JPH05184254A - シバ属内の体細胞雑種植物およびその製造方法 - Google Patents
シバ属内の体細胞雑種植物およびその製造方法Info
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- JPH05184254A JPH05184254A JP3297996A JP29799691A JPH05184254A JP H05184254 A JPH05184254 A JP H05184254A JP 3297996 A JP3297996 A JP 3297996A JP 29799691 A JP29799691 A JP 29799691A JP H05184254 A JPH05184254 A JP H05184254A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
［目的］ シバ属内のシバ以外の植物の有する優れた形
質を効率的に導入するようにしたシバの雑種およびその
製造方法を提供することを目的とする。 ［構成］ シバ由来のプロトプラストとシバ属内の他の
植物のプロトプラストとを電気処理によって細胞融合さ
せ、体細胞雑種植物を得るようにしたものである。
質を効率的に導入するようにしたシバの雑種およびその
製造方法を提供することを目的とする。 ［構成］ シバ由来のプロトプラストとシバ属内の他の
植物のプロトプラストとを電気処理によって細胞融合さ
せ、体細胞雑種植物を得るようにしたものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は細胞融合を用いた体細胞
雑種植物およびその製造方法に係り、とくにシバ属の植
物の品種改良に用いて好適な体細胞雑種およびその製造
方法に関する。
雑種植物およびその製造方法に係り、とくにシバ属の植
物の品種改良に用いて好適な体細胞雑種およびその製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物の品種改良は、従来主として人工交
配によってなされていた。このような人工交配による方
法は、近縁種のみしか雑種を得るとができないという欠
点がある。このような欠点を克服すべく、近年細胞融合
技術が進歩し、種間以上の雑種を得ることが可能になっ
ている。このような細胞融合技術はイネ科の植物に応用
され、イネを中心とした細胞融合に関する研究が報告さ
れている。この他に野菜を中心に、食用に供される植物
の細胞融合に関する研究報告が存在する。
配によってなされていた。このような人工交配による方
法は、近縁種のみしか雑種を得るとができないという欠
点がある。このような欠点を克服すべく、近年細胞融合
技術が進歩し、種間以上の雑種を得ることが可能になっ
ている。このような細胞融合技術はイネ科の植物に応用
され、イネを中心とした細胞融合に関する研究が報告さ
れている。この他に野菜を中心に、食用に供される植物
の細胞融合に関する研究報告が存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】シバ属の植物は、公園
やゴルフ場などに多く利用されている。このようなシバ
属の植物の品種改良は、従来は人工交配によって行なわ
れていた。このために耐病性、耐踏圧性、耐寒性、耐塩
性、耐虫性等の他のシバ属植物に有する優れた形質を効
率的にシバに導入することが困難であった。
やゴルフ場などに多く利用されている。このようなシバ
属の植物の品種改良は、従来は人工交配によって行なわ
れていた。このために耐病性、耐踏圧性、耐寒性、耐塩
性、耐虫性等の他のシバ属植物に有する優れた形質を効
率的にシバに導入することが困難であった。
【０００４】本発明はこのような問題点に鑑みてなされ
たものであって、他のシバ属植物に有する耐病性、耐踏
圧性、耐寒性、耐塩性、耐虫性等の優れた形質をシバに
導入するようにした体細胞雑種植物を提供することを目
的とするものである。
たものであって、他のシバ属植物に有する耐病性、耐踏
