニを添加したO.D.値とほぼ同じ値を示した。
【００３２】実施例３ 実施例１の(1) で得られた抗 Der fIIモノクローナル抗
体のうち３種、18G8、13A4、15E11 を用いて、コナヒョ
ウヒダニの虫体の凍結乾燥粉末と精製 Der fIIに対する
ウェスターンブロットを行った。コナヒョウヒダニ虫体
凍結乾燥粉末10mgを１mlのＰＢＳに溶解、また精製 Der
fIIを６μg/mlとなるようにＰＢＳで調製し、それぞれ
を公知の方法によってβ−メルカプトエタノールの存在
下でＳＤＳ化する。前者を20μl 、後者を10μlとり、2
0％ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE ミニゲル TEFC
O社製）において20mA、1.5 時間の電気泳動を行った。
電気泳動終了後、ブロッティングペーパー（PVDF：ミリ
ポア社製）に160mA １時間トランスファーした。３％BS
A を含むＰＢＳで室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ
−Tween で洗浄した。18G8、13A4、15E11 を50μg/mlと
なるように２mg/ml のBSA を含むＰＢＳに希釈した。ブ
ロッティングペーパーを切断してそれぞれの抗体溶液に
浸漬し、−４℃で１晩反応させた。ＰＢＳ−Tween で洗
浄後、２次抗体としてパーオキシダーゼ標識抗マウスＩ
ｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ：バイオラッド社
製）を用い、２mg/ml のBSA を含むＰＢＳを１：1,500
に希釈した溶液にブロッティングペーパーを浸漬し、室
温で２時間振盪しながら反応させた。ＰＢＳ−Tween で
洗浄後、基質として４−クロロ−１−ナフトール溶液に
浸漬し呈色させた。図２のような結果を得た。
【００３３】実施例４ 実施例１の(1) で得たモノクローナル抗体のうち３つの
抗 Der fIIモノクローナル抗体、18G8、13A4、15E11 に
ついて、18G8、13A4をアルカリフォスファターゼ標識し
たもの、18G8* 、3A4*を作成し、これら３つの抗体の抗
原認識部位の違いを推定するため、競合実験を行った。
【００３４】マイクロタイタープレートに精製 Der fII
を30μg/mlとなるようにＰＢＳで希釈し、各ウェルに50
μl ずつ加えて室温で２時間インキュベート後、ブロッ
キングを行った。18G8* の濃度が一定量（９μg/ml）の
溶液と、非標識の18G8または13A4または15E11 が０〜10
μg/mlという濃度で共存するようにＰＢＳで調製した溶
液を各ウェルに50μl ずつ加えた。同様に13A4* の濃度
が一定量（９μg/ml）となり、非標識の18G8または13A4
または15E11 が０〜10μg/mlという濃度で共存するよう
にＰＢＳで調製した溶液を別の各ウェルに50μl ずつ加
えた。室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−Tween
で洗浄後、基質溶液を 100μl 加え、室温で２時間反応
させた。5N NaOH 50μl を添加し、反応を停止させた。
オートリーダーで波長 405nmにおける吸光度を測定した
結果、13A4と15E11 に競合反応が認められず、18G8と13
A4、18G8と15E11 には競合反応が認められたことから、
13A4と15E11 は Der fIIの互いに異なる抗原決定基を認
識していることが明らかとなった（図３参照）。
【００３５】実施例５ 実施例２で用いた、モノクローナル抗体 15E11、13A4*
を使用した酵素免疫測定法を用い、Der fI、Der pI、De
r pII の共存下で Der fIIのみが検出される範囲を測定
した。実施例１の(2) と同様にして15E11 を固定化した
マイクロタイタープレートを作成し各ウェルに精製 Der
fIIが 0.3μg/mlになり、Der fI、Der pI、Der pIIが
０〜30μg/mlで共存するようにＰＢＳ−Tween で調製し
た溶液を、50μl ずつ加えた。室温で２時間インキュベ
ートした後、ＰＢＳ−Tween で洗浄し、基質溶液 100μ
l を加え発色させた。室温で10分間反応させた後、5N N
aOH 50μl を添加し、反応を停止させた。オートリーダ
ーで波長 405nmにおける吸光度を測定した結果、Der f