圧性、耐寒性、耐塩性、耐虫性等の優れた形質をシバに
導入するようにした体細胞雑種植物を提供することを目
的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞融合法に
よって得られるシバとシバ属内の他の植物の体細胞雑種
植物およびその製造方法に関するものであって、これに
よってシバに有用な形質を持たせるようにしたものであ
る。
よって得られるシバとシバ属内の他の植物の体細胞雑種
植物およびその製造方法に関するものであって、これに
よってシバに有用な形質を持たせるようにしたものであ
る。
【０００６】本発明は、シバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏ
ｎｉｃａ）由来の培養細胞または植物体から調整したプ
ロトプラストと、シバ属由来の培養細胞または植物体ま
たは種子から得られるプロトプラストとを細胞融合して
得られる体細胞雑種植物およびその製造方法に関するも
のである。
ｎｉｃａ）由来の培養細胞または植物体から調整したプ
ロトプラストと、シバ属由来の培養細胞または植物体ま
たは種子から得られるプロトプラストとを細胞融合して
得られる体細胞雑種植物およびその製造方法に関するも
のである。
【０００７】より詳細に説明すれば、本発明の対象とな
るシバ属とは、シバ（Ｚｏｙｓｉａｊａｐｏｎｉｃ
ａ）、コウライシバ（Ｚ． ｍａｔｒｅｌｌａ）、コウ
シュンシバ（Ｚ． ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）、ナガミノ
オニシバ（Ｚ． ｓｉｎｉｃａ）、オニシバ（Ｚ． ｍ
ａｃｒｏｓｔａｃｈｙａ）が挙げられる。
るシバ属とは、シバ（Ｚｏｙｓｉａｊａｐｏｎｉｃ
ａ）、コウライシバ（Ｚ． ｍａｔｒｅｌｌａ）、コウ
シュンシバ（Ｚ． ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）、ナガミノ
オニシバ（Ｚ． ｓｉｎｉｃａ）、オニシバ（Ｚ． ｍ
ａｃｒｏｓｔａｃｈｙａ）が挙げられる。
【０００８】ここで培養細胞とは、再分化能を有する上
記の植物体の完熟または未熟の種子、ランナーの成長
点、根の組織からカルスを誘導し、培養液で振とう培養
して得ることができる細胞である。
記の植物体の完熟または未熟の種子、ランナーの成長
点、根の組織からカルスを誘導し、培養液で振とう培養
して得ることができる細胞である。
【０００９】例えば上記の材料を７０％エタノール水溶
液および次亜塩素酸ナトリウム水溶液等で滅菌処理した
後に、植物ホルモンを含むＬＳ寒天培地等にこれらの植
物片を無菌で播種し、２５〜２８℃、０〜３０００ｌｕ
ｘ、１５〜２０時間日長の条件下で、カルスを誘導す
る。このカルスを継代した後に、再分化能を有する（エ
ンブリオジェニックな）カルスを選抜し、Ｎ６、ＡＡ、
Ｒ２培地で液体培養する。これにより再分化能を有する
培養細胞を得ることができる。
液および次亜塩素酸ナトリウム水溶液等で滅菌処理した
後に、植物ホルモンを含むＬＳ寒天培地等にこれらの植
物片を無菌で播種し、２５〜２８℃、０〜３０００ｌｕ
ｘ、１５〜２０時間日長の条件下で、カルスを誘導す
る。このカルスを継代した後に、再分化能を有する（エ
ンブリオジェニックな）カルスを選抜し、Ｎ６、ＡＡ、
Ｒ２培地で液体培養する。これにより再分化能を有する
培養細胞を得ることができる。
【００１０】このような培養は、植物ホルモンを含む培
地で培養される。植物ホルモンとは、２、４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（２、４−Ｄ）、ナフタレン酸（ＮＡ
Ａ）、カイネチン、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ジベレ
リン等が挙げられる。さらに４−アミノ−３、４、６−
トリクロロピコリン酸、２、６ジクロロ−Ｏ−アニミン
酸、ベンジルアデニン（ＢＡ）、アブシジン酸（ＡＢ
Ａ）等が用いられる。
地で培養される。植物ホルモンとは、２、４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（２、４−Ｄ）、ナフタレン酸（ＮＡ
Ａ）、カイネチン、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ジベレ
リン等が挙げられる。さらに４−アミノ−３、４、６−
トリクロロピコリン酸、２、６ジクロロ−Ｏ−アニミン
酸、ベンジルアデニン（ＢＡ）、アブシジン酸（ＡＢ
Ａ）等が用いられる。
【００１１】再分化能を有する培養細胞および植物体、
根、種子、さらに再分化能を持たない培養細胞からプロ
トプラストを得るためには、セルラーゼ、マセロザイ
ム、ドリセラーゼ、ペクトリアーゼ等を含む酵素液中
で、これらの組織片を１６〜３０℃、０〜５０ｒｐｍ、
３〜１８時間処理する。ここで植物体、根、種子等は
０．５〜１ｍｍ角に細断し、高張液を用いて１０〜１５
０ｒｐｍで振とうし、さらに酵素液で振とうすることに
より、組織中に酵素を浸透させることができる。
根、種子、さらに再分化能を持たない培養細胞からプロ
トプラストを得るためには、セルラーゼ、マセロザイ
ム、ドリセラーゼ、ペクトリアーゼ等を含む酵素液中
で、これらの組織片を１６〜３０℃、０〜５０ｒｐｍ、
３〜１８時間処理する。ここで植物体、根、種子等は
０．５〜１ｍｍ角に細断し、高張液を用いて１０〜１５
０ｒｐｍで振とうし、さらに酵素液で振とうすることに
より、組織中に酵素を浸透させることができる。
【００１２】酵素処理後、３０〜１００μｍのメッシュ
を通して、未消化組織を取除き、さに洗浄液にてプロト
プラストを洗浄する。洗浄に際しては、濾液に洗浄液を
加え、５００〜２０００ｒｐｍで３〜１５分間遠心分離
し、上澄み液を除いた後に、遠沈管に付着しているプロ
トプラストを洗浄液で洗い、さらに遠心分離する。これ
によって酵素液を完全に除去する。
を通して、未消化組織を取除き、さに洗浄液にてプロト
プラストを洗浄する。洗浄に際しては、濾液に洗浄液を
加え、５００〜２０００ｒｐｍで３〜１５分間遠心分離
し、上澄み液を除いた後に、遠沈管に付着しているプロ
トプラストを洗浄液で洗い、さらに遠心分離する。これ
によって酵素液を完全に除去する。
【００１３】またプロトプラスト液中に未消化物が多量
に存在しているときには、１５〜２５％のシュクロース
液の上に、プロトプラスト液を浮かべて、残骸物を遠心
分離し、上層のプロトプラスト層のみを分離する。
に存在しているときには、１５〜２５％のシュクロース
液の上に、プロトプラスト液を浮かべて、残骸物を遠心
分離し、上層のプロトプラスト層のみを分離する。
【００１４】得られたプロトプラストを融合液中で懸濁
した後に、電気細胞融合処理を行なう。なおここで用い
るプロトプラストとは、再分化能を有するものと、再分
化能を有しないものとを懸濁して用いる。あるいはまた
ともに再分化能を有するものであってもよい。
した後に、電気細胞融合処理を行なう。なおここで用い
るプロトプラストとは、再分化能を有するものと、再分
化能を有しないものとを懸濁して用いる。あるいはまた
ともに再分化能を有するものであってもよい。
【００１５】プロトプラストは０．１〜０．６Ｍマニト
ール、０．１〜１０ｍＭのＭＥＳ（モルフォリノエタン
スルホン酸）、０．１〜１０ｍＭの塩化カルシウム２水
塩（ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ）を含む溶液に混合する。さ
らにプロトプラストの数が１．０×１０5 〜５．０×１
０7 個／ｍｌになるように濃度を調整する。
ール、０．１〜１０ｍＭのＭＥＳ（モルフォリノエタン
スルホン酸）、０．１〜１０ｍＭの塩化カルシウム２水
塩（ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ）を含む溶液に混合する。さ
らにプロトプラストの数が１．０×１０5 〜５．０×１
０7 個／ｍｌになるように濃度を調整する。
【００１６】このプロトプラスト溶液に、１０００〜１
００００ＫＨｚの交流を５０〜３００Ｖ／ｃｍの電圧で