I、Der pI、Der pII 存在下でも正しく Der fIIのみを
検出していることが明らかになった（図４参照）。
【００３６】実施例６ 実施例２で用いた、モノクローナル抗体 15E11、13A4*
を使用した酵素免疫測定法を用いてコナヒョウヒダニの
虫体数と吸光度の関連性を調べた。実施例１の(2) と同
様にして、15E11 を固定化したマイクロタイタープレー
トを作成した。コナヒョウヒダニ０〜100 匹をＰＢＳ−
Tween500μl で10秒間攪拌後、10分間放置して抽出し、
1,000rpm、２分間遠心した上清を各ウェルに50μlずつ
加えた。室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ−
Tween で３回洗浄し13A4* ９μg/mlにＰＢＳ−Tween で
調製した溶液を50μl ずつ添加した。室温で２時間イン
キュベートし、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄後、基質溶液
100 μl を加えた。室温で10分間反応させた後、5N NaO
H 50μl を添加し反応を停止させた。各ウェルをオート
リーダーで波長 405nmにおける吸光度を測定し、図５の
ような結果を得た。決定される吸光度は虫体の数に比例
していることから、測定された吸光度から試料中の虫体
数が推定できることがわかった。
【００３７】実施例７ 実施例１の(1) で得られたモノクローナル抗体13A4をリ
ガンドとしたゲルを用いてダニ虫体凍結乾燥粉末から D
er fIIをアフィニティークロマトグラフィーにより精製
した。ＣＮＢｒ−Sepharose （ファルマシア社製）1.5g
を１mM HClで膨潤させ、0.1MNaHCO3 −0.5MNaCl pH8.3
バッファー（以下、Ｃバッファーと略記する) で充分洗
浄した。ゲルをネジ付き試験管に移しＣバッファーに透
析しておいた13A4(732μg/ml) ５mlを添加し、20mlのＣ
バッファーを加えた後、室温にて２時間振盪、反応させ
た。
【００３８】2,500rpm、10分間遠心分離し、ゲルに0.2M
グリシンpH8.0 バッファーを25ml加え、室温にて２時間
震盪させた。2,500rpm、10分間遠心分離し、ゲルをＣバ
ッファー、0.1M酢酸-0.5M NaCl pH4.0バッファーで交互
に２回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄後、５ml容プラスチッ
クシリンジに充填しカラムとした。このカラムを0.2Mグ
リシン-HCl pH2.3バッファー（以下、溶出バッファーと
略記する）、ＰＢＳ−0.5M NaCl バッファー（以下、洗
浄バッファーと略記する) で交互に洗浄し、洗浄バッフ
ァーで平衡化しておいた。コナヒョウヒダニの凍結乾燥
粉末0.05ｇをＰＢＳ 500μl に溶解し、0.3 μフィルタ
ー（マイレクス：ミリポア社製）で濾過後、500 μl を
カラムに添加した。
【００３９】流速92秒／mlの条件下で洗浄バッファーで
非吸着画分を洗浄し、溶出バッファーで吸着画分を溶出
させた。それぞれの画分の吸光度を280nm にて測定し
た。各画分を SDS-PAGE にかけ、同時に実施例２で用い
たモノクローナル抗体 15E11、13A4* を使用した酵素免
疫測定法を用い、画分中の Der fII量を測定した結果、
このゲルはダニ虫体凍結乾燥粉末溶液の中から Der fII
のみを特異的に吸着していることが明らかとなり、 Der
fIIをダニ虫体凍結乾燥粉末から１ステップで精製でき
ることが示された（図６および図７参照）。
【００４０】実施例８ 実施例１の(1) で得られたモノクローナル抗体を用いた
キットにより、ハウスダスト中の Der fIIの分量を測定
した。キット（１例）は次のように構成した。 1) 一次抗体コーティングプレート（以下、プレートと
略称する） 2) 抗原抽出用容器（以下、容器と略称する） 3) 洗浄液 4) 酵素標識二次抗体溶液 5) 発色基質 6) 基質溶解液 7) 反応停止液 8) 標準 Der fII。
【００４１】ハウスダストサンプルは不特定のボランテ
ィアを募り、不特定の市販の電気掃除機によって不特定
の場所を３分間以上吸引することによって回収された。
回収されたハウスダストを約0.05〜0.1g分取し、容器に
入れ、よく振り10分間放置抽出した。容器から抽出液50