１〜６０秒間印加し、プロトプラストが電極間に１列に
並んだ状態、すなわちパールチェーンを形成させる。
００００ＫＨｚの交流を５０〜３００Ｖ／ｃｍの電圧で
１〜６０秒間印加し、プロトプラストが電極間に１列に
並んだ状態、すなわちパールチェーンを形成させる。
【００１７】つぎに１〜８ＫＶ／ｃｍの直流パルスを１
〜５秒毎に１〜５００μ秒間、１〜８回与え、プロトプ
ラストを融合させる。さらに交流電圧を０〜１２０秒間
かけ、融合したプロトプラストを修復させる。その後に
電源を切り、直ちに電極を外し、プロトプラスト液を静
置する。これによって、プロトプラストの電極への付着
をなくすことができる。
〜５秒毎に１〜５００μ秒間、１〜８回与え、プロトプ
ラストを融合させる。さらに交流電圧を０〜１２０秒間
かけ、融合したプロトプラストを修復させる。その後に
電源を切り、直ちに電極を外し、プロトプラスト液を静
置する。これによって、プロトプラストの電極への付着
をなくすことができる。
【００１８】融合処理したプロトプラストを５〜１５％
グルコース、２、４Ｄを０〜５ｍｇ／ｌを含むＲ２、Ｍ
Ｓ、ＢＰ、Ｂ５培地に再混濁する。このときに再分化す
るプロトプラストの数を１．０×１０2 〜１０7 個／ｍ
ｌに調整する。この混濁液をアガロース（低融点アガロ
ース）および７％グルコースを含む培地に当量混合し、
シャーレ中で固化させる。最終的にアガロース濃度は
０．５〜１．５％とする。このときにプロトプラストが
均一になるように、ピペットを用いて混合した後、固化
させる。
グルコース、２、４Ｄを０〜５ｍｇ／ｌを含むＲ２、Ｍ
Ｓ、ＢＰ、Ｂ５培地に再混濁する。このときに再分化す
るプロトプラストの数を１．０×１０2 〜１０7 個／ｍ
ｌに調整する。この混濁液をアガロース（低融点アガロ
ース）および７％グルコースを含む培地に当量混合し、
シャーレ中で固化させる。最終的にアガロース濃度は
０．５〜１．５％とする。このときにプロトプラストが
均一になるように、ピペットを用いて混合した後、固化
させる。
【００１９】このプロトプラストが再分化し難い場合に
は、固化したアガロースゲルを切断し、液体培地中で培
養する。このときに液体培地にはイネ科等の培養細胞を
共存させて培養するのがよい。培養条件は１０〜８０ｒ
ｐｍ、２５〜２８℃、暗条件とする。
は、固化したアガロースゲルを切断し、液体培地中で培
養する。このときに液体培地にはイネ科等の培養細胞を
共存させて培養するのがよい。培養条件は１０〜８０ｒ
ｐｍ、２５〜２８℃、暗条件とする。
【００２０】融合したプロトプラストは２〜３週間程度
培養することにより、イネ科培養細胞と共存しなくて
も、分裂をするようになる。さらに培養を続けることに
より、５〜１０週間後には肉眼で観察できるようなカル
スが形成されることになる。
培養することにより、イネ科培養細胞と共存しなくて
も、分裂をするようになる。さらに培養を続けることに
より、５〜１０週間後には肉眼で観察できるようなカル
スが形成されることになる。
【００２１】このカルスをシュクロースを３％含むＭＳ
固体培地等に置床し、培養することによって、不定胚を
形成し、植物体となる。得られた植物体は、固体寒天培
地からロックウール耕等に液体培地を浸し、順化を行な
う。この際に、糖類濃度を低下させることにより、順化
を効率化させることができる。さらにバーミキュライト
等に植物体を移植し、湿度と照明条件を制御し、屋外に
移植できる状態にする。
固体培地等に置床し、培養することによって、不定胚を
形成し、植物体となる。得られた植物体は、固体寒天培
地からロックウール耕等に液体培地を浸し、順化を行な
う。この際に、糖類濃度を低下させることにより、順化
を効率化させることができる。さらにバーミキュライト
等に植物体を移植し、湿度と照明条件を制御し、屋外に
移植できる状態にする。
【００２２】
【実施例】実施例１（シバとコウライシバの細胞融合） （１）カルス誘導およびサスペンジョンの作成 シバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）およびコウラ