μl をプレートのウェルに滴下した。室温２時間インキ
ュベート後プレートを洗浄液で洗浄し、洗浄液５mlにつ
き添付の酵素標識二次抗体溶液１滴を加えたものを50μ
l 滴下し、室温で２時間インキュベートした。洗浄液で
洗浄後、発色基質１タブレットを基質溶液５mlに溶解し
たものを、100μl 滴下し、室温10分後、反応停止液を5
0μl 滴下し、405nm の吸光度を測定した。同様に標準
Der fIIを洗浄液で希釈したものを用いて検量線を作成
した。
【００４２】容器内に残っているハウスダストに50％エ
タノールを添加し、洗いこんで回収し、ステンレスメッ
シュ(355μ) で濾過し、濾液に１％となるようにメチレ
ンブルーを添加し、80μm フィルター（富士写真フィル
ム社製ミクロフィルター）数枚で濾過し、実体顕微鏡20
倍下でダニを回収し、酢酸クロラール法にてプレパラー
トし、同定したハウスダスト中のコナヒョウダニ数を測
定した。
【００４３】ハウスダスト中の Der fII量とダニ数には
相関性があった（図８参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１(4) で得られた精製 Der fＩ、Der f
II、 Der pＩ、 Der pIIの検量線を示すグラフであり、
縦軸は405nm におけるO.D.値を、横軸は測定サンプル濃
度（μg/ml）を示す。●は Der fII、○は Der fＩ、△
は Der pＩ、黒い△は Der pIIである。
【図２】実施例３で得られた精製 Der fII、ダニ虫体凍
結乾燥粉末のウェスタンブロットによる結果を示す図で
ある。レーン１はマーカーC.B.B.（クーマシーブリリア
ントブルー）染色、レーン２は Der fIIC.B.B.染色、レ
ーン３はダニ虫体の凍結乾燥粉末C.B.B.染色、レーン４
は Der fII13A4、レーン５は Der fII 15E11、レーン６
は Der fII18G8、レーン７はダニ凍結乾燥粉末13A4、レ
ーン８はダニ凍結乾燥粉末15E11 、レーン９はダニ凍結
乾燥粉末18G8である。
【図３】実施例４で得られた標識抗体を反応させたとき
のO.D.値を示すグラフであり、縦軸は標識抗体のみを反
応させたときのO.D.値をＢo とし、共存する非標識抗体
のそれぞれの濃度におけるO.D.値ををＢn としたときの
Ｂn/Ｂo の値を表す。横軸は共存する非標識抗体の濃度
（μg/ml）を表す。Ａ図は、13A4* と非標識抗体の競合
の場合、Ｂ図は、18G8* と非標識抗体の競合の場合であ
る。○は15E11 、●は13A4、△は18G8である。
【図４】実施例５で得られた Der fＩ（○）、Der pI
（●）、Der pII(△）の共存下でDer fIIのみが検出さ
れる範囲を測定した結果を示すグラフである。 縦軸
は、Der fII のみの溶液のO.D.値をＢo とし、共存する
Der fＩのそれぞれの濃度におけるO.D.値ををＢn とし
たときのＢn/Ｂo の値を示す。横軸は、共存する抗原濃
度（μg/ml）を示す。
【図５】実施例６で得られたコナヒョウヒダニの虫体数
と吸光度の関連性を示すグラフであり、縦軸は、405nm
におけるO.D.値を表す。横軸は、添加したダニの虫体数
を表す。●はＰＢＳ-Tween抽出、○はＰＢＳ抽出の場合
を示す。
【図６】実施例７で得られた画分中の Der f II 精製度
を示すグラフであり、縦軸は、280nm におけるO.D.値
（●）、またはELISA 系より算出された含有 Der fII量
（μg/ml)(○) を示す。横軸は、画分の番号である。
【図７】実施例７で得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀
染色図であり、レーン１は分子量マーカー、レーン２は
標準 Der fII、レーン３は、ダニ虫体の凍結乾燥粉末溶
液、レーン４、５は、カラム非吸着画分（画分の番号は
図６に基づく）、レーン６，７、８はカラムに吸着し溶
出された精製画分（画分の番号は図６に基づく）であ
る。
【図８】実施例８で得られたハウスダスト中の Der fII
量とダニ数の分散の結果を示すグラフである。縦軸は E
LISA系より産出されたハウスダスト１ｇ中の Der fII量
（μg)で、横軸はハウスダスト１ｇ中のコナヒョウダニ
数を表す。ｎ＝16、相関係数ｒ＝0.884 である。
【手続補正書】
【提出日】平成３年９月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】ハウスダスト（室内塵）は気管支喘息、ア
レルギー性鼻炎などの重要なアレルゲンであるが、その
アレルゲンは主としてダニに由来しているといわれ（坂
本、化学と生物、Vol.26, No.2 1988)、ハウスダストの
皮膚テスト陽性者の９割以上は、ダニでも陽性であると
いわれている（早川、信田、日本臨床、45巻、８号、19
87）。アレルゲンの起源として重要なダニは、コナヒョ
ウヒダニ（Dermtopha-goides farinae) や、ヤケヒョウ
ヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus) である (T.
Miyamoto ら、J. Allergy 42, 14 (1968)) 。コナヒョ
ウヒダニには、アレルゲン活性を持つ Der fＩ（分子量
24,000)、 Der fII（分子量 15,000 〜16,000) という
２つの主要タンパク (Yasueda, Int. Arch. Allergy pp
l. Immunol.,81, 214 (1986)) のほか、さまざまな分子
量の複数のアレルゲンが存在している。 Der fＩは主に
ダニ糞中、Der fII はダニ虫体中（含死体、破片）に含
有されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】ハ）細胞融合及び抗体産生ハイブリドーマ
の選択 脾細胞１〜２×108cellsとミエローマを約５：１の割合
で混合し、遠心後ペレットとした。これにポリエチレン
グリコール（PEG4000 関東化学) 50％を含む−RPMI 1ml
を加えて１分間攪拌し、さらに１分間攪拌後、RPMI８ml
を８分間かけて添加攪拌し、RPMI10mlを加えて遠心し、
ペレットを脾細胞が５×106/mlとなるように懸濁し、 1
00μl ずつ96ウェルプレート（住友ベークライト製）に
播種した。翌日からヒポキサンチン 0.1mM、アミノプテ
リン0.4 μM 、チミジン16μM を含むRPMI（以下、ＨＡ
Ｔ培地と略記する）を、各ウェルに 100μl 添加し、そ
の後約１〜２週間、ＨＡＴ培地をハイブリドーマのコロ
ニーが出現するまで100 μl ずつ交換した。ハイブリド
ーマのコロニーがウェルに出現した時点で抗 Der fII抗
体の検出を行い、陽性であったウェルの細胞について限
界希釈を実施し、ヒポキサンチン 0.1mM、チミジン16μ
M を含むRPMIでの培養期間を経た後、コロニーの出現し
ているウェルについて抗 Der fII抗体の検出を確認後、
２回目の限界希釈を実施し、クローニングを行った。こ
うして抗 Der fIIモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】(2) 不溶化抗体の調製 未処理の96ウェルマイクロタイタープレート (Immulon
1 、ダイナテクラボラトリー社製、以下、マイクロタイ
タープレートと称する) の各ウェルにＰＢＳに溶解した
５μg/mlのマウス抗 Der fIIモノクローナル抗体の１
つ、15E11 の溶液を50μl 加えて室温で２時間インキュ
ベートした。次に各ウェルの溶液を除去し、0.05％のト
ゥイーン20を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Tween と称す
る) で３回洗浄し、１％BSA 又は１％トゥイーン20を含
むＰＢＳで室温で１時間（または４℃で１晩) ブロッキ
ングした。ＰＢＳ−Tween で３回洗浄後、このプレート
を使用した。このプレートは−30℃の低温で充分に保存
することができた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】(4) 精製 Der fIIを用いた検量線の作成 本実施例中の(2) で述べた方法で作成したモノクロナー
ル抗体の１つ、15E11を固定したマイクロタイタープレ
ートに、精製 Der fII 0〜0.3 μg/mlを含有するＰＢＳ
（またはＰＢＳ−Tween)を50μl 加えた。特異的結合の
対照物として、同じコナヒョウヒダニのアレルゲンDer
fI（分子量24Ｋ）またはヤケヒョウヒダニのアレルゲン
Der pI（分子量24Ｋ）または DerpII( 分子量15Ｋ）を
０〜0.3 μg/ml含有するＰＢＳ（またはＰＢＳ−Tween)
を各々別なウェルに50μl 加えた。室温で２時間インキ