イシバ（Ｚｏｙｓｉａｍａｔｒｅｌｌａ）の種子を公知
の方法により滅菌処理した後に、２、４−Ｄ（２ｍｇ／
ｌ）、カゼイン加水分解物（２ｇ／ｌ）、シュクロース
３％を含むＬＳ寒天培地に置床し、２６℃、暗条件でカ
ルスを誘導した。継代を経た後、カルス中に存在する白
色でコンパクトな再分化能を有するカルスを、ＡＡ培地
であって、ホルモン（２、４Ｄ３ｍｇ）、糖（シュクロ
ース３％、ソルビトール３％）を含む液体培地中で１０
０ｒｐｍ、２６℃、暗条件の元で振とう培養し、サスペ
ンジョン細胞を得た。このカルスの一部をホルモンを含
まないＭＳ固体培地に置床し、再分化能を確認した後
に、酵素処理を行なった。
イシバ（Ｚｏｙｓｉａｍａｔｒｅｌｌａ）の種子を公知
の方法により滅菌処理した後に、２、４−Ｄ（２ｍｇ／
ｌ）、カゼイン加水分解物（２ｇ／ｌ）、シュクロース
３％を含むＬＳ寒天培地に置床し、２６℃、暗条件でカ
ルスを誘導した。継代を経た後、カルス中に存在する白
色でコンパクトな再分化能を有するカルスを、ＡＡ培地
であって、ホルモン（２、４Ｄ３ｍｇ）、糖（シュクロ
ース３％、ソルビトール３％）を含む液体培地中で１０
０ｒｐｍ、２６℃、暗条件の元で振とう培養し、サスペ
ンジョン細胞を得た。このカルスの一部をホルモンを含
まないＭＳ固体培地に置床し、再分化能を確認した後
に、酵素処理を行なった。
【００２３】（２）プロトプラストの調整 上記のサスペンジョン細胞を、３％セルラーゼＲＳ、２
％マセロザイムＲ−１０、０．１％ペクトリアーゼＹ−
２３、０．５Ｍマニトール、７ｍＭ塩化カルシウム２水
塩、７ｍＭ ＭＥＳ、１／２ＭＳ培地を含む酵素液で２
６℃、４０ｒｐｍ、４時間処理した。
％マセロザイムＲ−１０、０．１％ペクトリアーゼＹ−
２３、０．５Ｍマニトール、７ｍＭ塩化カルシウム２水
塩、７ｍＭ ＭＥＳ、１／２ＭＳ培地を含む酵素液で２
６℃、４０ｒｐｍ、４時間処理した。
【００２４】酵素処理後、酵素液を濾過し、０．４Ｍマ
ニトール、０．３ｍＭ塩化カルシウム２水塩、７ｍＭ
ＭＥＳを含む洗浄液を加え、遠心分離してさらに沈降し
たプロトプラストを洗浄液で２回洗浄した。
ニトール、０．３ｍＭ塩化カルシウム２水塩、７ｍＭ
ＭＥＳを含む洗浄液を加え、遠心分離してさらに沈降し
たプロトプラストを洗浄液で２回洗浄した。
【００２５】（３）ヨードアセトアミド処理 上記のようにして調整したコウライシバのプロトプラス
トを血球計算板を用いて５×１０6 個／ｍｌになるよう
に濃度を調整し、懸濁した後に、ヨードアセトアミド液
から２５ｍＭになるように加え、５℃、１５分間処理し
た。処理後に洗浄液で２回洗浄し、１．０×１０7 個／
ｍｌになるように調整した。
トを血球計算板を用いて５×１０6 個／ｍｌになるよう
に濃度を調整し、懸濁した後に、ヨードアセトアミド液
から２５ｍＭになるように加え、５℃、１５分間処理し
た。処理後に洗浄液で２回洗浄し、１．０×１０7 個／
ｍｌになるように調整した。
【００２６】（４）細胞融合 上記の（２）および（３）で得られたノシバおよびコウ
ライシバのプロトプラストを、それぞれ１．０×１０7
個／ｍｌになるように洗浄液に懸濁し、溶液が均一にな
るように混合した後、電気細胞融合を行なった。
ライシバのプロトプラストを、それぞれ１．０×１０7
個／ｍｌになるように洗浄液に懸濁し、溶液が均一にな
るように混合した後、電気細胞融合を行なった。
【００２７】すなわちこの懸濁液に、２０００ＫＨｚ、
２５０Ｖ／ｃｍの交流を１０〜１５秒かけてパールチェ
ーンを形成した後に、１秒毎に３回、５ＫＶ／ｃｍの直
流パルスを１００μ秒間かけてプロトプラストを融合し
た。その後に２０００ＫＨｚ、２５０Ｖ／ｃｍの交流を
減衰させながらかけた。
２５０Ｖ／ｃｍの交流を１０〜１５秒かけてパールチェ
ーンを形成した後に、１秒毎に３回、５ＫＶ／ｃｍの直
流パルスを１００μ秒間かけてプロトプラストを融合し
た。その後に２０００ＫＨｚ、２５０Ｖ／ｃｍの交流を
減衰させながらかけた。
【００２８】（５）融合細胞の培養 融合処理したプロトプラストを１１％グルコース、２ｍ