ュベート後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄し、次いで(3)
で作成したアルカリフォスファターゼ標識抗 Der fIIモ
ノクローナル抗体の１つ（名称を13A4* とする) を９μ
g/mlとなるようにＰＢＳ（またはＰＢＳ−Tween)で希釈
し、50μl ずつ添加した。室温で２時間インキュベート
後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄し、ジエタノールアミン
バッファーpH9.8 、５mlに基質タブレット（アルカリフ
ォスファターゼ基質、タブレット、シグマ社製）１個の
割合で溶解した基質溶液（以下基質溶液と略記する）を
100 μl 加えて発色させた。室温で10分間反応後、5N N
aOH 50μl を添加し反応を停止させた。各ウェルについ
てマイクロオートリーダー（コロナ社製、以下、オート
リーダーと称する）で波長405nm の吸光度を測定し、図
１のような結果を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】実施例２ 実施例１の(1) で得られた抗 Der fIIモノクローナル抗
体を用いて、試料中のDer fII の定量と虫体数の関連性
について実験した。実施例１の(1) 、(2) で述べた方法
で作成したモノクローナル抗体15E11 を固定化したマイ
クロタイタープレートに、精製した Der fIIを０〜300n
g/mlを含有するＰＢＳ−Tween を標準物質として各ウェ
ルに50μl ずつ加えた。別のウェルには検出試料とし
て、人髪（５mg）、室外飼育のイヌの毛(5mg）、室内飼
育のイヌの毛（４mg）、室内飼育のネコの毛（１mg）、
青梅綿（５mg）のそれぞれに、コナヒョウヒダニを加え
ないものと、50匹加えたものに、ＰＢＳ−Tween500μl
を加えて、10秒間攪拌し10分間放置後、10,000rpm で２
分間遠心したものの上清を50μl 加えた。室温で２時間
インキュベートした後、ＰＢＳ−Tween で３回洗浄、次
いで(3) で作成したアルカリフォスファターゼ標識モノ
クロナール抗体13A4* を９μg/mlとなるようにＰＢＳ−
Tween で希釈し、50μl ずつ添加した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】実施例３ 実施例１の(1) で得られた抗 Der fIIモノクローナル抗
体のうち３種、18G8、13A4、15E11 を用いて、コナヒョ
ウヒダニの虫体の凍結乾燥粉末と精製 Der fIIに対する
ウェスターンブロットを行った。コナヒョウヒダニ虫体
凍結乾燥粉末10mgを１mlのＰＢＳに溶解、また精製 Der
fIIを６μg/mlとなるようにＰＢＳで調製し、それぞれ
を公知の方法によってβ−メルカプトエタノールの存在
下でＳＤＳ化する。前者を20μl 、後者を10μlとり、2
0％ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE ミニゲル TEFC
O社製）において20mA、1.5 時間の電気泳動を行った。
電気泳動終了後、ブロッティングペーパー（PVDF：ミリ
ポア社製）に160mA １時間トランスファーした。３％BS
A を含むＰＢＳで室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ
−Tween で洗浄した。18G8、13A4、15E11 を50μg/mlと
なるように２mg/ml のBSA を含むＰＢＳに希釈した。ブ
ロッティングペーパーを切断してそれぞれの抗体溶液に
浸漬し、４℃で１晩反応させた。ＰＢＳ−Tween で洗浄
後、２次抗体としてパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ：バイオラッド社製）
を用い、２mg/ml のBSA を含むＰＢＳで１：1,500 に希
釈した溶液に、ブロッティングペーパーを浸漬し、室温
で２時間振盪しながら反応させた。ＰＢＳ−Tween で洗
浄後、基質として４−クロロ−１−ナフトール溶液に浸
漬し呈色させた。図２のような結果を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】実施例４ 実施例１の(1) で得たモノクローナル抗体のうち３つの