ｇ／ｌ ２、４Ｄを含む８Ｐ培地に懸濁し、この懸濁液
を低融点アガロースを含む８Ｐ培地とを速やかに混合
し、直径が３５ｍｍのシャーレに均一に展開し、０．５
ｍｌずつ固化させた。なおこのときのプロトプラストの
密度は約１０6 個／ｍｌである。
ｇ／ｌ ２、４Ｄを含む８Ｐ培地に懸濁し、この懸濁液
を低融点アガロースを含む８Ｐ培地とを速やかに混合
し、直径が３５ｍｍのシャーレに均一に展開し、０．５
ｍｌずつ固化させた。なおこのときのプロトプラストの
密度は約１０6 個／ｍｌである。
【００２９】この融合プロトプラストを含むゲルを切出
し、１１％グルコース、２ｍｇ／ｌ２、４Ｄを含む８Ｐ
液体培地で満たした直径が６ｃｍのシャーレに浮かべ、
３０ｒｐｍ程度で振とう培養した。なおこのときには、
２６℃、暗条件で振とうを行なっている。
し、１１％グルコース、２ｍｇ／ｌ２、４Ｄを含む８Ｐ
液体培地で満たした直径が６ｃｍのシャーレに浮かべ、
３０ｒｐｍ程度で振とう培養した。なおこのときには、
２６℃、暗条件で振とうを行なっている。
【００３０】培養２週間後に、周囲の液体培地を除き、
さらに同一条件で培養を行ない、継代を繰返した後に、
６〜７週間後にコロニーが形成された。このコロニーを
２ｍｇ／ｌ ２、４−Ｄ、６％シュクロース、０．５％
アガロースを含むＮ６培地で培養し、カルス化させた。
なおこのときの培養条件は、２６℃で２０００ｌｕｘと
した。
さらに同一条件で培養を行ない、継代を繰返した後に、
６〜７週間後にコロニーが形成された。このコロニーを
２ｍｇ／ｌ ２、４−Ｄ、６％シュクロース、０．５％
アガロースを含むＮ６培地で培養し、カルス化させた。
なおこのときの培養条件は、２６℃で２０００ｌｕｘと
した。
【００３１】このカルスを再分化培地（ＭＳ培地、３％
シュクロース）に置床し、再分化を図ったところ、不定
胚の形成が見られ、さらに培養を続けたところ、シュー
トおよび発根が見られ、植物体が得られた。このときの
培養条件は、２６℃、３０００ｌｕｘで、１８時間日長
とした。
シュクロース）に置床し、再分化を図ったところ、不定
胚の形成が見られ、さらに培養を続けたところ、シュー
トおよび発根が見られ、植物体が得られた。このときの
培養条件は、２６℃、３０００ｌｕｘで、１８時間日長
とした。
【００３２】実施例２（シバとコウシュンシバ（Ｚｏｙ
ｓｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）の細胞融合） （１）カルス誘導およびサスペンジョンの作成 シバのカルス誘導およびサスペンジョンの作成は、実施
例１の（１）項記載の方法で得た。
ｓｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）の細胞融合） （１）カルス誘導およびサスペンジョンの作成 シバのカルス誘導およびサスペンジョンの作成は、実施
例１の（１）項記載の方法で得た。
【００３３】（２）プロトプラストの調整 シバのプロトプラストの調整は、実施例１の（２）項記
載の方法によって得た。一方コウシュンシバ（Ｚｏｙｓ
ｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）は、植物体のランナー部
の先端を切断し、常法に従って滅菌処理し、０．５〜
１．０ｍｍ角に細断し、０．５Ｍマニトール、１／２Ｍ
Ｓ培地を含む高張液に浸透した。この溶液を１００ｒｐ
ｍにて振とうした。高張液を除いた後に、３％マルラー
ゼＲＳ、２％マセロザイムＲ−１０、０．１％ペクトリ
アーゼＹ−２３、０．５Ｍマニトール、７ｍＭ塩化カル
シウム２水塩、７ｍＭ ＭＥＳ、１／２ＭＳ培地を含む
酵素液で２６℃、３０ｒｐｍ、４時間処理した。そして
酵素処理後に、酵素液を濾過し、実施例１の（２）項記
載の洗浄液にて３回洗浄した。
載の方法によって得た。一方コウシュンシバ（Ｚｏｙｓ
ｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）は、植物体のランナー部
の先端を切断し、常法に従って滅菌処理し、０．５〜
１．０ｍｍ角に細断し、０．５Ｍマニトール、１／２Ｍ
Ｓ培地を含む高張液に浸透した。この溶液を１００ｒｐ
ｍにて振とうした。高張液を除いた後に、３％マルラー
ゼＲＳ、２％マセロザイムＲ−１０、０．１％ペクトリ
アーゼＹ−２３、０．５Ｍマニトール、７ｍＭ塩化カル
シウム２水塩、７ｍＭ ＭＥＳ、１／２ＭＳ培地を含む
酵素液で２６℃、３０ｒｐｍ、４時間処理した。そして
酵素処理後に、酵素液を濾過し、実施例１の（２）項記
載の洗浄液にて３回洗浄した。
【００３４】（３）細胞融合 上記（２）項記載の方法によって得られたシバおよびコ
ウシュンシバのプロトプラストをそれぞれ約１．０×１
０7 個／ｍｌになるように洗浄液に懸濁し、よく混合し
た後に融合処理を行なった。
ウシュンシバのプロトプラストをそれぞれ約１．０×１
０7 個／ｍｌになるように洗浄液に懸濁し、よく混合し
た後に融合処理を行なった。
【００３５】すなわち懸濁液に１ＭＨｚで２５０Ｖ／ｃ
ｍの交流を３０秒かけてパールチェーンを形成した後
に、１秒おきに２回、３ＫＶ／ｃｍの直流パルスを１０
０μ秒かけて融合した。その後に１ＭＨｚ、２５０Ｖ／
ｃｍの交流を減衰させながらかけた。
ｍの交流を３０秒かけてパールチェーンを形成した後
に、１秒おきに２回、３ＫＶ／ｃｍの直流パルスを１０
０μ秒かけて融合した。その後に１ＭＨｚ、２５０Ｖ／
ｃｍの交流を減衰させながらかけた。
【００３６】（４）融合細胞の培養 得られた融合細胞を実施例１の（５）項記載の方法によ
ってアガロースに包埋した。このゲルを切出し、直径が
６ｃｍのシャーレに８Ｐの液体培地を入れた上に浮かべ
た。この液体培地にはさらに、実施例１の（１）項記載
のサスペンジョン細胞から成る培養細胞を１００ｍｇ程
度入れ、２６℃、暗条件、３０ｒｐｍで振とう培養し
た。
ってアガロースに包埋した。このゲルを切出し、直径が
６ｃｍのシャーレに８Ｐの液体培地を入れた上に浮かべ
た。この液体培地にはさらに、実施例１の（１）項記載
のサスペンジョン細胞から成る培養細胞を１００ｍｇ程
度入れ、２６℃、暗条件、３０ｒｐｍで振とう培養し
た。
【００３７】培養２週間後に、周囲の液体培地と培養細
胞とを除き、新しい培地に交換した後に、同一条件で培
養した。継代の後に、５〜６週間後に、コロニーが形成
された。このコロニーを２ｍｇ／ｌ ２、４−Ｄ、６％
シュクロース、０．５％アガロースを含むＮ６固体培地
で培養し、カルスを得た。なおこの培養は、２６℃、２
０００ｌｕｘの培養条件で行なった。
胞とを除き、新しい培地に交換した後に、同一条件で培
養した。継代の後に、５〜６週間後に、コロニーが形成
された。このコロニーを２ｍｇ／ｌ ２、４−Ｄ、６％
シュクロース、０．５％アガロースを含むＮ６固体培地
で培養し、カルスを得た。なおこの培養は、２６℃、２
０００ｌｕｘの培養条件で行なった。
【００３８】このカルスを実施例１の（５）項記載の方
法によって不定胚を形成させ、植物体を得た。
法によって不定胚を形成させ、植物体を得た。
【００３９】
【発明の効果】以上のように本発明は、シバ由来のプロ
トプラストとシバ属内の他の植物のプロトプラストとの
細胞融合によって得られた体細胞雑種およびその製造方
法に係るものである。本発明によれば、シバにシバ属内
の他の植物の優れた形質を効果的に導入することが可能
になり、耐病性、耐踏圧性、耐寒性、耐塩性、耐虫性等
の優れた形質を有する雑種のシバを得ることが可能にな
るとともに、その形質をも任意に選択あるいは制御でき
るようになる。
トプラストとシバ属内の他の植物のプロトプラストとの
細胞融合によって得られた体細胞雑種およびその製造方
法に係るものである。本発明によれば、シバにシバ属内
の他の植物の優れた形質を効果的に導入することが可能
になり、耐病性、耐踏圧性、耐寒性、耐塩性、耐虫性等
の優れた形質を有する雑種のシバを得ることが可能にな
るとともに、その形質をも任意に選択あるいは制御でき
るようになる。
Claims (4)
- 【請求項１】 シバ由来のプロトプラストとシバ属内の
他の植物のプロトプラストとの細胞融合により得られる