抗 Der fIIモノクローナル抗体、18G8、13A4、15E11 に
ついて、18G8、13A4をアルカリフォスファターゼ標識し
たもの、18G8* 、13A4* を作成し、これら３つの抗体の
抗原認識部位の違いを推定するため、競合実験を行っ
た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】実施例５で得られた Der fＩ（○）、Der pI
（●）、Der pII(△）の共存下でDer fIIのみが検出さ
れる範囲を測定した結果を示すグラフである。 縦軸
は、Der fII のみの溶液のO.D.値をＢo とし、共存する
抗原のそれぞれの濃度におけるO.D.値ををＢn としたと
きのＢn/Ｂo の値を示す。横軸は、共存する抗原濃度
（μg/ml）を示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】実施例８で得られたハウスダスト中の Der fII
量とダニ数の分散の結果を示すグラフである。縦軸は E
LISA系より算出されたハウスダスト１ｇ中の Der fII量
（μg)で、横軸はハウスダスト１ｇ中のコナヒョウダニ
数を表す。ｎ＝16、相関係数ｒ＝0.884 である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 森 俊夫 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社応用技術研究所内 (72)発明者 杉山 哲資 千葉県千葉市西都賀１−21−８ (72)発明者 安藤 徹 千葉県船橋市東中山１−13−23 グランジ ュール中山102号

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides
    farinae)由来の抗原Der fIIを哺乳類に免疫して得られ
    る、 Der fIIを選択的に認識しＩｇＧまたはＩｇＭクラ
    スに属する抗 Der fIIモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】 1B2 (微工研条寄第3247号) 、7C10 (微工
    研条寄第3248号) 、15E11 (微工研条寄第3249号) 、18G
    8 (微工研条寄第3250号) 、13A4 (微工研条寄第3251号)
    、24B7 (微工研条寄第3252号) から選ばれる請求項１
    記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】 モノクローナル抗体の Der fII上の認識
    部位が互いに異なる請求項１または２記載のモノクロー
    ナル抗体。
  4. 【請求項４】 請求項１、２または３記載のモノクロー
    ナル抗体を酵素、蛍光色素、化学発光物質またはラジオ
    アイソトープの１種以上を用いて標識して得られる標識
    モノクロナール抗体。
  5. 【請求項５】 請求項１、２または３記載のモノクロー
    ナル抗体を用いてアフィニティクロマトグラフィーによ
    り Der fIIを精製する方法。
  6. 【請求項６】 Der fII を検出するための免疫測定法で
    あって、試料を請求項１、２または３記載のモノクロー
    ナル抗体とインキュベートすることを特徴とする免疫測
    定法。
  7. 【請求項７】 Der fII を検出するための免疫測定法で
    あって、試料を請求項４記載の標識モノクロナール抗体
    とインキュベートすることを特徴とする免疫測定法。
  8. 【請求項８】 請求項１、２または３記載のモノクロー
    ナル抗体を産生するハイブリドーマセルライン。
  9. 【請求項９】 請求項６記載の免疫測定法に使用するた
    めの請求項１、２または３記載のモノクローナル抗体、
    固相化担体、ブロッキング試薬、標識抗マウスＩｇ抗
    体、発色基質、洗浄液、および標準 Der fIIからなるキ
    ット。
  10. 【請求項１０】 請求項７記載の免疫測定法に使用する
    ための請求項１、２または３記載のモノクローナル抗体
    を固相化した担体、請求項４記載の標識モノクロナール
    抗体、発色基質、洗浄液、および標準 Der fIIからなる
    キット。
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