体細胞雑種植物。 - 【請求項２】 シバ属内の他の植物がコウライシバであ
ることを特徴とする請求項１に記載の体細胞雑種植物。 - 【請求項３】 シバ由来の細胞または植物体から調整し
たプロトプラストとシバ属の他の植物の細胞、植物体、
または種子から調整されるプロトプラストとを融合さ
せ、体細胞雑種植物を作成するようにしたシバ属内の体
細胞雑種植物の製造方法。 - 【請求項４】 プロトプラストの融合を電気処理によっ
て行なうことを特徴とする請求項３に記載のシバ属内の
体細胞雑種植物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3297996A JPH05184254A (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | シバ属内の体細胞雑種植物およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3297996A JPH05184254A (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | シバ属内の体細胞雑種植物およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184254A true JPH05184254A (ja) | 1993-07-27 |
Family
ID=17853781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3297996A Pending JPH05184254A (ja) | 1991-10-18 | 1991-10-18 | シバ属内の体細胞雑種植物およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05184254A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1009044C2 (nl) * | 1998-04-29 | 1999-11-01 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadha | Strikte zelfbevruchters met een gemodificeerde bloemmorfologie. |
| CN115868459A (zh) * | 2022-12-16 | 2023-03-31 | 福建省农业科学院水稻研究所 | 马尼拉草作为小宽头飞虱的产卵载体在稻虱缨小蜂冷藏中的应用以及稻虱缨小蜂的冷藏方法 |
-
1991
- 1991-10-18 JP JP3297996A patent/JPH05184254A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1009044C2 (nl) * | 1998-04-29 | 1999-11-01 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadha | Strikte zelfbevruchters met een gemodificeerde bloemmorfologie. |
| WO1999055143A1 (en) * | 1998-04-29 | 1999-11-04 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Strict self pollinating plants with modified flower morphology |
| CN115868459A (zh) * | 2022-12-16 | 2023-03-31 | 福建省农业科学院水稻研究所 | 马尼拉草作为小宽头飞虱的产卵载体在稻虱缨小蜂冷藏中的应用以及稻虱缨小蜂的冷藏方法 |
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